Summary
该研究详细介绍了FRET映射的方法，包括标记位点的选择，染料的选择，采集和数据分析。该方法可有效确定蛋白质系统中的结合位点、构象变化和动态运动，如果与现有的3-D结构信息结合使用，这种方法最有用。
Abstract
Förster共振能量转移（FRET）是一种基于荧光的成熟方法，用于成功测量 体外 生物分子内和细胞内的距离。在FRET中，通过荧光强度或寿命的变化来测量能量转移的效率与两个荧光分子或标记之间的距离有关。从远处测定动力学和构象变化只是该方法应用于生物系统的一些示例。在某些条件下，该方法可以通过提供有关动力学，柔韧性和对结合表面的适应性的信息来增加和增强现有的X射线晶体结构。我们描述了使用FRET和相关距离测定来阐明结构性质，通过识别结合位点或二聚体亚基的方向。通过明智地选择标记位点，并经常采用多种标记策略，我们成功地应用了这些映射方法来确定蛋白质-DNA复合物和SecA-SecYEG蛋白质易位系统中的全局结构性质。在SecA-SecYEG系统中，我们使用FRET映射方法来识别前蛋白结合位点并确定结合信号序列区域的局部构象。本研究概述了进行FRET绘图研究的步骤，包括识别适当的标记位点，讨论可能的标记，包括非天然氨基酸残基，标记程序，如何进行测量以及解释数据。
Introduction
对于蛋白质，动力学的阐明以及3维（3-D）结构知识可以增强对生物分子系统的结构 - 功能关系的理解。结构方法，如X射线晶体学和低温电子显微镜，捕获静态结构，并且通常需要确定多个结构以阐明生物分子结合和动力学的各个方面1。本文讨论了一种基于解决方案的方法来映射全局结构元素，例如结合位点或结合相互作用，这些元素可能更短暂，并且不容易被静态方法捕获。这种方法的强候选系统是先前已通过X射线晶体学，NMR光谱或其他结构方法确定3-D结构的系统。在这种情况下，我们利用SecA-SecYEG复合物的X射线晶体结构（蛋白质一般分泌途径中的核心参与者），在前蛋白穿过膜2之前，使用Förster共振能量转移（FRET）绘制信号肽结合位点的位置。通过基因修饰对生物系统的操纵加上我们对3-D结构的了解，使得能够在插入通道 3之前立即确定信号序列和早期成熟区域的构象。
FRET涉及能量从一个分子（供体）到另一个分子（受体）的无辐射转移，其距离依赖性方式是通过空间4，5。通过供体的减少或受体荧光强度的增加来监测这种转移的效率。能量传递的效率可谓
E = R06/（R06 + R6）
其中 R0 值是传输效率为 50% 的距离6。该技术以前被描述为分子尺，并且根据供体 - 受体染料4，7，8，9的身份，有效地确定2.5-12nm范围内的距离。使用或不使用受体的供体荧光强度和寿命允许确定转移效率，因此距离为5，8。由于该技术的可用性，该方法的灵敏度和易用性，FRET在单分子荧光光谱和共聚焦显微镜6等领域也得到了广泛的应用。荧光蛋白（如绿色荧光蛋白）的出现使得细胞内动力学和活细胞成像的观察相对容易10，11。许多 FRET 应用程序（如此类）将在此虚拟问题中详细讨论。
在这项研究中，我们特别关注使用FRET测量来产生距离值以确定结构细节。以前，FRET测量已被有效地用于确定DNA分子在与蛋白质12，13，14结合时的构象，蛋白质的内部动力学以及蛋白质结合相互作用15，16，17。这种方法的优点在于能够确定具有相对较少材料量的溶液中的柔性和动态结构单元。值得注意的是，当与现有结构信息结合使用时，这种方法特别有效，不能用作3-D结构测定的手段。如果工作建立在现有的结构信息之上，并且通常与计算仿真18，19相结合，则该方法可提供最佳的结构洞察力和细化。在这里，描述了使用从稳态和时间分辨的FRET测量中获得的距离来绘制结合位点，其位置尚不清楚，在SecA-SecYEG复合物的现有晶体结构上，主要蛋白质在一般分泌途径3中。
一般分泌途径是一种高度保守的系统，从原核生物到真核生物再到古菌，介导蛋白质穿过或进入膜到其在细胞中的功能位置的运输。对于革兰氏阴性菌，例如我们研究中使用的生物体 大肠杆菌 ，蛋白质入或穿过内膜转移到周质。细菌SecY通道复合物（称为转座蛋白）与其他蛋白质协调以转移新合成的蛋白质，该蛋白质通过通常位于N端20，21的信号序列被引导到其在细胞中的正确位置。对于与围质结合的蛋白质，ATPase SecA蛋白与核糖体的出口隧道相关，并且在翻译了大约100个残基22个后与前蛋白相关。与SecB伴侣蛋白一起，它将前蛋白维持在未折叠状态。SecA与SecYEG转座结合，并通过ATP水解的许多循环，促进蛋白质在膜上的转运23，24。
SecA是一种多结构域蛋白，以胞质和膜结合形式存在。SecA是细胞质基质中的同源二甲基蛋白，由前蛋白结合或交联结构域25，两个核苷酸结合结构域，螺旋翼结构域，螺旋支架结构域和两个螺旋指（THF）26，27，28，29 组成（图1）。在先前对SecA-SecYEG复合物的晶体学研究中，THF的位置表明它积极参与蛋白质易位，随后与信号肽的交联实验进一步确定了该区域在蛋白质易位30，31中的重要性。先前使用FRET映射方法的研究表明，外源信号肽与SecA2，32的该区域结合。为了在插入SecYEG通道之前充分了解信号序列的构象和位置以及前蛋白的早期成熟区域，创建了一种蛋白质嵌合体，其中通过Ser-Gly连接子将早期成熟区域的信号序列和残基连接到SecA（图1）。使用这种生物学上可行的结构，进一步证明前蛋白的信号序列和早期成熟区域以平行的方式与THF结合2。随后，使用FRET映射方法阐明了在SecYEG存在下信号序列和早期成熟区域的构象和位置，如下所述3。
了解SecA-SecYEG复合物33，34，35的3-D结构和结合位点的可能位置，使我们能够明智地将供体 - 受体标签放置在各个FRET距离的交集识别结合位点位置的位置。这些FRET映射测量表明，信号序列和前蛋白的早期成熟区域形成发夹，尖端位于SecYEG通道的口，表明发夹结构在通道插入之前是模板化的。
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Protocol
1. 标签站点的选择
- 鉴定至少三个潜在的标记位点，以对现有蛋白质结构上的假定结合位点进行三角测量。在这种情况下，鉴定出通过遗传融合附着在SecA上的SecA，SecYEG和前蛋白2。
- 选择在推定结合位点的25-75 Å范围内的标记位点，并且在蛋白质的相对静态区域中，距离将决定要使用的特定FRET染料对36。将标记位点定位在彼此相对不同的蛋白质区域中，因此这些位点描述三角形的顶点，推定的结合位点位于中心（图1A-D）。
- 在目的标记位点引入或鉴定半胱氨酸（Cys）残基，在没有其他Cys残基的蛋白质中，以提高特定位点37，38的标记效率。
- 引入非天然氨基酸，例如，对叠氮苯丙氨酸用于点击化学标记，以便用不同的染料有效地标记一种蛋白质在两个不同的位置39，40。
- 测试Cys突变体的功能丧失。使用适当的活性测定法验证无Cys突变体和非天然氨基酸突变体的活性。在这种情况下，通过生长测定法验证活性，然后进行 体外 孔雀石绿色ATP酶测定32，41，42
2. 标记蛋白质
- 将一个或多个感兴趣的蛋白质纯化至至少95%的纯度，以进行准确的标记。按照参考文献3中详述的方案纯化SecA和SecYEG蛋白。确保至少5μg纯化的蛋白质用于此步骤，因为在标记过程中会丢失一些蛋白质。
- 根据其 R0 值和标记位点之间的预测距离，选择两种染料进行 FRET 测量。使用荧光蛋白数据库中的信息估计R0 值并观察供体发射和受体吸光度重叠，该数据库还给出了常用染料的光谱（https://www.fpbase.org/spectra/）36。
注意：R0 定义为给定染料对的转印效率为50%的距离。对于映射实验，预测距离应接近染料对的R0 值，以确保可以准确测量距离。 - 标记步骤 1.1.1 中标识的位置。与供体-受体染料对。
- 根据制造商的说明标记蛋白质，特别注意参数，例如最佳蛋白质浓度，温度，pH值，时间长度和所用特定染料的缓冲液43，44。
- 在25 mM三盐酸（pH 7.5），25 mM KCl，1mM EDTA（TKE）缓冲液中以1-2mg / mL或约10μM的浓度制备蛋白质。将染料溶解在二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亚砜（DMSO）中，终浓度为1mM。在搅拌的同时滴加染料至溶液中，以达到染料：蛋白质摩尔比为5∶1（50μM染料：10μM蛋白质）。
- 让反应在室温（RT）下在玻璃小瓶中轻轻摇动或在4°C下过夜4小时。 通过加入β-巯基乙醇来停止反应。
注意：如果蛋白质与Tris缓冲液不相容，可以使用磷酸盐或HEPES缓冲液。将pH值保持在7.0-7.5范围内。如果蛋白质具有二硫键，请在标记前添加还原剂，例如DTT或TCEP。在添加染料之前，通过透析或凝胶过滤去除DTT。
- 为了获得准确的FRET测量，使用具有适当分子量截止值（MWCO）的离心浓缩器去除游离染料，以使游离染料流过，同时保留标记的蛋白质。
- 通过在3mL浓缩器的上部放置〜1 mL水来制备浓缩器膜，然后将水离心通过膜（在4，300× g下至少10分钟）。
- 通过在浓缩器中离心标记的样品（在4，300× g下20分钟）除去游离染料。重复3-4次，处理流过。
- 使用紫外-可见吸收光谱检查标记蛋白的标记效率。
注意：FRET 测量要求标记效率达到 50% 或更高。较低的标记效率会降低 FRET 信号，并可能导致测量不准确。 - 获得标记蛋白质的紫外-可见光谱，范围为250-700nm，以观察蛋白质吸收带和染料最大吸收带。测量染料吸收峰处和蛋白质280nm处的吸光度。
- 确定蛋白质的浓度，并使用校正因子CF和以下等式45，46校正染料的任何贡献：
其中C是蛋白质的浓度（M），A280是样品在280nm处的吸光度，Amax是染料吸收最大值处的吸光度，ε蛋白质是280nm处蛋白质的消光系数，CF是校正因子，A'280 / A'max，其中A'280是280nm处的吸光度，A'max是染料在峰值处的吸光度。 - 使用以下等式确定标签效率：
其中 ε染料是染料 的摩尔消光系数，C是步骤2.4.5中确定的蛋白质浓度，E是标记效率。重复步骤2.4.2，直到标记效率值趋于稳定且小于100%。
3. 确定 R 0 值
- 原位测量 R0 值。以相同浓度的总蛋白4μM制备两个蛋白质样品，一个仅使用供体染料标记的蛋白质，另一个仅使用受体染料标记的蛋白质。对于 SecA，蛋白质浓度为 4 μM SecA 单体对于这些测量效果很好。
- 为 1 cm x 1 cm 比色皿准备 2.5 mL 的样品体积，为 5 mm x 5 mm 比色皿准备 600 μL 的样品，或为 3 mm x 3 mm 比色皿准备 200 μL 的样品体积。
- 如果使用分光荧光计，请打开荧光计并在荧光软件中打开光谱采集和分析程序。单击红色的 M 将计算机连接到仪器（图2A），然后选择 发射光谱。
- 使用“收集实验”菜单项输入扫描参数，例如激发波长、发射扫描范围、温度和样品更换器位置（图2B）。
- 单击 RTC 并使用设置为染料吸收最大值的激发波长监测峰值处的荧光发射，从而优化仪器设置（例如光谱狭缝）。对于SecA，设置以下设置：带通为1 nm;激发和发射狭缝分别为 1 和 1.5 mm，温度为 25 °C，搅拌速度为 250 rpm。
注意：不要超过仪器的每秒计数 （cps） 容量（通常为 2 x 106 cps）。
- 将供体标记的蛋白质样品置于样品支架中，然后单击 “运行 ”，通过在染料吸收最大值（例如，AF488为488 nm）处激发样品并扫描发射峰（对于仅用AF488标记的仅供体SecA蛋白为505-750 nm）来生成仅用供体染料标记的蛋白质（仅供体蛋白质）的发射扫描。
- 通过将扫描延长25-50 nm超过峰值的末尾来建立扫描基线。通过对不同浓度的样品进行吸收和荧光测量来测量仅供体蛋白质的量子产率，如47所述。为这些测量保持相同的狭缝设置。
- 使用游离供体染料作为量子产率的参考。获得不同浓度下仅供体蛋白和游离染料的至少四次测量值，以进行准确测定。
- 绘制荧光强度或积分面积与仅供体蛋白和游离染料或参比物的吸光度的关系图。确定仅供体蛋白（斜率D）和参比蛋白（斜率R）的斜率。
- 量子产率（Φ）使用以下等式计算：
这里的ΦD 是供体蛋白的量子产率，ΦR 是游离染料的量子产率（这通常可以从制造商处获得）， 斜率D 和 斜率R 是步骤3.4.2中确定的斜率，分别用于供体蛋白和参考，分别 ηD 和ηR 分别表示供体纯蛋白质和无参考染料溶液的折射率 47。
- 使用1 cm的光程细胞获得仅受体蛋白的吸收光谱。通过将吸收光谱除以染料浓度，生成仅受体蛋白的消光系数谱。
- 使用图形分析程序生成光谱重叠积分 J （λ） 。标准工作表程序（例如电子表格）也可用于此过程。
- 将仅供体蛋白的荧光发射光谱（步骤3.4）乘以仅受体蛋白的消光系数谱，以生成重叠光谱。
- 将得到的重叠谱乘以 λ4。
- 通过重叠区域的积分来确定曲线下的面积。重叠区域定义为供体发射光谱乘以受体消光系数光谱产生正值的区域。光谱重叠积分定义为：
其中 FD （λ） 是仅供体蛋白（在步骤3.4中获得）的发射光谱，εA（λ） 是仅受体蛋白的消光系数谱，并且具有M-1 cm-1 （在步骤3.5中获得）的单位。得到的光谱重叠积分的单位应为 M-1 cm-1nm4。 - 规范化光谱重叠积分。将重叠积分除以相同光谱范围内仅供体蛋白质光谱的积分面积：
- 使用以下等式计算Å中的R0 值：
其中 κ2 是取向因子，对于自由旋转的染料，通常取为 2/3， η 是折射率，对于稀水溶液可以近似为 1.33， QD 是供体的量子产率（步骤 3.4）， J（λ） 是步骤 3.6.35 中确定的光谱重叠积分。注意：如果染料不能自由旋转，可以按照Ivanov 48 的描述引入校正，并由Auclair49 和Zhang2，3实施。
4. 执行频率频谱测量
- 以相同浓度制备供体纯蛋白、仅受体蛋白和供体-受体蛋白样品;建议浓度为4μM。如果使用 3 mm x 3 mm 比色皿，则使用 200 μL 溶液，如果使用 5 mm x 5 mm 比色皿，则使用 600 μL，如果使用 1 cm x 1 cm 比色皿，则使用 2.5 mL。
- 通过使用相等的摩尔量的仅供体和仅受体蛋白来制备供体 - 受体蛋白样品。
- 通过在仅对照供体和仅受体样品中引入相同量的未标记蛋白质，将相同量的标记样品仅对供体和仅受体蛋白质样品中引入相同量的摩尔量。例如，对于相同浓度的溶液，每个仅供体FRET样品将含有100μL仅供体蛋白质和100μL未标记蛋白质，体积为200μL。
- 仅生成供体、仅受体和供体-受体样品的荧光发射光谱。按照步骤 3.2 中所述优化信号。优化后，为所有样品保持相同的设置。
- 按照步骤3.3所述获取仅供体扫描。在供体染料吸收最大值处激发溶液，并扫描供体和（预期）受体发射峰。
- 将样品更换为仅受体蛋白，或将样品更换器位置更改为含有仅受体蛋白的比色皿。
- 使用与步骤4.2.1相同的设置，仅用受体染料（仅受体蛋白质）标记的蛋白质获得发射扫描。在供体激发波长处激发样品。
注意：该光谱为在供体波长处激发的受体量（步骤5.1.2中的FA ）提供校正 - 将样品交换为供体-受体蛋白样品，或将样品更换器位置更改为含有供体-受体标记蛋白的比色皿。
- 使用与步骤4.2.1和4.2.3中相同的设置获得供体 - 受体蛋白质样品的发射扫描。
- 对于所有光谱，通过减去扫描结束时测量的背景计数来校正背景荧光。
- 测量仅供体和供体-受体样品的供体寿命，如步骤4.1.2所述制备。使用时间相关的单光子计数荧光仪器，该仪器能够在纳秒（10-9 s）时间范围内测量和分辨荧光衰变。
注意：对于FRET染料对，将激发光源与供体染料的吸收最大值相匹配。- 打开仪器。打开采集软件，使用仪器控制软件与荧光光谱仪进行数据采集。
- 对于采集，选择 TCSPC衰减，时间范围为55 ns，增益为1和4096通道。
- 使用非乳制奶精或商业散射溶液获得仪器响应函数（IRF），并监测490nm处的散射。调整狭缝设置，并根据需要使用中性密度滤光片，以保持足够低的计数率，以避免脉冲堆积5.单击“ 接受 ”，然后单击 “启动”。这将开始收购。
注意：对于 180 kHz 的重复频率，最大计数率为 4000 cps。 - 在490 nm处收集IRF，直到峰值通道最多有20，000个计数。在测量每次荧光衰变之前和之后收集IRF。
- 通过监测供体发射波长520nm处的荧光发射，获得仅供体和供体 - 受体样品的荧光衰变。
- 调整狭缝设置，使最大计数速率达到或更低。对于蛋白质样品，狭缝设置通常为 15-20 nm 带通。收集衰变，直到在峰值通道中获得20，000个计数。
- 分析衰变或荧光强度（I）作为荧光寿命（τ）的时间（t）的函数。使用以下等式将衰减拟合为指数之和：
其中 αI 是第 i个 分量的主要因子，τI 是寿命。拟合与IRF重新结合以匹配荧光衰变。从简化的 Χ2 参数中判断拟合质量。
5. 弗雷特数据分析
- 仅使用以下等式从供体 - 受体样品相对于供体的供体强度降低来计算FRET效率。
其中FDA 是供体-受体样品的荧光强度，FD 是供体荧光峰值处唯一供体样品的荧光强度。如果数据有噪声，请使用峰值的集成区域。- 更正仅供体样本和供体-受体样本之间在标记方面的任何差异。根据捐赠者的标记程度计算校正，如下所示。
其中 ，fDA 是供体-受体样本中的供体标记效率， fD 是仅供体样本中的供体标记效率。 - 通过从供体 - 受体蛋白谱中减去仅受体蛋白谱（步骤4.2），校正受体荧光对供体激发光谱的任何贡献。
- 校正仅受体蛋白相对于供体 - 受体蛋白样品的标记效率差异，得出以下用于计算效率的等式：
其中 fA 表示受体标记的小数。该方程包括由于染料标记和受体荧光引起的所有校正。 - 使用以下等式计算 FRET 与效率的距离：
使用在步骤 3.6.5 中获得的 R0 值。 - 使用仅供体和在步骤 4.3.3-4.3.5 中测量的供体-受体样品的荧光寿命计算 FRET 效率：
- 使用振幅加权寿命计算 FRET 效率并与稳态结果进行比较5.
- 按照步骤5.1.4计算与荧光寿命确定的效率的距离。比较 FRET 效率和距离的稳态值和时间分辨值，并确保它们彼此误差范围内。
- 更正仅供体样本和供体-受体样本之间在标记方面的任何差异。根据捐赠者的标记程度计算校正，如下所示。
6. 映射距离
- 使用计算的距离将结合位点映射到三维结构上。使用步骤5.1.4中给出的方程和每个FRET对在步骤3.6.5中获得的R0 值计算所有染料对和检查的位置的所有染料对的距离和误差。
- 使用 PyMOL50 等 3-D 图形查看程序将距离映射到结构上（ 补充文件中给出的脚本）。脚本中的命令可以直接输入到命令窗口中，并提供适当的距离信息。
- 为测量的每个距离和相关误差生成一个外壳（图3， 图4， 补充图1-3）。
- 通过不同外壳的交集映射位置（补充图1-3）。通过SecA和SecYEG上的三个不同位置以及信号肽上的四个不同位置映射信号肽结合位点（图1）。
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Representative Results
这项研究的重点是在将前蛋白插入SecYEG通道之前确定SecA上前蛋白结合位点的位置。为了绘制结合位点，在前蛋白的不同区域和SecA和SecYEG蛋白上的三个不同位置之间进行了FRET实验（图1A-D）。从获得的距离和SecA，SecYEG和前蛋白的三维结构中，预测了前蛋白结合位点的位置。不是使用三个独立的实体（SecA，SecYEG和前蛋白）来执行这些测量，而是在掺入Gly-Ser链接子2，3后通过基因修饰将PhoA信号序列连接到SecA。为了用染料轻松标记，在PhoA前蛋白中的残基2，22，35和45处引入了Cys残基或琥珀色突变（图1E）。
识别场地和标签
信号序列的假定结合位点先前已使用类似的FRET映射方法2，32进行鉴定。这些和其他研究已经将双螺旋指（THF）和前蛋白交联结构域确定为信号肽的可能结合位点，其建议的方向与THF33，51，52，53，54平行（图1F）。因此，根据SecA和SecYEG晶体结构中推定结合位点的位置（图1A-D中以绿色显示），对SecA和SecYEG蛋白上的潜在标记位点进行鉴定。选择三个位点来对假定结合位点的位置进行三角测量，其中基本上三个位点在假定结合位点周围形成一个三角形。如图1所示，三个位点在结合位点的FRET范围内（50-70 Å）。选择了Alexa Fluor 488（AF488）和Alexa Fluor 647（AF647）的染料对，因为R0值为55.7 Å36与标记位点和推定结合位点之间的预期距离非常吻合，确保测量精度。
选择用于标记的三个位点，SecA37，SecA321和SecY292（在图1A-D中显示为洋红色，紫色和青色球）位于整个蛋白质复合物中，在假定的结合位点周围形成一个三角形。三个位点分别突变为无Cys突变体中的Cys残基，以确保只有正确的位置被标记为2，37。对于SecY292实验，使用马来酰亚胺化学方法用AF647标记PhoA前蛋白位点，用AF488标记SecY残基292。在嵌合蛋白中，用AF647标记位点SecA37和SecA321，用AF488标记前蛋白。在SecA-PhoA嵌合蛋白中，PhoA前蛋白片段的残基2，22，37和45在单个蛋白质中各自突变为琥珀密码子。琥珀色密码子突变允许在这些位置引入非天然氨基酸，对叠氮基苯丙氨酸，随后使用点击化学39，40用AF488标记。每个突变都是独立产生和标记的，以确保蛋白质组分的正确，差异标记。确定所有蛋白质的标记程度，通常需要50%或更好才能继续处理样品。
确定传输效率和距离
在执行能量转移测量之前，确定供体量子产率，重叠积分和R0 值（步骤3.4-3.6）。相对于染料荧光素测量供体量子产率，其量子产率为0.79，在0.1 M NaOH47中。在一系列浓度下获得吸收和荧光发射光谱，以生成相对于荧光发射强度的线性吸收图，以确定量子产率。在这些测量中，在线性范围（0.1-1.0）内测量吸收至关重要，并且所有发射测量都需要使用相同的狭缝设置生成。由于这些值用于确定重叠积分和 R0 值，因此应在 FRET 条件下测量它们。蛋白质局部环境深刻影响染料发射，因此，应测量所研究的每个位点的供体量子产量。我们注意到，SecA和SecYEG上的位点对R0 值的影响比嵌合体的PhoA部分上的位点更强。对于具有相同偏高或偏YEG位点的染料对，R0 值通常彼此在5 Å以内;而对于两个不同的SecA位置，R 0 值可以相差20 Å（残留物37 与 321），强调了确定每个染料对的R0 值的重要性（表1）。
R0 的计算假设供体和受体染料自由旋转，并且染料不旋转的程度有助于测量中的整体不确定性。为了适当地考虑染料的相对运动及其取向，对不同标记位置的所有供体和受体染料进行了稳态荧光各向异性测量。这些值在 0.10-0.21 范围内，用于计算与距离测量值 2，3，48 相关的误差。对供体和受体染料观察到的相对较高的各向异性值对应于染料旋转的减少，这与自由旋转的假设不一致。缺乏自由旋转会在距离计算中产生19%-25%的误差。如 表1所示，这导致测量距离的平均不确定性最多为±15 Å。在绘制FRET距离时，距离测量中的这些不确定性是一个重要的考虑因素，如下所述。
供体-受体对之间的计算距离基于效率和距离之间的关系，其中较高的效率表示供体-受体对相隔较短的距离。为了确定FRET效率，在供体激发波长（488nm）处激发的荧光发射光谱是在仅供体和供体 - 受体样品上获得的。通常，供体排放强度的降低意味着存在能量转移（步骤5.1）。 图1G 描绘了SecA 37残基与PhoA嵌合体的残基2或22的供体 - 受体光谱。SecA37残留物用AF647或受体染料标记，PhoA残留物用AF488或供体染料标记。在任何一个位置，供体荧光减少，并且在供体 - 受体样品中可以看到受体荧光强度的小幅增加。由于激发是在488nm的供体激发波长下进行的，这不会直接激发受体，因此观察到的任何受体荧光都是能量转移的结果。因此，供体强度的降低和受体强度的伴随增加是两种染料之间的能量转移的结果。值得注意的是，在受体存在的情况下，PhoA2位置（蓝色）的供体荧光强度高于PhoA22位置（黄色）。供体强度降低的相对差异表明，PhoA2残基和SecA37残基之间的能量转移弱于PhoA22和SecA37残基之间的传递，这意味着PhoA2残基比PhoA22离SecA37更远。距离是根据效率与R0 值之间的关系确定的（步骤5.1.4）。
由于稳态荧光测量可以表示两个或更多距离的平均值，因此我们还进行了时间分辨荧光测量。对于这些实验，供体染料的寿命是在受体存在和不存在的情况下测量的（图1G）。如果有两个不同的能量转移过程有助于测量的稳态荧光效率，则它们将被观察为谨慎的寿命，前提是它们在仪器的时间分辨率内可以解析。为了增强解决生命周期的能力，应在峰值时收集10，000个或更多计数;然而，峰高或峰通道计数需要与采集时间和对样品的潜在损害相平衡。时间分辨测量得出每个供体 - 受体对的单一寿命，与染料之间的一个方向或距离一致。我们注意到，在我们的FRET映射技术揭示的区域中观察到的距离的微小差异不会导致我们系统中的可解析寿命。此外，由时间分辨荧光测量确定的效率与从稳态测量中确定的效率非常一致，进一步支持测量的效率仅来自染料对之间的一个距离3。
将 FRET 距离映射到三维结构上
共振能量转移测量产生足够的距离信息，以识别SecA上信号序列的结合位点和方向。SecA和SecYEG上的三个位置以及SecA-PhoA嵌合体的PhoA区域的四个位置提供了用于映射结合位点的12个不同距离（表1）。将12个距离映射到 热图加海水 体SecA-SecYEG复合物（PDBID：3DIN）的三维X射线共晶结构上，以识别信号序列33的结合位点。SecA-SecYEG复合物的结构类似于在 大肠杆菌 中观察到的结构，如 体内 光交联研究55所证明的那样。
我们使用 SecA-PhoA 嵌合体中 PhoA 信号序列的起始 （PhoA2） 和结束 （PhoA22） 残基来说明如何在 SecA-SecYEG 复合物上鉴定残基位置。由于能量转移可以发生在所有方向上，FRET距离和相关误差描述了一个球形壳，其中一个来自供体 - 受体对的染料位置被指定为中心。在这项研究中，残基SecA37，SecA321和SecY292形成了三个球形壳的中心，描述了信号序列中PhoA2残基的位置。 图 3 显示了由三个独立位置（SecA37（洋红色）、SecA321（紫色）和 SecY292（青色））产生的重叠区域的可视化。每个FRET壳只有一部分与蛋白质结构相交，并且落在该壳内的残基和骨架被突出显示。因此，由SecA37-PhoA2距离定义的壳内的蛋白质区域以洋红色表示（图3A，E），而由SecA321-PhoA2和SecY292-PhoA2壳定义的区域分别以紫色（图3B，F）和青色（图3C，G）显示。假定的结合位点主要由双螺旋指组成，以绿色显示。
如图3所示，这些FRET壳中的每一个都定义了蛋白质复合物的相对较大部分。对于所有三个位置，FRET壳确实与假定的结合位点相交;然而，例如，对于SecA321残留物，相交区域较小，并且位于手指的末端，与螺旋支架域显着重叠。所有三个FRET壳的交集或公共区域（图3D，H）定义了PhoA2残留物的位置。这个区域比每个FRET壳小得多，并且只包括THF的一小部分，螺旋脚手架的贡献很大。用于生成FRETT壳的脚本和分子可视化程序PyMOL的相交区域在补充信息中给出。在补充图1-3中，壳的部分在SecA-SecYEG复合物上可视化为粉红色点。
使用类似的策略来确定PhoA22残留物的位置。由PhoA22 FRET距离定义的FRET壳（图4A-C，E-G）描述了相对于PhoA2残留物的较小面积（图4D，H与图3D，H）。我们将这种差异解释为认为PhoA2残基和相关区域比PhoA22更灵活和不稳定。值得注意的是，归因于PhoA22残留物的区域更靠近THF的尖端和SecYEG通道的口，在公共区域中识别SecY区域（图3D，H）。所有三种染料配对都与假定的结合位点一起识别区域;然而，相交的公共区域将PhoA22位置（图4D，H）置于THF相对于PhoA2位置的另一端（图3D，H）的中心。这些发现表明，从残基2-22延伸的预蛋白的信号序列沿着THF处于相对非结构化的状态。这一结果与早期的研究表明，信号序列在扩展状态下沿THF与蛋白质结合，枯草芽孢杆菌晶体结构中SecA的C端基本上模拟信号肽的结构并占据相同的位置（如图1F所示）2，26.我们采用类似的方法鉴定SecA-PhoA前蛋白嵌合体的早期成熟区（残基37和45）中的两个位置，以进一步定义信号序列和早期成熟区的结合和取向，如下所述。在其他研究中，FRET距离已被有效地用于改进现有结构或分子动力学模拟衍生模型18，19，56;我们无法做到这一点，因为不存在绑定到SecA的信号序列的结构。
图 1：具有代表性 FRET 光谱 （A-D） 的 SecA-SecYEG 复合物中的标记位点 具有代表性的 FRET 光谱 （A-D） SecA-SecYEG 共晶结构 （PDBID： 3DIN） 33 的四种不同视图，其中 SecA37、SecA321 和 SecY292 的标记位点分别显示为洋红色、紫色和青色球。A-C是综合大楼的侧视图，D是俯视图。SecA以浅灰色显示，SecYEG以深灰色显示，推定的结合位点THF以绿色显示。（E）SecA-PhoA嵌合体构建体的示意图，其通过Ser-Gly连接子（未按比例绘制）将SecA蛋白连接到PhoA前蛋白。嵌合体的PhoA部分的标记位点以蓝色，绿色，黄色和红色给出，对应于残留物2，22，37和45。（F）枯草芽孢杆菌SecA蛋白（PDBID：1M6N）晶体结构的带状图，其中核苷酸结合结构域1和2分别以蓝色和浅蓝色显示，前蛋白交联结构域以金色显示，中央螺旋以绿色显示，双螺旋指以青色显示，螺旋翼结构域以深绿色显示，C端连接子以红色显示26.非结构化C端作为基于先前的FRET图谱研究2的结合PhoA信号肽的模型。（G）SecA37-AF647和PhoA2-AF488 FRET对以及SecA37-AF647和PhoA22-AF488 FRET对的供体-受体样品的稳态荧光光谱。供体-受体样本的供体强度降低表明能量转移。基于供体强度的降低，PhoA22相对于PhoA2位点发生更大的能量转移。（H） SecA37-AF647 和 PhoA22-AF488 FRET 对的仅时间分辨荧光供体（洋红色）和供体-受体（轻品红色）衰变光谱。仪器响应功能以灰色显示。供体 - 受体复合物具有较短的衰变，因此具有与能量转移一致的更快寿命。所有分子结构均用指示的PDB文件和PyMOL50生成。图1E-H已从张等人修改而来。请点击此处查看此图的大图。
图 2：FluorEssence 程序的用户界面 （A） 打开的窗口显示的红色 M 周围有一个圆圈。必须单击此选项才能将程序与荧光计连接。（B）实验设置窗口说明了输入扫描相关参数的不同区域（单晶、探测器、附件）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：针对偏高 A-PhoA2 位置确定的 FRET 距离外壳。 由 FRET 距离和相关的不确定性（表 1）构成的 FRET 距离壳体在 SecA-SecYEG 复合物 （PDBID： 3DIN） 上进行了描述。（自动对照）用于 PhoA2 位置的 FRET 距离外壳，分别在中心位置使用 SecA37（洋红色）、SecA321（紫色）和 SecY292（青色）构成。外壳根据中心残留物着色。（D）三个FRET壳的交点定义了PhoA2的位置，以蓝色显示。（英文-H）视图从 A 到 D 旋转约 180°。所有分子结构均用指示的PDB文件和PyMOL50生成。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：针对偏高 A-PhoA22 位置确定的 FRET 距离外壳。 由 FRET 距离和相关不确定性构成的 FRET 距离壳（表 1）在塞卡-塞耶格复合物 （PDBID： 3DIN） 上进行了描述。（自动对照）用于 PhoA22 位置的 FRET 距离外壳，分别在中心位置使用 SecA37（洋红色）、SecA321（紫色）和 SecY292（青色）构成。外壳根据中心残留物着色。（D）三个FRET壳的交点定义了PhoA22的位置，以黄色显示。（英文-H）视图从 A 到 D 旋转约 180°。所有分子结构均用指示的PDB文件和PyMOL50生成。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：投影到枯草芽孢杆菌 -地基杆菌热密度聚乙烯共晶结构 （PDBID： 5EUL） 上的 PhoA2、PhoA22、PhoA37 和 PhoA45 的 FRET 映射位置，如图 1 所示。插入THF末端的OmpA肽底物以粉红色显示。在 ATP-γS 存在下生成 FRET 映射区域，其中 PhoA2 显示为蓝色，PhoA22 显示为绿色，PhoA37 显示为黄色，PhoA45 显示为红色。重叠区域以橄榄色（PhoA22 和 PhoA37）和橙色（PhoA37 和 PhoA45）显示。肽底物（残基749-791，青色）从原始结构中切除并建模到假定的结合区域，而不对结构进行任何改变（以红色圈出）。（B）模型肽底物的放大视图。OmpA肽底物的残基2（Lys），22（Tyr）和37（Gly）分别以蓝色，绿色和黄色的棒状形式描绘。模型肽中的这些残基与预测的FRET映射位置表现出极好的一致性。为清楚起见，省略了原始结构中的纳米体。这个数字是从张等人3修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
| 标记的位点在塞卡-磷-塞耶格复合物上 | 在裂解体的磷酸化磷肽部分上标记的位点 | |||
| 磷A2-AF488 | 河粉磷酸化物22-AF488 | 河粉磷酸化物37-AF488 | 河粉原虫A45-AF488 | |
| 二甲酸 37-AF467-磷酰胺 | ||||
| R0 = 57 | R0 = 57 | R0 = 57 | R0 = 60 | |
| 烦恼效率 | 0.27 +/- .01 | 0.52 +/- .02 | 0.39 +/- .03 | 0.36 +/- .03 |
| 距离 | 67 +/- 15 | 56 +/- 12 | 62 +/- 13 | 66 +/- 15 |
| 美国证券交易委员会321-AF647-磷酸盐 | ||||
| R0 = 40 | R0 = 38 | R0 = 37 | R0 = 38 | |
| 烦恼效率 | 0.16 +/- .04 | 0.62 +/- .01 | 0.39 +/- 0.02 | 0.43 +/- 0.02 |
| 距离 | 53 +/- 11 | 34.9 +/- 7.3 | 39.7 +/- 7.9 | 39.7 +/- 7.5 |
| 磷气-AF647 | 河粉磷酸化物22-AF647 | 河粉磷酸化物37-AF647 | 河粉磷酸盐45-AF647 | |
| 秒292-AF488 EG | ||||
| R0 = 57 | R0 = 50 | R0 = 53 | R0 = 54 | |
| 烦恼效率 | 0.25 +/- .06 | 0.46 +/- .06 | 0.24 +/- .05 | 0.30 +/- .01 |
| 距离 | 68 +/- 15 | 51.3 +/- 9.2 | 64 +/- 14 | 62 +/- 13 |
| 改编自参考文献 3。 | ||||
| 以埃为单位给出的 R0 值是按照文本中所述计算的 | ||||
| FRET效率是通过在所述受体存在下供体荧光强度的降低来计算的。误差报告为三个独立测量的SD。 | ||||
| 供体-受体距离（R）以埃为单位给出，并按文中所述计算。报告的误差是由于考虑了实验误差和染料取向引起的误差。 染料取向是根据稳态荧光各向异性估计的 | ||||
表 1：针对偏磷酸化物复合物确定的传递效率和距离。 对于用于映射前蛋白结合位点的12个距离，给出了FRET效率，距离和R0 值。
补充图1： 以粉红色点显示的 FRET 距离壳，用于确定偏A37残基和偏高-仲耶格复合物（PDBID：3DIN）上的磷37残基。Sec A以浅灰色显示，SecYEG以深灰色显示，SecA37残留物以品红色显示。 请按此下载此档案。
补充图 2： FRET距离壳，以粉红色点显示，为SecA-秒形复合物（PDBID：3DIN）上的SecA321残基和PhoA 37残基确定。Sec A以浅灰色显示，SecYEG以深灰色显示，SecA321残留物以紫色显示。 请按此下载此档案。
补充图 3： FRET距离壳，以粉红色点显示，确定SecY292残基和SecA-SecYEG复合物（PDBID：3DIN）上的PhoA 37残留物。Sec A以浅灰色显示，SecYEG以深灰色显示，SecY292残留物以青色显示。 请按此下载此档案。
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Discussion
通过使用FRET映射方法，我们鉴定了SecA蛋白上的信号序列结合位点。重要的是，该复合物的3-D晶体结构的存在极大地促进了我们的研究。这种制图方法的优势在于能够使用现有结构来识别要标注的位置。这种方法不能用于确定3D结构;然而，结构元件56的测定、现有结构49的细化、结合位点位置2、32的测定或动态运动57的阐明，都是该方法的可能应用。
在SecYEG-SecA-PhoA复合物中，三个标记位点在假定的结合位点周围形成一个三角形（图1）。使用从该三角形的顶点到同一残差的多个距离测量来细化类似于GPS导航方法的位置信息。在SecA和SecY上鉴定出三个位点，SecA37，SecA341和SecY292，以及前蛋白的信号序列和早期成熟区域的四个位点PhoA2，PhoA22，PhoA37，PhoA45，以提供总共12个距离来绘制信号肽的位置（表1）。重要的是，为了提高距离测量的准确性，标记位点应位于蛋白质的相对静态区域，例如二级结构元件而不是环中。此外，场地还应位于溶剂相对容易到达的位置，以便于提高标签效率。在SecA-PhoA-SecYEG复合物中，从三角形位点或顶点到结合底物中残基的距离测量性能足以将结合底物中的残基定位到相对较小的区域（图3D，H 和 图4D，H）。从多个距离测量中识别相交区域可显著细化单个距离测量的位置，如图 3 和 图4所示。因此，当使用此方法时，强烈建议测量多个距离。虽然这种方法可以识别参与结合的分子区域，例如，它不能提供精确的结构信息;这些信息最好从其他结构方法获得，如X射线，核磁共振和冷冻电镜。FRET距离可用于有效地细化现有结构18，19 或模型，在这种情况下，由于不存在绑定到SecA的信号序列模型，这是不可能的。
为了确保染料标记仅在所需位置进行并且FRET距离测量准确，优选使用诱变进行标记。生成无Cys突变体需要使用定点诱变方法将Cys残基相对保守地突变为Ser或其他野生型蛋白质中的类似残基。在目前的研究中，Cys突变被引入到无Cys版本的SecA和SecYEG中，用于标记37。通过生长测定法验证突变蛋白的活性，然后进行 体外 孔雀石绿色ATP酶测定41，42。相关的活性测定取决于蛋白质的功能，例如对于DNA结合蛋白质，DNA结合测定将是合适的58。如果不能确保仅在一个位置进行标记，则可能导致使用相同染料标记多个位点，这会使距离测定变得明显复杂。因此，在同一蛋白质上引入第二个标记可以通过位点定向诱变掺入非天然氨基酸来完成。我们采用这种方法，通过引入非天然氨基酸，对叠氮苯丙氨酸，并在点击化学39，40标记，在与Cys残基不同的位置标记SecA-PhoA嵌合体。
该方法的另一个重要考虑因素是所用染料的选择以及相关的R0值。在识别出潜在的标记位点后，可以从3D结构中估计要测量的距离。有了这些信息，研究人员可以选择具有R0值的染料对，这些染料跨越了所需的预期距离范围。例如，AF488-AF647 染料对的计算 R0 为 55.7 Å，这为距离假定结合位点约 40-75 Å 的标记位点提供了良好的范围。虽然在步骤2.2中计算的R0值对于选择用于系统的染料对很有用，但将染料附着到蛋白质上可以显着改变其性质。为了获得更高的准确性，应从使用标记蛋白进行的原位实验中计算R0值（步骤3.1 - 3.6.5）。
转移效率的测量可以通过监测稳态荧光发射并观察供体发射的减少或受体发射的增加来完成。尽管两种效应的观察是可取的，但效率可以从5，8所述的任一中计算出来。效率也可以根据供体-受体样本中供体寿命相对于仅供体样本的减少来计算。建议通过多种方法确定效率，特别是使用时间分辨方法来建立所测量效率的相对均匀性。
映射方法还允许我们确定信号序列的相对 取向 以及PhoA前蛋白相对于SecA和推定结合位点的早期成熟区域。SecA-SecYEG X射线晶体结构和随后的冷冻电镜研究提供了关于信号序列的结构和前蛋白相对于通道和SecA34，35的早期成熟区域的清晰度。在X射线结构中，OmpA前蛋白的残基1-41附着在双螺旋手指的尖端上，并在通道中的发夹结构中可视化（以粉红色显示， 图5）。使用与上述相同的协议将SecA-PhoA嵌合体中四个PhoA残基的位置映射到该结构上。如图 5所示，PhoA37和PhoA45残留物（黄色，橙色，红色）的位置在PhoA2和PhoA22之间，PhoA45更接近PhoA2。这些发现，特别是PhoA45的位置，表明PhoA前蛋白正在形成发夹结构。
为了进一步验证我们的FRET鉴定的结合位点，我们将我们的映射位置与OmpA前蛋白的位置进行了比较，方法是从通道中切除41个残基前蛋白结构并将其建模为由FRET映射定义的区域（图5，青色）。在不改变前蛋白X射线结构的情况下，我们发现OmpA前蛋白片段切除结构上的残基2，22和37的位置（以蓝色，绿色和黄色显示）与FRET映射位置（图5B）非常吻合，并表明发夹在通道进入之前形成。OmpA前蛋白在X射线晶体结构中的残基41处结束;然而，SecY的C端是非结构化的，它提供了PhoA45可能位置的指示。在我们的建模结构中，发夹环位于通道的口，旨在促进前蛋白在膜上的易位。因此，在本例中，FRET映射方法通过提供蛋白质在膜上易位所需的动态运动的提示来增强静态SecA-SecYEG结构的现有信息。虽然不适合 从头 结构测定，但如果三维结构信息可用，FRET映射方法可以通过阐明结合位点和动态运动来进一步理解结构 - 功能关系。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R15GM135904（授予IM）和美国国立卫生研究院拨款GM110552（授予DBO）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 490 nm LED laser | Horiba | 1684-LED | |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne | Life Technologies | A20347 | |
| Agar | Difco | DF0812 | |
| Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne | Life Technologies | A10254 | |
| Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10904 | |
| Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne | Life Technologies | S10906 | |
| Amicon Ultra4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) | Sigma | UFC805008 | |
| Dodecylmaltoside (DDM) | Anatrace | D310 | |
| E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
| extended signal peptide SP41 | Biomolecules Midwest | N/A | Synthesized custom item |
| FluorEssence | Horiba | version 2.4 | spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer |
| Fluoromax 4 spectrofluorometer | Horiba | N/A | |
| GlobalsWE | Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine | spectral analysis program for time-resolved decays | |
| H4AzidoPheOH | BACHEM | 4020250.0001 | |
| LB (Miller) Broth | Fisher Scientific | BP9723 | |
| Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) | Sigma-Aldrich | 420816 | dilution is needed to make a proper scattering solution |
| PTI Felix GX | Horiba | version 4.1.0.4096 | spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument |
| PTI Time Master Instrument | Horiba | NA | |
| Pymol Molecular Graphics Program | Schrodinger | version 2.4 | |
| Water bath | Thermo Scientific | NESLAB RTE 10 |
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