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Biochemistry

Förster 공명 에너지 전달 매핑: 글로벌 구조적 특징을 밝히기 위한 새로운 방법론

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

이 연구는 라벨링 사이트 선택, 염료 선택, 수집 및 데이터 분석을 포함한 FRET 매핑의 방법론을 자세히 설명합니다. 이 방법론은 단백질 시스템에서 결합 부위, 형태 변화 및 동적 운동을 결정하는 데 효과적이며 기존 3-D 구조 정보와 함께 수행 할 때 가장 유용합니다.

Abstract

Förster 공명 에너지 전달 (FRET)은 생체 관 내 뿐만 아니라 세포 내에서도 생체 분자 사이의 거리를 성공적으로 측정하는 데 사용되는 확립 된 형광 기반 방법입니다. FRET에서, 형광 강도 또는 수명의 변화에 의해 측정되는 에너지 전달의 효율은 두 형광 분자 또는 라벨 사이의 거리와 관련된다. 거리로부터의 역학 및 형태 변화의 결정은 생물학적 시스템에 대한 이 방법의 적용의 몇 가지 예에 불과하다. 특정 조건 하에서, 이 방법론은 결합 표면에 대한 역학, 유연성 및 적응에 관한 정보를 제공함으로써 기존의 X선 결정 구조를 추가하고 향상시킬 수 있다. 우리는 결합 부위의 식별 또는 이량체 서브유닛의 배향을 통해 구조적 특성을 밝히기 위한 FRET와 연관된 거리 결정의 사용을 기술한다. 라벨링 부위의 신중한 선택과 종종 여러 라벨링 전략의 고용을 통해, 우리는 단백질-DNA 복합체 및 SecA-SecYEG 단백질 전좌 시스템에서 글로벌 구조적 특성을 결정하기 위해 이러한 매핑 방법을 성공적으로 적용했습니다. SecA-SecYEG 시스템에서, 우리는 프리단백질 결합 부위를 확인하고 결합된 신호 서열 영역의 국소 입체형태를 결정하기 위해 FRET 매핑 방법을 사용하였다. 이 연구는 적절한 라벨링 부위의 식별, 비천연 아미노산 잔기를 포함한 가능한 라벨에 대한 논의, 라벨링 절차, 측정 수행 방법 및 데이터 해석을 포함하여 FRET 매핑 연구를 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다.

Introduction

단백질의 경우, 3차원(3차원) 구조 지식과 함께 역학의 해명은, 생체분자 시스템의 구조-기능 관계에 대한 이해를 향상시킨다. X선 결정학 및 극저온 전자 현미경과 같은 구조적 방법은 정적 구조를 포착하고 종종 생체 분자 결합 및 역학의 측면을 밝히기 위해 여러 구조의 결정을 필요로합니다1. 이 문서에서는 결합 부위 또는 결합 상호 작용과 같은 전역 구조 요소를 매핑하는 솔루션 기반 방법에 대해 설명합니다.이 요소는 잠재적으로 더 일시적이며 정적 방법에 의해 덜 쉽게 캡처됩니다. 이 방법론에 대한 강력한 후보 시스템은 3-D 구조가 이전에 X선 결정학, NMR 분광법 또는 기타 구조적 방법에 의해 결정된 시스템이다. 이 경우, 우리는 단백질 일반 분비 경로의 중심자인 SecA-SecYEG 복합체의 X선 결정 구조를 활용하여프리단백질을 멤브레인을 가로지르는 수송 전에 Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 사용하여 신호 펩티드 결합 부위의 위치를 매핑합니다. 3-D 구조에 대한 우리의 지식과 결합 된 유전 적 변형을 통한 생물학적 시스템의 조작은 채널 3에 삽입되기 직전에 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 입체 형태를 결정할 수있었습니다.

FRET는 공간 4,5를 통과하는 거리 의존적 방식으로 한 분자(공여체)로부터 다른 분자(수용체)로 에너지의 방사선 없는 전달을 포함한다. 이 전달의 효율은 공여체의 감소 또는 수용체 형광 강도의 증가를 통해 모니터링됩니다. 에너지 전달의 효율은 다음과 같이 설명 할 수 있습니다.

E = R0 6/(R06 +R6)

여기서 R0 값은 전사가50% 효율인 거리이다(6). 이 기술은 이전에 분자 통치자로서 기술되었으며, 공여체-수용체 염료 4,7,8,9의 동일성에 따라 2.5-12 nm 범위의 거리를 결정하는데 효과적이다. 공여체 형광 강도 및 수명은 수용체 유무에 관계없이 전달 효율의 결정을 허용하고 결과적으로 거리 5,8을 허용한다. 기술의 가용성, 방법의 감도 및 사용 편의성으로 인해 FRET는 단일 분자 형광 분광법 및 공초점 현미경6과 같은 분야에서 광범위한 적용을 발견했습니다. 녹색 형광 단백질과 같은 형광 단백질의 출현은 세포 내 역학 및 살아있는 세포 이미징의 관찰을 비교적 용이하게10,11로 만들었다. 이와 같은 많은 FRET 응용 프로그램은이 가상 문제에서 자세히 설명합니다.

이 연구에서는 특히 FRET 측정을 사용하여 구조적 세부 사항을 결정하기 위해 거리 값을 산출하는 데 중점을 둡니다. 이전에는 FRET 측정이 단백질 12,13,14에 결합할 때 DNA 분자의 입체형태, 단백질의 내부 역학 및 단백질 결합 상호작용 15,16,17을 결정하는데 효과적으로 사용되었다. 이 방법의 장점은 상대적으로 적은 양의 재료를 가진 솔루션에서 유연하고 역동적 인 구조 요소를 결정할 수있는 능력에 있습니다. 중요한 것은이 방법이 기존 구조 정보와 함께 사용될 때 특히 효과적이며 3-D 구조 결정 수단으로 사용할 수 없다는 것입니다. 이 방법은 작업이 종종 계산 시뮬레이션18,19와 결합 된 기존 구조 정보를 기반으로하는 경우 구조의 최상의 통찰력과 구체화를 제공합니다. 여기서, 정상 상태 및 시간-분해능 FRET 측정으로부터 수득된 거리의 사용은 일반적인 분비 경로에서 SecA-SecYEG 복합체의 기존 결정학적 구조 상에서, 주요 단백질의 위치를 알려지지 않았던 결합 부위를 맵핑하기 위해 기술된다3.

원핵생물에서 진핵생물, 고세균에 이르기까지 고도로 보존된 시스템인 일반 분비 경로는 단백질을 세포에서 기능적 위치로 또는 막으로 운반하는 것을 매개합니다. 우리의 연구에 사용 된 유기체 인 대장균과 같은 그람 음성 박테리아의 경우 단백질은 내막을 가로 질러 주변 세포로 삽입되거나 전좌됩니다. 박테리아 SecY 채널 복합체 (트랜스로콘이라고 함)는 새로 합성 된 단백질을 전좌시키기 위해 다른 단백질과 협조하며, 이는 일반적으로 N 말단20,21에 위치한 신호 서열을 통해 세포 내의 정확한 위치로 향합니다. 주변형질에 결합된 단백질의 경우, ATPase SecA 단백질은 리보솜의 출구 터널과 연관되고, 약 100개의 잔기가 번역된 후 프리단백질과 연관된다(22). SecB 샤페론 단백질과 함께, 프리단백질을 펼쳐진 상태로 유지한다. SecA는 SecYEG 트랜스로콘에 결합하고, ATP 가수분해의 많은 사이클을 통해, 막(23,24)을 가로지르는 단백질 수송을 용이하게 한다.

SecA는 세포질 및 막 결합 형태로 존재하는 다중 도메인 단백질이다. 시토졸 내의 동종이량체 단백질로서, SecA는 프리단백질 결합 또는 가교 도메인25, 2개의 뉴클레오티드-결합 도메인, 나선형 날개 도메인, 나선형 스캐폴드 도메인, 및 2개의 나선 손가락(THF)26,27,28,29로 구성된다(도 1). SecA-SecYEG 복합체의 이전의 결정학적 연구에서, THF의 위치는 단백질 전좌 및 신호 펩티드를 사용한 후속 가교 실험에 적극적으로 관여하였음을 시사하였고, 단백질 전좌30,31에서 이 영역의 중요성을 더욱 확립하였다. FRET 매핑 방법론을 사용한 이전의 연구들은 외인성 신호 펩티드가 SecA2,32의 이 영역에 결합한다는 것을 입증하였다. SecYEG 채널 내로 삽입하기 전에 예비단백질의 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 입체 형태 및 위치를 완전히 이해하기 위해, 초기 성숙 영역의 신호 서열 및 잔기가 Ser-Gly 링커를 통해 SecA에 부착되는 단백질 키메라가 생성되었다(도 1). 이러한 생물학적으로 실행 가능한 구축물을 사용하여, 예비단백질의 신호 서열 및 초기 성숙 영역이 병렬 방식으로 THF에 결합한다는 것을 추가로 입증하였다2. 이어서, FRET 매핑 방법론을사용하여 후술하는 바와 같이 SecYEG의 존재 하에 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 입체 형태 및 위치를 밝히기 위해 사용되었다.

SecA-SecYEG 복합체33,34,35의 3-D 구조와 결합 부위의 가능한 위치에 대한 지식을 통해 개별 FRET 거리의 교차점이 결합 부위 위치를 식별하는 위치에 기증자 - 수용체 라벨을 신중하게 배치 할 수있었습니다. 이러한 FRET 매핑 측정은 프리단백질의 신호 서열 및 초기 성숙 영역이 SecYEG 채널의 입에 위치한 팁과 함께 헤어핀을 형성한다는 것을 밝혀내고, 헤어핀 구조가 채널 삽입 전에 템플리트된다는 것을 입증한다.

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Protocol

1. 라벨링 사이트 선택

  1. 기존 단백질 구조 상의 추정적 결합 부위를 삼각 측량하기 위해 적어도 세 개의 잠재적 표지 부위를 동정한다. 이 경우, 유전자 융합을 통해 SecA에 부착된 SecA, SecYEG 및 프리단백질이 확인되었다2.
    1. 추정적 결합 부위의 25-75 Å 이내 및 단백질의 비교적 정적 영역 내에서 표지 부위를 선택하고, 거리는 사용되는 특정 FRET 염료 쌍을 결정할 것이다(36). 서로 비교적 구별되는 단백질 영역에서 라벨링 부위를 찾으므로, 부위는 중앙에 위치한 추정 결합 부위가 있는 삼각형의 정점을 설명합니다(그림 1A-D).
    2. 다른 Cys 잔기가 없는 단백질에 관심 있는 표지 부위에 시스테인 (Cys) 잔기를 도입하거나 동정하여, 특정 부위37,38의 표지 효율을 개선시킨다.
    3. 클릭 화학으로 표지하기 위해 비천연 아미노산, 예를 들어, p-아지도페닐알라닌을 도입하여 서로 다른 염료39,40으로 두 개의 별개의 위치에서 하나의 단백질을 효과적으로 표지합니다.
    4. Cys 돌연변이체를 기능 상실에 대해 시험한다. 적절한 활성 검정을 이용하여 Cys-less 돌연변이체 및 비천연 아미노산 변이체의 활성을 검증한다. 이 경우, 활성은 성장 분석으로 검증되었고, 이어서 시험관내 말라카이트 그린 ATPase 검정32,41,42

2. 단백질 표지

  1. 정확한 표지를 위해 관심있는 단백질 또는 단백질을 적어도 95% 순도로 정제한다. 참조3에 상술된 프로토콜에 따라 SecA 및 SecYEG 단백질을 정제한다. 라벨링 과정에서 일부 단백질이 손실되므로 이 단계를 위해 최소 5μg의 정제된 단백질이 있는지 확인하십시오.
  2. FRET 측정을 위해R0 값과 라벨링된 부위 사이의 예측된 거리에 따라 두 개의 염료를 선택하십시오. R0 값을 추정하고 형광 단백질 데이터베이스로부터의 정보를 사용하여 공여체 방출 및 수용체 흡광도 중첩을 관찰하며, 이는 또한 일반적으로 사용되는 염료(https://www.fpbase.org/spectra/)36에 대한 스펙트럼을 제공한다.
    참고: R0은 주어진 염료 쌍에 대해 전달 효율이50 %인 거리로 정의된다. 매핑 실험의 경우, 예측 거리는 염료 쌍의R0 값에 근접하여 거리를 정확하게 측정할 수 있어야 합니다.
  3. 1.1.1단계에서 식별된 위치에 레이블을 지정합니다. 기증자 - 수용체 염료 쌍으로.
    1. 사용된 특정 염료에 대한 최적의 단백질 농도, 온도, pH, 시간 길이 및 완충액과 같은 파라미터에 특히 주의를 기울여 제조업체의 지침에 따라 단백질을 라벨링합니다(43,44).
    2. 단백질을 25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) 완충액에서 1-2 mg/mL 또는 약 10 μM의 농도로 준비하십시오. 염료를 디메틸포름아미드 (DMF) 또는 디메틸술폭시드 (DMSO)에 용해시켜 최종 농도 1 mM로 한다. 교반하면서 용액에 염료를 적가하여 염료:단백질 몰비가 5:1(50 μM 염료:10 μM 단백질)에 도달한다.
    3. 반응을 4°C에서 밤새 부드럽게 흔들거나 또는 밤새 유리 바이알에서 실온 (RT)에서 4 h 동안 진행되도록 허용한다. β-메르캅토에탄올을 첨가하여 반응을 중지시킨다.
      참고: 단백질이 트리스 버퍼와 호환되지 않는 경우, 포스페이트 또는 HEPES 버퍼를 사용할 수 있습니다. pH를 7.0-7.5 범위로 유지하십시오. 단백질이 이황화 결합을 갖는 경우, 표지 전에 DTT 또는 TCEP와 같은 환원제를 첨가한다. 염료를 첨가하기 전에 투석 또는 겔 여과에 의해 DTT를 제거하십시오.
  4. 정확한 FRET 측정을 위해 표지된 단백질을 보유하면서 자유 염료가 통과하도록 적절한 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 원심 농축기로 자유 염료를 제거한다.
    1. 3 mL 농축기의 상부에 ~1 mL의 물을 위치시킨 다음, 상기 멤브레인을 통해 물을 원심분리(4,300 x g에서 10분 이상)하여 농축기 멤브레인을 준비한다.
    2. 표지된 샘플을 농축기에서 원심분리하여 자유 염료를 제거한다(4,300 x g에서 20분). 3-4 번 반복하고 흐름을 처리하십시오.
    3. UV-Vis 흡수 분광법을 사용하여 표지된 단백질의 표지 효율을 확인한다.
      참고: FRET 측정에는 50% 이상의 라벨링 효율성이 필요합니다. 라벨링 효율이 낮을수록 FRET 신호가 감소하고 측정이 부정확해질 수 있습니다.
    4. 250-700 nm 범위의 표지된 단백질의 UV-Vis 스펙트럼을 구하여 단백질 흡수 밴드와 염료 최대 흡수 밴드를 모두 관찰하였다. 염료의 흡수 피크와 단백질의 경우 280 nm에서 흡광도를 측정하십시오.
    5. 단백질의 농도를 결정하고 보정 인자, CF 및 다음 방정식45,46을 사용하여 염료로부터의 임의의 기여에 대해 정확하다:
      Equation 1
      여기서 C는 단백질 (M)의 농도, A280은 280nm에서의 샘플 흡광도,Amax는 염료 흡수 최대값에서의 흡광도, ε 단백질은 280nm에서의 단백질에 대한 흡광 계수, CF는 보정 인자 A'280/A'max이며, 여기서 A'280은 280 nm에서의 흡광도, A'max는 염료에 대한 피크 최대값에서의 흡광도이다.
    6. 다음 방정식을 사용하여 레이블링 효율을 결정합니다.
      Equation 2
      여기서 염료ε 염료의 몰 흡광 계수이고, C는 단계 2.4.5에서 결정된 바와 같은 단백질의 농도이고, E는 표지 효율이다. 라벨링 효율 값이 정체되고 100% 미만이 될 때까지 2.4.2단계를 반복합니다.

3. R0 값 결정

  1. R0 값을 제자리에서 측정합니다. 총 단백질 4 μM의 동일한 농도에서 두 개의 단백질 샘플을 준비하고, 하나는 공여체 염료로만 표지된 단백질로, 다른 하나는 수용체 염료로만 표지된 단백질로 준비한다. SecA의 경우, 4 μM SecA 단량체의 단백질 농도가 이러한 측정에 잘 작동합니다.
    1. 1cm x 1cm 큐벳의 경우 2.5mL, 5mm x 5mm 큐벳의 경우 600μL, 3mm x 3mm 큐벳의 경우 200μL의 시료 부피를 준비합니다.
  2. 형광계를 켜고 분광 형광계를 사용하는 경우 형광 소프트웨어에서 스펙트럼 수집 및 분석 프로그램을 엽니 다. 빨간색 M 을 클릭하여 컴퓨터를 계측기에 연결하고(그림 2A) 방출 스펙트럼을 선택합니다.
    1. 실험 수집 메뉴 항목을 사용하여 여기 파장, 방출 스캔 범위, 온도 및 샘플 체인저 위치와 같은 스캔 매개 변수를 입력합니다(그림 2B).
    2. RTC를 클릭하고 염료의 흡수 최대치에 설정된 여기 파장을 사용하여 피크에서의 형광 방출을 모니터링하여 기기 설정(예: 스펙트럼 슬릿)을 최적화합니다. SecA의 경우 다음 설정을 설정합니다: 대역 통과를 1nm로 설정합니다. 여기 및 방출 슬릿은 각각 1 및 1.5 mm로서, 온도는 25°C에서, 교반 속도는 250 rpm이다.
      참고: 계측기의 초당 수(cps) 용량(일반적으로 2 x 106cps )을 초과하지 마십시오.
  3. 공여체 표지된 단백질 샘플을 샘플 홀더에 놓고 클릭 실행 을 클릭하여 염료 흡수 최대치(예를 들어, AF488의 경우 488 nm)에서 샘플을 흥분시키고 방출 피크(AF488로 표지된 공여체 전용 SecA 단백질에 대해 505-750 nm)를 통해 주사함으로써 공여체 염료만(공여자 전용 단백질)의 방출 스캔을 생성한다.
  4. 스캔을 피크의 끝을 지나서 25-50 nm로 연장함으로써 스캔에 대한 기준선을 확립한다. 도47에 기재된 바와 같이 상이한 농도의 샘플에 대해 흡수 및 형광 측정을 수행하여 공여체 전용 단백질의 양자 수율을 측정한다. 이러한 측정에 대해 동일한 슬릿 설정을 유지합니다.
    1. 자유 공여체 염료를 양자 수율의 기준으로 사용하십시오. 정확한 결정을 위해 서로 다른 농도에서 공여체 전용 단백질과 자유 염료의 적어도 네 가지 측정을 얻으십시오.
    2. 형광 강도 또는 통합 영역 대 공여체 전용 단백질 및 유리 염료 또는 참조에 대한 흡광도를 플롯한다. 공여체 전용 단백질(Slope D) 및 기준(SlopeR)에 대한 기울기를 결정한다.
    3. 양자 수율(Φ)은 다음 방정식을 사용하여 계산됩니다.
      Equation 3
      여기서 ΦD는 공여체 전용 단백질의 양자 수율이고, ΦR은 자유 염료의 양자 수율이며(이것은 일반적으로 제조사로부터 얻을 수 있음), Slope D 및 Slope R은 공여체 전용 단백질에 대해 각각 단계 3.4.2에서 결정된 기울기이고, η D 및 ηR이다. 공여체 전용 단백질 및 무기준 염료 용액의 굴절 지수를 각각 47로 나타낸다.
  5. 1 cm 경로 길이 세포를 사용하여 수용체 전용 단백질의 흡수 스펙트럼을 얻으십시오. 흡수 스펙트럼을 염료 농도로 나눔으로써 수용체 전용 단백질의 흡광 계수 스펙트럼을 생성합니다.
  6. 스펙트럼 중첩 적분, J(λ) 를 그래픽 분석 프로그램을 사용하여 생성한다. 표준 워크시트 프로그램(예: 스프레드시트)도 이 프로세스에 사용할 수 있습니다.
    1. 공여체 전용 단백질의 형광 방출 스펙트럼을 곱하여(단계 3.4) 수용체 전용 단백질의 흡광 계수 스펙트럼에 의해 중첩 스펙트럼을 생성한다.
    2. 결과 중첩 스펙트럼에λ4를 곱합니다.
    3. 겹치는 영역의 통합을 통해 곡선 아래의 영역을 결정합니다. 중첩 영역은 공여체 방출 스펙트럼에 수용체 소멸 계수 스펙트럼을 곱한 값이 양수 값을 산출하는 영역으로 정의됩니다. 스펙트럼 중첩 적분은 다음과 같이 정의됩니다.
      Equation 4
      여기서 FD(λ)는 공여체 전용 단백질(단계 3.4에서 얻음)의 방출 스펙트럼이고, εA(λ)는 수용체 전용 단백질의 흡광 계수 스펙트럼이고, M-1 cm-1의 단위(단계 3.5에서 얻어짐)를 갖는다. 결과 스펙트럼 중첩 적분은 M-1 cm-1nm4의 단위를가져야합니다.
    4. 스펙트럼 중첩 적분을 정규화합니다. 중첩 적분을 동일한 스펙트럼 범위에 걸쳐 공여체 전용 단백질 스펙트럼의 통합 영역으로 나눕니다.
      Equation 5
    5. 다음 방정식을 사용하여 Å의R0 값을 계산합니다.
      Equation 6
      여기서 κ2는 배향 계수이며, 전형적으로 자유롭게 회전하는 염료에 대해 2/3으로 취해지η, 이는 굴절률이며 희석된 수용액에 대해 1.33으로 근사될 수 있고, KD는 공여체의 양자 수율이고(단계 3.4), J(λ)는 단계 3.6.35에서 결정된 바와 같은 스펙트럼 중첩 적분이다. 참고 : 염료가 자유롭게 회전하지 않으면 Ivanov 48에 설명 된대로 수정을 도입하고 Auclair49 및 Zhang 2,3에 의해 구현 될 수 있습니다.

4. FRET 스펙트럼 측정 수행

  1. 공여체 전용 단백질, 수용체 전용 단백질 및 공여체-수용체 단백질 샘플을 동일한 농도로 준비하고; 4 μM의 농도가 권장됩니다. 3mm x 3mm 큐벳을 사용하는 경우 200μL의 용액을 사용하고, 5mm x 5mm 큐벳을 사용하는 경우 600μL, 1cm x 1cm 큐벳을 사용하는 경우 2.5mL를 사용합니다.
    1. 공여체-수용체 단백질 샘플을 공여체만 및 수용체 전용 단백질의 동량의 동일한 몰량을 사용하여 준비한다.
    2. 동일한 양의 표지된 샘플을 대조군 공여체 전용 및 수용체 단백질 샘플에만 유지하고, 표지되지 않은 단백질을 공여체 전용 또는 수용체 전용 샘플에 동일한 몰량으로 도입함으로써 유지한다. 예를 들어, 동일한 농도의 용액의 경우, 각 공여체 전용 FRET 샘플은 200 μL 부피에 대해 100 μL의 공여체 전용 단백질 및 100 μL의 비표지된 단백질을 함유할 것이다.
  2. 공여체만, 수용체만, 및 공여체-수용체 샘플의 형광 방출 스펙트럼을 생성한다. 단계 3.2에서 설명한 대로 신호를 최적화합니다. 일단 최적화되면 모든 샘플에 대해 동일한 설정을 유지합니다.
    1. 단계 3.3에 설명된 대로 공여체 전용 스캔을 구하십시오. 용액을 공여체 염료 흡수 최대치에서 흥분시키고, 공여체 및 (예상된) 수용체 방출 피크를 통해 스캔한다.
    2. 샘플을 수용체 전용 단백질로 교환하거나 수용체 전용 단백질을 포함하는 큐벳으로 샘플 체인저 위치를 변경하십시오.
    3. 단계 4.2.1에서와 동일한 설정을 사용하여 수용체 염료만(acceptor only protein)으로 표지된 단백질의 방출 스캔을 얻는다. 기증자 여기 파장에서 샘플을 흥분시킨다.
      참고: 이 스펙트럼은 공여체 파장에서 여기된 수용체의 양에 대한 보정을 제공합니다(단계 5.1.2의FA ).
    4. 샘플을 공여체-수용체 단백질 샘플로 교환하거나 샘플 체인저 위치를 공여체 수용체 표지된 단백질을 함유하는 큐벳으로 변경한다.
    5. 단계 4.2.1 및 4.2.3에서와 동일한 설정을 사용하여 공여체-수용체 단백질 샘플의 방출 스캔을 수득한다.
    6. 모든 스펙트럼에 대해 스캔이 끝날 때 측정된 배경 카운트를 빼서 배경 형광을 보정합니다.
  3. 단계 4.1.2에 설명된 대로 제조된 공여체만 및 공여체-수용체 샘플의 공여체 수명을 측정한다. 나노초 (10-9 s) 시간 범위에서 형광 붕괴를 측정하고 해결할 수있는 시간 상관 단일 광자 계수 형광 기기를 사용하십시오.
    참고: FRET 염료 쌍의 경우, 여기 광원을 공여체 염료의 흡수 최대치와 일치시킵니다.
    1. 계측기를 켭니다. 수집 소프트웨어를 열고 형광 분광계로 데이터를 수집하기 위해 계측기 제어 소프트웨어를 사용하십시오.
    2. 획득을 위해 TCSPC 붕괴를 선택하고, 시간 범위는 55ns이며, 이득은 1 및 4096 채널입니다.
    3. 비 유제품 크리머 또는 상업용 산란 용액의 용액을 사용하여 기기 반응 기능 (IRF)을 얻고 490nm에서 산란을 모니터링하십시오. 슬릿 설정을 조정하고 필요에 따라 중성 밀도 필터를 사용하여 펄스 더미 업을 피하기 위해 충분히 낮은 카운트 속도를유지합니다 5. 수락 을 클릭한 다음 시작을 클릭합니다. 그러면 인수가 시작됩니다.
      참고: 최대 카운트 레이트는 4000cps로 180kHz 반복률에 사용됩니다.
    4. 피크 채널이 최대 20,000 카운트를 가질 때까지 490 nm에서 IRF를 수집하십시오. 각 형광 붕괴를 측정하기 전후에 IRF를 수집한다.
    5. 공여체 방출 파장, 520 nm에서의 형광 방출을 모니터링함으로써 공여체 전용 및 공여체 수용체 샘플의 형광 붕괴를 구한다.
    6. 최대 카운트 속도가 4000cps 이하인 슬릿 설정을 조정합니다. 슬릿 설정은 일반적으로 단백질 샘플에 대한 15-20 nm 대역 통과입니다. 피크 채널에서 20,000 카운트를 얻을 때까지 붕괴를 수집하십시오.
  4. 형광 수명(τ)에 대한 시간(t)의 함수로서 형광 강도(I)의 붕괴 또는 형광 강도(I)를 분석한다. 감쇠를 다음 방정식을 사용하여 지수의 합에 맞춥니다.
    Equation 7
    여기서 α I는 i번째 구성 요소의 전지수 계수이고 τ I는 수명입니다. 적합은 형광 붕괴와 일치하도록 IRF와 재결합된다. 감소된Χ2 파라미터로부터 적합도의 품질을 판단합니다.

5. FRET 데이터 분석

  1. 다음 식으로만 공여체에 비해 공여체-수용체 샘플의 공여체 강도의 감소로부터 FRET 효율을 계산한다.
    Equation 8
    여기서FDA 는 공여체 수용체 샘플의 형광강도이고 FD는 공여체 형광의 피크에서 공여체 샘플만 형광의 형광 강도이다. 데이터가 시끄러운 경우 피크의 통합 영역을 사용합니다.
    1. 기증자만과 기증자-수용자 샘플 사이의 라벨링의 차이에 대해 수정하십시오. 다음과 같이 기증자 라벨링 정도를 기준으로 보정을 계산합니다.
      Equation 9
      여기서 fDA는 공여체-수용체 샘플에서의 공여체 라벨링 효율이고, fD는 공여체 전용 샘플에서의 라벨링 효율이다.
    2. 공여체-수용체 단백질 스펙트럼으로부터 수용체 전용 단백질 스펙트럼(단계 4.2)의 뺄셈을 통해 공여체-여기된 스펙트럼에 대한 수용체 형광의 임의의 기여에 대해 정확하다.
      Equation 14
    3. 공여체-수용체 단백질 샘플에 비해 수용체 전용 단백질의 라벨링 효율의 차이에 대해 정정하여 효율을 계산하기 위한 다음 방정식을 산출한다:
      Equation 10
      여기서 fA는 수용체 라벨링의 분수 양을 나타낸다. 이 방정식은 염료 표지 및 수용체 형광으로 인한 모든 보정을 포함합니다.
    4. 다음 방정식을 사용하여 효율성에서 FRET 거리를 계산합니다.
      Equation 11
      단계 3.6.5에서 얻어진 R0 값을 사용한다.
    5. 단계 4.3.3-4.3.5에서 측정된 공여체만 및 공여체-수용체 샘플의 형광 수명을 사용하여 FRET 효율을 계산하십시오.
      Equation 12
    6. 진폭 가중 수명을 사용하여 FRET 효율을 계산하고 정상 상태 결과와 비교5.
      Equation 13
    7. 단계 5.1.4에서와 같이 형광 수명에 의해 결정된 효율로부터 거리를 계산한다. FRET 효율성 및 거리에 대한 정상 상태 및 시간 해결 값을 비교하고 서로 오류 내에 있는지 확인합니다.

6. 거리 매핑

  1. 계산된 거리를 사용하여 결합 부위를 입체 구조에 매핑합니다. 단계 5.1.4에서 주어진 방정식을 사용하여 조사된 모든 염료 쌍 및 위치에 대한 거리 및 오차를 계산하고, 각 FRET 쌍에 대해 단계 3.6.5에서 얻은R0 값을 계산한다.
    1. PyMOL50 과 같은 3D 그래픽 보기 프로그램을 사용하여 거리를 구조에 매핑 합니다(보조 파일에 제공된 스크립트). 스크립트의 명령은 적절한 거리 정보를 사용하여 명령 창에 직접 입력할 수 있습니다.
    2. 측정된 각 거리 및 관련 오류에 대해 셸을 생성합니다(그림 3, 그림 4, 보충 그림 1-3).
    3. 서로 다른 쉘의 교차점을 통해 위치를 매핑합니다(보충 그림 1-3). 신호 펩티드 결합 부위는 SecA 및 SecYEG 상의 세 개의 상이한 위치와 신호 펩티드 상의 네 개의 상이한 위치를 통해 맵핑되었다(도 1).

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Representative Results

이 연구는 SecYEG 채널 내로 프리단백질을 삽입하기 전에 SecA 상의 프리단백질 결합 부위의 위치를 결정하는 데 초점을 맞추었다. 결합 부위를 매핑하기 위해, 프리단백질의 상이한 영역과 SecA 및 SecYEG 단백질 상의 세 개의 별개의 위치 사이에서 FRET 실험을 수행하였다(도 1A-D). SecA, SecYEG, 및 프리단백질의 거리 및 입체 구조로부터 프리단백질 결합 부위의 위치를 예측하였다. 이러한 측정을 수행하기 위해 3개의 분리된 독립체(SecA, SecYEG 및 프리단백질)를 채용하는 대신, PhoA 신호 서열은 Gly-Ser 링커 2,3의 혼입 후 유전자 변형을 통해 SecA에 부착되었다. 염료를 사용한 facile 표지를 위해, Cys 잔기 또는 호박색 돌연변이를 PhoA 예비단백질의 잔기 2, 22, 35 및 45에서 도입하였다(도 1E).

사이트 식별 및 라벨링
신호 서열에 대한 추정적 결합 부위는 이전에 유사한 FRET 맵핑 방법2,32를 사용하여 확인되었다. 이들 및 다른 연구들은 THF 33,51,52,53,54에 대한 평행한 위치에서 제안된 배향을 갖는 신호 펩티드의 가능한 결합 부위로서 이나선 핑거 (THF) 및 프리단백질 가교 도메인을 확인했다 (도 1F). 따라서, SecA 및 SecYEG 단백질 상의 잠재적인 표지 부위의 확인은 SecA 및 SecYEG 결정 구조 내의 추정적 결합 부위의 위치에 기초하여 이루어졌다(도 1A-D에 녹색으로 도시됨). 추정적 결합 부위의 위치를 삼각 측량하기 위해 세 개의 부위가 선택되었으며, 여기서 본질적으로 세 부위는 추정 결합 부위 주위에 삼각형을 형성한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 세 부위는 결합 부위의 FRET 범위 내에 있었다 (50-70 Å). Alexa Fluor 488 (AF488) 및 Alexa Fluor 647 (AF647)의 염료 쌍이 선택되었는데, 이는 55.7Å36의R0 값이 표지 부위와 추정 결합 부위 사이의 예상 거리와 잘 일치하여 측정 정확도를 보장합니다.

표지를 위해 선택된 세 부위, SecA37, SecA321 및 SecY292 (도 1A-D에서 자홍색, 보라색 및 시안 구체로 나타냄)는 추정 결합 부위 주위에 삼각형을 형성하는 단백질 복합체 전체에 걸쳐 위치한다. 세 부위를 Cys-less 돌연변이체 내의 Cys 잔기로 개별적으로 돌연변이시켜 정확한 위치만이 2,37로 표지되도록 하였다. SecY292 실험을 위해, PhoA 예비단백질 부위를 AF647로 표지하였고, SecY 잔기 292를 말레이미드 화학을 사용하여 AF488로 표지하였다. 키메라 단백질에서, 부위 SecA37 및 SecA321은 AF647로 표지되었고, 프리단백질은 AF488로 표지되었다. SecA-PhoA 키메라 단백질에서, PhoA 예비단백질 세그먼트의 잔기 2, 22, 37, 및 45는 각각 개별 단백질에서 호박색 코돈으로 돌연변이되었다. 호박색 코돈 돌연변이는 그 위치에 비천연 아미노산인 p-아지도페닐알라닌의 도입을 허용하였고, 이는 이어서 클릭 화학39,40을 사용하여 AF488로 표지되었다. 각각의 돌연변이는 단백질 성분의 정확하고 차등적인 표지를 보장하기 위해 독립적으로 생성되고 표지되었다. 표지의 정도는 모든 단백질에 대해 결정되었고, 샘플을 진행하기 위해 일반적으로 50% 이상이 될 필요가 있었다.

전송 효율성 및 거리 결정
에너지 전달 측정을 수행하기 전에, 공여체 양자 수율, 중첩 적분 및R0 값이 결정되었다(단계 3.4-3.6). 공여체 양자 수율은 염료인 플루오레세인에 대하여 측정되었으며, 이는 0.1 MNaOH47에서 0.79의 양자 수율을 갖는다. 흡수 및 형광 방출 스펙트럼은 양자 수율을 결정하기 위해 형광 방출 강도에 대한 흡수의 선형 플롯을 생성하기 위해 일련의 농도에서 수득되었다. 이러한 측정에서는 선형 범위(0.1-1.0)에서 흡수를 측정하는 것이 중요하며 모든 방출 측정은 동일한 슬릿 설정으로 생성되어야 합니다. 이들 값은 겹치는 적분과R0 값을 결정하는 데 사용되므로 FRET 조건 하에서 측정해야 합니다. 단백질 국소 환경은 염료 방출에 심오하게 영향을 미치므로, 공여체 양자 수율은 조사된 각각의 부위에 대해 측정되어야 한다. 우리는 SecA 및 SecYEG의 사이트가 키메라의 PhoA 부분에있는 사이트보다R0 값에 더 강하게 영향을 미친다는 것을 주목합니다. 동일한 SecA 또는 SecYEG 부위를 갖는 염료 쌍의 경우,R0 값은 전형적으로 서로의 5 Å 이내이고; R0 값은 두 개의 상이한 SecA 위치 (잔기 37 대 321)에 대해 20 Å만큼 다를 수 있는 반면, 각 염료 쌍에 대해R0 값을 결정하는 것의 중요성을 강조한다 (표 1).

R0의 계산은 공여체 및 수용체 염료가 자유롭게 회전하고 염료가 회전하지 않는 정도가 측정의 전반적인 불확실성에 기여한다고 가정합니다. 염료의 상대적 움직임 및 이들의 배향을 적절히 고려하기 위해, 정상 상태 형광 이방성 측정을 상이한 표지 위치에 있는 모든 공여체 및 수용체 염료에 대해 수행하였다. 0.10-0.21 범위에 있던 이 값들은 거리 측정 2,3,48과 관련된 오차를 계산하는데 사용되었다. 공여체 및 수용체 염료 둘 다에 대해 관찰된 비교적 높은 이방성 값은 염료 회전의 감소에 상응하며, 이는 자유 회전의 가정과 일치하지 않는다. 자유 회전이 없으면 거리 계산에서 19 % -25 %의 오류가 발생합니다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 이것은 최대 ± 15 Å의 측정된 거리에서의 평균 불확실성을 초래하였다. FRET 거리를 매핑할 때 거리 측정의 이러한 불확실성은 아래에 설명된 것처럼 중요한 고려 사항입니다.

공여체-수용체 쌍 사이의 계산된 거리는 효율성과 거리 사이의 관계에 기초하며, 여기서 더 높은 효율은 더 짧은 거리로 분리된 공여체-수용체 쌍을 나타낸다. FRET 효율을 결정하기 위해, 공여체 여기 파장(488nm)에서 여기된 형광 방출 스펙트럼을 공여체 전용 및 공여체-수용체 샘플에서 수득한다. 전형적으로, 공여체 방출 강도의 감소는 에너지 전달의 존재를 의미한다(단계 5.1). 도 1G는 PhoA 키메라의 잔기 2 또는 22 중 하나를 갖는 SecA 37 잔기에 대한 공여체-수용체 스펙트럼을 묘사한다. SecA37 잔기는 AF647 또는 수용체 염료로 표지되고, PhoA 잔기는 AF488 또는 공여체 염료로 표지된다. 어느 위치에서나, 공여체 형광은 감소되고, 수용체 형광 강도의 작은 증가는 공여체-수용체 샘플에서 볼 수 있다. 여기는 수용체를 직접 여기시키지 않는 488nm의 공여체 여기 파장에서 이루어지기 때문에, 관찰된 임의의 수용체 형광은 에너지 전달로부터 초래된다. 따라서, 공여체 강도의 감소와 수반되는 수용체 강도의 증가는 두 염료 사이의 에너지 전달로부터 초래된다. 유의하게는, 공여체 형광 강도는 수용체의 존재 하에서의 PhoA22 위치(황색)에 비해 PhoA2 위치(청색)에 대해 더 높다. 공여체 강도 감소의 이러한 상대적 차이는 PhoA2 잔기와 SecA37 잔기 사이의 에너지 전달이 PhoA22 및 SecA37 잔기 사이의 전달보다 약하다는 것을 나타내며, 이는 PhoA2 잔기가 PhoA22보다 SecA37로부터 더 멀리 위치함을 의미한다. 거리는 효율과R0 값 사이의 관계로부터 결정된다(단계 5.1.4).

정상 상태 형광 측정은 둘 이상의 거리의 평균을 나타낼 수 있기 때문에 시간 분해 형광 측정도 수행했습니다. 이러한 실험을 위해, 공여체 염료의 수명은 수용체의 존재 및 부재 하에 측정된다(그림 1G). 측정된 정상 상태 형광 효율에 기여하는 두 개의 별개의 에너지 전달 공정이 있다면, 장비의 시간 분해능 내에서 분해할 수 있다면 신중한 수명으로 관찰될 것입니다. 수명을 해결하는 능력을 향상 시키려면 피크에서 10,000 카운트 이상을 수집해야합니다. 그러나, 피크 높이 또는 피크 채널 카운트는 수집 시간 및 샘플에 대한 잠재적 손상과 균형을 이루어야 한다. 시간 해결 측정은 각 공여체-수용체 쌍에 대해 단 하나의 방향 또는 염료 사이의 거리와 일치하는 단일 수명을 산출했습니다. 우리는 FRET 매핑 기술에 의해 밝혀진 영역에서 관찰 된 거리의 작은 차이가 우리 시스템에서 해결 가능한 수명으로 이어지지 않는다는 점에 유의합니다. 더욱이, 시간-분해된 형광 측정에 의해 결정된 효율은 정상 상태 측정으로부터 결정된 것과 잘 일치하여, 측정된 효율이 염료 쌍3 사이의 단지 하나의 거리에서만 발생한다는 것을 추가로 지원하였다.

FRET 거리를 3차원 구조에 매핑
공진 에너지 전달 측정은 SecA 상의 신호 서열의 결합 부위 및 방향을 식별하기에 충분한 거리 정보를 산출한다. SecA-PhoA 키메라의 PhoA 영역 상의 네 위치와 함께 SecA 및 SecYEG의 세 위치는 결합 부위를 매핑하는 데 사용되는 12개의 서로 다른 거리를 제공한다(표 1). 12개의 거리를 신호 서열(33)의 결합 부위를 식별하기 위해 써모토가 마리티마 SecA-SecYEG 복합체(PDBID: 3DIN)의 3차원 X선 공결정 구조 상에 맵핑하였다. SecA-SecYEG 복합체의 구조는 생체내 광가교 연구(55)에 의해 입증된 바와 같이 대장균에서 관찰된 것과 유사하다.

우리는 SecA-SecYEG 복합체 상에서 잔기 위치가 어떻게 확인되었는지를 설명하기 위해 SecA-PhoA 키메라 내의 PhoA 신호 서열의 시작 (PhoA2) 및 말단 (PhoA22) 잔기를 사용한다. 에너지 전달이 모든 방향에서 발생할 수 있기 때문에, FRET 거리 및 관련 오류는 구형 쉘을 설명하며, 도너-수용체 쌍으로부터의 염료 위치 중 하나가 중심으로 지정된다. 본 연구에서, 잔기 SecA37, SecA321, 및 SecY292는 신호 서열의 PhoA2 잔기의 위치를 설명하는 3개의 구형 쉘의 중심을 형성한다. 세 개의 개별 위치인 SecA37(마젠타), SecA321(보라색) 및 SecY292(시안)에서 발생하는 중첩 영역의 시각화가 그림 3에 나와 있습니다. 각 FRET 쉘의 일부만이 단백질 구조와 교차하며, 그 쉘 내에 속하는 잔기 및 백본이 강조된다. 따라서, SecA37-PhoA2 거리에 의해 정의된 쉘 내의 단백질 영역은 마젠타로 도시되고(도 3A,E), SecA321-PhoA2 및 SecY292-PhoA2 쉘에 의해 정의된 영역은 각각 보라색(도 3B,F) 및 시안(도 3C,G)으로 표시된다. 주로 두 나선 손가락으로 구성된 추정 결합 부위는 녹색으로 표시됩니다.

도 3에 도시된 바와 같이, 이들 FRET 쉘들 각각은 단백질 복합체의 비교적 큰 섹션을 정의한다. 세 위치 모두에 대해, FRET 쉘은 추정 결합 부위와 교차한다; 그러나, 예를 들어, SecA321 잔기의 경우, 교차된 영역은 더 작고, 나선형 스캐폴드 도메인과 상당한 중첩을 갖는 손가락의 끝을 향해 놓여 있다. 세 FRET 쉘 모두의 교차 또는 공통 영역(그림 3D, H)은 PhoA2 잔기의 위치를 정의합니다. 이 영역은 각 FRET 쉘보다 상당히 작으며, 나선형 스캐폴드로부터의 큰 기여를 갖는 THF의 작은 부분만을 포함한다. FRET 쉘을 생성하는 데 사용되는 스크립트와 분자 시각화 프로그램인 PyMOL의 교차된 영역은 보충 정보에 나와 있습니다. 쉘의 일부는 보충 그림 1-3에서 SecA-SecYEG 복합체에서 분홍색 점으로 시각화됩니다.

유사한 전략이 PhoA22 잔기의 위치를 확인하기 위해 사용되었다. PhoA22 FRET 거리(그림 4A-C, E-G)에 의해 정의된 FRET 쉘은 PhoA2 잔기에 비해 더 작은 면적을 기술한다(그림 4D, H vs.도 3D, H). 우리는이 차이를 해석하여 PhoA2 잔기 및 관련 영역이 PhoA22보다 더 유연하고 불안정하다는 것을 암시합니다. 유의하게도, PhoA22 잔기에 기인하는 영역은 THF의 끝과 SecYEG 채널의 입에 더 가깝게 위치하며, SecY의 영역은 공통 영역에서 확인된다(도 3D,H). 세 가지 염료 짝짓기 모두 추정적 결합 부위와 함께 영역을 식별하고; 그러나 교차된 공통 영역은 PhoA2 위치를 기준으로 THF의 반대쪽 끝에 있는 PhoA22 위치(그림 4D, H)를 중심으로합니다(그림 3D, H). 이러한 발견은 잔기 2-22로부터 연장되는 프리단백질의 신호 서열이 상대적으로 구조화되지 않은 상태에서 THF를 따라 놓여 있음을 시사할 것이다. 이러한 결과는 신호 서열이 확장된 상태에서 THF를 따라 단백질에 결합하고 B. subtilis 결정 구조에서 SecA의 C 말단 말단이 본질적으로 신호 펩티드의 구조를 모델링하고 동일한 위치를 차지한다는 것을 시사하는 이전 연구와 일치한다 (적색 도 1F에 나타냄)2,26 . 우리는 SecA-PhoA 프리단백질 키메라의 초기 성숙 영역 (잔기 37 및 45)에서 두 위치를 확인하기 위해 유사한 접근법을 사용하여 아래에 논의 된 바와 같이 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 결합 및 배향을 추가로 정의한다. 다른 연구에서는 FRET 거리가 기존의 구조 또는 분자 역학 시뮬레이션 유래 모델을 정제하는데 효과적으로 사용되어 왔다18,19,56; 우리는 SecA에 바인딩 된 신호 시퀀스에 대한 구조가 존재하지 않기 때문에이 작업을 수행 할 수 없었습니다.  

Figure 1
도 1: 대표적인 FRET 스펙트럼을 갖는 SecA-SecYEG 복합체 내의 라벨링 부위. (A-D) SecA-SecYEG 공동결정 구조(PDBID: 3DIN)33의 네 가지 상이한 뷰는 SecA37, SecA321 및 SecY292의 라벨링 부위가 각각 마젠타, 바이올렛 및 시안 구체로서 도시된다. A-C는 단지의 측면도이고 D는 상단보기입니다. SecA는 밝은 회색으로 표시되고, SecYEG는 진한 회색으로 표시되고, 추정 결합 부위인 THF는 녹색으로 표시된다. (e) Ser-Gly 링커를 통해 SecA 단백질을 PhoA 예비단백질에 연결하는 SecA-PhoA 키메라 구축물의 개략도(스케일로 그려지지 않음). 키메라의 PhoA 부분 상의 라벨링 부위는 청색, 녹색, 황색 및 적색으로 주어지며, 잔기 2, 22, 37 및 45에 상응한다. (F) 뉴클레오티드 결합 도메인 1 및 2가 각각 청색 및 연한 파란색으로 표시되는 B. subtilis SecA 단백질 (PDBID: 1M6N)의 결정 구조의 리본 다이어그램은 금으로, 중앙 나선은 녹색으로, 2 나선 손가락은 시안색으로, 나선형 날개 도메인은 진한 녹색으로, C 말단 링커는 적색26으로 표시된다. . 비구조화된 C-말단은 이전의 FRET 맵핑 연구2에 기초한 결합된 PhoA 신호 펩티드의 모델로서 작용한다. (g) SecA37-AF647 및 PhoA2-AF488 FRET 쌍 및 SecA37-AF647 및 PhoA22-AF488 FRET 쌍의 공여체 전용 및 공여체-수용체 샘플의 정상 상태 형광 스펙트럼. 기증자-수용체 샘플에 대한 기증자 강도의 감소는 에너지 전달을 나타냅니다. 더 큰 에너지 전달은 공여체 강도의 감소에 기초하여 PhoA2 부위에 비해 PhoA22로부터 일어난다. (h) 시간-분해된 형광 공여체만(마젠타) 및 공여체-수용체(광 마젠타) SecA37-AF647 및 PhoA22-AF488 FRET 쌍의 붕괴 스펙트럼. 계측기 응답 기능은 회색으로 표시됩니다. 기증자 - 수용체 복합체는 더 짧은 붕괴를 제공하고 결과적으로 에너지 전달과 일치하는 더 빠른 수명을 제공합니다. 모든 분자 구조는 지시된 PDB 파일 및 PyMOL50으로 생성되었다. 도 1E-H는 Zhang et al.3으로부터 변형되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: FluorEssence 프로그램의 사용자 인터페이스 . (A) 시작 창은 빨간색 M 주위에 원으로 표시됩니다. 프로그램을 형광계와 연결하려면 클릭해야합니다. (B) 실험 설정 창은 스캔 관련 파라미터가 입력되는 다양한 영역(모노, 검출기, 액세서리)을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: SecA-PhoA2 위치에 대해 결정된 FRET 거리 쉘. FRET 거리 및 연관된 불확실성으로부터 구축된 FRET 거리 쉘(표 1)은 SecA-SecYEG 복합체(PDBID: 3DIN) 상에 묘사되어 있다. (A-C) 중앙 위치에 각각 SecA37(마젠타), SecA321(바이올렛) 및 SecY292(시안)로 구성된 PhoA2 위치에 대한 FRET 거리 쉘. 껍질은 중심 잔류 물에 따라 착색됩니다. (D) 세 FRET 쉘의 교차점은 파란색으로 표시된 PhoA2의 위치를 정의합니다. (E-H) 뷰는 A-D에서 약 180° 회전합니다. 모든 분자 구조는 지시된 PDB 파일 및 PyMOL50으로 생성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: SecA-PhoA22 위치에 대해 결정된 FRET 거리 쉘. FRET 거리 및 관련 불확실성으로부터 구축된 FRET 거리 쉘(표 1)은 SecA-SecYEG 복합체(PDBID: 3DIN)에 묘사되어 있다. (A-C) 중앙 위치에 각각 SecA37 (자홍색), SecA321 (보라색) 및 SecY292 (시안)로 구성된 PhoA22 위치에 대한 FRET 거리 쉘. 껍질은 중심 잔류 물에 따라 착색됩니다. (d) 세 FRET 쉘의 교차점은 노란색으로 표시된 PhoA22의 위치를 정의합니다. (E-H) 뷰는 A-D에서 약 180° 회전합니다. 모든 분자 구조는 지시된 PDB 파일 및 PyMOL50으로 생성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 도 1에서와 같이 B. subtilis SecA-Geobacillus thermodenitrificans SecYE 공결정 구조 (PDBID: 5EUL) 상에 투사된 PhoA2, PhoA22, PhoA37 및 PhoA45의 FRET-매핑된 위치. THF의 끝에 삽입된 OmpA 펩티드 기질은 분홍색으로 표시된다. FRET-매핑된 영역은 ATP-γS의 존재 하에 생성되었으며, PhoA2는 파란색, PhoA22는 녹색, PhoA37은 노란색, PhoA45는 빨간색으로 표시되었다. 겹치는 영역은 올리브(PhoA22 및 PhoA37) 및 오렌지(PhoA37 및 PhoA45)로 표시된다. 펩티드 기질 (잔기 749-791, 시안)을 원래의 구조로부터 절제하고, 구조에 어떠한 변경도 없이 추정적 결합 영역 내로 모델링하였다 (적색으로 원형). (b) 모델링된 펩티드 기질의 확대도. OmpA 펩티드 기질의 잔기 2(Lys), 22(Tyr), 및 37(Gly)은 각각 청색, 녹색 및 황색으로 스틱 형태로 묘사된다. 모델링된 펩티드 내의 이들 잔기는 예측된 FRET가 매핑된 위치와 우수한 일치를 나타낸다. 명확성을 위해, 원래의 구조에서 나노바디는 생략되었다. 이 수치는 Zhang et al.3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

SecA-PhoA-SecYEG 복합체에 라벨이 붙은 사이트 SecA-PhoA 키메라의 PhoA 펩티드 부분 상의 표지된 부위
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 PhoA37-AF488 PhoA45-AF488
SecA 37-AF467-PhoA
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
FRET 효율성 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
거리 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SecA321-AF647-PhoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
FRET 효율성 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
거리 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 PhoA22-AF647 PhoA37-AF647 PhoA45-AF647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
FRET 효율성 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
거리 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
참조 3에서 적응.
옹스트롬에 주어진 R0 값은 본문에 설명된 대로 계산되었다.
FRET 효율은 기재된 바와 같이 수용체의 존재하에서의 공여체 형광 강도의 감소로부터 계산되었다. 이 오류는 세 개의 독립적인 측정에서 SD로 보고됩니다.
기증자 - 수락자 거리 (R)는 옹스트롬으로 주어지고 텍스트에 설명 된대로 계산됩니다. 보고된 오류는 실험 오차를 고려한 결과이며 염료의 배향으로부터 발생하는 결과이다.  염료 배향은 정상 상태 형광 이방성으로부터 추정된다.

표 1: SecA-PhoA-SecYEG 복합체에 대해 결정된 전달 효율 및 거리. FRET 효율, 거리 및R0 값은 프리단백질 결합 부위를 매핑하는데 사용되는 12 거리에 대해 주어진다.

보충 그림 1: 분홍색 점으로 표시된 FRET 거리 쉘은 SecA-SecYEG 복합체 상의 SecA37 잔기 및 PhoA37 잔기에 대해 결정된다(PDBID: 3DIN). Sec A는 밝은 회색으로, SecYEG는 진한 회색으로 표시되고, SecA37 잔기는 자홍색으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 분홍색 점으로 표시된 FRET 거리 쉘은 SecA-SecYEG 복합체 상의 SecA321 잔기 및 PhoA 37 잔기에 대해 결정된다(PDBID: 3DIN). Sec A는 밝은 회색으로 표시되고, SecYEG는 진한 회색으로 표시되고, SecA321 잔기는 보라색으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 분홍색 점으로 표시된 FRET 거리 쉘은 SecA-SecYEG 복합체 상의 SecY292 잔기 및 PhoA 37 잔기에 대해 결정된다(PDBID: 3DIN). Sec A는 밝은 회색으로, SecYEG는 어두운 회색으로 표시되고, SecY292 잔기는 시안으로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

FRET 매핑 방법론의 사용을 통해, 우리는 SecA 단백질 상의 신호 서열 결합 부위를 동정하였다. 중요하게도, 복합체의 3-D 결정 구조의 존재는 우리의 연구를 크게 촉진했습니다. 이 매핑 방법론의 강점은 기존 구조를 사용하여 레이블링을 위한 위치를 식별하는 능력에 있습니다. 이 방법론은 3-D 구조를 결정하는 데 사용할 수 없습니다. 그러나, 구조 요소(56)의 결정, 기존 구조물(49)의 정제, 결합 부위 위치(2,32)의 결정, 또는 동적 운동(57)의 해명은 모두 이 방법의 가능한 적용이다.

SecYEG-SecA-PhoA 복합체에서 세 개의 라벨링 부위는 추정 결합 부위 주위에 삼각형을 형성합니다(그림 1). 이 삼각형의 꼭짓점으로부터 동일한 잔류물로 다중 거리 측정을 사용하면 GPS 네비게이션 방법과 유사한 위치 정보가 구체화됩니다. 세 개의 부위, SecA37, SecA341, 및 SecY292는 예비단백질의 신호 서열 및 초기 성숙 영역에서 4개의 부위, PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45와 함께 SecA 및 SecY 상에서 확인되었고, 신호 펩티드의 위치를 매핑하기 위한 총 12개의 거리를 수득하였다(표 1). 중요하게는, 거리 측정의 정확도를 향상시키기 위해, 표지 부위는 루프가 아닌 이차 구조 요소와 같은 단백질의 비교적 정적 영역에 위치해야 한다. 또한, 사이트는 라벨링의 용이성과 효율성 향상을 위해 용매에 상대적으로 접근 할 수있는 위치에 있어야합니다. SecA-PhoA-SecYEG 복합체 내에서, 삼각형 부위 또는 정점으로부터 결합 기질 내의 잔기까지의 거리 측정의 성능은 결합 기질 내의 잔기를 비교적 작은 영역으로 위치시키기에 충분하였다(도 3D, H 및 도 4D, H). 다중 거리 측정으로부터 교차된 영역의 식별은 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이 단일 거리 측정의 위치로부터 위치를 상당히 구체화한다. 따라서이 방법을 사용할 때는 여러 거리를 측정하는 것이 좋습니다. 이 방법은 결합에 관여하는 분자의 영역을 확인할 수 있지만, 예를 들어, 정확한 구조적 정보를 제공하지 않는다; 이러한 정보는 X-ray, NMR 및 cryo-EM과 같은 다른 구조적 방법에서 가장 잘 얻을 수 있습니다. FRET 거리는 기존 구조(18,19) 또는 모델을 효과적으로 미세화하는데 사용될 수 있으며, 이 경우, SecA에 결합된 신호 시퀀스의 모델이 존재하지 않기 때문에 불가능하였다.

염료 표지가 원하는 위치에서만 발생하고 FRET 거리 측정이 정확한지 확인하기 위해, 표지를 위한 돌연변이유발의 사용이 바람직하다. Cys-less 돌연변이체의 생성은 부위-지시된 돌연변이유발 방법을 사용하여 달리 야생형 단백질에서 Ser 또는 유사한 잔기에 대한 Cys 잔기의 비교적 보존적 돌연변이를 필요로 한다. 현재 연구에서, Cys 돌연변이는37 라벨링을 위해 SecA 및 SecYEG의 Cys-free 버전에 도입되었다. 돌연변이체 단백질의 활성은 성장 검정에 이어 시험관내 말라카이트 그린 ATPase 검정41,42로 검증되었다. 관련 활성 분석은 단백질의 기능에 의존하며, 예를 들어 DNA 결합 단백질에 대해, DNA 결합 검정은 적절할 것이다58. 한 위치에서만 라벨링을 보장하지 않으면 동일한 염료로 둘 이상의 부위가 라벨링되어 거리 결정이 크게 복잡해질 수 있습니다. 따라서, 동일한 단백질 상에 두 번째 표지의 도입은 부위-지시된 돌연변이유발에 의한 비천연 아미노산의 혼입을 통해 이루어질 수 있다. 우리는이 방법론을 사용하여 비천연 아미노산, p-아지도페닐알라닌을 도입하고 클릭 화학39,40으로 라벨링하여 Cys 잔기와 구별되는 위치에 SecA-PhoA 키메라를 라벨링했습니다.

이 방법의 추가적인 중요한 고려사항은 사용된 염료의 선택과 연관된R0 값이다. 잠재적인 라벨링 부위의 식별 후에, 측정될 거리는 3-D 구조로부터 추정될 수 있다. 이 정보를 통해 조사관은 원하는 예상 거리 범위에 걸쳐R0 값을 가진 염료 쌍을 선택할 수 있습니다. 예를 들어, AF488-AF647 염료 쌍은 55.7 Å의 계산된 R0을 가지며, 이는 추정 결합 부위로부터 추정된40-75 Å 떨어진 곳에 위치한 표지 부위에 대해 양호한 범위를 제공한다. 단계 2.2에서 계산된R0 값은 시스템에 사용할 염료 쌍을 선택하는 데 유용하지만, 염료를 단백질에 부착하면 그 특성이 크게 바뀔 수 있습니다. 더 큰 정확도를 위해,R0 값은 표지된 단백질로 수행된 계내 실험으로부터 계산되어야 한다(단계 3.1 - 3.6.5).

전달 효율의 측정은 정상 상태 형광 방출을 모니터링하고 공여체 방출의 감소 또는 수용체 방출의 증가를 관찰함으로써 수행 할 수 있습니다. 두 효과의 관찰이 바람직하지만, 효율은 5,8에 기재된 바와 같이 어느 것으로부터 계산될 수 있다. 효율은 또한 공여체 전용 샘플에 비해 공여체-수용체 샘플에서의 공여자 수명의 감소로부터 계산될 수 있다. 하나 이상의 방법에 의한 효율의 결정은 특히 측정된 효율의 상대적 균질성을 확립하기 위해 시간-해결 방법의 사용을 권장한다.

매핑 방법은 또한 SecA 및 추정 결합 부위에 대한 신호 서열과 PhoA 프리단백질의 초기 성숙 영역의 상대적 배향을 결정할 수있게 해주었습니다. SecA-SecYEG X선 결정 구조 및 후속 cryo-EM 연구는 채널 및 SecA34,35에 대하여 프리단백질의 신호 서열 및 초기 성숙 영역의 구조에 관한 명확성을 제공하였다. X선 구조에서, OmpA 예비단백질의 잔기 1-41을 두 나선 손가락의 팁에 부착하고 채널 내의 헤어핀 구조로 시각화하였다(분홍색으로 표시됨, 도 5). SecA-PhoA 키메라 내의 네 개의 PhoA 잔기의 위치는 상기 기재된 바와 동일한 프로토콜을 사용하여 이 구조 상에 맵핑되었다. 도 5에 도시된 바와 같이, PhoA37 및 PhoA45 잔기(황색, 주황색, 적색)의 위치는 PhoA2와 PhoA22 사이에 있고, PhoA45는 PhoA2에 더 가깝다. 이러한 발견, 특히 PhoA45의 위치는 PhoA 프리단백질이 헤어핀 구조를 형성하고 있음을 시사했다.

FRET 동정된 결합 부위를 추가로 검증하기 위해, 우리는 채널로부터 41개의 잔기 프리단백질 구조를 절제하고 이를 FRET 매핑에 의해 정의된 영역으로 모델링함으로써 OmpA 프리단백질의 위치와 매핑된 위치를 비교하였다(도 5, 시안). 프리단백질 X선 구조의 어떠한 변경도 없이, 우리는 OmpA 예비단백질 단편 적출 구조 상의 잔기 2, 22, 및 37(청색, 녹색 및 황색으로 나타냄)의 위치가 FRET 매핑된 위치(도 5B)와 현저하게 잘 일치한다는 것을 발견하고, 채널 진입 전에 헤어핀이 형성된다는 것을 시사한다. OmpA 예비단백질은 X선 결정 구조의 잔기 41에서 끝나고; 그러나 구조화되지 않은 SecY의 C 말단은 PhoA45의 가능한 위치를 나타냅니다. 우리의 모델링 된 구조에서, 헤어핀 루프는 채널의 입에 위치하며, 멤브레인을 가로 지르는 프리 단백질의 전좌를 용이하게합니다. 따라서, 이 예에서, FRET 매핑 방법론은 막을 가로지르는 단백질 전좌에 필요한 동적 운동의 힌트를 제공함으로써 정적 SecA-SecYEG 구조의 기존 정보를 향상시킨다. de novo 구조 결정에는 적합하지 않지만, 3차원 구조 정보가 이용 가능하다면, FRET 매핑 방법론은 결합 부위 및 동적 운동의 해명을 통해 구조-기능 관계에 대한 현재의 이해를 증진시킬 수 있다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 국립 보건원 보조금 R15GM135904 (IM에 수여)와 국립 보건원 GM110552 (DBO에 수여)에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

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생화학 문제 181 형광 에너지 전달 SecA 단백질 전좌 FRET 매핑
Förster 공명 에너지 전달 매핑: 글로벌 구조적 특징을 밝히기 위한 새로운 방법론
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Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

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