Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: En ny metode for å belyse globale strukturelle egenskaper

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

Studien beskriver metodikken for FRET-kartlegging, inkludert valg av merkingssteder, valg av fargestoffer, innsamling og dataanalyse. Denne metoden er effektiv til å bestemme bindingssteder, konformasjonsendringer og dynamiske bevegelser i proteinsystemer og er mest nyttig hvis den utføres i forbindelse med eksisterende 3-D strukturell informasjon.

Abstract

Förster resonance energy transfer (FRET) er en etablert fluorescensbasert metode som brukes til å måle avstander i og mellom biomolekyler in vitro så vel som i celler. I FRET er effektiviteten av energioverføring, målt ved endringer i fluorescensintensitet eller levetid, relatert til avstanden mellom to fluorescerende molekyler eller etiketter. Bestemmelse av dynamikk og konformasjonsendringer fra avstandene er bare noen eksempler på anvendelser av denne metoden til biologiske systemer. Under visse forhold kan denne metoden legge til og forbedre eksisterende røntgenkrystallstrukturer ved å gi informasjon om dynamikk, fleksibilitet og tilpasning til bindingsflater. Vi beskriver bruken av FRET og tilhørende avstandsbestemmelser for å belyse strukturelle egenskaper, gjennom identifisering av bindingssted eller orientering av dimerunderenheter. Gjennom fornuftig valg av merkingssteder, og ofte bruk av flere merkingsstrategier, har vi med hell brukt disse kartleggingsmetodene for å bestemme globale strukturelle egenskaper i et protein-DNA-kompleks og SecA-SecYEG-proteintranslokasjonssystemet. I SecA-SecYEG-systemet har vi brukt FRET-kartleggingsmetoder for å identifisere preproteinbindingsstedet og bestemme den lokale konformasjonen av det bundne signalsekvensområdet. Denne studien skisserer trinnene for å utføre FRET-kartleggingsstudier, inkludert identifisering av passende merkingssteder, diskusjon av mulige etiketter, inkludert ikke-innfødte aminosyrerester, merkingsprosedyrer, hvordan man utfører målinger og tolkning av dataene.

Introduction

For proteiner fører belysning av dynamikk sammen med 3-dimensjonal (3-D) strukturell kunnskap til en forbedret forståelse av struktur-funksjonsforhold i biomolekylære systemer. Strukturelle metoder, som røntgenkrystallografi og kryogen elektronmikroskopi, fanger opp en statisk struktur og krever ofte bestemmelse av flere strukturer for å belyse aspekter ved biomolekylbinding og dynamikk1. Denne artikkelen diskuterer en løsningsbasert metode for å kartlegge globale strukturelle elementer, for eksempel bindingssteder eller bindingsinteraksjoner, som potensielt er mer forbigående og mindre enkle å fange opp med statiske metoder. Sterke kandidatsystemer for denne metoden er de der en 3-D-struktur tidligere har blitt bestemt ved røntgenkrystallografi, NMR-spektroskopi eller andre strukturelle metoder. I dette tilfellet utnytter vi røntgenkrystallstrukturen til SecA-SecYEG-komplekset, en sentral aktør i proteinets generelle sekretoriske vei, for å kartlegge plasseringen av et signalpeptidbindingssted ved hjelp av Förster resonansenergioverføring (FRET) før transport av preproteinet over membranen2. Manipulering av det biologiske systemet gjennom genetiske modifikasjoner kombinert med vår kunnskap om 3-D-strukturen muliggjorde bestemmelse av konformasjonen av signalsekvensen og tidlig moden region umiddelbart før innsetting i kanal 3.

FRET innebærer strålingsfri overføring av energi fra ett molekyl (donor) til et annet (akseptor) på en avstandsavhengig måte som er gjennom rom 4,5. Effektiviteten av denne overføringen overvåkes enten gjennom en reduksjon i donor eller en økning i akseptorfluorescensintensitet. Effektiviteten av energioverføring kan beskrives som

E = R06/(R06 + R6)

der R0-verdien er avstanden der overføringen er 50% effektiv6. Teknikken har tidligere blitt beskrevet som en molekylær linjal og er effektiv til å bestemme avstander i området 2,5-12 nm, avhengig av identiteten til donor-akseptorfargene 4,7,8,9. Donorfluorescensintensiteter og levetider med eller uten akseptor tillater bestemmelse av overføringseffektivitet og følgelig avstander 5,8. På grunn av tilgjengeligheten av teknologien, metodens følsomhet og brukervennlighet har FRET også funnet bred anvendelse på områder som enkeltmolekylfluorescensspektroskopi og konfokalmikroskopi6. Ankomsten av fluorescerende proteiner som grønt fluorescerende protein har gjort observasjonen av intracellulær dynamikk og levende cellebilder relativtlettvint 10,11. Mange FRET-applikasjoner som disse diskuteres i detalj i dette virtuelle problemet.

I denne studien fokuserer vi spesielt på bruk av FRET-målinger for å gi avstandsverdier for å bestemme strukturelle detaljer. Tidligere har FRET-målinger blitt effektivt brukt til å bestemme konformasjonen av DNA-molekyler når de er bundet til protein 12,13,14, den indre dynamikken til proteiner og proteinbindende interaksjoner 15,16,17. Fordelene med denne metoden ligger i evnen til å bestemme fleksible og dynamiske strukturelle elementer i en løsning med relativt lave mengder materiale. Det er viktig å merke seg at denne metoden er spesielt effektiv når den brukes sammen med eksisterende strukturell informasjon og ikke kan brukes som et middel til 3-D strukturbestemmelse. Metoden gir best innsikt og raffinement av struktur hvis arbeidet bygger på eksisterende strukturell informasjon ofte kombinert med beregningssimulering18,19. Her beskrives bruk av avstander oppnådd fra steady-state og tidsoppløste FRET-målinger for å kartlegge et bindingssted, hvis plassering ikke var kjent, på en eksisterende krystallografisk struktur av SecA-SecYEG-komplekset, store proteiner i den generelle sekretoriske banen3.

Den generelle sekretoriske banen, et svært konservert system fra prokaryoter til eukaryoter til archaea, formidler transport av proteiner enten over eller inn i membranen til deres arbeidssted i cellen. For gramnegative bakterier, som E. coli, organismen som ble brukt i vår studie, blir proteiner satt inn i eller translokert over den indre membranen til periplasma. Det bakterielle SecY-kanalkomplekset (kalt transloconet) koordinerer med andre proteiner for å translokere det nylig syntetiserte proteinet, som er rettet mot sin korrekte plassering i cellen gjennom en signalsekvens som vanligvis ligger ved N-terminalen20,21. For proteiner bundet til periplasma assosierer ATPase SecA-proteinet med utgangstunnelen til ribosomet, og med preproteinet etter at ca. 100 rester er oversatt22. Sammen med SecB chaperone-proteinet opprettholder det preproteinet i en utfoldet tilstand. SecA binder seg til SecYEG-transloconet, og gjennom mange sykluser av ATP-hydrolyse letter proteintransport over membranen23,24.

SecA er et multi-domene protein som finnes i cytosoliske og membranbundne former. Et homodimert protein i cytosolen, SecA, består av et preproteinbindende eller tverrbindende domene25, to nukleotidbindende domener, et spiralformet vingedomene, et spiralformet stillasdomene og de to helixfingeren (THF)26,27,28,29 (figur 1). I tidligere krystallografiske studier av SecA-SecYEG-komplekset antydet plasseringen av THF at den var aktivt involvert i proteintranslokasjon og påfølgende tverrbindingseksperimenter med signalpeptidet etablerte videre betydningen av denne regionen i proteintranslokasjon30,31. Tidligere studier, ved hjelp av FRET-kartleggingsmetodikken, viste at eksogene signalpeptider binder seg til denne regionen av SecA 2,32. For fullt ut å forstå konformasjonen og plasseringen av signalsekvensen og den tidlig modne regionen av preproteinet før innsetting i SecYEG-kanalen, ble det opprettet en proteinkimera der signalsekvensen og restene av den tidlige modne regionen ble festet til SecA gjennom en Ser-Gly-linker (figur 1). Ved hjelp av denne biologisk levedyktige konstruksjonen ble det videre demonstrert at signalsekvensen og den tidlig modne regionen av preproteinet binder seg til THF på en parallell måte2. Deretter ble FRET-kartleggingsmetoden brukt til å belyse konformasjonen og plasseringen av signalsekvensen og tidlig moden region i nærvær av SecYEG som beskrevet nedenfor3.

Kunnskap om 3D-strukturen til SecA-SecYEG-komplekset 33,34,35 og den mulige plasseringen av bindingsstedet tillot oss å plassere donor-akseptoretiketter på steder der skjæringspunktet mellom individuelle FRET-avstander identifiserer bindingsstedets plassering. Disse FRET-kartleggingsmålingene viste at signalsekvensen og den tidlige modne regionen av preproteinet danner en hårnål med spissen plassert ved munningen av SecYEG-kanalen, noe som viser at hårnålstrukturen er mal før kanalinnsetting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Valg av merkesteder

  1. Identifiser minst tre potensielle merkingssteder for å triangulere det antatte bindingsstedet på eksisterende proteinstrukturer. I dette tilfellet ble SecA, SecYEG og preprotein festet til SecA gjennom genetisk fusjon identifisert2.
    1. Velg merkesteder innen 25-75 Å fra det antatte bindingsstedet og i relativt statiske områder av proteinet, vil avstanden bestemme det spesifikke FRET-fargestoffparet som skal brukes36. Finn merkingsstedene i proteinregioner som er relativt forskjellige fra hverandre, slik at stedene beskriver hjørnene til en trekant med det antatte bindingsstedet i midten (figur 1A-D).
    2. Introduser eller identifiser cystein (Cys) rester på merkingssteder av interesse for et protein som ikke har andre Cys-rester, for å forbedre merkingseffektiviteten til det spesifikke stedet37,38.
    3. Introduser unaturlige aminosyrer, for eksempel p-azidofenylalanin for merking med klikkkjemi, for effektivt å merke ett protein i to forskjellige posisjoner med forskjellige fargestoffer39,40.
    4. Test Cys-mutantene for tap av funksjon. Kontroller aktiviteten til den Cys-mindre mutanten og den unaturlige aminosyremutanten ved hjelp av en passende aktivitetsanalyse. I dette tilfellet ble aktiviteten verifisert med en vekstanalyse etterfulgt av en in vitro malakittgrønn ATPase-analyse 32,41,42

2. Merking av proteinet

  1. Rens proteinet eller proteiner av interesse til minst 95% renhet for nøyaktig merking. Rens SecA- og SecYEG-proteiner etter protokoller beskrevet i referanse3. Sørg for at du har minst 5 μg renset protein for dette trinnet, da noe protein vil gå tapt under merkingsprosessen.
  2. Velg to fargestoffer for FRET-målinger avhengig av deres R0-verdi og de forventede avstandene mellom merkede steder. Estimer R0-verdier og observer donoremisjon og akseptorabsorbansoverlapping ved hjelp av informasjonen fra fluorescerende proteindatabasen, som også gir spektra for vanlige fargestoffer (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    MERK: R0 er definert som avstanden der overføringseffektiviteten er 50% for et gitt fargestoffpar. For kartleggingseksperimenter bør forventede avstander være nær R0-verdien til fargestoffparet for å sikre at avstander kan måles nøyaktig.
  3. Merk posisjonene som er identifisert i trinn 1.1.1. med donor-akseptor fargestoffparet.
    1. Merk proteinet i henhold til produsentens instruksjoner med særlig vekt på parametere som optimal proteinkonsentrasjon, temperatur, pH, lengde på tid og buffer for de spesifikke fargestoffene som brukes43,44.
    2. Forbered proteinet i en konsentrasjon på 1-2 mg / ml eller ca. 10 μM i en 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) buffer. Løs opp fargestoff i dimetylformamid (DMF) eller dimetylsulfoksid (DMSO) til en endelig konsentrasjon på 1 mM. Tilsett fargestoffet dråpevis til løsningen mens du rører for å nå et fargestoff: proteinmolarforhold på 5: 1 (50 μM fargestoff: 10 μM protein).
    3. La reaksjonen fortsette i 4 timer ved romtemperatur (RT) i et hetteglass med forsiktig gynging eller over natten ved 4 °C. Stopp reaksjonen ved å tilsette β-merkaptoetanol.
      MERK: Hvis protein ikke er kompatibelt med Tris-buffer, kan fosfat- eller HEPES-buffere brukes. Oppretthold pH i området 7,0-7,5. Hvis proteinet har disulfidbindinger, legg til et reduksjonsmiddel som DTT eller TCEP før merking. Fjern DTT ved dialyse eller gelfiltrering før du tilsetter fargestoff.
  4. For nøyaktige FRET-målinger fjerner du det frie fargestoffet med en sentrifugalkonsentrator med en passende molekylvektavskjæring (MWCO) for å la det frie fargestoffet strømme gjennom mens du beholder det merkede proteinet.
    1. Forbered konsentratormembranen ved å plassere ~ 1 ml vann i den øvre delen av en 3 ml konsentrator og sentrifuger deretter vannet gjennom membranen (minst 10 minutter ved 4,300 x g).
    2. Fjern fritt fargestoff ved å sentrifugere merket prøve i konsentrator (20 min ved 4,300 x g). Gjenta 3-4 ganger og kast gjennomstrømningen.
    3. Kontroller merkingseffektiviteten til det merkede proteinet ved hjelp av UV-Vis absorpsjonsspektroskopi.
      MERK: FRET-målinger krever merkeeffektivitet på 50 % eller høyere. Lavere merkingseffektivitet reduserer FRET-signalet og kan føre til unøyaktigheter i målingen.
    4. Oppnå et UV-Vis-spektrum av det merkede proteinet med et område fra 250-700 nm for å observere både proteinabsorpsjonsbåndet og fargestoffets maksimale absorpsjonsbånd. Mål absorbansen ved absorpsjonstoppen av fargestoff og ved 280 nm for protein.
    5. Bestem konsentrasjonen av protein og korriger for eventuelle bidrag fra fargestoffet ved hjelp av korreksjonsfaktoren CF og følgende ligninger45,46:
      Equation 1
      hvor C er konsentrasjonen av proteinet (M), A280 er prøveabsorbansen ved 280 nm, Amax er absorbansen ved fargestoffabsorpsjonsmaksimum, ε protein er utryddelseskoeffisienten for proteinet ved 280 nm og CF er korreksjonsfaktoren, A'280 / A'max, hvor A'280 er absorbansen ved 280 nm og A'max er absorbansen ved topp maksimum for fargestoffet bare.
    6. Bestem merkingseffektivitet ved hjelp av følgende ligning:
      Equation 2
      hvor εfargestoff er den molare utryddelseskoeffisienten til fargestoffet, C er konsentrasjonen av proteinet som bestemt i trinn 2.4.5, og E er merkingseffektiviteten. Gjenta trinn 2.4.2 til verdien for merkingseffektivitet har flatet ut og er mindre enn 100 %.

3. Bestem R 0-verdiene

  1. Mål R0-verdiene in situ. Forbered to proteinprøver ved samme konsentrasjon av totalt protein, 4 μM, en med proteinet merket med donorfargestoffet og en med proteinet merket med akseptorfargestoffet. For SecA fungerer en proteinkonsentrasjon på 4 μM SecA-monomer godt for disse målingene.
    1. Forbered prøvevolumer på 2,5 ml for en 1 cm x 1 cm kyvette, 600 μL for en 5 mm x 5 mm kyvette eller 200 μL for en 3 mm x 3 mm kyvette.
  2. Slå på fluorometeret og åpne spektralinnsamlings- og analyseprogrammet i fluorescensprogramvaren hvis du bruker et spektrofluorometer. Klikk på den røde M-en for å koble datamaskinen til instrumentet (figur 2A) og velg Emission Spectra.
    1. Angi skanneparametere som eksitasjonsbølgelengde, området for utslippsskanning, temperatur og prøvevekslerposisjon ved hjelp av menyelementet Samle eksperiment (figur 2B).
    2. Klikk på RTC og optimaliser instrumentinnstillingene (f.eks. spektralspalter) ved å overvåke fluorescensutslippet på toppen ved hjelp av en eksitasjonsbølgelengde satt ved fargestoffets absorpsjonsmaksimum. For SecA, sett følgende innstillinger: bandpass som 1 nm; eksitasjons- og utslippsspalter som henholdsvis 1 og 1,5 mm, med temperaturen ved 25 °C og omrøringshastigheten ved 250 o/min.
      MERK: Ikke overskrid instrumentets kapasitet per sekund (cps) (typisk 2 x 106 cps).
  3. Plasser donormerket proteinprøve i prøveholderen og klikk Kjør for å generere en utslippsskanning av proteinet merket med donorfargestoffet (kun donorprotein) ved å spenne prøven ved fargeabsorpsjonsmaksimum (f.eks. 488 nm for AF488) og skanne over utslippstoppen (505-750 nm for donor bare SecA-protein merket med AF488).
  4. Etabler en grunnlinje for skanningen ved å forlenge skanningen 25-50 nm forbi slutten av toppen. Mål kvanteutbyttet av donorproteinet, ved å utføre absorpsjons- og fluorescensmålinger på prøver med forskjellige konsentrasjoner som beskrevet47. Oppretthold de samme spalteinnstillingene for disse målingene.
    1. Bruk fritt donorfargestoff som referanse for kvanteutbyttet. Oppnå minst fire målinger av donorproteinet og det frie fargestoffet i forskjellige konsentrasjoner for en nøyaktig bestemmelse.
    2. Plott fluorescensintensiteten eller det integrerte området mot absorbansen for donorproteinet og det frie fargestoffet eller referansen. Bestem skråningene for donorproteinet (SlopeD) og referansen (SlopeR).
    3. Kvanteutbytte (Φ) beregnes ved hjelp av følgende ligning:
      Equation 3
      her er ΦD kvanteutbyttet til donorproteinet, ΦR er kvanteutbyttet til det frie fargestoffet (dette kan vanligvis fås fra produsenten), SkråningD og SkråningR er skråningene bestemt i trinn 3.4.2 for donorens eneste protein og referanse, henholdsvis og ηD og ηR representerer brytningsindeksen for donorproteinet og de referansefrie fargestoffløsningene, henholdsvis 47.
  5. Oppnå et absorpsjonsspekter av ditt akseptorprotein ved hjelp av en 1 cm banelengdecelle. Generer et utryddelseskoeffisientspektrum av ditt akseptorprotein ved å dele absorpsjonsspekteret med fargestoffkonsentrasjonen.
  6. Generer spektraloverlapping integralet, J (λ) ved hjelp av et grafisk analyseprogram. Et standard regnearkprogram (f.eks. regneark) kan også brukes til denne prosessen.
    1. Multipliser fluorescensutslippsspekteret til donorproteinet (trinn 3.4) med utryddelseskoeffisientspekteret til det aksepterte proteinet for å generere overlappingsspekteret.
    2. Multipliser det resulterende overlappingsspekteret med λ4.
    3. Bestem området under kurven ved å integrere overlappingsområdet. Overlappingsområdet er definert som området der donoremisjonsspekteret multiplisert med akseptorutryddelseskoeffisientspekteret gir positive verdier. Det spektrale overlappingsintegralet er definert som:
      Equation 4
      hvor FD (λ) er emisjonsspekteret til donorproteinet (oppnådd i trinn 3.4) og εA (λ) er utryddelseskoeffisientspekteret til det akseptorbaserte proteinet og har enheter på M-1 cm-1 (oppnådd i trinn 3.5). Det resulterende spektrale overlappingsintegralet skal ha enheter på M-1 cm-1nm4.
    4. Normaliser spektraloverlappingsintegralet. Del overlappingsintegralet med det integrerte området av donorens eneste proteinspektrum over samme spektralområde:
      Equation 5
    5. Beregn R0-verdien i Å ved hjelp av følgende ligning:
      Equation 6
      hvor κ2 er orienteringsfaktoren, vanligvis tatt som 2/3 for fritt roterende fargestoffer, η er brytningsindeksen og kan tilnærmes som 1,33 for fortynnede vandige løsninger, QD er kvanteutbyttet til giveren (trinn 3.4) og J(λ) er spektraloverlappingsintegralet som bestemt i trinn 3.6.35. MERK: Hvis fargestoffene ikke roterer fritt, kan korreksjoner innføres som beskrevet av Ivanov 48 og implementert av Auclair49 og Zhang 2,3.

4. Utfør FRET-spektrale målinger

  1. Forbered donor-bare protein, akseptor-bare protein og donor-akseptor proteinprøver ved samme konsentrasjon; en konsentrasjon på 4 μM anbefales. Bruk 200 μL oppløsning, hvis du bruker en 3 mm x 3 mm kyvette, 600 μL hvis du bruker en 5 mm x 5 mm kyvette, eller 2,5 ml hvis du bruker en 1 cm x 1 cm kyvette.
    1. Forbered donor-akseptorproteinprøven ved å bruke like molare mengder av donoren og akseptor bare protein.
    2. Opprettholde samme mengde merket prøve i kontroll donor bare og akseptor bare proteinprøver gjennom innføring av umerket protein i samme molar mengde til enten donor bare eller akseptor bare prøver. For eksempel, for løsninger med samme konsentrasjon, vil hver donor-eneste FRET-prøve inneholde 100 μL donorprotein og 100 μL umerket protein for et volum på 200 μL.
  2. Generer fluorescensutslippsspektra kun av giveren, kun akseptor og donor-akseptorprøver. Optimaliser signalet som beskrevet i trinn 3.2. Når de er optimalisert, opprettholder du de samme innstillingene for alle prøvene.
    1. Få tak i skanningen kun for donor som beskrevet i trinn 3.3. Begeistre løsningen ved donorfargestoffabsorpsjonen maksimalt og skann over donoren og (forventet) akseptorutslippstopper.
    2. Bytt enten prøven til det rene acceptorproteinet eller endre prøvevekslerposisjonen til kyvetten som inneholder det eneste akseptorproteinet.
    3. Oppnå en utslippsskanning av proteinet merket med kun akseptorfargestoff (akseptor bare protein) med de samme innstillingene som i trinn 4.2.1. Begeistre prøven ved donorens eksitasjonsbølgelengde.
      MERK: Dette spekteret gir en korreksjon for mengden akseptor som er eksitert ved donorbølgelengden (FA i trinn 5.1.2)
    4. Bytt prøven til donor-akseptorproteinprøven eller endre prøvevekslerposisjonen til kyvetten som inneholder donor-akseptormerket protein.
    5. Få en utslippsskanning av donor-akseptorproteinprøven med de samme innstillingene som i trinn 4.2.1 og 4.2.3.
    6. For alle spektra, korriger for bakgrunnsfluorescens ved å trekke fra bakgrunnstallene som ble målt på slutten av skanningen.
  3. Mål donorlevetiden til kun donoren og donor-akseptorprøver utarbeidet som beskrevet i trinn 4.1.2. Bruk et tidskorrelert enkeltfotonterende fluorescensinstrument som er i stand til å måle og løse fluorescerende henfall i nanosekundet (10-9 s) tidsområde.
    MERK: For FRET-fargestoffpar, match eksitasjonslyskilden til absorpsjonsmaksimumet av donorfargen.
    1. Slå på instrumentet. Åpne anskaffelsesprogramvaren, bruk instrumentkontrollprogramvaren for datainnsamling med fluorescensspektrometeret.
    2. For anskaffelse velger du TCSPC Decay, med et tidsintervall på 55 ns, en forsterkning på 1 og 4096 kanaler.
    3. Oppnå en instrumentresponsfunksjon (IRF) ved hjelp av en løsning av ikke-meieri creamer eller kommersiell spredningsløsning og overvåke spredningen ved 490 nm. Juster spalteinnstillingen og bruk nøytrale tetthetsfiltre etter behov for å opprettholde en lav nok tellehastighet for å unngå pulsoppsamling5. Klikk Godta og deretter Start. Dette vil starte oppkjøpet.
      MERK: En maksimal tellehastighet på 4000 cps brukes til en repetisjonshastighet på 180 kHz.
    4. Samle IRF ved 490 nm til toppkanalen har maksimalt 20 000 tellinger. Samle en IRF før og etter måling av hvert fluorescensforfall.
    5. Oppnå fluorescensnedbrytningene til kun donoren og donor-akseptorprøver ved å overvåke fluorescensutslippet ved donoremisjonsbølgelengden, 520 nm.
    6. Juster spalteinnstillingene for en maksimal antallshastighet på 4000 cps eller mindre. Spalteinnstillinger er vanligvis 15-20 nm båndpass for proteinprøver. Samle forfallet til 20.000 teller er oppnådd i toppkanalen.
  4. Analyser forfallet eller fluorescensintensiteten (I) som en funksjon av tid (t) for fluorescenslevetiden (τ). Tilpass forfallet til en sum av eksponentialer med følgende formel:
    Equation 7
    hvor αI er den preeksponensielle faktoren til den ith komponenten og τI er levetiden. Passformen er rekonvolvert med IRF for å matche fluorescensnedbrytningen. Døm kvaliteten på passformen fra de reduserte Χ2-parametrene .

5. Analyse av FRET-data

  1. Beregn FRET-effektivitet fra reduksjonen i donorintensiteten til donor-akseptorprøven i forhold til giveren bare med følgende ligning.
    Equation 8
    hvor FDA er fluorescensintensiteten til donorakseptorprøven og FD er fluorescensintensiteten til donorprøven ved toppen av donorfluorescensen. Bruk de integrerte områdene av toppene hvis dataene er støyende.
    1. Korriger for eventuelle forskjeller i merking mellom kun donor og donor-akseptorprøver. Beregn korreksjoner basert på donorgraden av merking som følger.
      Equation 9
      hvor fDA er donormerkingseffektiviteten i donorakseptorprøven og fD er merkingseffektiviteten i donorprøven.
    2. Korrekt for eventuelle bidrag fra akseptorfluorescensen til donor-eksitert spektrum gjennom subtraksjon av det akseptor-eneste proteinspekteret (trinn 4.2) fra donor-akseptorproteinspekteret.
      Equation 14
    3. Korriger for forskjellene i merkingseffektiviteten til akseptorproteinet i forhold til donor-akseptorproteinprøven som gir følgende ligning for beregning av effektivitet:
      Equation 10
      der fA betegner brøkmengden av akseptormerking. Denne ligningen inkluderer alle korreksjoner på grunn av fargestoffmerking og akseptorfluorescens.
    4. Beregn FRET-avstander fra effektiviteten ved hjelp av følgende ligning:
      Equation 11
      ved bruk av R0-verdien oppnådd i trinn 3.6.5.
    5. Beregn FRET-effektivitet ved bruk av kun donorens levetid og donor-akseptorprøver målt i trinn 4.3.3-4.3.5:
      Equation 12
    6. Bruk den amplitudevektede levetiden til å beregne FRET-effektivitet og sammenligne med steady state-resultater5.
      Equation 13
    7. Beregn avstanden som i trinn 5.1.4 fra effektiviteten bestemt av fluorescenslevetid. Sammenlign steady-state og tidsbestemte verdier for FRET-effektivitet og avstander, og sørg for at de er feil av hverandre.

6. Kartlegging av avstandene

  1. Bruk de beregnede avstandene til å kartlegge bindingsstedet på den tredimensjonale strukturen. Beregn avstandene og feilene for alle fargestoffparene og stedene som er undersøkt ved hjelp av ligningen gitt i trinn 5.1.4 og R0-verdier oppnådd i trinn 3.6.5 for hvert FRET-par.
    1. Bruk et 3-D grafisk visningsprogram som PyMOL50 for å kartlegge avstandene på strukturen (skript gitt i Tilleggsfil). Kommandoer fra skriptet kan legges direkte inn i kommandovinduet med riktig avstandsinformasjon.
    2. Generer et skall for hver målte avstand og tilhørende feil (figur 3, figur 4, tilleggstall 1-3).
    3. Kartlegg posisjonen gjennom skjæringspunktet mellom de ulike skjellene (Tilleggsfigur 1-3). Signalpeptidbindingsstedet ble kartlagt gjennom de tre forskjellige lokalitetene på SecA og SecYEG og fire forskjellige steder på signalpeptidet (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne studien fokuserte på å bestemme plasseringen av preproteinbindingsstedet på SecA før innsetting av preproteinet i SecYEG-kanalen. For å kartlegge bindingsstedet ble det utført FRET-eksperimenter mellom forskjellige regioner av preproteinet og tre forskjellige steder på SecA- og SecYEG-proteinene (figur 1A-D). Fra avstandene som er oppnådd og tredimensjonale strukturer av SecA, SecYEG og preproteinet, ble plasseringen av preproteinbindingsstedet spådd. I stedet for å bruke tre separate enheter (SecA, SecYEG og preprotein) for å utføre disse målingene, ble PhoA-signalsekvensen festet til SecA gjennom genetisk modifisering etter inkorporering av en Gly-Ser linker 2,3. For lett merking med fargestoffer ble Cys-rester eller ravmutasjoner introdusert ved rester 2, 22, 35 og 45 i PhoA-preproteinet (figur 1E).

Identifisering av nettsteder og merking
Et antatt bindingssted for signalsekvensen var tidligere identifisert ved hjelp av lignende FRET-kartleggingsmetoder 2,32. Disse og andre studier hadde identifisert to-helixfingeren (THF) og preproteinkryssbindingsdomenet som mulige bindingssteder for signalpeptidet med en foreslått orientering i en parallell posisjon til THF 33,51,52,53,54 (figur 1F). Dermed ble identifisering av potensielle merkingssteder på SecA- og SecYEG-proteiner gjort basert på plasseringen av det antatte bindingsstedet i SecA- og SecYEG-krystallstrukturen (vist i grønt i figur 1A-D). Tre steder ble valgt for å triangulere posisjonen til det antatte bindingsstedet, hvor de tre stedene i hovedsak danner en trekant rundt det antatte bindingsstedet. Som det fremgår av figur 1, var de tre lokalitetene innenfor FRET-området til bindingsstedet (50-70 Å). Fargestoffparet Alexa Fluor 488 (AF488) og Alexa Fluor 647 (AF647) ble valgt, da R0-verdien på 55,7 Å36 samsvarer godt med de forventede avstandene mellom de merkede stedene og det antatte bindingsstedet som sikrer målenøyaktighet.

De tre stedene som er valgt for merking, SecA37, SecA321 og SecY292 (vist som magenta, fiolette og cyan kuler i figur 1A-D) ligger i hele proteinkomplekset og danner en trekant rundt det antatte bindingsstedet. De tre stedene ble separat mutert til Cys-rester i en Cys-mindre mutant for å sikre at bare riktig posisjon ble merket 2,37. For SecY292-eksperimentene ble PhoA-preproteinstedene merket med AF647 og SecY-rest 292 ble merket med AF488 ved bruk av maleimidkjemi. I kimærproteinet ble stedene SecA37 og SecA321 merket med AF647 og preproteinet merket med AF488. I SecA-PhoA-kimærproteinet ble rester 2, 22, 37 og 45 av PhoA-preproteinsegmentet hver mutert til et ravkodon i individuelle proteiner. De gule kodonmutasjonene tillot innføring av unaturlig aminosyre, p-azidofenylalanin, ved disse posisjonene, som senere ble merket med AF488 ved hjelp av klikkkjemi39,40. Hver mutasjon ble generert og merket uavhengig for å sikre korrekt, differensiell merking av proteinkomponentene. Graden av merking ble bestemt for alle proteiner og måtte generelt være 50% eller bedre for å fortsette med prøven.

Bestemmelse av overføringseffektivitet og avstander
Før energioverføringsmålingene ble utført, ble donorkvanteutbyttet, overlappingsintegralet og R0-verdiene bestemt (trinn 3.4-3.6). Donorkvanteutbyttet ble målt i forhold til fargestoffet, fluorescein, som har et kvanteutbytte på 0,79 i 0,1 M NaOH47. Absorpsjons- og fluorescensemisjonsspektra ble oppnådd ved en rekke konsentrasjoner for å generere et lineært absorpsjonsplott i forhold til fluorescensutslippsintensitet for å bestemme kvanteutbyttet. I disse målingene er det avgjørende å måle absorpsjonen i det lineære området (0,1-1,0), og alle utslippsmålinger må genereres med de samme spalteinnstillingene. Siden disse verdiene brukes til å bestemme overlappende integraler og R0-verdier , bør de måles under FRET-forhold. Protein lokalt miljø påvirker fargestoffutslippet sterkt, og følgelig bør donorkvanteutbytter måles for hvert av de undersøkte stedene. Vi bemerker at nettsteder på SecA og SecYEG påvirker R0-verdiene sterkere enn de på PhoA-delen av kimæren. For fargepar med samme SecA- eller SecYEG-område er R0-verdiene vanligvis innenfor 5 Å fra hverandre; mens R0-verdiene kan variere med så mye som 20 Å for de to forskjellige SecA-lokalitetene (rester 37 vs. 321), noe som understreker viktigheten av å bestemme R0-verdier for hvert fargestoffpar (tabell 1).

Beregningen av R0 forutsetter at donor- og akseptorfargene roterer fritt, og i hvilken grad fargestoffene ikke roterer bidrar til den generelle usikkerheten i målingen. For å ta hensyn til fargestoffenes relative bevegelse og deres orienteringer, ble steady-state fluorescensanisotropimålinger utført på alle donor- og akseptorfargene i de forskjellige merkeposisjonene. Disse verdiene, som var i området 0,10-0,21, ble brukt til å beregne feilen knyttet til avstandsmålingene 2,3,48. De relativt høye anisotropiverdiene observert for både donor- og akseptorfarger tilsvarer en reduksjon i fargerotasjon, noe som er uforenlig med antagelsen om fri rotasjon. Mangelen på fri rotasjon genererer en feil på 19% -25% i avstandsberegningene. Som vist i tabell 1 førte dette til en gjennomsnittlig usikkerhet i de målte avstandene på høyst ± 15 Å. Ved kartlegging av FRET-avstandene er disse usikkerhetene i avstandsmålingene et viktig hensyn, som omtalt nedenfor.

Den beregnede avstanden mellom donor-akseptorpar er basert på forholdet mellom effektivitet og avstand, der en høyere effektivitet er en indikasjon på donor-akseptorpar atskilt med kortere avstand. For å bestemme FRET-effektiviteten oppnås fluorescensutslippsspektra begeistret ved donoreksitasjonsbølgelengden (488 nm) på kun donor- og donorakseptorprøver. Vanligvis betyr en reduksjon i donorutslippsintensitet tilstedeværelsen av energioverføring (trinn 5.1). Figur 1G viser donor-akseptorspektrene for SecA 37-resten med enten rest 2 eller 22 av FoA-kimæren. SecA37-resten er merket med AF647 eller akseptorfargen, og PhoA-restene er merket med AF488 eller donorfargen. I begge posisjoner reduseres donorfluorescensen, og en liten økning i akseptorfluorescensintensiteten kan ses i donorakseptorprøvene. Siden eksitasjon gjøres ved donoreksitasjonsbølgelengden på 488 nm, som ikke direkte opphisser akseptoren, observeres enhver akseptorfluorescens fra energioverføring. Dermed er reduksjonen i donorintensitet og samtidig økning i akseptorintensitet et resultat av energioverføring mellom de to fargestoffene. Signifikant er donorfluorescensintensiteten høyere for PhoA2-posisjonen (blå) i forhold til PhoA22-posisjonen (gul) i nærvær av akseptoren. Denne relative forskjellen i reduksjonen i donorintensitet indikerer at energioverføringen mellom PhoA2-resten og SecA37-resten er svakere enn overføringen mellom PhoA22- og SecA37-restene, noe som innebærer at PhoA2-resten ligger lenger unna SecA37 enn PhoA22. Avstander bestemmes ut fra forholdet mellom effektivitet og R0-verdier (trinn 5.1.4).

Siden steady-state fluorescensmålingene kunne representere et gjennomsnitt på to eller flere avstander, utførte vi også tidsoppløste fluorescensmålinger. For disse forsøkene måles levetiden til donorfargestoffet i nærvær og fravær av akseptoren (figur 1G). Hvis det var to forskjellige energioverføringsprosesser som bidro til den målte steady-state fluorescenseffektiviteten, ville de bli observert som diskrete levetider, forutsatt at de kunne løses innen instrumentets tidsoppløsning. For å forbedre evnen til å løse levetidene, bør 10.000 tellinger eller mer samles inn på det meste; Topphøyden eller toppkanaltellingene må imidlertid balanseres med tidspunktet for anskaffelse og potensiell skade på prøven. Tidsbestemte målinger ga enkeltlevetider for hvert donor-akseptorpar som stemte overens med bare én retning eller avstand mellom fargestoffene. Vi bemerker at små forskjeller i avstanden som observert i områdene som avdekkes av vår FRET-kartleggingsteknikk, ikke vil føre til løsbare levetider i systemet vårt. Videre var effektiviteten som bestemt av de tidsoppløste fluorescensmålingene i god overensstemmelse med de som ble bestemt fra steady state-målingene, noe som gir ytterligere støtte for at de målte effektivitetene oppstår fra bare én avstand mellom fargestoffparene3.

Kartlegging av FRET-avstandene på den 3-dimensjonale strukturen
Resonansenergioverføringsmålingene gir tilstrekkelig avstandsinformasjon til å identifisere bindingsstedet og orienteringen til signalsekvensen på SecA. De tre stedene på SecA og SecYEG sammen med de fire posisjonene på PhoA-regionen i SecA-PhoA-kimæren gir de 12 forskjellige avstandene som brukes til å kartlegge bindingsstedet (tabell 1). De tolv avstandene ble kartlagt på den tredimensjonale røntgenkokrystallstrukturen til Thermotoga maritima SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN) for å identifisere bindingsstedet til signalsekvensen33. Strukturen til SecA-SecYEG-komplekset ligner den som ble observert i E. coli som det fremgår av en in vivo fotocrosslinkingstudie55.

Vi bruker begynnelsen (PhoA2) og slutten (PhoA22) rester av PhoA-signalsekvensen i SecA-PhoA-kimæren for å illustrere hvordan reststeder ble identifisert på SecA-SecYEG-komplekset. Siden energioverføring kan forekomme i alle retninger, beskriver FRET-avstandene og tilhørende feil et sfærisk skall, med en av fargestedene fra donor-akseptorparet utpekt som sentrum. I denne studien danner restene SecA37, SecA321 og SecY292 sentrene til tre sfæriske skall som beskriver plasseringen av PhoA2-resten av signalsekvensen. Visualisering av de overlappende områdene som oppstår fra de tre separate stedene, SecA37 (magenta), SecA321 (lilla) og SecY292 (cyan) er vist i figur 3. Bare en del av hvert FRET-skall krysser med proteinstrukturen, og restene og ryggraden som faller innenfor det skallet er uthevet. Dermed er proteinområdene i skallet definert av SecA37-PhoA2-avstanden vist i magenta (figur 3A, E), mens regionene definert av SecA321-PhoA2 og SecY292-PhoA2-skjellene er vist i henholdsvis lilla (figur 3B, F) og cyan (figur 3C, G). Det antatte bindingsstedet, som hovedsakelig består av to-helixfingeren, er vist i grønt.

Som vist i figur 3, definerer hvert av disse FRET-skallene en relativt stor del av proteinkomplekset. For alle tre stedene krysser FRET-skallet med det antatte bindingsstedet; For SecA321-resten er imidlertid det kryssede området mindre og ligger mot endene av fingrene med betydelig overlapping med det spiralformede stillasdomenet. Skjæringspunktet eller fellesarealet for alle tre FRET-skjellene (figur 3D, H), definerer plasseringen av PhoA2-resten. Dette området er betydelig mindre enn hvert FRET-skall og omfatter bare en liten del av THF med et stort bidrag fra spiralstillaset. Skriptene som brukes til å generere FRET-skallene og de kryssede områdene for det molekylære visualiseringsprogrammet, PyMOL, er gitt i tilleggsinformasjon. Deler av skjellene er visualisert som rosa prikker på SecA-SecYEG-komplekset i tilleggsfigur 1-3.

En lignende strategi ble brukt til å identifisere plasseringen av PhoA22-resten. FRET-skjellene definert av PhoA22 FRET-avstandene (figur 4A-C, E-G) beskriver et mindre område i forhold til PhoA2-resten (figur 4D, Hvs. figur 3D, H). Vi tolker denne forskjellen til å antyde at PhoA2-resten og tilhørende region er mer fleksible og labile enn PhoA22. Det er viktig å merke seg at området som tilskrives PhoA22-resten ligger nærmere spissen av THF og munningen av SecYEG-kanalen, med regioner av SecY identifisert i fellesområdet (figur 3D, H). Alle tre fargekombinasjonene identifiserer regioner sammen med det antatte bindingsstedet; De kryssede fellesarealene sentrerer imidlertid PhoA22-plasseringen (figur 4D, H) i motsatt ende av THF i forhold til PhoA2-plasseringen (figur 3D, H). Disse funnene tyder på at signalsekvensen til preproteinet som strekker seg fra rester 2-22, ligger langs THF i en relativt ustrukturert tilstand. Dette resultatet er i samsvar med tidligere studier som tyder på at signalsekvensen binder seg til proteinet langs THF i en utvidet tilstand, og at den C-terminale enden av SecA i B. subtilis krystallstruktur i hovedsak modellerer strukturen til signalpeptidet og opptar samme sted (vist i rød figur 1F)2,26 . Vi benyttet en lignende tilnærming for å identifisere to steder i den tidlige modne regionen (rester 37 og 45) av SecA-PhoA preprotein chimera for ytterligere å definere bindingen og orienteringen av signalsekvensen og tidlig moden region som diskutert nedenfor. I andre studier har FRET-avstander blitt brukt effektivt til å avgrense en eksisterende struktur eller molekylær dynamikksimulerings-avledet modell 18,19,56; vi var ikke i stand til å gjøre dette, da det ikke eksisterer noen struktur for signalsekvensen bundet til SecA.  

Figure 1
Figur 1: Merkingssteder i SecA-SecYEG-kompleks med representative FRET-spektra. (A-D) Fire forskjellige visninger av SecA-SecYEG-kokrystallstrukturen (PDBID: 3DIN)33 der merkingsstedene til SecA37, SecA321 og SecY292 vises som henholdsvis magenta, fiolette og cyan kuler. A-C er sidevisninger av komplekset og D er en toppvisning. SecA er vist i lysegrått, SecYEG er vist i mørkegrått og det antatte bindingsstedet, THF, er vist i grønt. (E) Skjematisk av SecA-PhoA-kimærkonstruksjonen, som forbinder SecA-proteinet med PhoA-preproteinet gjennom en Ser-Gly-linker (ikke tegnet i skala). Merkingsstedene på PhoA-delen av kimæren er gitt i blått, grønt, gult og rødt, tilsvarende rester 2, 22, 37 og 45. (F) Bånddiagram over krystallstrukturen til B. subtilis SecA-protein (PDBID: 1M6N) farget av domene der nukleotidbindende domener 1 og 2 er vist i henholdsvis blått og lyseblått, preproteinkryssbindingsdomenet er vist i gull, den sentrale helixen i grønt, to-helixfingeren i cyan, det spiralformede vingedomenet i mørkegrønt og C-terminallinkeren i rødt26 . Den ustrukturerte C-terminalen fungerer som en modell av det bundne PhoA-signalpeptidet basert på en tidligereFRET-kartleggingsstudie 2. (G) Steady-state fluorescens spektra av donor bare og donor-akseptor prøver av SecA37-AF647 og PhoA2-AF488 FRET par og SecA37-AF647 og PhoA22-AF488 FRET par. Reduksjonen i donorintensitet for donor-akseptorprøven er en indikasjon på energioverføring. Større energioverføring skjer fra PhoA22 i forhold til PhoA2-området basert på reduksjonen i donorintensiteten. (H) Kun tidsoppløst fluorescensdonor (magenta) og donorakseptor (lys magenta) henfallsspektra i SecA37-AF647 og PhoA22-AF488 FRET-paret. Instrumentresponsfunksjonen er vist i grått. Donor-akseptorkomplekset gir kortere forfall og dermed en raskere levetid forenlig med energioverføring. Alle molekylære strukturer ble generert med den angitte PDB-filen og PyMOL50. Figur 1E-H er modifisert fra Zhang et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Brukergrensesnittet til FluorEssence-programmet. (A) Åpningsvinduet vises med en sirkel rundt den røde M-en. Dette må klikkes for å koble programmet til fluorometeret. (B) Eksperimentoppsettvinduet illustrerer de forskjellige områdene (monoer, detektorer, tilbehør) der skanningsrelevante parametere er angitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: FRET avstandsskjell bestemt for SecA-PhoA2-posisjonen. FRET avstandsskall konstruert fra FRET-avstandene og tilhørende usikkerheter (tabell 1) er avbildet på SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN). (A-C) FRET avstandsskjell for PhoA2-stedet konstruert med henholdsvis SecA37 (magenta), SecA321 (fiolett) og SecY292 (cyan) i midtposisjonen. Skallene er farget i henhold til senterresten. (D) Skjæringspunktet mellom de tre FRET-skjellene definerer plasseringen av PhoA2, vist i blått. (E-H) Visningene roteres omtrent 180° fra AD. Alle molekylære strukturer ble generert med den angitte PDB-filen og PyMOL50. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: FRET avstandsskjell bestemt for SecA-PhoA22-posisjonen. FRET avstandsskjell konstruert fra FRET-avstandene og tilhørende usikkerheter (tabell 1) er avbildet på SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN). (A-C) FRET avstandsskall for PhoA22-stedet konstruert med henholdsvis SecA37 (magenta), SecA321 (fiolett) og SecY292 (cyan) i midtposisjonen. Skallene er farget i henhold til senterresten. (D) Skjæringspunktet mellom de tre FRET-skjellene definerer plasseringen av PhoA22, vist i gult. (E-H) Visningene roteres omtrent 180° fra AD. Alle molekylære strukturer ble generert med den angitte PDB-filen og PyMOL50. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: FRET-kartlagte steder av PhoA2, PhoA22, PhoA37 og PhoA45 projisert på B. subtilis SecA -Geobacillus thermodenitrificans SecYE cocrystal struktur (PDBID: 5EUL). (A) Farging av SecA-SecYE som i figur 1. OmpA-peptidsubstratet satt inn på slutten av THF er vist i rosa. FRET-kartlagte regioner ble generert i nærvær av ATP-γS, med PhoA2 vist i blått, PhoA22 i grønt, PhoA37 i gult og PhoA45 i rødt. Overlappende regioner er vist i oliven (PhoA22 og PhoA37) og oransje (PhoA37 og PhoA45). Peptidsubstratet (rester 749-791, cyan) ble skåret ut fra den opprinnelige strukturen og modellert inn i det antatte bindingsområdet uten endringer i strukturen (sirklet i rødt). (B) Forstørret visning av det modellerte peptidsubstratet. Rester 2 (Lys), 22 (Tyr) og 37 (Gly) av OmpA-peptidsubstratet er avbildet i henholdsvis blå, grønn og gul. Disse restene i de modellerte peptidene viser utmerket samsvar med de forutsagte FRET-kartlagte lokalitetene. For klarhetens skyld er nanokroppen i den opprinnelige strukturen utelatt. Dette tallet er modifisert fra Zhang et al.3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

merket nettsted på SecA-PhoA-SecYEG kompleks Merket sted på PhoA peptid del av SecA-PhoA Chimera
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 PhoA37-AF488 PhoA45-AF488
Sek 37-AF467-PhoA
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
FRET effektivitet 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
avstand 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
Seca321-AF647-PhoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
FRET effektivitet 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
avstand 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 PhoA22-AF647 PhoA37-AF647 PhoA45-AF647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
FRET effektivitet 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
avstand 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
tilpasset fra referanse 3.
R0-verdier gitt i angstrom ble beregnet som beskrevet i teksten
FRET-effektiviteten ble beregnet ut fra reduksjonen i donorfluorescensintensitet i nærvær av akseptoren som beskrevet. Feilen rapporteres som SD fra tre uavhengige målinger.
Donor-akseptoravstander (R) er gitt i angstrom og beregnet som beskrevet i teksten. Feilen som rapporteres skyldes en vurdering av den eksperimentelle feilen og den som skyldes orienteringen av fargestoffene.  Fargeretningen er estimert ut fra steady state fluorescensanisotropi

Tabell 1: Overføringseffektivitet og avstander bestemt for SecA-PhoA-SecYEG-komplekset. FRET-effektivitet, avstander og R0-verdier er gitt for de 12 avstandene som brukes til å kartlegge preproteinbindingsstedet.

Supplerende figur 1: FRET avstandsskall, vist i rosa prikker, bestemt for SecA37-resten og PhoA 37-resten på SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN). Sek A er vist i lysegrått, SecYEG er vist i mørkegrått og SecA37-restene er vist i magenta. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: FRET avstandsskall, vist i rosa prikker, bestemt for SecA321-resten og PhoA 37-resten på SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN). Sek A er vist i lysegrått, SecYEG er vist i mørkegrått og SecA321-restene er vist i fiolett. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: FRET avstandsskall, vist i rosa prikker, bestemt for SecY292-resten og PhoA 37-resten på SecA-SecYEG-komplekset (PDBID: 3DIN). Sek A er vist i lysegrått, SecYEG er vist i mørkegrått og SecY292-resten er vist i cyan. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gjennom bruk av FRET-kartleggingsmetodikken identifiserte vi signalsekvensbindingsstedet på SecA-proteinet. Det er viktig at tilstedeværelsen av en 3-D krystallstruktur av komplekset i stor grad lettet vår studie. Styrken til denne kartleggingsmetodikken ligger i evnen til å bruke en eksisterende struktur for å identifisere steder for merking. Denne metoden kan ikke brukes til å bestemme en 3D-struktur; Imidlertid er bestemmelse av strukturelle elementer56, forfining av en eksisterende struktur49, bestemmelse av et bindingssted 2,32, eller belysning av dynamisk bevegelse57, alle mulige anvendelser av denne metoden.

I SecYEG-SecA-PhoA-komplekset danner de tre merkestedene en trekant rundt det antatte bindingsstedet (figur 1). Bruken av flere avstandsmålinger fra hjørnene i denne trekanten til samme rest foredler posisjonsinformasjonen som ligner på GPS-navigasjonsmetoder. Tre lokaliteter, SecA37, SecA341 og SecY292, ble identifisert på SecA og SecY sammen med fire lokaliteter, PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 i signalsekvensen og den tidlig modne regionen av preproteinet for å gi totalt 12 avstander for kartlegging av plasseringen av signalpeptidet (tabell 1). Viktigere, for å forbedre nøyaktigheten av avstandsmålingene, bør merkingssteder være plassert i relativt statiske områder av proteinet, for eksempel i sekundære strukturelementer i stedet for løkker. Videre bør nettsteder også være på steder som er relativt tilgjengelige for løsemiddel for enkel og økt effektivitet av merking. Innenfor SecA-PhoA-SecYEG-komplekset var ytelsen til avstandsmålinger fra trekantstedene eller hjørnene til rester i bindingssubstratet tilstrekkelig til å lokalisere restene i bindingssubstratet til et relativt lite område (figur 3D, H og figur 4D, H). Identifisering av det kryssede området fra flerdistansemålingene forbedrer signifikant plasseringen fra måling av enkeltavstand, som vist i figur 3 og figur 4. Når du bruker denne metoden, anbefales det derfor sterkt å måle flere avstander. Selv om denne metoden kan identifisere regioner av molekyler involvert i binding, for eksempel, gir den ikke presis strukturell informasjon; slik informasjon oppnås best fra andre strukturelle metoder som røntgen, NMR og kryo-EM. FRET avstander kan brukes til å effektivt avgrense en eksisterende struktur18,19 eller modell, i dette tilfellet, som ikke var mulig som ingen modell av signalsekvensen bundet til SecA eksisterer.

For å sikre at fargestoffmerking skjer på bare ønskede steder og FRET-avstandsmålinger er nøyaktige, foretrekkes bruk av mutagenese for merking. Generering av en Cys-mindre mutant krever relativt konservativ mutasjon av Cys-rester til Ser eller lignende rester i det ellers villtypeproteinet ved bruk av stedsrettede mutagenesemetoder. I den nåværende studien ble Cys-mutasjoner introdusert i Cys-frie versjoner av SecA og SecYEG for merking37. Aktiviteten til det muterte proteinet ble verifisert med en vekstanalyse etterfulgt av en in vitro malakittgrønn ATPase-analyse41,42. Relevante aktivitetsanalyser avhenger av proteinets funksjon, for eksempel for DNA-bindende proteiner, en DNA-bindende analyse vil være passende58. Unnlatelse av å sikre merking på bare ett sted kan føre til merking av mer enn ett sted med samme fargestoff, noe som betydelig kompliserer avstandsbestemmelsene. Dermed kan innføringen av en andre etikett på det samme proteinet gjøres ved inkorporering av unaturlig aminosyre ved stedsrettet mutagenese. Vi brukte denne metoden for å merke SecA-PhoA-kimæren på steder som er forskjellige fra Cys-rester ved å introdusere den unaturlige aminosyren, p-azidofenylalanin og merking med klikkkjemi39,40.

En ekstra viktig vurdering av denne metoden er valget av fargestoffer som brukes og den tilhørende R0-verdien . Etter identifisering av potensielle merkesteder kan avstandene som skal måles estimeres fra 3D-strukturen. Med denne informasjonen kan etterforskerne velge fargestoffer par med R0-verdier som spenner over ønsket område av forventede avstander. For eksempel har fargestoffparet AF488-AF647 en beregnet R0 på 55,7 Å, noe som gir et godt utvalg for merking av steder som ligger anslagsvis 40-75 Å unna det antatte bindingsstedet. Selv om R0-verdiene beregnet i trinn 2.2 er nyttige for å velge hvilket fargestoffpar som skal brukes til systemet ditt, kan vedlegg av fargestoffene til proteinet endre egenskapene betydelig. For større nøyaktighet bør R0-verdier beregnes ut fra in situ-eksperimenter utført med merket protein (trinn 3.1 - 3.6.5).

Måling av overføringseffektivitet kan gjøres enten ved å overvåke steady-state fluorescensutslipp og observere enten en reduksjon i donorutslipp eller en økning i akseptorutslipp. Selv om observasjon av begge effektene er ønskelig, kan effektiviteten beregnes ut fra enten som beskrevet 5,8. Effektiviteten kan også beregnes ut fra reduksjonen i donorlevetid i donorakseptorprøven i forhold til donorprøven. Bestemmelse av effektivitet ved mer enn én metode anbefales, spesielt bruk av tidsoppløste metoder for å fastslå den relative homogeniteten av de målte effektivitetene.

Kartleggingsmetoden tillot oss også å bestemme den relative orienteringen av signalsekvensen og de tidlige modne områdene av PhoA-preproteinet i forhold til SecA og det antatte bindingsstedet. En SecA-SecYEG røntgenkrystallstruktur og påfølgende kryo-EM-studie ga klarhet om signalsekvensens struktur og preproteinets tidlig modne region med hensyn til kanalen og SecA34,35. I røntgenstrukturen ble rester 1-41 av OmpA-preproteinet festet til spissen av to-helixfingeren og visualisert i en hårnålsstruktur i kanalen (vist i rosa, figur 5). Plasseringen av de fire PhoA-restene i SecA-PhoA-kimæren ble kartlagt på denne strukturen ved hjelp av samme protokoll som beskrevet ovenfor. Som vist i figur 5, er plasseringen av PhoA37- og PhoA45-restene (gul, oransje, rød) mellom PhoA2 og PhoA22, med PhoA45 nærmere PhoA2. Disse funnene, spesielt plasseringen av PhoA45, antydet at PhoA-preproteinet dannet en hårnålsstruktur.

For ytterligere å validere vårt FRET-identifiserte bindingssted, utførte vi en sammenligning av våre kartlagte lokaliteter med OmpA-preproteinet ved å fjerne preproteinstrukturen på 41 rester fra kanalen og modellere den inn i regionene definert ved FRET-kartlegging (figur 5, cyan). Uten noen endring av preproteinrøntgenstrukturen finner vi at plasseringen av rester 2, 22 og 37 (vist i blått, grønt og gult) på OmpA preproteinfragmentets utskårne struktur stemmer bemerkelsesverdig godt overens med de FRET-kartlagte stedene (figur 5B) og antyder at hårnålsformene før kanalinngang. OmpA-preproteinet slutter ved rest 41 i røntgenkrystallstrukturen; C-terminalen til SecY, som er ustrukturert, gir imidlertid en indikasjon på den mulige plasseringen av PhoA45. I vår modellerte struktur sitter hårnålssløyfen ved kanalens munn, klar til å lette translokasjonen av preproteinet over membranen. I dette eksemplet forbedrer FRET-kartleggingsmetoden eksisterende informasjon om den statiske SecA-SecYEG-strukturen, ved å gi et hint om den dynamiske bevegelsen som trengs for proteintranslokasjon over membranen. Selv om den ikke er egnet for de novo strukturbestemmelser, kan FRET-kartleggingsmetodikken fremme den nåværende forståelsen av struktur-funksjonsforhold, gjennom belysning av bindingssteder og dynamiske bevegelser hvis 3-dimensjonal strukturell informasjon er tilgjengelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health stipend R15GM135904 (tildelt IM) og National Institutes of Health Grant GM110552 (tildelt DBO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Biokjemi Utgave 181 fluorescens energioverføring SecA proteintranslokasjon FRET kartlegging
Förster Resonance Energy Transfer Mapping: En ny metode for å belyse globale strukturelle egenskaper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter