Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

Çalışma, etiketleme alanlarının seçimi, boya seçimi, elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere FRET haritalama metodolojisini detaylandırmaktadır. Bu metodoloji, protein sistemlerinde bağlanma bölgelerini, konformasyonel değişiklikleri ve dinamik hareketleri belirlemede etkilidir ve mevcut 3-B yapısal bilgilerle birlikte gerçekleştirilirse en yararlı olanıdır.

Abstract

Förster rezonans enerji transferi (FRET), in vitro ve hücrelerdeki biyomoleküller arasındaki mesafeleri başarılı bir şekilde ölçmek için kullanılan floresan tabanlı bir yöntemdir. FRET'te, floresan yoğunluğundaki veya ömründeki değişikliklerle ölçülen enerji transferinin verimliliği, iki floresan molekülü veya etiketi arasındaki mesafe ile ilgilidir. Dinamiklerin belirlenmesi ve mesafelerden gelen konformasyonel değişiklikler, bu yöntemin biyolojik sistemlere uygulanmasına sadece birkaç örnektir. Belirli koşullar altında, bu metodoloji dinamikler, esneklik ve bağlanma yüzeylerine adaptasyon hakkında bilgi sağlayarak mevcut X-ışını kristal yapılarına katkıda bulunabilir ve geliştirebilir. Bir bağlanma yerinin tanımlanması veya dimer alt birimlerinin oryantasyonları yoluyla yapısal özellikleri aydınlatmak için FRET ve ilişkili mesafe belirlemelerinin kullanımını açıklıyoruz. Etiketleme alanlarının akıllıca seçilmesi ve sıklıkla çoklu etiketleme stratejilerinin kullanılmasıyla, bir protein-DNA kompleksindeki ve SecA-SecYEG protein translokasyon sistemindeki küresel yapısal özellikleri belirlemek için bu haritalama yöntemlerini başarıyla uyguladık. SecA-SecYEG sisteminde, preprotein bağlanma bölgesini tanımlamak ve bağlı sinyal dizisi bölgesinin yerel konformasyonunu belirlemek için FRET haritalama yöntemlerini kullandık. Bu çalışma, uygun etiketleme alanlarının belirlenmesi, doğal olmayan amino asit kalıntıları dahil olmak üzere olası etiketlerin tartışılması, etiketleme prosedürleri, ölçümlerin nasıl yapılacağı ve verilerin yorumlanması dahil olmak üzere FRET haritalama çalışmalarının gerçekleştirilmesi için gereken adımları özetlemektedir.

Introduction

Proteinler için, 3 boyutlu (3-B) yapısal bilgi ile birlikte dinamiklerin aydınlatılması, biyomoleküler sistemlerin yapı-işlev ilişkilerinin daha iyi anlaşılmasına yol açar. X-ışını kristalografisi ve kriyojenik elektron mikroskobu gibi yapısal yöntemler, statik bir yapı yakalar ve genellikle biyomolekül bağlanmasının ve dinamiğinin yönlerini aydınlatmak için çoklu yapıların belirlenmesini gerektirir1. Bu makalede, bağlama siteleri veya bağlama etkileşimleri gibi genel yapısal öğeleri eşlemek için potansiyel olarak daha geçici ve statik yöntemlerle daha az kolay yakalanan çözüm tabanlı bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji için güçlü aday sistemler, 3 boyutlu bir yapının daha önce X-ışını kristalografisi, NMR spektroskopisi veya diğer yapısal yöntemlerle belirlendiği sistemlerdir. Bu durumda, protein genel sekretuar yolunda merkezi bir oyuncu olan SecA-SecYEG kompleksinin X-ışını kristal yapısından yararlanarak, preproteinin membran2 boyunca taşınmasından önce Förster rezonans enerji transferini (FRET) kullanarak bir sinyal peptid bağlanma bölgesinin yerini haritalandırıyoruz. Biyolojik sistemin genetik modifikasyonlar yoluyla manipülasyonu, 3-D yapısı hakkındaki bilgimizle birleştiğinde, kanal 3'e yerleştirilmeden hemen önce sinyal dizisinin ve erken olgun bölgenin konformasyonunun belirlenmesini sağladı.

FRET, enerjinin bir molekülden (donör) diğerine (alıcı) radyasyonsuz transferini, mesafeye bağlı bir şekilde,uzay 4,5 boyunca içerir. Bu transferin etkinliği, donördeki bir azalma veya alıcı floresan yoğunluğundaki bir artış ile izlenir. Enerji transferinin verimliliği şu şekilde tanımlanabilir:

E = R 0 6/(R0 6 + R 6)

R0 değerinin, aktarımın% 50 verimli olduğu mesafe6. Bu teknik daha önce moleküler bir cetvel olarak tanımlanmıştır ve donör-alıcıboyaların 4,7,8,9 kimliğine bağlı olarak 2.5-12 nm aralığındaki mesafelerin belirlenmesinde etkilidir. Donör floresan yoğunlukları ve alıcılı veya alıcısız ömürleri, transfer verimliliklerinin ve dolayısıylamesafelerin 5,8 olarak belirlenmesine izin verir. Teknolojinin mevcudiyeti, yöntemin hassasiyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle, FRET ayrıca tek moleküllü floresan spektroskopisi ve konfokal mikroskopi6 gibi alanlarda geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Yeşil floresan proteini gibi floresan proteinlerin ortaya çıkışı, hücre içi dinamiklerin ve canlı hücre görüntülemenin gözlemlenmesini nispeten kolay hale getirmiştir10,11. Bunlar gibi birçok FRET uygulaması bu sanal sayıda ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

Bu çalışmada, yapısal detayları belirlemek için mesafe değerlerini elde etmek için FRET ölçümlerinin kullanımına özellikle odaklanıyoruz. Daha önce, FRET ölçümleri, protein 12,13,14'e, proteinlerin iç dinamiklerine ve protein bağlanma etkileşimlerine15,16,17 bağlandığında DNA moleküllerinin konformasyonunu belirlemek için etkili bir şekilde kullanılmıştır. Bu yöntemin avantajları, nispeten düşük miktarda malzemeye sahip bir çözeltide esnek ve dinamik yapısal elemanları belirleme yeteneğinde yatmaktadır. Önemli bir şekilde, bu yöntem mevcut yapısal bilgilerle birlikte kullanıldığında özellikle etkilidir ve 3 boyutlu yapı belirleme aracı olarak kullanılamaz. Yöntem, çalışmanın genellikle hesaplamalı simülasyon18,19 ile birleştirilen mevcut yapısal bilgilere dayanması durumunda yapının en iyi içgörüsünü ve iyileştirilmesini sağlar. Burada, kararlı durum ve zaman çözümlü FRET ölçümlerinden elde edilen mesafelerin kullanımı, genel sekretuar yolu3'teki ana proteinler olan SecA-SecYEG kompleksinin mevcut bir kristalografik yapısı üzerinde, yeri bilinmeyen bir bağlanma bölgesini haritalamak için tanımlanmıştır.

Prokaryotlardan ökaryotlara ve arkelere kadar oldukça korunmuş bir sistem olan genel salgı yolu, proteinlerin hücre içindeki fonksiyonel konumlarına membran boyunca veya içine taşınmasına aracılık eder. Çalışmamızda kullanılan organizma olan E. coli gibi Gram-negatif bakteriler için, proteinler iç zar boyunca periplazmaya yerleştirilir veya yer değiştirir. Bakteriyel SecY kanal kompleksi (translokon olarak adlandırılır), tipik olarak N-terminus20,21'de bulunan bir sinyal dizisi aracılığıyla hücredeki doğru konumuna yönlendirilen yeni sentezlenmiş proteini translokasyona yerleştirmek için diğer proteinlerle koordine olur. Periplazmaya bağlı proteinler için, ATPaz SecA proteini, ribozomun çıkış tüneli ile ve yaklaşık 100 kalıntı çevrildikten sonra preprotein ile ilişkilidir22. SecB şaperon proteini ile birlikte, preproteini açılmamış bir durumda tutar. SecA, SecYEG translokonuna bağlanır ve birçok ATP hidrolizi döngüsü boyunca, membran23,24 boyunca protein taşınmasını kolaylaştırır.

SecA, sitozolik ve membrana bağlı formlarda bulunan çok alanlı bir proteindir. Sitosoldeki homodimerik bir protein olan SecA, bir preprotein bağlanma veya çapraz bağlanma alanı25, iki nükleotid bağlayıcı alan, bir sarmal kanat alanı, bir sarmal iskele alanı ve iki sarmal parmak (THF) 26,27,28,29'dan oluşur (Şekil 1). SecA-SecYEG kompleksinin önceki kristalografik çalışmalarında, THF'nin yeri, protein translokasyonunda aktif olarak yer aldığını ve daha sonra sinyal peptidi ile çapraz bağlanma deneylerinin bu bölgenin protein translokasyonundaki önemini daha da ortaya koyduğunu ileri sürdü30,31. FRET haritalama metodolojisini kullanan önceki çalışmalar, eksojen sinyal peptitlerinin SecA 2,32'nin bu bölgesine bağlandığını göstermiştir. SecYEG kanalına yerleştirilmeden önce sinyal dizisinin ve preproteinin erken olgun bölgesinin konformasyonunu ve yerini tam olarak anlamak için, erken olgun bölgenin sinyal dizisinin ve kalıntılarının bir Ser-Gly bağlayıcı aracılığıyla SecA'ya bağlandığı bir protein kimera oluşturuldu (Şekil 1). Bu biyolojik olarak uygulanabilir yapı kullanılarak, preproteinin sinyal dizisinin ve erken olgun bölgesinin THF'ye paralel bir şekilde bağlandığıgösterilmiştir 2. Daha sonra, FRET haritalama metodolojisi, aşağıda açıklandığı gibi SecYEG'nin varlığında sinyal dizisinin ve erken olgun bölgenin konformasyonunu ve yerini aydınlatmak için kullanılmıştır.

SecA-SecYEG kompleksi33,34,35'in 3-D yapısı ve bağlanma yerinin olası konumu hakkında bilgi, bireysel FRET mesafelerinin kesişiminin bağlanma yeri yerini tanımladığı yerlere bağışçı-alıcı etiketlerini makul bir şekilde yerleştirmemize izin verdi. Bu FRET haritalama ölçümleri, sinyal dizisinin ve preproteinin erken olgun bölgesinin, ucu SecYEG kanalının ağzında bulunan bir saç tokası oluşturduğunu ve saç tokası yapısının kanal yerleştirmeden önce şablonlandığını gösterdiğini ortaya koymuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Etiketleme alanlarının seçimi

  1. Mevcut protein yapıları üzerindeki varsayılan bağlanma bölgesini üçgenleştirmek için en az üç potansiyel etiketleme bölgesi tanımlayın. Bu durumda, genetik füzyon yoluyla SecA'ya bağlı SecA, SecYEG ve preprotein tanımlandı2.
    1. Varsayılan bağlanma bölgesinin 25-75 şiçindeki etiketleme bölgelerini seçin ve proteinin nispeten statik bölgelerinde, mesafe kullanılacak spesifik FRET boya çiftini belirleyecektir36. Etiketleme bölgelerini birbirinden nispeten farklı protein bölgelerinde bulun, böylece siteler bir üçgenin köşelerini, merkezde bulunan varsayılan bağlanma bölgesi ile tanımlar (Şekil 1A-D).
    2. Belirli bir bölgenin etiketleme verimliliğini artırmak için başka Cys kalıntısı olmayan bir proteindeki ilgili etiketleme bölgelerinde sistein (Cys) kalıntılarını tanıtmak veya tanımlamak37,38.
    3. Bir proteini farklı boyalarla iki farklı konumda etkili bir şekilde etiketlemek için tıklama kimyası ile etiketlemek için p-azidofenilalanin gibi doğal olmayan amino asitleri tanıtın39,40.
    4. Cys mutantlarını fonksiyon kaybı açısından test edin. Uygun bir aktivite testi kullanarak Cys-less mutantının ve doğal olmayan amino asit mutantının aktivitesini doğrulayın. Bu durumda, aktivite bir büyüme testi ve ardından in vitro malakit yeşil ATPaz testi 32,41,42 ile doğrulanmıştır.

2. Proteinin etiketlenmesi

  1. Doğru etiketleme için ilgili protein veya proteinleri en az% 95 saflığa kadar saflaştırın. SecA ve SecYEG proteinlerini referans3'te ayrıntılı olarak açıklanan protokolleri izleyerek saflaştırın. Bu adım için en az 5 μg saflaştırılmış proteine sahip olduğunuzdan emin olun, çünkü etiketleme işlemi sırasında bir miktar protein kaybolacaktır.
  2. FRET ölçümleri için R0 değerlerine ve etiketli bölgeler arasındaki tahmini mesafelere bağlı olarak iki boya seçin. R0 değerlerini tahmin edin ve yaygın olarak kullanılan boyalar için spektrum veren floresan protein veritabanındaki bilgileri kullanarak donör emisyonu ve alıcı absorbansının örtüştüğünü gözlemleyin (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    NOT: R 0, belirli bir boyaçifti için transfer verimliliğinin %50 olduğu mesafe olarak tanımlanır. Haritalama deneyleri için, mesafelerin doğru bir şekilde ölçülebilmesini sağlamak için tahmin edilen mesafeler boya çiftinin R0 değerine yakın olmalıdır.
  3. Adım 1.1.1'de tanımlanan konumları etiketleyin. donör-alıcı boya çifti ile.
    1. Proteini, üreticinin talimatlarına göre, optimal protein konsantrasyonu, sıcaklık, pH, süre uzunluğu ve kullanılan spesifik boyalar için tampon gibi parametrelere özellikle dikkat ederek etiketleyin43,44.
    2. Proteini 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) tamponunda 1-2 mg / mL konsantrasyonda veya yaklaşık 10 μM konsantrasyonda hazırlayın. Boyayı dimetilformamid (DMF) veya dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona çözün. Bir boyaya ulaşmak için karıştırırken boyayı çözeltiye damla damla ekleyin: 5: 1 protein molar oranı (50 μM boya: 10 μM protein).
    3. Reaksiyonun oda sıcaklığında (RT) bir cam şişede hafifçe sallanan veya 4 ° C'de gece boyunca 4 saat ilerlemesine izin verin. β-merkaptoetanol ekleyerek reaksiyonu durdurun.
      NOT: Protein Tris tamponu ile uyumlu değilse, fosfat veya HEPES tamponları kullanılabilir. PH'ı 7.0-7.5 aralığında tutun. Proteinin disülfür bağları varsa, etiketlemeden önce DTT veya TCEP gibi bir indirgeyici ajan ekleyin. DTT'yi boya eklemeden önce diyaliz veya jel filtrasyonu ile çıkarın.
  4. Doğru FRET ölçümleri için, etiketli proteini korurken serbest boyanın akmasına izin vermek için serbest boyayı uygun bir moleküler ağırlık kesimine (MWCO) sahip bir santrifüjlü yoğunlaştırıcı ile çıkarın.
    1. Konsantratör membranını, 3 mL'lik bir konsantratörün üst kısmına ~ 1 mL su yerleştirerek hazırlayın ve ardından suyu membrandan santrifüj edin (4.300 x g'de en az 10 dakika).
    2. Etiketli numuneyi yoğunlaştırıcıda santrifüj yaparak serbest boyayı çıkarın (4.300 x g'de 20 dakika). 3-4 kez tekrarlayın ve akışı atın.
    3. UV-Vis absorpsiyon spektroskopisi kullanarak etiketli proteinin etiketleme verimliliğini kontrol edin.
      NOT: FRET ölçümleri, %50 veya daha yüksek etiketleme verimlilikleri gerektirir. Düşük etiketleme verimlilikleri FRET sinyalini azaltır ve ölçümlerde yanlışlıklara neden olabilir.
    4. Hem protein absorpsiyon bandını hem de boya maksimum absorpsiyon bandını gözlemlemek için etiketli proteinin 250-700 nm aralığında bir UV-Vis spektrumunu elde edin. Absorbansı boyanın emilim zirvesinde ve protein için 280 nm'de ölçün.
    5. Protein konsantrasyonunu belirleyin ve düzeltme faktörü, CF ve aşağıdaki denklemler45,46'yı kullanarak boyadan gelen herhangi bir katkı için doğru yapın:
      Equation 1
      burada C, proteinin (M) konsantrasyonudur, A 280,280 nm'deki numune absorbansıdır, A max, boya absorpsiyon maksimumundaki absorbanstır, ε protein, 280 nm'de protein için yok olma katsayısıdır ve CF, düzeltme faktörüdür, A'280 / A'max, burada A'280, 280 nm'de absorbanstır ve A'max sadece boya için maksimum zirvedeki absorbanstır.
    6. Aşağıdaki denklemi kullanarak etiketleme verimliliğini belirleyin:
      Equation 2
      burada εboya, boyanın molar yok olma katsayısıdır, C, adım 2.4.5'te belirlenen proteinin konsantrasyonudur ve E, etiketleme verimliliğidir. Etiketleme verimliliği değeri platolaşana ve %100'den az olana kadar adım 2.4.2'yi tekrarlayın.

