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Biochemistry

Cartographie du transfert d’énergie par résonance de Förster : une nouvelle méthodologie pour élucider les caractéristiques structurelles mondiales

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

L’étude détaille la méthodologie de la cartographie FRET, y compris la sélection des sites d’étiquetage, le choix des colorants, l’acquisition et l’analyse des données. Cette méthodologie est efficace pour déterminer les sites de liaison, les changements conformationnels et les mouvements dynamiques dans les systèmes protéiques et est plus utile si elle est réalisée en conjonction avec les informations structurelles 3D existantes.

Abstract

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est une méthode établie basée sur la fluorescence utilisée pour mesurer avec succès les distances dans et entre les biomolécules in vitro ainsi qu’à l’intérieur des cellules. Dans FRET, l’efficacité du transfert d’énergie, mesurée par les changements d’intensité de fluorescence ou de durée de vie, est liée à la distance entre deux molécules ou étiquettes fluorescentes. La détermination de la dynamique et des changements conformationnels à partir des distances ne sont que quelques exemples d’applications de cette méthode aux systèmes biologiques. Dans certaines conditions, cette méthodologie peut ajouter et améliorer les structures cristallines de rayons X existantes en fournissant des informations sur la dynamique, la flexibilité et l’adaptation aux surfaces de liaison. Nous décrivons l’utilisation du FRET et des déterminations de distance associées pour élucider les propriétés structurelles, par l’identification d’un site de liaison ou les orientations des sous-unités dimères. Grâce à un choix judicieux des sites de marquage et souvent à l’utilisation de plusieurs stratégies de marquage, nous avons appliqué avec succès ces méthodes de cartographie pour déterminer les propriétés structurelles globales d’un complexe protéine-ADN et du système de translocation de protéines SecA-SecYEG. Dans le système SecA-SecYEG, nous avons utilisé des méthodes de cartographie FRET pour identifier le site de liaison des préprotéines et déterminer la conformation locale de la région de séquence de signaux liés. Cette étude décrit les étapes à suivre pour effectuer des études de cartographie FRET, y compris l’identification des sites d’étiquetage appropriés, la discussion des étiquettes possibles, y compris les résidus d’acides aminés non natifs, les procédures d’étiquetage, la façon d’effectuer des mesures et l’interprétation des données.

Introduction

Pour les protéines, l’élucidation de la dynamique ainsi que les connaissances structurelles en 3 dimensions (3D) conduisent à une meilleure compréhension des relations structure-fonction des systèmes biomoléculaires. Les méthodes structurelles, telles que la cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique cryogénique, capturent une structure statique et nécessitent souvent la détermination de plusieurs structures pour élucider les aspects de la liaison et de la dynamique des biomolécules1. Cet article décrit une méthode basée sur une solution pour mapper des éléments structurels globaux, tels que des sites de liaison ou des interactions de liaison, qui sont potentiellement plus transitoires et moins facilement capturés par des méthodes statiques. Les systèmes candidats solides pour cette méthodologie sont ceux dans lesquels une structure 3D a déjà été déterminée par cristallographie aux rayons X, spectroscopie RMN ou d’autres méthodes structurelles. Dans ce cas, nous tirons parti de la structure cristalline des rayons X du complexe SecA-SecYEG, un acteur central de la voie sécrétoire générale des protéines, pour cartographier l’emplacement d’un site de liaison peptidique signal à l’aide du transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) avant le transport de la préprotéine à travers la membrane2. La manipulation du système biologique par des modifications génétiques couplée à notre connaissance de la structure 3D a permis de déterminer la conformation de la séquence de signaux et de la région mature précoce immédiatement avant l’insertion dans le canal 3.

FRET implique le transfert d’énergie sans rayonnement d’une molécule (donneur) à une autre (accepteur) d’une manière dépendante de la distance qui traverse l’espace 4,5. L’efficacité de ce transfert est surveillée soit par une diminution du donneur, soit par une augmentation de l’intensité de fluorescence de l’accepteur. L’efficacité du transfert d’énergie peut être décrite comme suit :

E = R06/(R06 + R6)

dans laquelle la valeur R0 est la distance à laquelle le transfert est efficace à 50 %6. La technique a déjà été décrite comme une règle moléculaire et est efficace pour déterminer des distances comprises entre 2,5 et 12 nm, en fonction de l’identité des colorants donneur-accepteur 4,7,8,9. Les intensités de fluorescence du donneur et les durées de vie avec ou sans accepteur permettent de déterminer les efficacités de transfert et, par conséquent, les distances 5,8. En raison de la disponibilité de la technologie, de la sensibilité de la méthode et de la facilité d’utilisation, FRET a également trouvé une large application dans des domaines tels que la spectroscopie de fluorescence à molécule unique et la microscopie confocale6. L’avènement de protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte a rendu l’observation de la dynamique intracellulaire et de l’imagerie des cellules vivantes relativement facile10,11. De nombreuses applications FRET telles que celles-ci sont abordées en détail dans ce numéro virtuel.

Dans cette étude, nous nous concentrons particulièrement sur l’utilisation des mesures FRET pour produire des valeurs de distance afin de déterminer les détails structurels. Auparavant, les mesures FRET ont été utilisées efficacement pour déterminer la conformation des molécules d’ADN lorsqu’elles sont liées à la protéine 12,13,14, la dynamique interne des protéines et les interactions de liaison aux protéines 15,16,17. Les avantages de cette méthode résident dans la capacité de déterminer des éléments structurels flexibles et dynamiques dans une solution avec des quantités relativement faibles de matériau. De manière significative, cette méthode est particulièrement efficace lorsqu’elle est utilisée conjointement avec des informations structurelles existantes et ne peut pas être utilisée comme moyen de détermination de la structure 3D. La méthode fournit le meilleur aperçu et le meilleur raffinement de la structure si le travail s’appuie sur des informations structurelles existantes souvent couplées à une simulation informatique18,19. Ici, l’utilisation des distances obtenues à partir de mesures FRET à l’état d’équilibre et résolues dans le temps est décrite pour cartographier un site de liaison, dont l’emplacement n’était pas connu, sur une structure cristallographique existante du complexe SecA-SecYEG, des protéines majeures de la voie sécrétoire générale3.

La voie sécrétoire générale, un système hautement conservé des procaryotes aux eucaryotes en passant par les archées, médie le transport des protéines à travers ou dans la membrane jusqu’à leur emplacement fonctionnel dans la cellule. Pour les bactéries à Gram négatif, telles que E. coli, l’organisme utilisé dans notre étude, les protéines sont insérées ou transloquées à travers la membrane interne vers le périplasme. Le complexe de canaux secY bactériens (appelé translocon) se coordonne avec d’autres protéines pour translocaliser la protéine nouvellement synthétisée, qui est dirigée vers son emplacement correct dans la cellule par une séquence de signaux généralement située à la terminaison N20,21. Pour les protéines liées au périplasme, la protéine ATPase SecA s’associe au tunnel de sortie du ribosome, et à la préprotéine après qu’environ 100 résidus ont été traduits22. Avec la protéine chaperonne SecB, il maintient la préprotéine dans un état déplié. SecA se lie au translocon SecYEG et, à travers de nombreux cycles d’hydrolyse de l’ATP, facilite le transport des protéines à travers la membrane23,24.

SecA est une protéine multi-domaine qui existe sous des formes cytosoliques et membranaires. Une protéine homodimérique dans le cytosol, SecA se compose d’un domaine de liaison ou de réticulation préprotéique25, de deux domaines de liaison aux nucléotides, d’un domaine alaire hélicoïdal, d’un domaine d’échafaudage hélicoïdal et des deux doigts hélicoïdaux (THF)26,27,28,29 (Figure 1). Dans des études cristallographiques antérieures du complexe SecA-SecYEG, l’emplacement du THF a suggéré qu’il était activement impliqué dans la translocation des protéines et les expériences de réticulation ultérieures avec le peptide signal ont établi l’importance de cette région dans la translocation des protéines30,31. Des études antérieures, utilisant la méthodologie de cartographie FRET, ont démontré que les peptides de signal exogènes se lient à cette région de SecA 2,32. Pour bien comprendre la conformation et l’emplacement de la séquence de signaux et de la région mature précoce de la préprotéine avant son insertion dans le canal SecYEG, une chimère protéique dans laquelle la séquence de signal et les résidus de la région mature précoce ont été attachés à SecA par l’intermédiaire d’un liant Ser-Gly a été créée (Figure 1). En utilisant cette construction biologiquement viable, il a été démontré que la séquence de signaux et la région mature précoce de la préprotéine se lient au THF de manière parallèle2. Par la suite, la méthodologie de cartographie FRET a été utilisée pour élucider la conformation et l’emplacement de la séquence de signaux et de la région mature précoce en présence de SecYEG, comme décrit ci-dessous3.

La connaissance de la structure 3D du complexe SecA-SecYEG 33,34,35 et de l’emplacement possible du site de liaison nous a permis de placer judicieusement des étiquettes donneur-accepteur dans des endroits où l’intersection des distances FRET individuelles identifie l’emplacement du site de liaison. Ces mesures de cartographie FRET ont révélé que la séquence de signaux et la région mature précoce de la préprotéine forment une épingle à cheveux avec la pointe située à l’embouchure du canal SecYEG, démontrant que la structure en épingle à cheveux est modélisée avant l’insertion du canal.

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Protocol

1. Sélection des sites d’étiquetage

  1. Identifier au moins trois sites de marquage potentiels pour trianguler le site de liaison putative sur les structures protéiques existantes. Dans ce cas, SecA, SecYEG et préprotéine attachée à SecA par fusion génétique ont été identifiés2.
    1. Choisissez des sites d’étiquetage à moins de 25-75 Å du site de liaison putative et dans des régions relativement statiques de la protéine, la distance déterminera la paire de colorants FRET spécifique à utiliser36. Localisez les sites de marquage dans des régions protéiques relativement distinctes les unes des autres, de sorte que les sites décrivent les sommets d’un triangle avec le site de liaison putatif situé au centre (Figure 1A-D).
    2. Introduire ou identifier les résidus de cystéine (Cys) aux sites d’étiquetage d’intérêt dans une protéine qui n’a pas d’autres résidus de Cys, afin d’améliorer l’efficacité de marquage du site spécifique37,38.
    3. Introduire des acides aminés non naturels, par exemple la p-azidophénylalanine pour le marquage avec la chimie du clic, afin de marquer efficacement une protéine à deux positions distinctes avec différents colorants39,40.
    4. Testez les mutants de Cys pour la perte de fonction. Vérifier l’activité du mutant sans Cys et du mutant d’acide aminé non naturel à l’aide d’un test d’activité approprié. Dans ce cas, l’activité a été vérifiée avec un test de croissance suivi d’un test IN VITRO de malachite verte ATPase 32,41,42

2. Marquage de la protéine

  1. Purifier la ou les protéines d’intérêt à une pureté d’au moins 95% pour un marquage précis. Purifier les protéines SecA et SecYEG en suivant les protocoles détaillés dans la référence3. Assurez-vous d’avoir au moins 5 μg de protéines purifiées pour cette étape, car certaines protéines seront perdues pendant le processus d’étiquetage.
  2. Choisissez deux colorants pour les mesures FRET en fonction de leur valeur R0 et des distances prévues entre les sites marqués. Estimer les valeurs R0 et observer le chevauchement de l’émission du donneur et de l’absorbance de l’accepteur à l’aide des informations de la base de données sur les protéines fluorescentes, qui donne également des spectres pour les colorants couramment utilisés (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    REMARQUE: R0 est défini comme la distance à laquelle l’efficacité de transfert est de 50% pour une paire de colorants donnée. Pour les expériences de cartographie, les distances prévues doivent être proches de la valeur R0 de la paire de colorants pour s’assurer que les distances peuvent être mesurées avec précision.
  3. Étiquetez les positions identifiées à l’étape 1.1.1. avec la paire de colorant donneur-accepteur.
    1. Étiquetez la protéine conformément aux instructions du fabricant en accordant une attention particulière aux paramètres tels que la concentration optimale en protéines, la température, le pH, la durée et le tampon pour les colorants spécifiques utilisés43,44.
    2. Préparer la protéine à une concentration de 1-2 mg/mL ou environ 10 μM dans un tampon Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE). Dissoudre le colorant dans le diméthylformamide (DMF) ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) jusqu’à une concentration finale de 1 mM. Ajouter le colorant goutte à goutte à la solution en remuant pour obtenir un rapport molaire colorant:protéine de 5:1 (colorant 50 μM : protéine 10 μM).
    3. Laisser la réaction se poursuivre pendant 4 h à température ambiante (RT) dans un flacon en verre avec un balancement doux ou pendant la nuit à 4 °C. Arrêtez la réaction en ajoutant du β-mercaptoéthanol.
      REMARQUE: Si la protéine n’est pas compatible avec le tampon Tris, des tampons phosphate ou HEPES peuvent être utilisés. Maintenir le pH dans la plage de 7,0 à 7,5. Si la protéine a des liaisons disulfures, ajoutez un agent réducteur tel que DTT ou TCEP avant le marquage. Retirer la TNT par dialyse ou filtration sur gel avant d’ajouter du colorant.
  4. Pour des mesures FRET précises, retirez le colorant libre à l’aide d’un concentrateur centrifuge avec un seuil de poids moléculaire approprié (MWCO) pour laisser le colorant libre circuler tout en conservant la protéine marquée.
    1. Préparer la membrane du concentrateur en plaçant ~ 1 mL d’eau dans la partie supérieure d’un concentrateur de 3 mL, puis centrifuger l’eau à travers la membrane (au moins 10 min à 4 300 x g).
    2. Retirer le colorant libre en centrifugant l’échantillon marqué dans un concentrateur (20 min à 4 300 x g). Répétez 3-4 fois et jetez le flux à travers.
    3. Vérifiez l’efficacité d’étiquetage de la protéine marquée à l’aide de la spectroscopie d’absorption UV-Vis.
      REMARQUE: Les mesures FRET nécessitent des rendements d’étiquetage de 50% ou plus. Une efficacité d’étiquetage plus faible réduit le signal FRET et peut entraîner des inexactitudes dans la mesure.
    4. Obtenir un spectre UV-Vis de la protéine marquée avec une plage de 250-700 nm pour observer à la fois la bande d’absorption des protéines et la bande d’absorption maximale du colorant. Mesurer l’absorbance au pic d’absorption du colorant et à 280 nm pour les protéines.
    5. Déterminer la concentration de protéines et corriger toute contribution du colorant en utilisant le facteur de correction, CF, et les équations suivantes45,46:
      Equation 1
      où C est la concentration de la protéine (M), A280 est l’absorbance de l’échantillon à 280 nm, Amax est l’absorbance au maximum d’absorption du colorant, ε protéine est le coefficient d’extinction de la protéine à 280 nm et CF est le facteur de correction, A'280/A’max, où A'280 est l’absorbance à 280 nm et A’max est l’absorbance au maximum maximal pour le colorant uniquement.
    6. Déterminez l’efficacité de l’étiquetage à l’aide de l’équation suivante :
      Equation 2
      où εcolorant est le coefficient d’extinction molaire du colorant, C est la concentration de la protéine telle que déterminée à l’étape 2.4.5, et E est l’efficacité de marquage. Répétez l’étape 2.4.2 jusqu’à ce que la valeur d’efficacité de l’étiquetage ait plafonné et soit inférieure à 100 %.

3. Déterminez les valeurs R 0

  1. Mesurez les valeurs R0 in situ. Préparer deux échantillons de protéines à la même concentration de protéines totales, 4 μM, un avec la protéine marquée avec le colorant donneur seulement et un avec la protéine marquée avec le colorant accepteur seulement. Pour SecA, une concentration protéique de 4 μM SecA monomère fonctionne bien pour ces mesures.
    1. Préparer des volumes d’échantillons de 2,5 mL pour une cuvette de 1 cm x 1 cm, de 600 μL pour une cuvette de 5 mm x 5 mm ou de 200 μL pour une cuvette de 3 mm x 3 mm.
  2. Allumez le fluoromètre et ouvrez le programme d’acquisition et d’analyse spectrale dans le logiciel de fluorescence si vous utilisez un spectrofluoromètre. Cliquez sur le M rouge pour connecter l’ordinateur à l’instrument (Figure 2A) et choisissez Spectres d’émission.
    1. Entrez les paramètres de balayage tels que la longueur d’onde d’excitation, la plage de balayage d’émission, la température et la position du changeur d’échantillon à l’aide de l’élément de menu Expérience de collecte (Figure 2B).
    2. Cliquez sur RTC et optimisez les réglages de l’instrument (par exemple, les fentes spectrales) en surveillant l’émission de fluorescence au pic à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation réglée au maximum d’absorption du colorant. Pour SecA, définissez les paramètres suivants : passe-bande sur 1 nm ; les fentes d’excitation et d’émission sont respectivement de 1 et 1,5 mm, avec une température de 25 °C et une vitesse d’agitation de 250 tr/min.
      REMARQUE: Ne dépassez pas la capacité de comptage par seconde (cps) de l’instrument (généralement 2 x 106 cps).
  3. Placez l’échantillon de protéine marqué par le donneur dans le porte-échantillon et cliquez sur Exécuter pour générer un balayage d’émission de la protéine étiquetée avec le colorant du donneur uniquement (protéine du donneur uniquement) en excitant l’échantillon au maximum d’absorption du colorant (par exemple, 488 nm pour AF488) et en balayant le pic d’émission (505-750 nm pour la protéine SecA du donneur uniquement marquée avec AF488).
  4. Établissez une ligne de base pour l’analyse en étendant l’analyse de 25 à 50 nm au-delà de la fin du pic. Mesurer le rendement quantique de la protéine du donneur uniquement, en effectuant des mesures d’absorption et de fluorescence sur des échantillons de différentes concentrations comme décrit47. Conservez les mêmes réglages de fente pour ces mesures.
    1. Utilisez un colorant donneur libre comme référence pour le rendement quantique. Obtenez au moins quatre mesures de la protéine du donneur seulement et du colorant libre à différentes concentrations pour une détermination précise.
    2. Tracer l’intensité de fluorescence ou la zone intégrée par rapport à l’absorbance de la protéine donneuse uniquement et du colorant libre ou de la référence. Déterminer les pentes de la protéine donneuse seulement (penteD) et la référence (penteR).
    3. Le rendement quantique (Φ) est calculé à l’aide de l’équation suivante :
      Equation 3
      ici ΦD est le rendement quantique de la protéine donneuse uniquement, ΦR est le rendement quantique du colorant libre (cela peut généralement être obtenu auprès du fabricant), la penteD et la penteR sont les pentes déterminées à l’étape 3.4.2 pour la protéine et la référence du donneur uniquement, respectivement et ηD et ηR représentent l’indice de réfraction de la protéine donneuse uniquement et des solutions colorantes sans référence, respectivement 47.
  5. Obtenez un spectre d’absorption de votre protéine accepteur uniquement à l’aide d’une cellule de longueur de trajet de 1 cm. Générez un spectre de coefficient d’extinction de votre protéine accepteur uniquement en divisant le spectre d’absorption par la concentration en colorant.
  6. Générer l’intégrale de chevauchement spectral, J (λ) à l’aide d’un programme d’analyse graphique. Un programme de feuille de calcul standard (p. ex., feuille de calcul) peut également être utilisé pour ce processus.
    1. Multipliez le spectre d’émission de fluorescence de la protéine donneuse uniquement (étape 3.4) par le spectre du coefficient d’extinction de la protéine accepteur uniquement pour générer le spectre de chevauchement.
    2. Multipliez le spectre de chevauchement résultant par λ4.
    3. Déterminez l’aire sous la courbe en intégrant la région de chevauchement. La région de chevauchement est définie comme la zone où le spectre d’émission du donneur multiplié par le spectre du coefficient d’extinction de l’accepteur donne des valeurs positives. L’intégrale du chevauchement spectral est définie comme suit :
      Equation 4
      où FD (λ) est le spectre d’émission de la protéine donneuse seule (obtenue à l’étape 3.4) et εA(λ) est le spectre du coefficient d’extinction de la protéine accepteur uniquement et a des unités de M-1 cm-1 (obtenues à l’étape 3.5). L’intégrale de chevauchement spectral résultant devrait avoir des unités de M-1 cm-1nm4.
    4. Normaliser l’intégrale du chevauchement spectral. Divisez l’intégrale de chevauchement par l’aire intégrée du spectre protéique du donneur uniquement sur la même gamme spectrale :
      Equation 5
    5. Calculez la valeur R0 en Å à l’aide de l’équation suivante :
      Equation 6
      où κ2 est le facteur d’orientation, généralement pris comme 2/3 pour les colorants en rotation libre, η est l’indice de réfraction et peut être approximé comme 1,33 pour les solutions aqueuses diluées, QD est le rendement quantique du donneur (étape 3.4) et J(λ) est l’intégrale de chevauchement spectrale comme déterminé à l’étape 3.6.35. REMARQUE: Si les colorants ne tournent pas librement, des corrections peuvent être introduites comme décrit par Ivanov 48 et mis en œuvre par Auclair49 et Zhang 2,3.

4. Effectuer des mesures spectrales FRET

  1. Préparer des échantillons de protéines du donneur seulement, de protéines à accepteur seulement et de protéines de donneur-accepteur à la même concentration; une concentration de 4 μM est recommandée. Utiliser 200 μL de solution, si vous utilisez une cuvette de 3 mm x 3 mm, 600 μL si vous utilisez une cuvette de 5 mm x 5 mm ou 2,5 mL si vous utilisez une cuvette de 1 cm x 1 cm.
    1. Préparez l’échantillon de protéine donneur-accepteur en utilisant des quantités molaires égales de protéines du donneur uniquement et de protéines accepteurs uniquement.
    2. Conserver la même quantité d’échantillon marqué dans le donneur témoin seulement et accepter uniquement les échantillons de protéines grâce à l’introduction de protéines non marquées en quantité molaire égale aux échantillons du donneur seulement ou de l’accepteur seulement. Par exemple, pour des solutions de même concentration, chaque échantillon FRET de donneur seulement contiendrait 100 μL de protéines de donneur seulement et 100 μL de protéines non marquées pour un volume de 200 μL.
  2. Générez des spectres d’émission de fluorescence du donneur uniquement, de l’accepteur uniquement et des échantillons donneur-accepteur. Optimisez le signal comme décrit à l’étape 3.2. Une fois optimisé, conservez les mêmes paramètres pour tous les échantillons.
    1. Obtenez l’analyse du donneur uniquement comme décrit à l’étape 3.3. Excitez la solution au maximum de l’absorption du colorant du donneur et balayez les pics d’émission du donneur et de l’accepteur (attendu).
    2. Échangez l’échantillon contre la protéine accepteur uniquement ou remplacez la position du changeur d’échantillon par la cuvette contenant la protéine accepteur uniquement.
    3. Obtenir un scan d’émission de la protéine marquée avec un colorant accepteur uniquement (protéine accepteur uniquement) en utilisant les mêmes paramètres qu’à l’étape 4.2.1. Excitez l’échantillon à la longueur d’onde d’excitation du donneur.
      REMARQUE: Ce spectre fournit une correction pour la quantité d’accepteur excité à la longueur d’onde du donneur (FA à l’étape 5.1.2)
    4. Échangez l’échantillon contre l’échantillon de protéine donneur-accepteur ou remplacez la position du changeur d’échantillon par la cuvette contenant la protéine marquée donneur-accepteur.
    5. Obtenir un scan d’émission de l’échantillon de protéine donneur-accepteur en utilisant les mêmes réglages que dans les étapes 4.2.1 et 4.2.3.
    6. Pour tous les spectres, corrigez la fluorescence de fond en soustrayant les comptes de fond mesurés à la fin du balayage.
  3. Mesurer la durée de vie du donneur uniquement et les échantillons donneur-accepteur préparés comme décrit à l’étape 4.1.2. Utilisez un instrument de fluorescence à photon unique corrélé dans le temps capable de mesurer et de résoudre les désintégrations fluorescentes dans la plage de temps de la nanoseconde (10-9 s).
    REMARQUE: Pour les paires de colorants FRET, faites correspondre la source lumineuse d’excitation au maximum d’absorption du colorant donneur.
    1. Allumez l’instrument. Ouvrez le logiciel d’acquisition, utilisez le logiciel de contrôle de l’instrument pour l’acquisition de données avec le spectromètre de fluorescence.
    2. Pour l’acquisition, sélectionnez TCSPC Decay, avec une plage de temps de 55 ns, un gain de 1 et 4096 canaux.
    3. Obtenir une fonction de réponse de l’instrument (IRF) à l’aide d’une solution de crémeuse non laitière ou d’une solution de diffusion commerciale et surveiller la diffusion à 490 nm. Ajustez le réglage de la fente et utilisez des filtres à densité neutre au besoin pour maintenir un taux de comptage suffisamment faible pour éviter l’empilementd’impulsions 5. Cliquez sur Accepter , puis sur Démarrer. Cela lancera l’acquisition.
      REMARQUE: Un taux de comptage maximal de 4000 cps est utilisé pour un taux de répétition de 180 kHz.
    4. Collectez l’IRF à 490 nm jusqu’à ce que le canal de crête ait un maximum de 20 000 comptes. Recueillir un IRF avant et après avoir mesuré chaque désintégration de fluorescence.
    5. Obtenir les désintégrations de fluorescence du donneur uniquement et des échantillons donneur-accepteur en surveillant l’émission de fluorescence à la longueur d’onde d’émission du donneur, 520 nm.
    6. Ajustez les paramètres de fente pour un taux de comptage maximal de 4000 cps ou moins. Les réglages de fente sont généralement de 15 à 20 nm pour les échantillons de protéines. Collectez la désintégration jusqu’à ce que 20 000 comptes soient obtenus dans le canal de pointe.
  4. Analyser la désintégration ou l’intensité de fluorescence (I) en fonction du temps (t) pour la durée de vie de la fluorescence (τ). Ajuster la désintégration à une somme d’exponentielles avec l’équation suivante :
    Equation 7
    où αI est le facteur préexponentiel de la ième composante et τI est la durée de vie. L’ajustement est reconvolved avec l’IRF pour correspondre à la désintégration de fluorescence. Jugez la qualité de l’ajustement à partir des paramètres réduits Χ2.

5. Analyse des données FRET

  1. Calculer l’efficacité FRET à partir de la diminution de l’intensité du donneur de l’échantillon donneur-accepteur par rapport au donneur uniquement avec l’équation suivante.
    Equation 8
    où FDA est l’intensité de fluorescence de l’échantillon donneur-accepteur et FD est l’intensité de fluorescence de l’échantillon donneur seulement au sommet de la fluorescence du donneur. Utilisez les zones intégrées des pics si les données sont bruyantes.
    1. Corriger toute différence d’étiquetage entre les échantillons donneur seulement et donneur-accepteur. Calculez les corrections en fonction du degré d’étiquetage du donneur comme suit.
      Equation 9
      où fDA est l’efficacité d’étiquetage du donneur dans l’échantillon donneur-accepteur et fD est l’efficacité d’étiquetage dans l’échantillon donneur seulement.
    2. Corriger toute contribution de la fluorescence de l’accepteur au spectre excité par le donneur par soustraction du spectre de la protéine accepteur seulement (étape 4.2) du spectre de la protéine donneur-accepteur.
      Equation 14
    3. Corriger les différences dans l’efficacité d’étiquetage de la protéine accepteur uniquement par rapport à l’échantillon de protéine donneur-accepteur, ce qui donne l’équation suivante pour le calcul de l’efficacité:
      Equation 10
      où fA désigne la quantité fractionnaire de l’étiquetage de l’accepteur. Cette équation comprend toutes les corrections dues à l’étiquetage des colorants et à la fluorescence des accepteurs.
    4. Calculez les distances FRET à partir des rendements à l’aide de l’équation suivante :
      Equation 11
      en utilisant la valeur R0 obtenue à l’étape 3.6.5.
    5. Calculer l’efficacité FRET en utilisant les durées de vie de fluorescence du donneur uniquement et des échantillons donneur-accepteur mesurés à l’étape 4.3.3-4.3.5 :
      Equation 12
    6. Utilisez la durée de vie pondérée en fonction de l’amplitude pour calculer les rendements FRET et comparer avec les résultats à l’état d’équilibre5.
      Equation 13
    7. Calculer la distance comme à l’étape 5.1.4 à partir des rendements déterminés par la durée de vie de la fluorescence. Comparez les valeurs à l’état d’équilibre et les valeurs résolues dans le temps pour les efficacités et les distances FRET et assurez-vous qu’elles sont à l’écart les unes des autres.

6. Cartographie des distances

  1. Utilisez les distances calculées pour mapper le site de liaison sur la structure tridimensionnelle. Calculer les distances et les erreurs pour toutes les paires de colorants et les emplacements examinés à l’aide de l’équation donnée à l’étape 5.1.4 et des valeurs R0 obtenues à l’étape 3.6.5 pour chaque paire FRET.
    1. Utilisez un programme de visualisation graphique 3D tel que PyMOL50 pour mapper les distances sur la structure (script donné dans le fichier supplémentaire). Les commandes du script peuvent être saisies directement dans la fenêtre de commande avec les informations de distance appropriées.
    2. Générez un shell pour chaque distance mesurée et l’erreur associée (Figure 3, Figure 4, Figures supplémentaires 1-3).
    3. Cartographiez la position à travers l’intersection des différentes coquilles (figures supplémentaires 1-3). Le site de liaison du peptide signal a été cartographié à travers les trois emplacements différents sur SecA et SecYEG et quatre emplacements différents sur le peptide signal (Figure 1).

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Representative Results

Cette étude s’est concentrée sur la détermination de l’emplacement du site de liaison des préprotéines sur SecA avant l’insertion de la préprotéine dans le canal SecYEG. Pour cartographier le site de liaison, des expériences FRET ont été réalisées entre différentes régions de la préprotéine et trois emplacements distincts sur les protéines SecA et SecYEG (Figure 1A-D). À partir des distances obtenues et des structures tridimensionnelles de SecA, SecYEG et de la préprotéine, l’emplacement du site de liaison des préprotéines a été prédit. Plutôt que d’utiliser trois entités distinctes (SecA, SecYEG et préprotéine) pour effectuer ces mesures, la séquence de signaux PhoA a été attachée à SecA par modification génétique après incorporation d’un liant Gly-Ser 2,3. Pour un marquage facile avec des colorants, des résidus de Cys ou des mutations ambrées ont été introduits aux résidus 2, 22, 35 et 45 dans la préprotéine PhoA (Figure 1E).

Identification des sites et étiquetage
Un site de liaison putatif pour la séquence de signaux avait déjà été identifié à l’aide de méthodes de cartographie FRETsimilaires 2,32. Ces études et d’autres avaient identifié le doigt à deux hélices (THF) et le domaine de réticulation des préprotéines comme des sites de liaison possibles du peptide signal avec une orientation suggérée dans une position parallèle au THF 33,51,52,53,54 (Figure 1F). Ainsi, l’identification des sites de marquage potentiels sur les protéines SecA et SecYEG a été effectuée en fonction de l’emplacement du site de liaison putative dans la structure cristalline SecA et SecYEG (représentée en vert sur la figure 1A-D). Trois sites ont été choisis pour trianguler la position du site de liaison putative, où essentiellement les trois sites forment un triangle autour du site de liaison putative. Comme le montre la figure 1, les trois sites se trouvaient dans la plage FRET du site de liaison (50-70 Å). La paire de colorants Alexa Fluor 488 (AF488) et Alexa Fluor 647 (AF647) a été choisie, car la valeur R0 de 55,7 Å36 correspond bien aux distances attendues entre les sites étiquetés et le site de liaison putatif assurant la précision de la mesure.

Les trois sites choisis pour le marquage, SecA37, SecA321 et SecY292 (représentés sous forme de sphères magenta, violette et cyan dans la figure 1A-D) sont situés dans tout le complexe protéique formant un triangle autour du site de liaison putative. Les trois sites ont été mutés séparément en résidus de Cys dans un mutant sans Cys pour s’assurer que seule la position correcte était étiquetée 2,37. Pour les expériences SecY292, les sites de préprotéines PhoA ont été marqués avec AF647 et le résidu SecY 292 a été marqué avec AF488 en utilisant la chimie du maléimide. Dans la protéine chimérique, les sites SecA37 et SecA321 ont été marqués avec AF647 et la préprotéine a été marquée avec AF488. Dans la protéine chimérique SecA-PhoA, les résidus 2, 22, 37 et 45 du segment des préprotéines PhoA ont chacun été mutés en un codon ambré dans des protéines individuelles. Les mutations du codon ambré ont permis l’introduction d’un acide aminé non naturel, la p-azidophénylalanine, à ces positions, qui ont ensuite été marquées avec l’AF488 en utilisant la chimie du clic39,40. Chaque mutation a été générée et marquée indépendamment pour assurer un marquage différentiel correct des composants protéiques. Le degré d’étiquetage a été déterminé pour toutes les protéines et devait généralement être de 50 % ou mieux pour procéder à l’échantillonnage.

Détermination de l’efficacité et des distances de transfert
Avant d’effectuer les mesures de transfert d’énergie, le rendement quantique du donneur, l’intégrale de chevauchement et les valeurs R0 ont été déterminés (étapes 3.4-3.6). Le rendement quantique du donneur a été mesuré par rapport au colorant, la fluorescéine, qui a un rendement quantique de 0,79 dans 0,1 M NaOH47. Les spectres d’absorption et d’émission de fluorescence ont été obtenus à une série de concentrations pour générer un graphique linéaire de l’absorption par rapport à l’intensité d’émission de fluorescence afin de déterminer le rendement quantique. Dans ces mesures, il est essentiel de mesurer l’absorption dans la plage linéaire (0,1-1,0) et toutes les mesures d’émission doivent être générées avec les mêmes réglages de fente. Comme ces valeurs sont utilisées pour déterminer les intégrales de chevauchement et les valeurs R0 , elles doivent être mesurées dans des conditions FRET. L’environnement local des protéines affecte profondément l’émission de colorants et, par conséquent, les rendements quantiques des donneurs doivent être mesurés pour chacun des sites étudiés. Nous notons que les sites sur SecA et SecYEG influencent les valeurs R0 plus fortement que ceux sur la partie PhoA de la chimère. Pour les paires de colorants ayant le même site SecA ou SecYEG, les valeurs R0 sont généralement à moins de 5 Å les unes des autres; alors que les valeurs R0 peuvent différer jusqu’à 20 Å pour les deux emplacements SecA différents (résidus 37 vs 321), ce qui souligne l’importance de déterminer les valeurs R0 pour chaque paire de colorants (tableau 1).

Le calcul de R0 suppose que les colorants donneurs et accepteurs tournent librement et que le degré auquel les colorants ne tournent pas contribue à l’incertitude globale de la mesure. Pour tenir compte de manière appropriée du mouvement relatif des colorants et de leurs orientations, des mesures d’anisotropie de fluorescence à l’état d’équilibre ont été effectuées sur tous les colorants donneurs et accepteurs dans les différentes positions d’étiquetage. Ces valeurs, qui se situaient entre 0,10 et 0,21, ont été utilisées pour calculer l’erreur associée aux mesures de distance 2,3,48. Les valeurs d’anisotropie relativement élevées observées pour les colorants donneurs et accepteurs correspondent à une réduction de la rotation des colorants, ce qui est incompatible avec l’hypothèse de rotation libre. L’absence de rotation libre génère une erreur de 19% à 25% dans les calculs de distance. Comme le montre le tableau 1, cela a conduit à une incertitude moyenne dans les distances mesurées d’au plus ± 15 Å. Lors de la cartographie des distances FRET, ces incertitudes dans les mesures de distance sont une considération importante, comme indiqué ci-dessous.

La distance calculée entre les paires donneur-accepteur est basée sur la relation entre l’efficacité et la distance, dans laquelle une efficacité plus élevée est indicative de paires donneur-accepteur séparées par une distance plus courte. Pour déterminer l’efficacité fret, les spectres d’émission de fluorescence excités à la longueur d’onde d’excitation du donneur (488 nm) sont obtenus sur des échantillons de donneur seulement et d’accepteur de donneur. En règle générale, une réduction de l’intensité des émissions des donneurs signifie la présence d’un transfert d’énergie (étape 5.1). La figure 1G représente les spectres donneur-accepteur du résidu SecA 37 avec le résidu 2 ou 22 de la chimère PhoA. Le résidu SecA37 est étiqueté avec AF647 ou le colorant accepteur, et les résidus PhoA sont étiquetés avec AF488 ou le colorant donneur. À l’une ou l’autre position, la fluorescence du donneur est réduite et une légère augmentation de l’intensité de la fluorescence de l’accepteur peut être observée dans les échantillons donneur-accepteur. Étant donné que l’excitation se fait à la longueur d’onde d’excitation du donneur de 488 nm, ce qui n’excite pas directement l’accepteur, toute fluorescence d’accepteur observée résulte d’un transfert d’énergie. Ainsi, la diminution de l’intensité du donneur et l’augmentation concomitante de l’intensité de l’accepteur résultent du transfert d’énergie entre les deux colorants. De manière significative, l’intensité de fluorescence du donneur est plus élevée pour la position PhoA2 (bleu) par rapport à la position PhoA22 (jaune) en présence de l’accepteur. Cette différence relative dans la diminution de l’intensité du donneur indique que le transfert d’énergie entre le résidu PhoA2 et le résidu SecA37 est plus faible que le transfert entre les résidus PhoA22 et SecA37, ce qui implique que le résidu PhoA2 est situé plus loin de SecA37 que PhoA22. Les distances sont déterminées à partir de la relation entre l’efficacité et les valeurs R0 (étape 5.1.4).

Étant donné que les mesures de fluorescence à l’état d’équilibre pouvaient représenter une moyenne de deux distances ou plus, nous avons également effectué des mesures de fluorescence résolues dans le temps. Pour ces expériences, la durée de vie du colorant donneur est mesurée en présence et en absence de l’accepteur (Figure 1G). S’il y avait deux processus de transfert d’énergie distincts contribuant à l’efficacité de fluorescence mesurée à l’état d’équilibre, ils seraient observés comme des durées de vie discrètes, à condition qu’ils puissent être résolus dans la résolution temporelle de l’instrument. Pour améliorer la capacité de résoudre les durées de vie, 10 000 comptes ou plus devraient être recueillis au sommet; toutefois, la hauteur de crête ou le nombre de canaux de crête doit être équilibré avec le moment de l’acquisition et les dommages potentiels à l’échantillon. Les mesures résolues dans le temps ont donné des durées de vie uniques pour chaque paire donneur-accepteur compatibles avec une seule orientation ou distance entre les colorants. Nous notons que de petites différences dans la distance observées dans les zones révélées par notre technique de cartographie FRET ne conduiraient pas à des durées de vie résolvables dans notre système. De plus, les rendements déterminés par les mesures de fluorescence résolues dans le temps étaient en bon accord avec ceux déterminés à partir des mesures à l’état d’équilibre, ce qui confirme en outre que les rendements mesurés ne proviennent que d’une seule distance entre les paires de colorants3.

Cartographie des distances FRET sur la structure en 3 dimensions
Les mesures de transfert d’énergie de résonance fournissent suffisamment d’informations de distance pour identifier le site de liaison et l’orientation de la séquence de signaux sur SecA. Les trois emplacements sur SecA et SecYEG ainsi que les quatre positions sur la région PhoA de la chimère SecA-PhoA fournissent les 12 distances différentes utilisées pour cartographier le site de liaison (tableau 1). Les douze distances ont été cartographiées sur la structure cocristalline tridimensionnelle des rayons X du complexe Thermotoga maritima SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN) pour identifier le site de liaison de la séquence de signaux33. La structure du complexe SecA-SecYEG est similaire à celle observée chez E. coli , comme en témoigne une étude de photoréticulation in vivo 55.

Nous utilisons les résidus de début (PhoA2) et de fin (PhoA22) de la séquence de signaux PhoA dans la chimère SecA-PhoA pour illustrer comment les emplacements des résidus ont été identifiés sur le complexe SecA-SecYEG. Comme le transfert d’énergie peut se produire dans toutes les directions, les distances FRET et les erreurs associées décrivent une coquille sphérique, avec l’un des emplacements de colorant de la paire donneur-accepteur désigné comme le centre. Dans cette étude, les résidus SecA37, SecA321 et SecY292 forment les centres de trois coquilles sphériques qui décrivent l’emplacement du résidu PhoA2 de la séquence de signaux. La figure 3 montre la visualisation des régions qui se chevauchent à partir des trois emplacements distincts, SecA37 (magenta), SecA321 (violet) et SecY292 (cyan). Seule une partie de chaque coquille FRET recoupe la structure protéique, et les résidus et l’épine dorsale qui se trouvent dans cette coquille sont mis en évidence. Ainsi, les régions protéiques à l’intérieur de la coquille définies par la distance SecA37-PhoA2 sont représentées en magenta (Figure 3A,E), tandis que les régions définies par les coquilles SecA321-PhoA2 et SecY292-PhoA2 sont représentées en violet (Figure 3B,F) et en cyan (Figure 3C,G), respectivement. Le site de liaison putatif, constitué principalement du doigt à deux hélices, est représenté en vert.

Comme le montre la figure 3, chacune de ces coquilles FRET définit une section relativement importante du complexe protéique. Pour les trois emplacements, la coque FRET croise le site de liaison putatif; cependant, pour le résidu SecA321, par exemple, la zone intersectée est plus petite et se trouve vers les extrémités des doigts avec un chevauchement important avec le domaine de l’échafaudage hélicoïdal. L’intersection ou la zone commune des trois coques FRET (Figure 3D,H), définit l’emplacement du résidu PhoA2. Cette surface est considérablement plus petite que chaque coque FRET et ne comprend qu’une petite partie du THF avec une grande contribution de l’échafaudage hélicoïdal. Les scripts utilisés pour générer les coquilles FRET et les zones croisées pour le programme de visualisation moléculaire, PyMOL, sont donnés dans les informations supplémentaires. Des parties des coquilles sont visualisées sous forme de points roses sur le complexe SecA-SecYEG dans les figures supplémentaires 1 à 3.

Une stratégie similaire a été utilisée pour identifier l’emplacement du résidu de PhoA22. Les coques FRET définies par les distances FRET PhoA22 (Figure 4A-C,E-G) décrivent une surface plus petite par rapport au résidu PhoA2 (Figure 4D,H vs.Figure 3D,H). Nous interprétons cette différence comme suggérant que le résidu de PhoA2 et la région associée sont plus flexibles et labiles que phoA22. De manière significative, la zone attribuée au résidu phoa22 est située plus près de la pointe du THF et de l’embouchure du canal SecYEG, avec des régions de SecY identifiées dans la zone commune (Figure 3D, H). Les trois appariements de colorants identifient les régions ainsi que le site de liaison putatif; cependant, les zones communes intersectées centrent l’emplacement PhoA22 (Figure 4D,H) à l’extrémité opposée du THF par rapport à l’emplacement PhoA2 (Figure 3D,H). Ces résultats suggèrent que la séquence de signaux de la préprotéine, qui s’étend des résidus 2 à 22, se trouve le long du THF dans un état relativement peu structuré. Ce résultat est cohérent avec des études antérieures suggérant que la séquence du signal se lie à la protéine le long du THF dans un état étendu et que l’extrémité C-terminale de SecA dans la structure cristalline de B. subtilis modélise essentiellement la structure du peptide signal et occupe le même emplacement (représenté en rouge Figure 1F)2,26 . Nous avons utilisé une approche similaire pour identifier deux emplacements dans la région mature précoce (résidus 37 et 45) de la chimère préprotéinale SecA-PhoA afin de mieux définir la liaison et l’orientation de la séquence de signaux et de la région mature précoce, comme indiqué ci-dessous. Dans d’autres études, les distances FRET ont été utilisées efficacement pour affiner une structure existante ou un modèle dérivé de la simiulation de la dynamique moléculaire 18,19,56; nous n’avons pas été en mesure de le faire, car il n’existe aucune structure pour la séquence de signaux liée à SecA.  

Figure 1
Figure 1 : Sites de marquage dans le complexe SecA-SecYEG avec des spectres FRET représentatifs. (A-D) Quatre vues différentes de la structure cocristalline SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN)33 dans lesquelles les sites de marquage de SecA37, SecA321 et SecY292 sont représentés sous forme de sphères magenta, violette et cyan, respectivement. A-C sont des vues latérales du complexe et D est une vue de dessus. SecA est représenté en gris clair, SecYEG est affiché en gris foncé et le site de liaison putatif, le THF, est indiqué en vert. (E) Schéma de la construction chimère SecA-PhoA, qui relie la protéine SecA à la préprotéine PhoA via un liant Ser-Gly (non dessiné à l’échelle). Les sites d’étiquetage sur la partie PhoA de la chimère sont donnés en bleu, vert, jaune et rouge, correspondant aux résidus 2, 22, 37 et 45. (F) Diagramme ruban de la structure cristalline de la protéine B. subtilis SecA (PDBID: 1M6N) coloré par domaine où les domaines de liaison aux nucléotides 1 et 2 sont représentés en bleu et bleu clair, respectivement, le domaine de réticulation des préprotéines est représenté en or, l’hélice centrale en vert, le doigt à deux hélices en cyan, le domaine alaire hélicoïdal en vert foncé et le liant terminal C en rouge26 . Le C-terminus non structuré sert de modèle du peptide de signal PhoA lié basé sur une étude de cartographie FRET précédente2. (G) Spectres de fluorescence à l’état d’équilibre des échantillons donneur uniquement et donneur-accepteur de la paire FRET SecA37-AF647 et PhoA2-AF488 et de la paire FRET SecA37-AF647 et PhoA22-AF488. La réduction de l’intensité du donneur pour l’échantillon donneur-accepteur est révélatrice d’un transfert d’énergie. Un plus grand transfert d’énergie se produit à partir de PhoA22 par rapport au site PhoA2 en fonction de la diminution de l’intensité du donneur. (H) Spectres de désintégration du donneur de fluorescence résolu dans le temps uniquement (magenta) et donneur-accepteur (magenta léger) de la paire FRET SecA37-AF647 et PhoA22-AF488. La fonction de réponse de l’instrument est indiquée en gris. Le complexe donneur-accepteur donne une désintégration plus courte et par conséquent une durée de vie plus rapide compatible avec le transfert d’énergie. Toutes les structures moléculaires ont été générées avec le fichier PDB indiqué et PyMOL50. La figure 1E-H a été modifiée à partir de Zhang et al.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Interface utilisateur du programme FluorEssence. (A) La fenêtre d’ouverture est représentée par un cercle autour du M rouge. Il faut cliquer dessus pour connecter le programme au fluoromètre. (B) La fenêtre de configuration de l’expérience illustre les différentes zones (monos, détecteurs, accessoires) où les paramètres pertinents du balayage sont saisis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Coques de distance FRET déterminées pour la position SecA-PhoA2. Les coques de distance FRET construites à partir des distances FRET et les incertitudes associées (tableau 1) sont représentées sur le complexe SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (A-C) Coques de distance FRET pour l’emplacement PhoA2 construites avec SecA37 (magenta), SecA321 (violet) et SecY292 (cyan), respectivement en position centrale. Les coquilles sont colorées en fonction du résidu central. (D) L’intersection des trois coques FRET définit l’emplacement de PhoA2, représenté en bleu. (E-H) Les vues sont tournées d’environ 180 ° à partir de A-D. Toutes les structures moléculaires ont été générées avec le fichier PDB indiqué et PyMOL50. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Coques de distance FRET déterminées pour la position SecA-PhoA22. Les obus de distance FRET construits à partir des distances FRET et des incertitudes associées (tableau 1) sont représentés sur le complexe SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (A-C) Coques de distance FRET pour l’emplacement PhoA22 construites avec SecA37 (magenta), SecA321 (violet) et SecY292 (cyan), respectivement en position centrale. Les coquilles sont colorées en fonction du résidu central. (D) L’intersection des trois coques FRET définit l’emplacement de PhoA22, représenté en jaune. (E-H) Les vues sont tournées d’environ 180 ° à partir de A-D. Toutes les structures moléculaires ont été générées avec le fichier PDB indiqué et PyMOL50. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Emplacements cartographiés fret de PhoA2, PhoA22, PhoA37 et PhoA45 projetés sur la structure cocristalline de B. subtilis SecA -Geobacillus thermodenitrificans SecYE (PDBID : 5EUL). (A) Coloration de SecA-SecYE comme dans la figure 1. Le substrat peptidique OmpA inséré à l’extrémité du THF est représenté en rose. Les régions cartographiées FRET ont été générées en présence d’ATP-γS, avec PhoA2 en bleu, PhoA22 en vert, PhoA37 en jaune et PhoA45 en rouge. Les régions de chevauchement sont indiquées en olive (PhoA22 et PhoA37) et en orange (PhoA37 et PhoA45). Le substrat peptidique (résidus 749-791, cyan) a été excisé de la structure d’origine et modélisé dans la région de liaison putative sans aucune altération de la structure (encerclée en rouge). (B) Vue agrandie du substrat peptidique modélisé. Les résidus 2 (Lys), 22 (Tyr) et 37 (Gly) du substrat peptidique OmpA sont représentés sous forme de bâton en bleu, vert et jaune, respectivement. Ces résidus dans les peptides modélisés présentent un excellent accord avec les emplacements cartographiés FRET prédits. Pour plus de clarté, le nanocorps dans la structure d’origine a été omis. Ce chiffre a été modifié à partir de Zhang et al.3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

site étiqueté sur le complexe SecA-PhoA-SecYEG Site marqué sur la portion peptidique PhoA de SecA-PhoA Chimera
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 PhoA37-AF488 PhoA45-AF488
SecA 37-AF467-Phoa
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
Efficacité FRET 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
distance 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SecA321-AF647-Phoa
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
Efficacité FRET 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
distance 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 PhoA22-AF647 PhoA37-AF647 PhoA45-AF647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
Efficacité FRET 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
distance 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
adapté de la référence 3.
Les valeurs R0 données en angströms ont été calculées comme décrit dans le texte
L’efficacité FRET a été calculée à partir de la diminution de l’intensité de fluorescence du donneur en présence de l’accepteur comme décrit. L’erreur est signalée comme le SD à partir de trois mesures indépendantes.
Les distances donneur-accepteur (R) sont données en angströms et calculées comme décrit dans le texte. L’erreur signalée résulte d’un examen de l’erreur expérimentale et de celle découlant de l’orientation des colorants.  L’orientation du colorant est estimée à partir de l’anisotropie de fluorescence à l’état d’équilibre

Tableau 1 : Efficacité et distances de transfert déterminées pour le complexe SecA-PhoA-SecYEG. Les rendements FRET, les distances et les valeurs R0 sont donnés pour les 12 distances utilisées pour cartographier le site de liaison des préprotéines.

Figure supplémentaire 1 : Coque de distance FRET, représentée en points roses, déterminée pour le résidu SecA37 et le résidu PhoA 37 sur le complexe SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A est représenté en gris clair, SecYEG est représenté en gris foncé et le résidu SecA37 est représenté en magenta. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Coque de distance FRET, représentée en points roses, déterminée pour le résidu SecA321 et le résidu PhoA 37 sur le complexe SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A est représenté en gris clair, SecYEG est montré en gris foncé et le résidu SecA321 est représenté en violet. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Coque de distance FRET, représentée en points roses, déterminée pour le résidu SecY292 et le résidu PhoA 37 sur le complexe SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A est représenté en gris clair, SecYEG est montré en gris foncé et le résidu SecY292 est montré en cyan. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Grâce à l’utilisation de la méthodologie de cartographie FRET, nous avons identifié le site de liaison de la séquence de signaux sur la protéine SecA. Il est important de noter que la présence d’une structure cristalline 3D du complexe a grandement facilité notre étude. La force de cette méthodologie de cartographie réside dans la capacité d’utiliser une structure existante pour identifier les emplacements à étiqueter. Cette méthodologie ne peut pas être utilisée pour déterminer une structure 3D; toutefois, la détermination des élémentsstructurels 56, le raffinement d’une structure existante49, la détermination d’un emplacement de site de liaison 2,32 ou l’élucidation du mouvement dynamique57 sont toutes des applications possibles de cette méthode.

Dans le complexe SecYEG-SecA-PhoA, les trois sites d’étiquetage forment un triangle autour du site de liaison putatif (Figure 1). L’utilisation de plusieurs mesures de distance entre les sommets de ce triangle et le même résidu affine les informations de localisation de la même manière que les méthodes de navigation GPS. Trois sites, SecA37, SecA341 et SecY292, ont été identifiés sur SecA et SecY ainsi que quatre sites, PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 dans la séquence de signaux et la région mature précoce de la préprotéine pour donner un total de 12 distances pour cartographier l’emplacement du peptide signal (tableau 1). Il est important de noter que pour améliorer la précision des mesures de distance, les sites d’étiquetage doivent être situés dans des régions relativement statiques de la protéine, telles que des éléments de structure secondaire plutôt que des boucles. En outre, les sites devraient également être situés dans des endroits relativement accessibles au solvant pour faciliter et accroître l’efficacité de l’étiquetage. Dans le complexe SecA-PhoA-SecYEG, l’exécution de mesures de distance entre les sites triangulaires ou les sommets et les résidus dans le substrat de liaison était suffisante pour localiser les résidus dans le substrat de liaison sur une zone relativement petite (Figure 3D,H et Figure 4D,H). L’identification de la zone intersectée à partir des mesures de distance multiples affine considérablement l’emplacement par rapport à celui de la mesure de distance unique, comme le montrent les figures 3 et 4. Ainsi, lors de l’utilisation de cette méthode, la mesure de plusieurs distances est fortement recommandée. Bien que cette méthode puisse identifier des régions de molécules impliquées dans la liaison, par exemple, elle ne fournit pas d’informations structurelles précises; ces informations sont mieux obtenues à partir d’autres méthodes structurelles telles que les rayons X, la RMN et la cryo-EM. Les distances FRET peuvent être utilisées pour affiner efficacement une structure existante18,19 ou un modèle, dans ce cas, ce qui n’était pas possible car il n’existe aucun modèle de la séquence de signaux lié à SecA.

Pour s’assurer que l’étiquetage des colorants n’a lieu qu’aux endroits souhaités et que les mesures de distance FRET sont précises, l’utilisation de la mutagénèse pour l’étiquetage est préférable. La génération d’un mutant sans Cys nécessite une mutation relativement conservatrice des résidus de Cys en Ser ou en résidus similaires dans la protéine de type sauvage en utilisant des méthodes de mutagénèse dirigées par site. Dans la présente étude, des mutations de Cys ont été introduites dans des versions sans Cys de SecA et SecYEG pour l’étiquetage37. L’activité de la protéine mutante a été vérifiée par un test de croissance suivi d’un test in vitro d’ATPase vert malachite41,42. Les tests d’activité pertinents dépendent de la fonction de la protéine, par exemple pour les protéines de liaison à l’ADN, un test de liaison à l’ADN serait approprié58. Le fait de ne pas assurer l’étiquetage à un seul endroit peut entraîner l’étiquetage de plus d’un site avec le même colorant, ce qui complique considérablement les déterminations de distance. Ainsi, l’introduction d’une deuxième étiquette sur la même protéine peut se faire par l’incorporation d’acides aminés non naturels par mutagénèse dirigée par site. Nous avons utilisé cette méthodologie pour étiqueter la chimère SecA-PhoA à des endroits distincts des résidus de Cys en introduisant l’acide aminé non naturel, la p-azidophénylalanine et en marquant avec la chimie du clic39,40.

Une autre considération importante de cette méthode est le choix des colorants utilisés et la valeur R0 associée. Après identification des sites d’étiquetage potentiels, les distances à mesurer peuvent être estimées à partir de la structure 3D. Avec ces informations, les chercheurs peuvent choisir des paires de colorants avec des valeurs R0 qui couvrent la plage souhaitée de distances attendues. Par exemple, la paire de colorants AF488-AF647 a un R0 calculé de 55,7 Å, ce qui fournit une bonne plage pour les sites d’étiquetage situés à environ 40-75 Å du site de liaison putative. Bien que les valeurs R0 calculées à l’étape 2.2 soient utiles pour choisir la paire de colorants à utiliser pour votre système, la fixation des colorants à la protéine peut modifier leurs propriétés de manière significative. Pour plus de précision, les valeurs R0 doivent être calculées à partir d’expériences in situ effectuées avec des protéines marquées (étapes 3.1 à 3.6.5).

La mesure de l’efficacité du transfert peut être effectuée soit en surveillant l’émission de fluorescence à l’état d’équilibre et en observant soit une diminution de l’émission du donneur, soit une augmentation de l’émission de l’accepteur. Bien que l’observation des deux effets soit souhaitable, l’efficacité peut être calculée à partir de l’un ou l’autre comme décrit 5,8. L’efficacité peut également être calculée à partir de la diminution de la durée de vie du donneur dans l’échantillon donneur-accepteur par rapport à l’échantillon du donneur seulement. La détermination de l’efficacité par plus d’une méthode est recommandée, en particulier l’utilisation de méthodes résolues dans le temps pour établir l’homogénéité relative des efficiences mesurées.

La méthode de cartographie nous a également permis de déterminer l’orientation relative de la séquence de signaux et les régions matures précoces de la préprotéine PhoA par rapport à SecA et au site de liaison putatif. Une étude cristalline à rayons X SecA-SecYEG et une étude cryo-EM ultérieure ont fourni des éclaircissements concernant la structure de la séquence de signaux et la région mature précoce de la préprotéine par rapport au canal et SecA34,35. Dans la structure à rayons X, les résidus 1 à 41 de la préprotéine OmpA ont été attachés à l’extrémité du doigt à deux hélices et visualisés dans une structure en épingle à cheveux dans le canal (en rose, figure 5). Les emplacements des quatre résidus de PhoA dans la chimère SecA-PhoA ont été cartographiés sur cette structure en utilisant le même protocole que celui décrit ci-dessus. Comme le montre la figure 5, l’emplacement des résidus de PhoA37 et de PhoA45 (jaune, orange, rouge) se situe entre PhoA2 et PhoA22, PhoA45 étant plus proche de PhoA2. Ces résultats, en particulier l’emplacement de PhoA45, suggéraient que la préprotéine PhoA formait une structure en épingle à cheveux.

Pour valider davantage notre site de liaison identifié par FRET, nous avons effectué une comparaison de nos emplacements cartographiés avec celui de la préprotéine OmpA, en excisant la structure des préprotéines 41 résidus du canal et en la modélisant dans les régions définies par la cartographie FRET (Figure 5, cyan). Sans aucune altération de la structure des rayons X des préprotéines, nous constatons que les emplacements des résidus 2, 22 et 37 (représentés en bleu, vert et jaune) sur la structure excisée du fragment de préprotéine OmpA correspondent remarquablement bien aux emplacements cartographiés FRET (Figure 5B) et suggèrent que l’épingle à cheveux se forme avant l’entrée du canal. La préprotéine OmpA se termine au résidu 41 dans la structure cristalline des rayons X; cependant, le terminal C de SecY, qui n’est pas structuré, fournit une indication de l’emplacement possible de PhoA45. Dans notre structure modélisée, la boucle en épingle à cheveux se trouve à l’embouchure du canal, prête à faciliter la translocation de la préprotéine à travers la membrane. Ainsi, dans cet exemple, la méthodologie de cartographie FRET améliore les informations existantes de la structure statique SecA-SecYEG, en fournissant un indice du mouvement dynamique nécessaire à la translocation des protéines à travers la membrane. Bien qu’elle ne convienne pas aux déterminations de structure de novo , si des informations structurelles en 3 dimensions sont disponibles, la méthodologie de cartographie FRET peut approfondir la compréhension actuelle des relations structure-fonction, grâce à l’élucidation des sites de liaison et des mouvements dynamiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la subvention R15GM135904 des National Institutes of Health (attribuée à IM) et la subvention GM110552 des National Institutes of Health (attribuée à DBO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

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Biochimie Numéro 181 fluorescence transfert d’énergie SecA translocation de protéines cartographie FRET
Cartographie du transfert d’énergie par résonance de Förster : une nouvelle méthodologie pour élucider les caractéristiques structurelles mondiales
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Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

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