3. R 0 değerlerini belirleyin

  1. R0 değerlerini in situ olarak ölçün. Aynı toplam protein konsantrasyonunda, 4 μM'de, biri sadece donör boya ile etiketlenmiş protein ve diğeri sadece alıcı boya ile etiketlenmiş protein ile iki protein örneği hazırlayın. SecA için, 4 μM SecA monomerlik bir protein konsantrasyonu bu ölçümler için iyi çalışır.
    1. 1 cm x 1 cm küvet için 2,5 mL, 5 mm x 5 mm küvet için 600 μL veya 3 mm x 3 mm küvet için 200 μL numune hacimleri hazırlayın.
  2. Florometreyi açın ve spektroflorometre kullanıyorsanız floresan yazılımında spektral toplama ve analiz programını açın. Bilgisayarı cihaza bağlamak için kırmızı M'ye tıklayın (Şekil 2A) ve Emisyon Spektrumları'nı seçin.
    1. Uyarma dalga boyu, emisyon taraması aralığı, sıcaklık ve numune değiştirici konumu gibi tarama parametrelerini Toplama Deneyi menü öğesini kullanarak girin (Şekil 2B).
    2. RTC'ye tıklayın ve boyanın emme maksimumunda ayarlanmış bir uyarma dalga boyu kullanarak floresan emisyonunu zirvede izleyerek cihaz ayarlarını (örneğin, spektral yarıklar) optimize edin. SecA için aşağıdaki ayarları yapın: bandpass 1 nm olarak; uyarma ve emisyon yarıkları sırasıyla 1 ve 1,5 mm olarak, sıcaklık 25 ° C'de ve karıştırma hızı 250 rpm'de olmak üzere.
      NOT: Cihazın saniye başına sayım (cps) kapasitesini aşmayın (tipik olarak 2 x 106 cps).
  3. Donör etiketli protein örneğini numune tutucuya yerleştirin ve numuneyi boya emme maksimumunda (örneğin, AF488 için 488 nm) heyecanlandırarak ve emisyon zirvesini (AF488 ile etiketlenmiş sadece donör SecA proteini için 505-750 nm) tarayarak yalnızca donör boyası (yalnızca donör proteini) ile etiketlenmiş proteinin emisyon taramasını oluşturmak için Çalıştır'ı tıklayın.
  4. Taramayı zirvenin sonundan 25-50 nm uzağa uzatarak tarama için bir taban çizgisi oluşturun. Tarif edildiği gibi farklı konsantrasyonlardaki numuneler üzerinde absorpsiyon ve floresan ölçümleri yaparak sadece donör proteinin kuantum verimini ölçün47. Bu ölçümler için aynı yarık ayarlarını yapın.
    1. Kuantum verimi için referans olarak serbest donör boyası kullanın. Doğru bir belirleme için sadece donör proteininin ve serbest boyanın en az dört ölçümünü farklı konsantrasyonlarda elde edin.
    2. Floresan yoğunluğunu veya entegre alanı, yalnızca donör proteini ve serbest boya veya referans için absorbansa karşı çizin. Sadece donör proteini (EğimD) ve referans (Eğim R) için eğimleri belirleyin.
    3. Kuantum verimi (Φ) aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır:
      Equation 3
      burada Φ D, donör sadece proteinin kuantum verimidir, Φ R, serbest boyanın kuantum verimidir (bu genellikle üreticiden elde edilebilir), Eğim D ve Eğim R, sırasıyla donör sadece protein ve referans için adım 3.4.2'de belirlenen eğimlerdir ve η D ve ηR sadece donör proteininin kırılma indeksini ve referanssız boya çözeltilerini temsil eder, sırasıyla 47.
  5. 1 cm'lik bir yol boyu hücre kullanarak yalnızca alıcı proteininizin absorpsiyon spektrumunu elde edin. Emilim spektrumunu boya konsantrasyonuna bölerek yalnızca alıcı proteininizin yok olma katsayısı spektrumunu oluşturun.
  6. Bir grafik analiz programı kullanarak spektral örtüşme integrali, J (λ) oluşturun. Bu işlem için standart bir çalışma sayfası programı (örneğin, elektronik tablo) da kullanılabilir.
    1. Sadece donör proteininin floresan emisyon spektrumunu (adım 3.4), örtüşme spektrumunu oluşturmak için yalnızca alıcı proteinin yok olma katsayısı spektrumu ile çarpın.
    2. Elde edilen örtüşme spektrumunu λ4 ile çarpın.
    3. Örtüşen bölgenin tümleştirilmesiyle eğrinin altındaki alanı belirleyin. Örtüşme bölgesi, alıcı yok olma katsayısı spektrumu ile çarpılan donör emisyon spektrumunun pozitif değerler verdiği alan olarak tanımlanır. Spektral örtüşme integrali şu şekilde tanımlanır:
      Equation 4
      burada FD (λ), yalnızca donör proteininin emisyon spektrumudur (adım 3.4'te elde edilir) ve εA (λ), yalnızca alıcı proteinin yok olma katsayısı spektrumudur ve M-1 cm-1birimlerine sahiptir (adım 3.5'te elde edilmiştir). Elde edilen spektral örtüşme integrali M-1 cm-1nm 4 birimlerine sahip olmalıdır.
    4. Spektral örtüşme integralini normalleştirin. Örtüşme integralini, donörün entegre alanına bölün, aynı spektral aralıktaki sadece protein spektrumu:
      Equation 5
    5. Aşağıdaki denklemi kullanarakÅ'daki R 0 değerini hesaplayın:
      Equation 6
      burada κ 2, serbestçe dönen boyalar için tipik olarak 2/3 olarak alınan oryantasyon faktörüdür, η kırılma indeksidir ve seyreltik sulu çözeltiler için 1.33 olarak yaklaştırılabilir, QD, donörün kuantum verimidir (adım 3.4) ve J (λ), adım 3.6.35'te belirlenen spektral örtüşme integralidir. NOT: Boyalar serbestçe dönmüyorsa, düzeltmeler Ivanov 48 tarafından tanımlandığı ve Auclair49 ve Zhang 2,3 tarafından uygulandığı şekilde getirilebilir.

4. FRET spektral ölçümleri yapın

  1. Sadece donör proteini, sadece alıcı protein ve donör-alıcı protein örneklerini aynı konsantrasyonda hazırlayın; 4 μM'lik bir konsantrasyon önerilir. 3 mm x 3 mm küvet kullanıyorsanız 200 μL, 5 mm x 5 mm küvet kullanıyorsanız 600 μL veya 1 cm x 1 cm küvet kullanıyorsanız 2,5 mL çözelti kullanın.
    1. Donör-alıcı protein örneğini, sadece donör ve sadece alıcı proteinin eşit miktarda molar kullanarak hazırlayın.
    2. Etiketsiz proteinin sadece donör veya sadece alıcı numunelere eşit miktarda molar miktarda sokulması yoluyla sadece kontrol donöründe ve sadece alıcı protein numunelerinde aynı miktarda etiketli numuneyi koruyun. Örneğin, aynı konsantrasyondaki çözeltiler için, her bir donör FRET örneği, 200 μL'lik bir hacim için 100 μL sadece donör proteini ve 100 μL etiketsiz protein içerecektir.
  2. Yalnızca donör, yalnızca alıcı ve donör-alıcı numunelerinin floresan emisyon spektrumlarını oluşturun. Sinyali adım 3.2'de açıklandığı gibi optimize edin. Optimize edildikten sonra tüm numuneler için aynı ayarları yapın.
    1. Adım 3.3'te açıklandığı gibi yalnızca donör taramasını edinin. Çözeltiyi donör boya emiliminde maksimumda uyarın ve donör ve (beklenen) alıcı emisyon zirvelerini tarayın.
    2. Numuneyi yalnızca alıcı proteinle değiştirin veya numune değiştirici pozisyonunu yalnızca alıcı proteini içeren küvete değiştirin.
    3. Adım 4.2.1'deki ayarlarla aynı ayarları kullanarak yalnızca alıcı boya (yalnızca alıcı protein) ile etiketlenmiş proteinin emisyon taramasını alın. Numuneyi donör uyarma dalga boyunda uyarın.
      NOT: Bu spektrum, donör dalga boyunda uyarılan alıcı miktarı için bir düzeltme sağlar (adım 5.1.2'de FA )
    4. Numuneyi donör-alıcı protein numunesine değiştirin veya numune değiştirici pozisyonunu donör-alıcı etiketli proteini içeren küvete değiştirin.
    5. Adım 4.2.1 ve 4.2.3'teki ayarlarla aynı ayarları kullanarak donör-alıcı protein numunesinin emisyon taramasını elde edin.
    6. Tüm spektrumlar için, taramanın sonunda ölçülen arka plan sayımlarını çıkararak arka plan floresansı için düzeltin.
  3. Sadece donörün donör ömürlerini ve adım 4.1.2'de açıklandığı gibi hazırlanan donör-alıcı örneklerini ölçün. Nanosaniye (10-9 s) zaman aralığındaki floresan bozunumlarını ölçebilen ve çözebilen, zamanla ilişkili tek foton sayma floresan cihazı kullanın.
    NOT: FRET boya çiftleri için, uyarma ışık kaynağını donör boyanın emilim maksimumuyla eşleştirin.
    1. Cihazı açın. Edinme yazılımını açın, floresan spektrometresi ile veri toplama için cihaz kontrol yazılımını kullanın.
    2. Satın alma için, 55 ns'lik bir zaman aralığına, 1 ve 4096 kanallık bir kazanca sahip TCSPC Decay'i seçin.
    3. Süt ürünü olmayan krema çözeltisi veya ticari saçılma çözeltisi kullanarak bir cihaz tepki fonksiyonu (IRF) elde edin ve 490 nm'de saçılımı izleyin. Yarık ayarını yapın ve darbe yığılmasını önlemek için yeterince düşük bir sayım oranını korumak için gerektiğinde nötr yoğunluk filtreleri kullanın5. Kabul Et'i ve ardından Başlat'ı tıklatın. Bu, satın almayı başlatacaktır.
      NOT: 180 kHz tekrarlama hızı için maksimum 4000 cps sayım hızı kullanılır.
    4. IRF'yi 490 nm'de toplayın, ta ki tepe kanalı maksimum 20.000 sayıma sahip olana kadar. Her floresan bozunumunu ölçmeden önce ve sonra bir IRF toplayın.
    5. Sadece donörün floresan bozunumlarını ve donör-alıcı numunelerini, donör emisyon dalga boyundaki floresan emisyonunu (520 nm) izleyerek elde edin.
    6. Maksimum 4000 cps veya daha az sayım hızı için yarık ayarlarını yapın. Yarık ayarları, protein örnekleri için tipik olarak 15-20 nm bandpass'tır. Tepe kanalında 20.000 sayım elde edilene kadar çürümeyi toplayın.
  4. Floresan ömrü (τ) için zamanın (t) bir fonksiyonu olarak çürümeyi veya floresan yoğunluğunu (I) analiz edin. Bozunumu, aşağıdaki denklemle üstellerin toplamına sığdırın:
    Equation 7
    burada α I, i. bileşenin preüstel faktörüdür ve τ I, yaşamdır. Uyum, floresan bozunumuna uyacak şekilde IRF ile yeniden birleştirilir. Uyumun kalitesini azaltılmış Χ 2 parametrelerindendeğerlendirin.

5. FRET verilerinin analizi

  1. FRET verimliliğini, donör-alıcı numunenin donöre göre donör yoğunluğundaki azalmadan sadece aşağıdaki denklemle hesaplayın.
    Equation 8
    burada FDA , donör-alıcı numunenin floresan yoğunluğudur ve FD , donör floresansının zirvesindeki sadece donör numunenin floresan yoğunluğudur. Veriler gürültülüyse tepe noktalarının tümleşik alanlarını kullanın.
    1. Yalnızca donör ve donör-alıcı numuneler arasındaki etiketlemedeki farklılıklar için doğrudur. Aşağıdaki gibi etiketlemenin donör derecesine göre düzeltmeleri hesaplayın.
      Equation 9
      burada f DA, donör-alıcı numunedeki donör etiketleme verimliliğidir ve fD, yalnızca donör numunesindeki etiketleme verimliliğidir.
    2. Alıcı floresanın, sadece alıcı protein spektrumunun (adım 4.2) donör-alıcı protein spektrumundan çıkarılması yoluyla donör uyarılmış spektruma herhangi bir katkısı için doğrudur.
      Equation 14
    3. Donör-alıcı protein örneğine göre alıcı sadece proteinin etiketleme verimliliğindeki farklılıklar için doğru, verimliliği hesaplamak için aşağıdaki denklemi verir:
      Equation 10
      burada fA , alıcı etiketlemenin kesirli miktarını gösterir. Bu denklem, boya etiketleme ve alıcı floresansı nedeniyle yapılan tüm düzeltmeleri içerir.
    4. Aşağıdaki denklemi kullanarak verimliliklerden FRET mesafelerini hesaplayın:
      Equation 11
      adım 3.6.5'te elde edilen R0 değerini kullanarak.
    5. Yalnızca donörün floresan ömürlerini ve adım 4.3.3-4.3.5'te ölçülen donör-alıcı numuneleri kullanarak FRET verimliliğini hesaplayın:
      Equation 12
    6. FRET verimliliklerini hesaplamak ve kararlı durum sonuçları5 ile karşılaştırmak için genlik ağırlıklı yaşam süresini kullanın.
      Equation 13
    7. Adım 5.1.4'te olduğu gibi floresan ömrü ile belirlenen verimliliklerden uzaklığı hesaplayın. FRET verimlilikleri ve mesafeleri için kararlı durum ve zaman çözümlenmiş değerleri karşılaştırın ve birbirlerinin hatası içinde olduklarından emin olun.

6. Mesafelerin haritalandırılması

  1. Üç boyutlu yapıdaki bağlama bölgesini eşlemek için hesaplanan mesafeleri kullanın. Her FRET çifti için adım 3.6.5'te elde edilen adım 5.1.4 ve R0 değerlerinde verilen denklemi kullanarak incelenen tüm boya çiftleri ve konumları için mesafeleri ve hataları hesaplayın.
    1. Mesafeleri yapıya eşlemek için PyMOL50 gibi bir 3-B grafik görüntüleme programı kullanın ( Ek Dosyada verilen komut dosyası). Komut dosyasından gelen komutlar, uygun mesafe bilgileriyle doğrudan komut penceresine girilebilir.
    2. Ölçülen her mesafe ve ilişkili hata için bir kabuk oluşturun (Şekil 3, Şekil 4, Ek Şekil 1-3).
    3. Farklı kabukların kesişimi boyunca konumu haritalayın (Ek Şekil 1-3). Sinyal peptidi bağlanma bölgesi, SecA ve SecYEG'deki üç farklı konum ve sinyal peptidi üzerindeki dört farklı konum üzerinden haritalandı (Şekil 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışma, preproteinin SecYEG kanalına yerleştirilmesinden önce preprotein bağlanma bölgesinin SecA üzerindeki yerini belirlemeye odaklanmıştır. Bağlanma bölgesini haritalamak için, preproteinin farklı bölgeleri ile SecA ve SecYEG proteinleri üzerindeki üç farklı konum arasında FRET deneyleri yapıldı (Şekil 1A-D). Elde edilen mesafelerden ve SecA, SecYEG ve preproteinin üç boyutlu yapılarından, preprotein bağlanma bölgesinin yeri tahmin edildi. Bu ölçümleri gerçekleştirmek için üç ayrı varlık (SecA, SecYEG ve preprotein) kullanmak yerine, PhoA sinyal dizisi, bir Gly-Ser bağlayıcı 2,3'ün dahil edilmesinden sonra genetik modifikasyon yoluyla SecA'ya bağlandı. Boyalarla kolay etiketleme için, Cys kalıntıları veya amber mutasyonları, PhoA preproteinindeki 2, 22, 35 ve 45 numaralı kalıntılarda tanıtıldı (Şekil 1E).

Sitelerin tanımlanması ve etiketlenmesi
Sinyal dizisi için varsayılan bir bağlanma bölgesi daha önce benzer FRET haritalama yöntemleri2,32 kullanılarak tanımlanmıştı. Bu ve diğer çalışmalar, iki sarmal parmağı (THF) ve preprotein çapraz bağlanma alanını, THF 33,51,52,53,54'e paralel bir konumda önerilen bir oryantasyonla sinyal peptidinin olası bağlanma bölgeleri olarak tanımlamıştır (Şekil 1F). Bu nedenle, SecA ve SecYEG proteinleri üzerindeki potansiyel etiketleme bölgelerinin tanımlanması, SecA ve SecYEG kristal yapısındaki varsayılan bağlanma bölgesinin konumuna dayanarak yapılmıştır (Şekil 1A-D'de yeşil renkle gösterilmiştir). Varsayımsal bağlanma bölgesinin konumunu üçgenleştirmek için üç bölge seçildi, burada esasen üç bölge varsayılan bağlanma bölgesi etrafında bir üçgen oluşturuyordu. Şekil 1'de gösterildiği gibi, üç bölge bağlanma bölgesinin FRET aralığındaydı (50-70 Å). Alexa Fluor 488 (AF488) ve Alexa Fluor 647 (AF647) boya çifti seçildi, çünkü 55.7 Å36'nın R0 değeri, etiketli siteler ile ölçüm doğruluğunu sağlayan varsayılan bağlama bölgesi arasındaki beklenen mesafelere iyi karşılık geliyor.

Etiketleme için seçilen üç bölge, SecA37, SecA321 ve SecY292 (Şekil 1A-D'de macenta, menekşe ve camgöbeği küreleri olarak gösterilmiştir), varsayılan bağlanma bölgesi etrafında bir üçgen oluşturan protein kompleksi boyunca yer almaktadır. Üç bölge, yalnızca doğru pozisyonun 2,37 olarak etiketlendiğinden emin olmak için Cys-less mutantındaki Cys kalıntılarına ayrı ayrı mutasyona uğradı. SecY292 deneyleri için, PhoA preprotein bölgeleri AF647 ile etiketlendi ve SecY kalıntısı 292, maleimid kimyası kullanılarak AF488 ile etiketlendi. Kimerik proteinde, SecA37 ve SecA321 bölgeleri AF647 ile etiketlendi ve preprotein AF488 ile etiketlendi. SecA-PhoA kimerik proteininde, PhoA preprotein segmentinin 2, 22, 37 ve 45 kalıntılarının her biri, bireysel proteinlerde bir amber kodonuna mutasyona uğradı. Kehribar kodon mutasyonları, doğal olmayan amino asit p-azidofenilalaninin bu pozisyonlarda kullanılmasına izin verdi ve daha sonra tıklama kimyası39,40 kullanılarak AF488 ile etiketlendi. Her mutasyon, protein bileşenlerinin doğru, diferansiyel etiketlenmesini sağlamak için bağımsız olarak üretildi ve etiketlendi. Etiketleme derecesi tüm proteinler için belirlendi ve numuneye devam etmek için genellikle% 50 veya daha iyi olması gerekiyordu.

Transfer verimliliklerinin ve mesafelerinin belirlenmesi
Enerji transferi ölçümleri yapılmadan önce, donör kuantum verimi, örtüşme integrali ve R0 değerleri belirlenmiştir (adım 3.4-3.6). Donör kuantum verimi, 0.1 M NaOH47'de 0.79 kuantum verimine sahip olan boya floreseine göre ölçüldü. Absorpsiyon ve floresan emisyon spektrumları, kuantum verimini belirlemek için floresan emisyon yoğunluğuna göre doğrusal bir absorpsiyon grafiği oluşturmak için bir dizi konsantrasyonda elde edildi. Bu ölçümlerde, doğrusal aralıktaki (0.1-1.0) absorpsiyonu ölçmek çok önemlidir ve tüm emisyon ölçümlerinin aynı yarık ayarlarıyla üretilmesi gerekir. Bu değerler örtüşen integralleri ve R0 değerlerini belirlemek için kullanıldığından, FRET koşulları altında ölçülmeleri gerekir. Protein yerel ortamı boya emisyonunu derinden etkiler ve sonuç olarak, araştırılan bölgelerin her biri için donör kuantum verimi ölçülmelidir. SecA ve SecYEG'deki sitelerin R0 değerlerini kimeranın PhoA kısmındakilerden daha güçlü bir şekilde etkilediğini not ediyoruz. Aynı SecA veya SecYEG sitesine sahip boya çiftleri için, R0 değerleri tipik olarak birbirlerinin 5 şiçindedir; R 0 değerleri iki farklı SecA konumu için 20 şkadar farklılık gösterebilir (kalıntılar 37'ye karşı 321), her boya çifti için R0 değerlerinin belirlenmesinin önemini vurgulamaktadır (Tablo 1).

R0'ın hesaplanması, donör ve alıcı boyaların serbestçe döndüğünü ve boyaların dönmeme derecesinin ölçümdeki genel belirsizliğe katkıda bulunduğunu varsayar. Boyaların göreceli hareketini ve oryantasyonlarını uygun şekilde dikkate almak için, farklı etiketleme pozisyonlarındaki tüm donör ve alıcı boyalar üzerinde kararlı durum floresan anizotropi ölçümleri yapıldı. 0.10-0.21 aralığında olan bu değerler, 2,3,48 mesafe ölçümleriyle ilişkili hatayı hesaplamak için kullanıldı. Hem donör hem de alıcı boyalar için gözlemlenen nispeten yüksek anizotropi değerleri, serbest rotasyon varsayımıyla tutarsız olan boya rotasyonundaki bir azalmaya karşılık gelir. Serbest dönüş eksikliği, mesafe hesaplamalarında% 19-25'lik bir hata oluşturur. Tablo 1'de gösterildiği gibi, bu, ölçülen mesafelerde en fazla 15 ş± ortalama bir belirsizliğe yol açmıştır. FRET mesafelerini haritalandırırken, aşağıda tartışıldığı gibi, mesafe ölçümlerindeki bu belirsizlikler önemli bir husustur.

Donör-alıcı çiftleri arasındaki hesaplanan mesafe, daha yüksek bir verimliliğin daha kısa bir mesafe ile ayrılmış donör-alıcı çiftlerinin göstergesi olduğu verimlilik ve mesafe arasındaki ilişkiye dayanmaktadır. FRET verimliliklerini belirlemek için, sadece donör ve donör alıcı numunelerde donör uyarma dalga boyunda (488 nm) uyarılan floresan emisyon spektrumları elde edilir. Tipik olarak, donör emisyon yoğunluğundaki bir azalma, enerji transferinin varlığını gösterir (adım 5.1). Şekil 1G, SecA 37 kalıntısı için donör-alıcı spektrumlarını, PhoA kimerasının kalıntısı 2 veya 22 ile göstermektedir. SecA37 kalıntısı AF647 veya alıcı boya ile etiketlenir ve PhoA kalıntıları AF488 veya donör boya ile etiketlenir. Her iki pozisyonda da, donör floresansı azalır ve donör-alıcı numunelerinde alıcı floresan yoğunluğunda küçük bir artış görülebilir. Uyarım, alıcıyı doğrudan uyarmayan 488 nm'lik donör uyarma dalga boyunda yapıldığından, gözlemlenen herhangi bir alıcı floresansı, enerji transferinden kaynaklanır. Bu nedenle, donör yoğunluğundaki azalma ve alıcı yoğunluğundaki eşzamanlı artış, iki boya arasındaki enerji transferinden kaynaklanmaktadır. Önemli ölçüde, donör floresan yoğunluğu, alıcının varlığında PhoA22 pozisyonuna (sarı) göre PhoA2 pozisyonu (mavi) için daha yüksektir. Donör yoğunluğundaki azalmadaki bu göreceli fark, PhoA2 kalıntısı ile SecA37 kalıntısı arasındaki enerji transferinin, PhoA22 ve SecA37 kalıntıları arasındaki transferden daha zayıf olduğunu gösterir; bu, PhoA2 kalıntısının SecA37'den PhoA22'den daha uzakta bulunduğu anlamına gelir. Mesafeler, verimlilik ve R0 değerleri arasındaki ilişkiden belirlenir (adım 5.1.4).

Kararlı durum floresan ölçümleri ortalama iki veya daha fazla mesafeyi temsil edebildiğinden, zamana bağlı floresan ölçümleri de gerçekleştirdik. Bu deneyler için, donör boyanın ömrü, alıcının varlığı ve yokluğunda ölçülür (Şekil 1G). Ölçülen kararlı durum floresan verimliliğine katkıda bulunan iki ayrı enerji transfer işlemi olsaydı, cihazın zaman çözünürlüğü içinde çözülebilmeleri koşuluyla, bunlar gizli ömürler olarak gözlemlenirdi. Yaşam sürelerini çözme yeteneğini geliştirmek için, zirvede 10.000 veya daha fazla sayım toplanmalıdır; ancak, pik yükseklik veya pik kanal sayımlarının, numunenin elde edilme zamanı ve potansiyel hasarı ile dengelenmesi gerekir. Zaman çözümlü ölçümler, boyalar arasındaki yalnızca bir yönelim veya mesafe ile tutarlı olarak her bir donör-alıcı çifti için tek ömür verdi. FRET haritalama tekniğimizin ortaya koyduğu alanlarda gözlemlenen mesafedeki küçük farklılıkların, sistemimizde çözülebilir ömürlere yol açmayacağını not ediyoruz. Ayrıca, zaman çözümlü floresan ölçümleri tarafından belirlenen verimlilikler, kararlı durum ölçümlerinden belirlenenlerle iyi bir uyum içindeydi ve ölçülen verimliliklerin boya çiftleri arasındaki sadece bir mesafeden kaynaklandığı konusunda daha fazla destek sağladı3.

FRET mesafelerini 3 boyutlu yapıya eşleme
Rezonans enerji transferi ölçümleri, SecA'daki sinyal dizisinin bağlanma bölgesini ve yönünü tanımlamak için yeterli mesafe bilgisi verir. SecA ve SecYEG'deki üç konum, SecA-PhoA kimerasının PhoA bölgesindeki dört konumla birlikte, bağlanma bölgesini haritalamak için kullanılan 12 farklı mesafeyi sağlar (Tablo 1). On iki mesafe, sinyal dizisi33'ün bağlanma bölgesini tanımlamak için Thermotoga maritima SecA-SecYEG kompleksinin (PDBID: 3DIN) üç boyutlu X-ışını kokristal yapısına haritalandı. SecA-SecYEG kompleksinin yapısı, in vivo fotoçapraz bağlama çalışması55 tarafından kanıtlandığı gibi E. coli'de gözlemlenene benzer.

SecA-PhoA kimerasındaki PhoA sinyal dizisinin başlangıç (PhoA2) ve bitiş (PhoA22) kalıntılarını, SecA-SecYEG kompleksinde kalıntı konumlarının nasıl tanımlandığını göstermek için kullanıyoruz. Enerji transferi her yönde gerçekleşebildiğinden, FRET mesafeleri ve ilgili hatalar, donör-alıcı çiftinden gelen boya konumlarından birinin merkez olarak belirlendiği küresel bir kabuğu tanımlar. Bu çalışmada, SecA37, SecA321 ve SecY292 kalıntıları, sinyal dizisinin PhoA2 kalıntısının yerini tanımlayan üç küresel kabuğun merkezlerini oluşturur. Üç ayrı konumdan kaynaklanan çakışan bölgelerin görselleştirilmesi, SecA37 (macenta), SecA321 (mor) ve SecY292 (camgöbeği) Şekil 3'te gösterilmiştir. Her FRET kabuğunun sadece bir kısmı protein yapısı ile kesişir ve bu kabuğun içine düşen kalıntılar ve omurga vurgulanır. Böylece, SecA37-PhoA2 mesafesi ile tanımlanan kabuk içindeki protein bölgeleri macenta (Şekil 3A,E) cinsinden gösterilirken, SecA321-PhoA2 ve SecY292-PhoA2 kabukları tarafından tanımlanan bölgeler sırasıyla mor (Şekil 3B,F) ve camgöbeği (Şekil 3C,G) olarak gösterilmiştir. Esas olarak iki sarmal parmaktan oluşan varsayılan bağlanma bölgesi yeşil renkle gösterilmiştir.

Şekil 3'te gösterildiği gibi, bu FRET kabuklarının her biri protein kompleksinin nispeten büyük bir bölümünü tanımlar. Her üç konum için, FRET kabuğu varsayılan bağlanma bölgesi ile kesişir; Bununla birlikte, örneğin SecA321 kalıntısı için, kesişen alan daha küçüktür ve sarmal iskele alanı ile önemli ölçüde örtüşen parmakların uçlarına doğru uzanır. Her üç FRET kabuğunun kesişimi veya ortak alanı (Şekil 3D, H), PhoA2 kalıntısının yerini tanımlar. Bu alan her FRET kabuğundan önemli ölçüde daha küçüktür ve helisel iskelenin büyük katkısıyla THF'nin sadece küçük bir bölümünü içerir. FRET kabuklarını oluşturmak için kullanılan komut dosyaları ve moleküler görselleştirme programı PyMOL için kesişen alanlar Ek Bilgiler'de verilmiştir. Kabukların bölümleri, Ek Şekil 1-3'te SecA-SecYEG kompleksi üzerinde pembe noktalar olarak görselleştirilmiştir.

Benzer bir strateji, PhoA22 kalıntısının yerini belirlemek için kullanıldı. PhoA22 FRET mesafeleri tarafından tanımlanan FRET kabukları (Şekil 4A-C, E-G), PhoA2 kalıntısına göre daha küçük bir alanı tanımlar (Şekil 4D, H ve Şekil 3D, H). Bu farkı, PhoA2 kalıntısının ve ilişkili bölgenin PhoA22'den daha esnek ve kararsız olduğunu öne sürmek için yorumluyoruz. Önemli bir şekilde, PhoA22 kalıntısına atfedilen alan, THF'nin ucuna ve SecYEG kanalının ağzına daha yakın bir yerde bulunur ve ortak alanda SecY bölgeleri tanımlanır (Şekil 3D, H). Her üç boya eşleşmesi de varsayılan bağlanma bölgesi ile birlikte bölgeleri tanımlar; Bununla birlikte, kesişen ortak alanlar, THF'nin karşı ucundaki PhoA22 lokasyonunu (Şekil 4D,H) PhoA2 konumuna göre merkeze alır (Şekil 3D,H). Bu bulgular, 2-22 kalıntılarından uzanan preproteinin sinyal dizisinin, THF boyunca nispeten yapılandırılmamış bir durumda yattığını göstermektedir. Bu sonuç, sinyal dizisinin THF boyunca proteine genişletilmiş bir durumda bağlandığını ve B. subtilis kristal yapısındaki SecA'nın C-terminal ucunun esasen sinyal peptidinin yapısını modellediğini ve aynı yeri işgal ettiğini öne süren önceki çalışmalarla tutarlıdır (kırmızı Şekil 1F'de gösterilmiştir)2,26 . Aşağıda tartışıldığı gibi, sinyal dizisinin ve erken olgun bölgenin bağlanmasını ve oryantasyonunu daha da tanımlamak için SecA-PhoA preprotein kimerasının erken olgun bölgesindeki (kalıntı 37 ve 45) iki yeri tanımlamak için benzer bir yaklaşım kullandık. Diğer çalışmalarda FRET mesafeleri, mevcut bir yapıyı veya moleküler dinamik simiülasyondan türetilmiş model 18,19,56'yı rafine etmek için etkili bir şekilde kullanılmıştır; SecA'ya bağlı sinyal dizisi için bir yapı olmadığı için bunu yapamadık.  

Figure 1
Şekil 1: SecA-SecYEG kompleksindeki etiketleme bölgeleri, temsili FRET spektrumları ile. (A-D) SecA37, SecA321 ve SecY292'nin etiketleme alanlarının sırasıyla macenta, mor ve camgöbeği küreleri olarak gösterildiği SecA-SecYEG eş-kristal yapısının (PDBID: 3DIN)33'ün dört farklı görünümü. A-C, kompleksin yan görünümleridir ve D üst görünümdür. SecA açık gri, SecYEG koyu gri ve varsayılan bağlanma bölgesi THF yeşil renkte gösterilir. (E) SecA-PhoA kimera yapısının şeması, SecA proteinini bir Ser-Gly bağlayıcı aracılığıyla PhoA preproteinine bağlar (ölçeğe çekilmez). Kimera'nın PhoA kısmındaki etiketleme bölgeleri, kalıntı 2, 22, 37 ve 45'e karşılık gelen mavi, yeşil, sarı ve kırmızı olarak verilir. (F) B. subtilis SecA proteininin (PDBID: 1M6N) kristal yapısının şerit diyagramı, nükleotid bağlayıcı etki alanları 1 ve 2'nin sırasıyla mavi ve açık mavi renkte gösterildiği alana göre renklendirilmiş, preprotein çapraz bağlama alanı altın, merkezi sarmal yeşil renkte, iki sarmal parmak camgöbeğinde, sarmal kanat alanı koyu yeşil renkte ve C-terminal bağlayıcı kırmızırenkte 26 olarak gösterilmiştir. . Yapılandırılmamış C-terminus, önceki bir FRET haritalama çalışması2'ye dayanan bağlı PhoA sinyal peptidinin bir modeli olarak hizmet eder. (G) Sadece donörün kararlı hal floresan spektrumları ve SecA37-AF647 ve PhoA2-AF488 FRET çiftinin ve SecA37-AF647 ve PhoA22-AF488 FRET çiftinin donör-alıcı örnekleri. Donör-alıcı numune için donör yoğunluğundaki azalma, enerji transferinin göstergesidir. Donör yoğunluğundaki azalmaya bağlı olarak PhoA22'den PhoA2 bölgesine göre daha fazla enerji transferi gerçekleşir. (H) SecA37-AF647 ve PhoA22-AF488 FRET çiftinin sadece zaman çözümlü floresan donörü (macenta) ve donör-alıcı (hafif macenta) bozunma spektrumları. Cihaz tepki fonksiyonu gri renkle gösterilir. Donör-alıcı kompleksi daha kısa bir çürüme ve sonuç olarak enerji transferi ile tutarlı olarak daha hızlı bir kullanım ömrü sağlar. Tüm moleküler yapılar belirtilen PDB dosyası ve PyMOL50 ile üretildi. Şekil 1E-H, Zhang ve ark.3'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: FluorEssence programının kullanıcı arayüzü . (A) Açılış penceresi kırmızı M'nin etrafında bir daire ile gösterilmiştir. Programı florometreye bağlamak için bu düğmeye tıklanmalıdır. (B) Deney kurulum penceresi, taramayla ilgili parametrelerin girildiği farklı alanları (monolar, dedektörler, aksesuarlar) gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Resim 3: SecA-PhoA2 pozisyonu için belirlenen FRET mesafe mermileri. FRET mesafelerinden ve ilgili belirsizliklerden (Tablo 1) inşa edilen FRET mesafe kabukları SecA-SecYEG kompleksinde (PDBID: 3DIN) tasvir edilmiştir. (A-C) PhoA2 konumu için FRET mesafe mermileri, sırasıyla merkez konumda SecA37 (macenta), SecA321 (menekşe) ve SecY292 (camgöbeği) ile inşa edilmiştir. Kabuklar merkez kalıntısına göre renklendirilir. (D) Üç FRET kabuğunun kesişimi, mavi renkle gösterilen PhoA2'nin yerini tanımlar. (E-H) Görünümler A-D'den yaklaşık 180 ° döndürülür. Tüm moleküler yapılar belirtilen PDB dosyası ve PyMOL50 ile üretildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Resim 4: SecA-PhoA22 pozisyonu için belirlenen FRET mesafe mermileri. FRET mesafelerinden ve ilgili belirsizliklerden (Tablo 1) inşa edilen FRET mesafe kabukları SecA-SecYEG kompleksinde (PDBID: 3DIN) tasvir edilmiştir. (A-C) PhoA22 konumu için FRET mesafe mermileri, sırasıyla merkez konumda SecA37 (macenta), SecA321 (menekşe) ve SecY292 (camgöbeği) ile inşa edilmiştir. Kabuklar merkez kalıntısına göre renklendirilir. (D) Üç FRET kabuğunun kesişimi, sarı renkle gösterilen PhoA22'nin konumunu tanımlar. (E-H) Görünümler A-D'den yaklaşık 180 ° döndürülür. Tüm moleküler yapılar belirtilen PDB dosyası ve PyMOL50 ile üretildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: B. subtilis SecA-Geobacillus thermodenitrificans SecYE kokristal yapısına yansıtılan PhoA2, PhoA22, PhoA37 ve PhoA45'in FRET-haritalanmış konumları (PDBID: 5EUL). (A) Şekil 1'deki gibi SecA-SecYE'nin renklendirilmesi. THF'nin sonuna yerleştirilen OmpA peptid substratı pembe renkte gösterilir. FRET haritalı bölgeler ATP-γS varlığında üretildi, PhoA2 mavi, PhoA22 yeşil, PhoA37 sarı ve PhoA45 kırmızı olarak gösterildi. Örtüşen bölgeler zeytin (PhoA22 ve PhoA37) ve turuncu (PhoA37 ve PhoA45) olarak gösterilir. Peptit substratı (kalıntılar 749-791, camgöbeği) orijinal yapıdan eksize edildi ve yapıda herhangi bir değişiklik olmadan (kırmızı ile daire içine alınmış) varsayılan bağlanma bölgesine modellendi. (B) Modellenmiş peptit substratının genişletilmiş görünümü. OmpA peptid substratının 2 (Lys), 22 (Tyr) ve 37 (Gly) kalıntıları sırasıyla mavi, yeşil ve sarı renkte çubuk formunda gösterilmiştir. Modellenmiş peptitlerdeki bu kalıntılar, tahmin edilen FRET haritalı konumlarla mükemmel bir uyum göstermektedir. Netlik için, orijinal yapıdaki nanogövde ihmal edilmiştir. Bu rakam Zhang ve ark.3'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

SecA-PhoA-SecYEG kompleksinde etiketli site SecA-PhoA Kimera'nın PhoA peptid kısmında etiketlenmiş bölge
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 PhoA37-AF488 PhoA45-AF488
SecA 37-AF467-PhoA
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
FRET verimliliği 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
uzaklık 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SecA321-AF647-PhoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
FRET verimliliği 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
uzaklık 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 PhoA22-AF647 PhoA37-AF647 PhoA45-AF647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
FRET verimliliği 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
uzaklık 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
referans 3'ten uyarlanmıştır.
Angstromlarda verilen R0 değerleri metinde açıklandığı gibi hesaplanmıştır
FRET etkinliği, tarif edildiği gibi alıcının varlığında donör floresan yoğunluğundaki azalmadan hesaplanmıştır. Hata, üç bağımsız ölçümden SD olarak bildirilir.
Donör-alıcı mesafeleri ( R ) angstromlarda verilir ve metinde açıklandığı gibi hesaplanır. Bildirilen hata, deneysel hatanın dikkate alınmasından ve boyaların yönlendirilmesinden kaynaklandığı sonucuna varmıştır.  Boya oryantasyonu, kararlı hal floresan anizotropisinden tahmin edilir.

Tablo 1: SecA-PhoA-SecYEG kompleksi için Transfer Verimlilikleri ve Mesafeleri Belirlenmiştir. FRET verimlilikleri, mesafeler ve R0 değerleri, preprotein bağlanma bölgesini haritalamak için kullanılan 12 mesafe için verilir.

Ek Şekil 1: Pembe noktalarla gösterilen FRET mesafe kabuğu, SecA-SecYEG kompleksi üzerindeki SecA37 kalıntısı ve PhoA 37 kalıntısı için belirlenmiştir (PDBID: 3DIN). Sec A açık gri, SecYEG koyu gri ve SecA37 kalıntısı macenta olarak gösterilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Pembe noktalarla gösterilen FRET mesafe kabuğu, SecA-SecYEG kompleksi üzerindeki SecA321 kalıntısı ve PhoA 37 kalıntısı için belirlenmiştir (PDBID: 3DIN). Sec A açık gri, SecYEG koyu gri ve SecA321 kalıntısı menekşe renginde gösterilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Pembe noktalarla gösterilen FRET mesafe kabuğu, SecA-SecYEG kompleksi üzerindeki SecY292 kalıntısı ve PhoA 37 kalıntısı için belirlenmiştir (PDBID: 3DIN). Sec A açık gri, SecYEG koyu gri ve SecY292 kalıntısı camgöbeği ile gösterilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FRET haritalama metodolojisini kullanarak, SecA proteini üzerindeki sinyal dizisi bağlanma bölgesini belirledik. Daha da önemlisi, kompleksin 3 boyutlu kristal yapısının varlığı, çalışmamızı büyük ölçüde kolaylaştırdı. Bu haritalama metodolojisinin gücü, etiketleme için konumları tanımlamak için mevcut bir yapıyı kullanma yeteneğinde yatmaktadır. Bu metodoloji 3B bir yapıyı belirlemek için kullanılamaz; Bununla birlikte, yapısal elemanların belirlenmesi56, mevcut bir yapının iyileştirilmesi49, bir bağlanma yerikonumunun belirlenmesi 2,32 veya dinamik hareket57'nin aydınlatılması, bu yöntemin olası uygulamalarıdır.

SecYEG-SecA-PhoA kompleksinde, üç etiketleme bölgesi, varsayılan bağlanma bölgesi etrafında bir üçgen oluşturur (Şekil 1). Bu üçgenin köşelerinden aynı kalıntıya kadar çoklu mesafe ölçümlerinin kullanılması, GPS navigasyon yöntemlerine benzer konum bilgilerini rafine eder. SecA37, SecA341 ve SecY292 olmak üzere üç bölge, SecA ve SecY'de, sinyal dizisinde PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 ve preproteinin erken olgun bölgesi ile birlikte sinyal peptidinin yerini haritalamak için toplam 12 mesafe vermek üzere tanımlanmıştır (Tablo 1). Önemli olarak, mesafe ölçümlerinin doğruluğunu artırmak için, etiketleme bölgeleri, döngüler yerine ikincil yapı elemanları gibi proteinin nispeten statik bölgelerinde bulunmalıdır. Ayrıca, siteler ayrıca etiketlemenin kolaylığı ve artan verimliliği için çözücü için nispeten erişilebilir yerlerde olmalıdır. SecA-PhoA-SecYEG kompleksi içinde, üçgen bölgelerinden veya köşelerden bağlanma substratındaki kalıntılara kadar olan mesafe ölçümlerinin performansı, bağlayıcı substrattaki kalıntıların nispeten küçük bir alana yerleştirilmesi için yeterliydi (Şekil 3D, H ve Şekil 4D, H). Kesişen alanın çoklu mesafe ölçümlerinden tanımlanması, Şekil 3 ve Şekil 4'te gösterildiği gibi, konumu tek mesafe ölçümünden önemli ölçüde hassaslaştırır. Bu nedenle, bu yöntemi kullanırken, çoklu mesafelerin ölçülmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu yöntem, bağlanmada rol oynayan moleküllerin bölgelerini tanımlayabilse de, örneğin, kesin yapısal bilgi sağlamaz; Bu tür bilgiler en iyi X-ışını, NMR ve kriyo-EM gibi diğer yapısal yöntemlerden elde edilir. FRET mesafeleri, mevcut bir yapı18,19'u veya modeli etkili bir şekilde rafine etmek için kullanılabilir, bu durumda, SecA'ya bağlı sinyal dizisinin hiçbir modeli mevcut olmadığından bu mümkün değildi.

Boya etiketlemenin sadece istenen yerlerde yapılmasını ve FRET mesafe ölçümlerinin doğru olmasını sağlamak için, etiketleme için mutagenezi kullanılması tercih edilir. Cys-less mutantının üretilmesi, Cys kalıntılarının, bölgeye yönelik mutagenez yöntemleri kullanılarak aksi takdirde vahşi tip proteindeki Ser'e veya benzer kalıntılara nispeten konservatif mutasyonunu gerektirir. Bu çalışmada, Cys mutasyonları,37'yi etiketlemek için SecA ve SecYEG'nin Cys'siz versiyonlarına tanıtıldı. Mutant proteinin aktivitesi bir büyüme testi ve ardından in vitro malakit yeşil ATPaz testi41,42 ile doğrulandı. İlgili aktivite tahlilleri proteinin fonksiyonuna bağlıdır, örneğin DNA bağlayıcı proteinler için, DNA bağlayıcı bir tahlil uygun olacaktır58. Yalnızca bir yerde etiketlemenin sağlanamaması, aynı boya ile birden fazla sitenin etiketlenmesine neden olabilir ve bu da mesafe belirlemelerini önemli ölçüde zorlaştırır. Böylece, aynı protein üzerine ikinci bir etiketin eklenmesi, doğal olmayan amino asidin bölgeye yönelik mutagenez ile dahil edilmesiyle yapılabilir. Bu metodolojiyi, doğal olmayan amino asit, p-azidofenilalanini tanıtarak ve tıklama kimyası39,40 ile etiketleyerek Cys kalıntılarından farklı yerlerde SecA-PhoA kimerasını etiketlemek için kullandık.

Bu yöntemin bir diğer önemli hususu, kullanılan boyaların seçimi ve ilişkili R0 değeridir. Potansiyel etiketleme alanlarının belirlenmesinden sonra, ölçülecek mesafeler 3 boyutlu yapıdan tahmin edilebilir. Bu bilgiyle, araştırmacılar istenen beklenen mesafe aralığını kapsayan R0 değerlerine sahip boya çiftlerini seçebilirler. Örneğin, AF488-AF647 boya çifti, varsayılan bağlama bölgesinden tahmini40-75 şuzaklıkta bulunan siteleri etiketlemek için iyi bir aralık sağlayan 55,7 Å'lık hesaplanmış bir R 0'a sahiptir. Adım 2.2'de hesaplanan R0 değerleri, sisteminiz için hangi boya çiftinin kullanılacağını seçmek için yararlı olsa da, boyaların proteine bağlanması, özelliklerini önemli ölçüde değiştirebilir. Daha fazla doğruluk için, R0 değerleri, etiketli protein ile yapılan in situ deneylerden hesaplanmalıdır (adım 3.1 - 3.6.5).

Transfer verimliliğinin ölçümü, kararlı durum floresan emisyonunun izlenmesi ve donör emisyonunda bir azalma veya alıcı emisyonunda bir artış gözlenerek yapılabilir. Her iki etkinin de gözlemlenmesi arzu edilmekle birlikte, verimlilik tarif edildiği gibi 5,8'den hesaplanabilir. Verimlilik, sadece donör numunesine göre donör-alıcı numunedeki donör ömründeki azalmadan da hesaplanabilir. Verimliliğin birden fazla yöntemle belirlenmesi, özellikle ölçülen verimliliklerin göreceli homojenliğini belirlemek için zaman çözümlü yöntemlerin kullanılması önerilir.

Haritalama yöntemi ayrıca sinyal dizisinin göreceli oryantasyonunu ve PhoA preproteininin erken olgun bölgelerini SecA'ya ve varsayılan bağlanma bölgesine göre belirlememize izin verdi. Bir SecA-SecYEG X-ışını kristal yapısı ve ardından kriyo-EM çalışması, sinyal dizisinin yapısı ve preproteinin kanal ve SecA 34,35'e göre erken olgun bölgesi hakkında netlik sağlamıştır. X-ışını yapısında, OmpA preproteininin 1-41 arası kalıntıları iki sarmal parmağın ucuna tutturulmuş ve kanaldaki bir saç tokası yapısında görselleştirilmiştir (pembe olarak gösterilmiştir, Şekil 5). SecA-PhoA kimerasındaki dört PhoA kalıntısının yerleri, yukarıda tarif edildiği gibi aynı protokol kullanılarak bu yapıya haritalandı. Şekil 5'te gösterildiği gibi, PhoA37 ve PhoA45 kalıntılarının (sarı, turuncu, kırmızı) yeri PhoA2 ve PhoA22 arasındadır ve PhoA45 PhoA2'ye daha yakındır. Bu bulgular, özellikle PhoA45'in yeri, PhoA preproteininin bir saç tokası yapısı oluşturduğunu ileri sürdü.

FRET ile tanımlanmış bağlanma bölgemizi daha da doğrulamak için, 41 kalıntı preprotein yapısını kanaldan çıkararak ve FRET haritalaması ile tanımlanan bölgelere modelleyerek haritalanmış konumlarımızın OmpA preproteinininkiyle karşılaştırmasını yaptık (Şekil 5, camgöbeği). Preprotein X-ışını yapısında herhangi bir değişiklik olmadan, OmpA preprotein fragmanı eksize edilmiş yapı üzerindeki 2, 22 ve 37 numaralı kalıntıların (mavi, yeşil ve sarı olarak gösterilen) konumlarının, FRET haritalı konumlarla (Şekil 5B) oldukça iyi uyuştuğunu ve saç tokasının kanal girişinden önce oluştuğunu öne sürdüğünü görüyoruz. OmpA preproteini, X-ışını kristal yapısında kalıntı 41'de sona erer; Bununla birlikte, yapılandırılmamış olan SecY'nin C-terminali, PhoA45'in olası yerinin bir göstergesidir. Modellenmiş yapımızda, saç tokası halkası, preproteinin zar boyunca translokasyonunu kolaylaştırmak için hazır olan kanalın ağzında oturur. Bu nedenle, bu örnekte, FRET haritalama metodolojisi, membran boyunca protein translokasyonu için gereken dinamik hareketin bir ipucunu sağlayarak, statik SecA-SecYEG yapısının mevcut bilgilerini geliştirir. De novo yapı belirlemeleri için uygun olmasa da, 3 boyutlu yapısal bilgi mevcutsa, FRET haritalama metodolojisi, bağlanma bölgelerinin ve dinamik hareketlerin aydınlatılması yoluyla yapı-işlev ilişkilerinin mevcut anlayışını daha da ileri götürebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R15GM135904 (IM'ye verildi) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe GM110552 (DBO'ya verildi) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Biyokimya Sayı 181 floresan enerji transferi SecA protein translokasyonu FRET haritalaması
Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter