Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: una nuova metodologia per chiarire le caratteristiche strutturali globali

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

Lo studio descrive in dettaglio la metodologia della mappatura FRET, compresa la selezione dei siti di etichettatura, la scelta dei coloranti, l'acquisizione e l'analisi dei dati. Questa metodologia è efficace nel determinare i siti di legame, i cambiamenti conformazionali e i movimenti dinamici nei sistemi proteici ed è più utile se eseguita in combinazione con le informazioni strutturali 3D esistenti.

Abstract

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è un metodo consolidato basato sulla fluorescenza utilizzato per misurare con successo le distanze all'interno e tra le biomolecole in vitro e all'interno delle cellule. In FRET, l'efficienza del trasferimento di energia, misurata dalle variazioni dell'intensità di fluorescenza o della durata, si riferisce alla distanza tra due molecole o etichette fluorescenti. Determinazione della dinamica e cambiamenti conformazionali dalle distanze sono solo alcuni esempi di applicazioni di questo metodo ai sistemi biologici. In determinate condizioni, questa metodologia può aggiungere e migliorare le strutture cristalline a raggi X esistenti fornendo informazioni riguardanti la dinamica, la flessibilità e l'adattamento alle superfici di legame. Descriviamo l'uso di FRET e le determinazioni della distanza associate per chiarire le proprietà strutturali, attraverso l'identificazione di un sito di legame o gli orientamenti delle subunità dimeri. Attraverso una scelta giudiziosa dei siti di etichettatura e spesso l'impiego di più strategie di etichettatura, abbiamo applicato con successo questi metodi di mappatura per determinare le proprietà strutturali globali in un complesso proteina-DNA e il sistema di traslocazione proteica SecA-SecYEG. Nel sistema SecA-SecYEG, abbiamo utilizzato metodi di mappatura FRET per identificare il sito di legame preproteico e determinare la conformazione locale della regione della sequenza del segnale legato. Questo studio delinea i passaggi per l'esecuzione di studi di mappatura FRET, tra cui l'identificazione di siti di etichettatura appropriati, la discussione di possibili etichette tra cui residui di amminoacidi non nativi, procedure di etichettatura, come eseguire misurazioni e interpretare i dati.

Introduction

Per le proteine, la delucidazione della dinamica insieme alla conoscenza strutturale tridimensionale (3-D) porta a una migliore comprensione delle relazioni struttura-funzione dei sistemi biomolecolari. I metodi strutturali, come la cristallografia a raggi X e la microscopia elettronica criogenica, catturano una struttura statica e spesso richiedono la determinazione di più strutture per chiarire gli aspetti del legame e della dinamica delle biomolecole1. In questo articolo viene descritto un metodo basato su soluzione per la mappatura di elementi strutturali globali, ad esempio siti di associazione o interazioni di associazione, potenzialmente più transitori e meno facilmente acquisibili con metodi statici. I sistemi candidati forti per questa metodologia sono quelli in cui una struttura 3D è stata precedentemente determinata mediante cristallografia a raggi X, spettroscopia NMR o altri metodi strutturali. In questo caso, sfruttiamo la struttura cristallina a raggi X del complesso SecA-SecYEG, un attore centrale nella via secretoria generale della proteina, per mappare la posizione di un sito di legame peptidico del segnale utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) prima del trasporto della preproteina attraverso la membrana2. La manipolazione del sistema biologico attraverso modificazioni genetiche unita alla nostra conoscenza della struttura 3D ha permesso la determinazione della conformazione della sequenza del segnale e della regione precoce matura immediatamente prima dell'inserimento nel canale 3.

FRET comporta il trasferimento di energia senza radiazioni da una molecola (donatore) a un'altra (accettore) in modo dipendente dalla distanza che è attraverso lo spazio 4,5. L'efficienza di questo trasferimento viene monitorata attraverso una diminuzione del donatore o un aumento dell'intensità di fluorescenza dell'accettore. L'efficienza del trasferimento di energia può essere descritta come

E = R06/(R06 + R6)

in cui il valore R0 è la distanza alla quale il trasferimento è efficiente al 50%6. La tecnica è stata precedentemente descritta come un righello molecolare ed è efficace nel determinare distanze nell'intervallo 2,5-12 nm, a seconda dell'identità dei coloranti donatore-accettore 4,7,8,9. Le intensità di fluorescenza del donatore e la durata di vita con o senza accettore consentono di determinare le efficienze di trasferimento e, di conseguenza, le distanze 5,8. A causa della disponibilità della tecnologia, della sensibilità del metodo e della facilità d'uso, FRET ha anche trovato ampia applicazione in settori come la spettroscopia di fluorescenza a singola molecola e la microscopia confocale6. L'avvento di proteine fluorescenti come la proteina fluorescente verde ha reso l'osservazione della dinamica intracellulare e l'imaging delle cellule vive relativamente facile10,11. Molte applicazioni FRET come queste sono discusse in dettaglio in questo numero virtuale.

In questo studio, ci concentriamo in particolare sull'uso delle misurazioni FRET per produrre valori di distanza per determinare i dettagli strutturali. In precedenza, le misurazioni FRET sono state efficacemente utilizzate per determinare la conformazione delle molecole di DNA quando legate alla proteina 12,13,14, la dinamica interna delle proteine e le interazioni di legame proteico 15,16,17. I vantaggi di questo metodo risiedono nella capacità di determinare elementi strutturali flessibili e dinamici in una soluzione con quantità relativamente basse di materiale. Significativamente, questo metodo è particolarmente efficace se utilizzato in combinazione con le informazioni strutturali esistenti e non può essere utilizzato come mezzo di determinazione della struttura 3D. Il metodo fornisce la migliore comprensione e perfezionamento della struttura se il lavoro si basa su informazioni strutturali esistenti spesso accoppiate con la simulazione computazionale18,19. Qui, l'uso di distanze ottenute da misure FRET allo stato stazionario e risolte nel tempo è descritto per mappare un sito di legame, la cui posizione non era nota, su una struttura cristallografica esistente del complesso SecA-SecYEG, le principali proteine nella via secretoria generale3.

La via secretoria generale, un sistema altamente conservato dai procarioti agli eucarioti agli archaea, media il trasporto delle proteine attraverso o nella membrana fino alla loro posizione funzionale nella cellula. Per i batteri Gram-negativi, come E. coli, l'organismo utilizzato nel nostro studio, le proteine vengono inserite o traslocate attraverso la membrana interna al periplasma. Il complesso di canali SecY batterici (chiamato translocon) si coordina con altre proteine per traslocare la proteina appena sintetizzata, che viene diretta alla sua posizione corretta nella cellula attraverso una sequenza di segnali tipicamente situata al N-terminus20,21. Per le proteine legate al periplasma, la proteina ATPasi SecA si associa al tunnel di uscita del ribosoma e alla preproteina dopo che circa 100 residui sono stati tradotti22. Insieme alla proteina chaperone SecB, mantiene la preproteina in uno stato spiegato. SecA si lega al translocon SecYEG e, attraverso molti cicli di idrolisi dell'ATP, facilita il trasporto delle proteine attraverso la membrana23,24.

SecA è una proteina multi-dominio che esiste in forme citosoliche e legate alla membrana. Una proteina omodimerica nel citosol, SecA è costituita da un dominio di legame preproteico o cross-linking25, due domini leganti nucleotidi, un dominio alare elicoidale, un dominio elicoidale scaffold e il dito a due eliche (THF) 26,27,28,29 (Figura 1). In precedenti studi cristallografici del complesso SecA-SecYEG, la posizione del THF suggeriva che fosse attivamente coinvolto nella traslocazione delle proteine e nei successivi esperimenti di cross-linking con il peptide segnale ha ulteriormente stabilito il significato di questa regione nella traslocazione proteica30,31. Studi precedenti, utilizzando la metodologia di mappatura FRET, hanno dimostrato che i peptidi di segnale esogeni si legano a questa regione di SecA 2,32. Per comprendere appieno la conformazione e la posizione della sequenza del segnale e della regione precoce matura della preproteina prima dell'inserimento nel canale SecYEG, è stata creata una chimera proteica in cui la sequenza del segnale e i residui della regione della prima maturità sono stati attaccati alla SecA attraverso un linker Ser-Gly (Figura 1). Usando questo costrutto biologicamente vitale, è stato ulteriormente dimostrato che la sequenza del segnale e la regione precoce matura della preproteina si legano al THF in modo parallelo2. Successivamente, la metodologia di mappatura FRET è stata utilizzata per chiarire la conformazione e la posizione della sequenza del segnale e della regione di maturazione precoce in presenza di SecYEG come descritto di seguito3.

La conoscenza della struttura 3D del complesso SecA-SecYEG 33,34,35 e la possibile posizione del sito di legame ci hanno permesso di posizionare giudiziosamente le etichette donatore-accettore in luoghi in cui l'intersezione delle singole distanze FRET identifica la posizione del sito di legame. Queste misurazioni della mappatura FRET hanno rivelato che la sequenza del segnale e la regione precoce matura della preproteina formano una forcina con la punta situata alla bocca del canale SecYEG, dimostrando che la struttura della forcina è modellata prima dell'inserimento del canale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Selezione dei siti di etichettatura

  1. Identificare almeno tre potenziali siti di etichettatura per triangolare il presunto sito di legame sulle strutture proteiche esistenti. In questo caso, SecA, SecYEG e preproteina attaccate alla SecA attraverso la fusione genetica sono state identificate2.
    1. Scegliere i siti di etichettatura entro 25-75 Å dal sito di legame putativo e nelle regioni relativamente statiche della proteina, la distanza determinerà la coppia di coloranti FRET specifica da utilizzare36. Individuare i siti di etichettatura in regioni proteiche che sono relativamente distinte l'una dall'altra, in modo che i siti descrivano i vertici di un triangolo con il sito di legame putativo situato al centro (Figura 1A-D).
    2. Introdurre o identificare residui di cisteina (Cys) nei siti di etichettatura di interesse in una proteina che non ha altri residui di Cys, per migliorare l'efficienza di etichettatura del sito specifico37,38.
    3. Introdurre aminoacidi innaturali, ad esempio p-azidofenilalanina per l'etichettatura con chimica click, al fine di etichettare efficacemente una proteina in due posizioni distinte con coloranti diversi39,40.
    4. Testare i mutanti Cys per la perdita di funzione. Verificare l'attività del mutante senza Cys e del mutante inalterante dell'amminoacido utilizzando un test di attività appropriato. In questo caso, l'attività è stata verificata con un test di crescita seguito da un saggio in vitro di ATPasi verde malachite 32,41,42

2. Etichettatura della proteina

  1. Purificare la proteina o le proteine di interesse ad almeno il 95% di purezza per un'etichettatura accurata. Purificare le proteine SecA e SecYEG seguendo i protocolli descritti nel riferimento3. Assicurati di avere almeno 5 μg di proteine purificate per questo passaggio, poiché alcune proteine andranno perse durante il processo di etichettatura.
  2. Scegli due coloranti per le misurazioni FRET in base al loro valore R0 e alle distanze previste tra i siti etichettati. Stimare i valori di R0 e osservare la sovrapposizione dell'emissione del donatore e dell'assorbanza dell'accettore utilizzando le informazioni del database delle proteine fluorescenti, che fornisce anche spettri per coloranti comunemente usati (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    NOTA: R0 è definito come la distanza alla quale l'efficienza di trasferimento è del 50% per una data coppia di coloranti. Per gli esperimenti di mappatura, le distanze previste dovrebbero essere vicine al valore R0 della coppia di coloranti per garantire che le distanze possano essere misurate con precisione.
  3. Etichettare le posizioni identificate al punto 1.1.1. con la coppia colorante donatore-accettore.
    1. Etichettare la proteina secondo le istruzioni del produttore con particolare attenzione a parametri quali concentrazione ottimale di proteine, temperatura, pH, durata e tampone per i coloranti specifici utilizzati 43,44.
    2. Preparare la proteina ad una concentrazione di 1-2 mg/mL o circa 10 μM in un tampone Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE). Sciogliere il colorante in dimetilformammide (DMF) o dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di 1 mM. Aggiungere il colorante a goccia alla soluzione mescolando per raggiungere un rapporto molare colorante: proteina di 5:1 (colorante 50 μM: proteina 10 μM).
    3. Lasciare che la reazione proceda per 4 ore a temperatura ambiente (RT) in un flaconcino di vetro con oscillazione delicata o durante la notte a 4 °C. Interrompere la reazione aggiungendo β-mercaptoetanolo.
      NOTA: Se la proteina non è compatibile con il tampone Tris, è possibile utilizzare tamponi fosfato o HEPES. Mantenere il pH nell'intervallo 7,0-7,5. Se la proteina ha legami disolfuro, aggiungere un agente riducente come DTT o TCEP prima dell'etichettatura. Rimuovere il DTT mediante dialisi o filtrazione su gel prima di aggiungere colorante.
  4. Per misurazioni FRET accurate rimuovere il colorante libero con un concentratore centrifugo con un appropriato cut-off a peso molecolare (MWCO) per far fluire il colorante libero mantenendo la proteina etichettata.
    1. Preparare la membrana del concentratore posizionando ~ 1 mL di acqua nella parte superiore di un concentratore da 3 mL e quindi centrifugare l'acqua attraverso la membrana (almeno 10 minuti a 4.300 x g).
    2. Rimuovere il colorante libero centrifugando il campione etichettato nel concentratore (20 min a 4.300 x g). Ripeti 3-4 volte e smaltisci il flusso attraverso.
    3. Controllare l'efficienza di marcatura della proteina etichettata utilizzando la spettroscopia di assorbimento UV-Vis.
      NOTA: le misurazioni FRET richiedono efficienze di etichettatura pari o superiori al 50%. Minori efficienze di etichettatura riducono il segnale FRET e possono portare a imprecisioni nella misurazione.
    4. Ottenere uno spettro UV-Vis della proteina marcata con un intervallo da 250-700 nm per osservare sia la banda di assorbimento proteico che la banda di massimo assorbimento del colorante. Misurare l'assorbanza al picco di assorbimento del colorante e a 280 nm per le proteine.
    5. Determinare la concentrazione di proteine e correggere eventuali contributi del colorante utilizzando il fattore di correzione, CF, e le seguenti equazioni45,46:
      Equation 1
      dove C è la concentrazione della proteina (M), A280 è l'assorbanza del campione a 280 nm, Amax è l'assorbanza al massimo di assorbimento del colorante, ε proteina è il coefficiente di estinzione per la proteina a 280 nm e CF è il fattore di correzione, A'280/A'max, dove A'280 è l'assorbanza a 280 nm e A'max è l'assorbanza al massimo picco solo per il colorante.
    6. Determinare l'efficienza dell'etichettatura utilizzando la seguente equazione:
      Equation 2
      dove εcolorante è il coefficiente di estinzione molare del colorante, C è la concentrazione della proteina determinata nello stadio 2.4.5 ed E è l'efficienza di etichettatura. Ripetere il passaggio 2.4.2 fino a quando il valore di efficienza dell'etichettatura non si è stabilizzato ed è inferiore al 100%.

3. Determinare i valori R 0

  1. Misurare i valori R0 in situ. Preparare due campioni proteici alla stessa concentrazione di proteine totali, 4 μM, uno con la proteina etichettata solo con il colorante donatore e uno con la proteina etichettata solo con il colorante accettore. Per SecA, una concentrazione proteica di 4 μM SecA monomero funziona bene per queste misurazioni.
    1. Preparare volumi campione di 2,5 mL per una cuvetta da 1 cm x 1 cm, 600 μL per una cuvetta da 5 mm x 5 mm o 200 μL per una cuvetta da 3 mm x 3 mm.
  2. Accendere il fluorometro e aprire il programma di acquisizione e analisi spettrale nel software di fluorescenza se si utilizza uno spettrofluorometro. Fare clic sulla M rossa per collegare il computer allo strumento (Figura 2A) e scegliere Spettri di emissione.
    1. Immettere i parametri di scansione come la lunghezza d'onda di eccitazione, l'intervallo per la scansione delle emissioni, la temperatura e la posizione del cambia campione utilizzando la voce di menu Raccogli esperimento (Figura 2B).
    2. Fare clic su RTC e ottimizzare le impostazioni dello strumento (ad esempio, fessure spettrali) monitorando l'emissione di fluorescenza al picco utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione impostata al massimo assorbimento del colorante. Per SecA, impostare le seguenti impostazioni: passaggio di banda come 1 nm; fessure di eccitazione ed emissione rispettivamente di 1 e 1,5 mm, con la temperatura a 25 °C e la velocità di agitazione a 250 giri/min.
      NOTA: non superare la capacità di conteggio al secondo (cps) dello strumento (in genere 2 x 106 cps).
  3. Posizionare il campione proteico etichettato dal donatore nel supporto del campione e fare clic su Esegui per generare una scansione delle emissioni della proteina etichettata solo con il colorante del donatore (solo proteina del donatore) emozionando il campione al massimo di assorbimento del colorante (ad esempio, 488 nm per AF488) e scansionando sul picco di emissione (505-750 nm per la proteina SecA solo del donatore etichettata con AF488).
  4. Stabilire una linea di base per la scansione estendendo la scansione di 25-50 nm oltre la fine del picco. Misurare la resa quantistica della proteina solo donatrice, eseguendo misurazioni di assorbimento e fluorescenza su campioni di diverse concentrazioni come descritto47. Mantenere le stesse impostazioni della fessura per queste misurazioni.
    1. Utilizzare il colorante donatore libero come riferimento per la resa quantistica. Ottenere almeno quattro misurazioni della proteina solo donatore e del colorante libero a diverse concentrazioni per una determinazione accurata.
    2. Tracciare l'intensità di fluorescenza o l'area integrata rispetto all'assorbanza per la proteina solo donatore e il colorante libero o il riferimento. Determinare le pendenze per la proteina solo donatore (SlopeD) e il riferimento (SlopeR).
    3. La resa quantistica (Φ) è calcolata usando la seguente equazione:
      Equation 3
      qui ΦD è la resa quantistica della sola proteina donatrice, ΦR è la resa quantistica del colorante libero (questo di solito può essere ottenuto dal produttore), SlopeD e SlopeR sono le pendenze determinate nel passaggio 3.4.2 per il donatore solo proteina e riferimento, rispettivamente e ηD e ηR rappresentano l'indice di rifrazione della proteina solo donatore e delle soluzioni coloranti prive di riferimento, rispettivamente 47.
  5. Ottieni uno spettro di assorbimento della tua proteina solo accettore usando una cellula di lunghezza di percorso di 1 cm. Genera uno spettro di coefficiente di estinzione della tua proteina solo accettore dividendo lo spettro di assorbimento per la concentrazione del colorante.
  6. Generare l'integrale di sovrapposizione spettrale, J (λ) utilizzando un programma di analisi grafica. Per questo processo è possibile utilizzare anche un programma di fogli di lavoro standard (ad esempio, fogli di calcolo).
    1. Moltiplicare lo spettro di emissione di fluorescenza della proteina solo donatore (fase 3.4) per lo spettro del coefficiente di estinzione della proteina solo accettore per generare lo spettro di sovrapposizione.
    2. Moltiplicare lo spettro di sovrapposizione risultante per λ4.
    3. Determinare l'area sotto la curva mediante l'integrazione dell'area di sovrapposizione. La regione di sovrapposizione è definita come l'area in cui lo spettro di emissione del donatore moltiplicato per lo spettro del coefficiente di estinzione dell'accettore produce valori positivi. L'integrale di sovrapposizione spettrale è definito come:
      Equation 4
      dove FD (λ) è lo spettro di emissione della proteina solo donatore (ottenuta nella fase 3.4) e εA(λ) è lo spettro del coefficiente di estinzione della proteina solo accettore e ha unità di M-1 cm-1 (ottenute nella fase 3.5). L'integrale di sovrapposizione spettrale risultante dovrebbe avere unità di M-1 cm-1nm4.
    4. Normalizzare l'integrale di sovrapposizione spettrale. Dividere l'integrale di sovrapposizione per l'area integrata dello spettro proteico solo donatore sullo stesso intervallo spettrale:
      Equation 5
    5. Calcolare il valore R0 in Å utilizzando la seguente equazione:
      Equation 6
      dove κ2 è il fattore di orientamento, tipicamente preso come 2/3 per i coloranti a rotazione libera, η è l'indice di rifrazione e può essere approssimato come 1,33 per le soluzioni acquose diluite, QD è la resa quantistica del donatore (passo 3.4) e J(λ) è l'integrale di sovrapposizione spettrale come determinato nel passo 3.6.35. NOTA: Se i coloranti non ruotano liberamente, le correzioni possono essere introdotte come descritto da Ivanov 48 e implementato da Auclair49 e Zhang 2,3.

4. Eseguire misurazioni spettrali FRET

  1. Preparare campioni di proteine solo donatore, proteine solo accettore e campioni proteici donatore-accettore alla stessa concentrazione; si raccomanda una concentrazione di 4 μM. Utilizzare 200 μL di soluzione, se si utilizza una cuvetta da 3 mm x 3 mm, 600 μL se si utilizza una cuvetta da 5 mm x 5 mm o 2,5 mL se si utilizza una cuvetta da 1 cm x 1 cm.
    1. Preparare il campione di proteina donatore-accettore utilizzando quantità molari uguali del solo donatore e solo proteine accettore.
    2. Mantenere la stessa quantità di campione etichettato solo nel donatore di controllo e accettare solo campioni proteici attraverso l'introduzione di proteine non etichettate in quantità molare uguale ai campioni solo donatore o accettante. Ad esempio, per soluzioni della stessa concentrazione, ogni campione FRET solo donatore conterrebbe 100 μL di proteine solo donatrici e 100 μL di proteina non etichettata per un volume di 200 μL.
  2. Genera spettri di emissione di fluorescenza del solo donatore, solo accettore e campioni donatore-accettore. Ottimizzare il segnale come descritto nel passaggio 3.2. Una volta ottimizzato, mantenere le stesse impostazioni per tutti i campioni.
    1. Ottenere la scansione solo donatore come descritto nel passaggio 3.3. Eccitare la soluzione al massimo assorbimento del colorante del donatore e scansionare i picchi di emissione del donatore e dell'accettore (previsto).
    2. Sostituire il campione con la proteina solo accettore o modificare la posizione del cambia campione nella cuvetta contenente la proteina solo accettore.
    3. Ottenere una scansione delle emissioni della proteina etichettata solo con colorante accettore (solo proteina accettore) utilizzando le stesse impostazioni del passaggio 4.2.1. Eccitare il campione alla lunghezza d'onda di eccitazione del donatore.
      NOTA: questo spettro fornisce una correzione per la quantità di accettore eccitato alla lunghezza d'onda del donatore (FA nel passaggio 5.1.2)
    4. Scambiare il campione con il campione di proteina donatore-accettore o modificare la posizione del cambiafiltro nella cuvetta contenente la proteina marcata donatore-accettore.
    5. Ottenere una scansione delle emissioni del campione proteico donatore-accettore utilizzando le stesse impostazioni di cui ai passaggi 4.2.1 e 4.2.3.
    6. Per tutti gli spettri, correggere la fluorescenza di fondo sottraendo i conteggi di sfondo misurati alla fine della scansione.
  3. Misurare la durata di vita del donatore solo del donatore e i campioni donatore-accettore preparati come descritto al punto 4.1.2. Utilizzare uno strumento di fluorescenza per il conteggio dei singoli fotoni correlato al tempo in grado di misurare e risolvere i decadimenti fluorescenti nell'intervallo di tempo dei nanosecondi (10-9 s).
    NOTA: per le coppie di coloranti FRET, abbinare la sorgente luminosa di eccitazione al massimo di assorbimento del colorante donatore.
    1. Accendere lo strumento. Aprire il software di acquisizione, utilizzare il software di controllo dello strumento per l'acquisizione dei dati con lo spettrometro a fluorescenza.
    2. Per l'acquisizione, selezionare TCSPC Decay, con un intervallo di tempo di 55 ns, un guadagno di 1 e 4096 canali.
    3. Ottenere una funzione di risposta dello strumento (IRF) utilizzando una soluzione di crema non casearia o soluzione di scattering commerciale e monitorare lo scattering a 490 nm. Regolare l'impostazione della fessura e utilizzare filtri a densità neutra secondo necessità per mantenere una frequenza di conteggio sufficientemente bassa da evitare l'accumulo di impulsi5. Fare clic su Accetta e quindi su Avvia. Questo avvierà l'acquisizione.
      NOTA: per una frequenza di ripetizione di 180 kHz viene utilizzata una frequenza di conteggio massima di 4000 kHz.
    4. Raccogliere l'IRF a 490 nm fino a quando il canale di picco ha un massimo di 20.000 conteggi. Raccogliere un IRF prima e dopo aver misurato ogni decadimento di fluorescenza.
    5. Ottenere i decadimenti di fluorescenza del solo donatore e dei campioni donatore-accettore monitorando l'emissione di fluorescenza alla lunghezza d'onda di emissione del donatore, 520 nm.
    6. Regolare le impostazioni della fessura per una velocità di conteggio massima di 4000 cps o inferiore. Le impostazioni della fessura sono in genere 15-20 nm bandpass per i campioni proteici. Raccogli il decadimento fino a ottenere 20.000 conteggi nel canale di picco.
  4. Analizzare il decadimento o l'intensità di fluorescenza (I) in funzione del tempo (t) per la durata di fluorescenza (τ). Adatta il decadimento a una somma di esponenziali con la seguente equazione:
    Equation 7
    dove αI è il fattore premisponenziale dell'i-esima componente e τI è la durata. L'adattamento viene riconvolto con l'IRF per abbinare il decadimento della fluorescenza. Giudicare la qualità della vestibilità in base ai parametri Χ2 ridotti.

5. Analisi dei dati FRET

  1. Calcola l'efficienza FRET dalla diminuzione dell'intensità del donatore del campione donatore-accettore rispetto al donatore solo con la seguente equazione.
    Equation 8
    dove FDA è l'intensità di fluorescenza del campione donatore-accettore e FD è l'intensità di fluorescenza del campione solo donatore al picco della fluorescenza del donatore. Utilizzare le aree integrate dei picchi se i dati sono rumorosi.
    1. Correggere eventuali differenze nell'etichettatura tra i campioni solo donatore e donatore-accettore. Calcola le correzioni in base al grado di etichettatura del donatore come segue.
      Equation 9
      dove fDA è l'efficienza di etichettatura del donatore nel campione donatore-accettore e fD è l'efficienza di etichettatura nel campione solo donatore.
    2. Correggere eventuali contributi della fluorescenza dell'accettore allo spettro eccitato dal donatore attraverso la sottrazione dello spettro proteico solo accettore (fase 4.2) dallo spettro proteico donatore-accettore.
      Equation 14
    3. Correggere le differenze nell'efficienza di etichettatura della sola proteina accettore rispetto al campione proteico donatore-accettore producendo la seguente equazione per il calcolo dell'efficienza:
      Equation 10
      dove fA indica la quantità frazionaria dell'etichettatura dell'accettore. Questa equazione include tutte le correzioni dovute all'etichettatura del colorante e alla fluorescenza dell'accettore.
    4. Calcola le distanze FRET dalle efficienze usando la seguente equazione:
      Equation 11
      utilizzando il valore R0 ottenuto al punto 3.6.5.
    5. Calcolare l'efficienza FRET utilizzando la durata di fluorescenza del solo donatore e i campioni donatore-accettore misurati nei passaggi 4.3.3-4.3.5:
      Equation 12
    6. Utilizzare la durata ponderata in ampiezza per calcolare le efficienze FRET e confrontarle con i risultati dello statostazionario 5.
      Equation 13
    7. Calcolare la distanza come nel passaggio 5.1.4 dalle efficienze determinate dalla durata di fluorescenza. Confronta i valori di stato stazionario e di risoluzione temporale per le efficienze e le distanze FRET e assicurati che siano in errore l'uno dall'altro.

6. Mappatura delle distanze

  1. Utilizzare le distanze calcolate per mappare il sito di associazione sulla struttura tridimensionale. Calcolare le distanze e gli errori per tutte le coppie di coloranti e le posizioni esaminate utilizzando l'equazione fornita nei valori del punto 5.1.4 e R0 ottenuti nel passaggio 3.6.5 per ciascuna coppia FRET.
    1. Utilizzare un programma di visualizzazione grafica 3D come PyMOL50 per mappare le distanze sulla struttura (script fornito in File supplementare). I comandi dello script possono essere inseriti direttamente nella finestra di comando con le informazioni sulla distanza appropriate.
    2. Generare un guscio per ogni distanza misurata e l'errore associato (Figura 3, Figura 4, Figure supplementari 1-3).
    3. Mappare la posizione attraverso l'intersezione dei diversi gusci (Figure supplementari 1-3). Il sito di legame peptidico del segnale è stato mappato attraverso le tre diverse posizioni su SecA e SecYEG e quattro diverse posizioni sul peptide del segnale (Figura 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Questo studio si è concentrato sulla determinazione della posizione del sito di legame preproteico su SecA prima dell'inserimento della preproteina nel canale SecYEG. Per mappare il sito di legame, sono stati eseguiti esperimenti FRET tra diverse regioni della preproteina e tre posizioni distinte sulle proteine SecA e SecYEG (Figura 1A-D). Dalle distanze ottenute e dalle strutture tridimensionali di SecA, SecYEG e della preproteina, è stata prevista la posizione del sito di legame preproteico. Piuttosto che impiegare tre entità separate (SecA, SecYEG e preproteina) per eseguire queste misurazioni, la sequenza del segnale PhoA è stata collegata alla SecA attraverso la modificazione genetica dopo l'incorporazione di un linker Gly-Ser 2,3. Per la facile etichettatura con coloranti, residui di Cys o mutazioni ambrate sono stati introdotti ai residui 2, 22, 35 e 45 nella preproteina PhoA (Figura 1E).

Identificazione dei siti ed etichettatura
Un presunto sito di legame per la sequenza del segnale era stato precedentemente identificato utilizzando metodi di mappatura FRET simili 2,32. Questi e altri studi avevano identificato il dito a due eliche (THF) e il dominio di cross-linking preproteico come possibili siti di legame del peptide segnale con un orientamento suggerito in posizione parallela al THF 33,51,52,53,54 (Figura 1F). Pertanto, l'identificazione di potenziali siti di etichettatura sulle proteine SecA e SecYEG è stata effettuata in base alla posizione del presunto sito di legame nella struttura cristallina SecA e SecYEG (mostrata in verde nella Figura 1A-D). Tre siti sono stati scelti per triangolare la posizione del presunto sito di legame, dove essenzialmente i tre siti formano un triangolo attorno al sito di legame putativo. Come mostrato nella Figura 1, i tre siti si trovavano all'interno dell'intervallo FRET del sito di legame (50-70 Å). È stata scelta la coppia di coloranti Alexa Fluor 488 (AF488) e Alexa Fluor 647 (AF647), poiché il valore R0 di 55,7 Å36 corrisponde bene alle distanze previste tra i siti etichettati e il presunto sito di legame garantendo l'accuratezza della misurazione.

I tre siti scelti per l'etichettatura, SecA37, SecA321 e SecY292 (mostrati come sfere magenta, viola e ciano nella Figura 1A-D) si trovano in tutto il complesso proteico formando un triangolo attorno al sito di legame putativo. I tre siti sono stati mutati separatamente in residui di Cys in un mutante senza Cys per garantire che solo la posizione corretta fosse etichettata 2,37. Per gli esperimenti SecY292, i siti di preproteine PhoA sono stati etichettati con AF647 e il residuo SecY 292 è stato etichettato con AF488 utilizzando la chimica della maleimmide. Nella proteina chimerica, i siti SecA37 e SecA321 sono stati etichettati con AF647 e la preproteina è stata etichettata con AF488. Nella proteina chimerica SecA-PhoA, i residui 2, 22, 37 e 45 del segmento delle preproteine PhoA sono stati mutati ciascuno in un codone ambrato nelle singole proteine. Le mutazioni del codone ambrato hanno permesso l'introduzione di aminoacidi innaturali, p-azidofenilalanina, in quelle posizioni, che sono state successivamente etichettate con l'AF488 usando la chimica del clic39,40. Ogni mutazione è stata generata ed etichettata in modo indipendente per garantire un'etichettatura corretta e differenziale dei componenti proteici. Il grado di etichettatura è stato determinato per tutte le proteine e generalmente doveva essere del 50% o superiore per poter procedere con il campione.

Determinazione delle efficienze e delle distanze di trasferimento
Prima di eseguire le misurazioni del trasferimento di energia, sono stati determinati i valori di rendimento quantistico del donatore, integrale di sovrapposizione e R0 (passaggi 3.4-3.6). La resa quantistica del donatore è stata misurata rispetto al colorante, la fluoresceina, che ha una resa quantistica di 0,79 in 0,1 M NaOH47. Gli spettri di assorbimento e di emissione di fluorescenza sono stati ottenuti a una serie di concentrazioni per generare un grafico lineare di assorbimento relativo all'intensità di emissione di fluorescenza per determinare la resa quantistica. In queste misurazioni, è fondamentale misurare l'assorbimento nell'intervallo lineare (0,1-1,0) e tutte le misurazioni delle emissioni devono essere generate con le stesse impostazioni della fessura. Poiché questi valori vengono utilizzati per determinare gli integrali di sovrapposizione e i valori R0 , devono essere misurati in condizioni FRET. L'ambiente locale delle proteine influisce profondamente sull'emissione di coloranti e, di conseguenza, le rese quantistiche dei donatori dovrebbero essere misurate per ciascuno dei siti studiati. Notiamo che i siti su SecA e SecYEG influenzano i valori R0 più fortemente di quelli sulla porzione PhoA della chimera. Per le coppie di coloranti con lo stesso sito SecA o SecYEG, i valori R0 sono in genere entro 5 Å l'uno dall'altro; mentre i valori di R0 possono differire fino a 20 Å per le due diverse sedi SecA (residui 37 vs. 321), sottolineando l'importanza di determinare i valori di R0 per ciascuna coppia di coloranti (Tabella 1).

Il calcolo di R0 presuppone che i coloranti donatore e accettore ruotino liberamente e il grado in cui i coloranti non ruotano contribuisce all'incertezza complessiva nella misurazione. Per tenere adeguatamente conto del movimento relativo dei coloranti e dei loro orientamenti, sono state eseguite misurazioni dell'anisotropia a fluorescenza allo stato stazionario su tutti i coloranti donatori e accettori nelle diverse posizioni di etichettatura. Questi valori, che erano nell'intervallo 0,10-0,21, sono stati utilizzati per calcolare l'errore associato alle misurazioni della distanza 2,3,48. I valori di anisotropia relativamente elevati osservati sia per i coloranti donatori che per quelli accettori corrispondono a una riduzione della rotazione del colorante, che è incoerente con l'ipotesi della rotazione libera. La mancanza di rotazione libera genera un errore del 19%-25% nei calcoli della distanza. Come mostrato nella tabella 1, ciò ha comportato un'incertezza media nelle distanze misurate al massimo di ± 15 Å. Quando si mappano le distanze FRET, queste incertezze nelle misurazioni della distanza sono una considerazione importante, come discusso di seguito.

La distanza calcolata tra coppie donatore-accettore si basa sulla relazione tra efficienza e distanza, in cui una maggiore efficienza è indicativa di coppie donatore-accettore separate da una distanza più breve. Per determinare l'efficienza FRET, gli spettri di emissione di fluorescenza eccitati alla lunghezza d'onda di eccitazione del donatore (488 nm) sono ottenuti su campioni solo donatore e donatore-accettore. Tipicamente, una riduzione dell'intensità delle emissioni dei donatori indica la presenza di trasferimento di energia (fase 5.1). La Figura 1G illustra gli spettri donatore-accettore per il residuo SecA 37 con il residuo 2 o 22 della chimera PhoA. Il residuo SecA37 è etichettato con AF647 o il colorante accettore e i residui PhoA sono etichettati con AF488 o il colorante donatore. In entrambe le posizioni, la fluorescenza del donatore è ridotta e un piccolo aumento dell'intensità di fluorescenza dell'accettore può essere visto nei campioni donatore-accettore. Poiché l'eccitazione viene eseguita alla lunghezza d'onda di eccitazione del donatore di 488 nm, che non eccita direttamente l'accettore, qualsiasi fluorescenza dell'accettore osservata deriva dal trasferimento di energia. Pertanto, la diminuzione dell'intensità del donatore e il concomitante aumento dell'intensità dell'accettore derivano dal trasferimento di energia tra i due coloranti. Significativamente, l'intensità di fluorescenza del donatore è maggiore per la posizione PhoA2 (blu) rispetto alla posizione PhoA22 (giallo) in presenza dell'accettore. Questa differenza relativa nella diminuzione dell'intensità del donatore indica che il trasferimento di energia tra il residuo PhoA2 e il residuo SecA37 è più debole del trasferimento tra i residui PhoA22 e SecA37, il che implica che il residuo PhoA2 si trova più lontano da SecA37 rispetto a PhoA22. Le distanze sono determinate dalla relazione tra efficienza e valori R0 (punto 5.1.4).

Poiché le misurazioni di fluorescenza allo stato stazionario potrebbero rappresentare una media di due o più distanze, abbiamo anche eseguito misurazioni di fluorescenza risolte nel tempo. Per questi esperimenti, la durata del colorante donatore viene misurata in presenza e assenza dell'accettore (Figura 1G). Se ci fossero due distinti processi di trasferimento di energia che contribuiscono all'efficienza di fluorescenza allo stato stazionario misurata, sarebbero osservati come vite discrete, a condizione che siano risolvibili entro la risoluzione temporale dello strumento. Per migliorare la capacità di risolvere le vite, 10.000 conteggi o più dovrebbero essere raccolti al picco; tuttavia, l'altezza di picco o il conteggio dei canali di picco devono essere bilanciati con il tempo di acquisizione e il potenziale danno al campione. Le misurazioni risolte nel tempo hanno prodotto una singola durata per ogni coppia donatore-accettore coerente con un solo orientamento o distanza tra i coloranti. Notiamo che piccole differenze nella distanza osservate nelle aree rivelate dalla nostra tecnica di mappatura FRET non porterebbero a vite risolvibili nel nostro sistema. Inoltre, le efficienze determinate dalle misurazioni di fluorescenza risolte nel tempo erano in buon accordo con quelle determinate dalle misurazioni dello stato stazionario, fornendo un ulteriore supporto al fatto che le efficienze misurate derivano da una sola distanza tra le coppie di coloranti3.

Mappatura delle distanze FRET sulla struttura tridimensionale
Le misurazioni del trasferimento di energia di risonanza forniscono informazioni sufficienti sulla distanza per identificare il sito di legame e l'orientamento della sequenza del segnale su SecA. Le tre posizioni su SecA e SecYEG insieme alle quattro posizioni sulla regione PhoA della chimera SecA-PhoA forniscono le 12 diverse distanze utilizzate per mappare il sito di legame (Tabella 1). Le dodici distanze sono state mappate sulla struttura cocristallina tridimensionale a raggi X del complesso Thermotoga maritima SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN) per identificare il sito di legame della sequenza di segnale33. La struttura del complesso SecA-SecYEG è simile a quella osservata in E. coli , come evidenziato da uno studio di fotocrosslinking in vivo 55.

Usiamo i residui iniziali (PhoA2) e finali (PhoA22) della sequenza del segnale PhoA nella chimera SecA-PhoA per illustrare come sono state identificate le posizioni dei residui sul complesso SecA-SecYEG. Poiché il trasferimento di energia può avvenire in tutte le direzioni, le distanze FRET e gli errori associati descrivono un guscio sferico, con una delle posizioni del colorante dalla coppia donatore-accettore designata come centro. In questo studio, i residui SecA37, SecA321 e SecY292 formano i centri di tre gusci sferici che descrivono la posizione del residuo PhoA2 della sequenza del segnale. La visualizzazione delle regioni sovrapposte derivanti dalle tre posizioni separate, SecA37 (magenta), SecA321 (viola) e SecY292 (ciano) sono mostrate nella Figura 3. Solo una parte di ogni guscio FRET si interseca con la struttura proteica e vengono evidenziati i residui e la spina dorsale che rientrano in quel guscio. Pertanto, le regioni proteiche all'interno del guscio definite dalla distanza SecA37-PhoA2 sono mostrate in magenta (Figura 3A,E), mentre le regioni definite dai gusci SecA321-PhoA2 e SecY292-PhoA2 sono mostrate rispettivamente in viola (Figura 3B,F) e ciano (Figura 3C,G). Il presunto sito di legame, costituito principalmente dal dito a due eliche, è mostrato in verde.

Come mostrato nella Figura 3, ciascuno di questi gusci FRET definisce una sezione relativamente grande del complesso proteico. Per tutte e tre le posizioni, il guscio FRET si interseca con il presunto sito di legame; tuttavia, per il residuo SecA321, ad esempio, l'area intersecata è più piccola e si trova verso le estremità delle dita con una sovrapposizione significativa con il dominio dell'impalcatura elicoidale. L'intersezione o l'area comune di tutti e tre i gusci FRET (Figura 3D,H), definisce la posizione del residuo PhoA2. Questa area è considerevolmente più piccola di ogni guscio FRET e comprende solo una piccola parte del THF con un grande contributo dall'impalcatura elicoidale. Gli script utilizzati per generare i gusci FRET e le aree intersecate per il programma di visualizzazione molecolare, PyMOL, sono forniti nelle Informazioni supplementari. Parti dei gusci sono visualizzate come punti rosa sul complesso SecA-SecYEG nelle figure supplementari 1-3.

Una strategia simile è stata utilizzata per identificare la posizione del residuo di PhoA22. I gusci FRET definiti dalle distanze FRET PhoA22 (Figura 4A-C,E-G) descrivono un'area più piccola rispetto al residuo PhoA2 (Figura 4D,H vs Figura 3D,H). Interpretiamo questa differenza per suggerire che il residuo di PhoA2 e la regione associata sono più flessibili e labili di PhoA22. Significativamente, l'area attribuita al residuo di PhoA22 si trova più vicino alla punta del THF e alla bocca del canale SecYEG, con regioni di SecY identificate nell'area comune (Figura 3D, H). Tutti e tre gli accoppiamenti di coloranti identificano le regioni insieme al presunto sito di legame; tuttavia, le aree comuni intersecate centrano la posizione PhoA22 (Figura 4D, H) all'estremità opposta del THF rispetto alla posizione PhoA2 (Figura 3D, H). Questi risultati suggerirebbero che la sequenza di segnale della preproteina che si estende dai residui 2-22, si trova lungo il THF in uno stato relativamente non strutturato. Questo risultato è coerente con studi precedenti che suggeriscono che la sequenza del segnale si lega alla proteina lungo il THF in uno stato esteso e che l'estremità C-terminale della SecA nella struttura cristallina di B. subtilis modella essenzialmente la struttura del peptide del segnale e occupa la stessa posizione (mostrata in rosso Figura 1F)2,26 . Abbiamo impiegato un approccio simile per identificare due posizioni nella regione della prima maturazione (residui 37 e 45) della chimera preproteina SecA-PhoA per definire ulteriormente il legame e l'orientamento della sequenza del segnale e della regione della prima maturazione, come discusso di seguito. In altri studi le distanze FRET sono state utilizzate efficacemente per perfezionare una struttura esistente o un modello derivato dalla simiulazione della dinamica molecolare 18,19,56; non siamo stati in grado di farlo, in quanto non esiste alcuna struttura per la sequenza di segnali legata alla SecA.  

Figure 1
Figura 1: Siti di etichettatura nel complesso SecA-SecYEG con spettri FRET rappresentativi. (A-D) Quattro diverse viste della struttura cocristallina SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN)33 in cui i siti di etichettatura di SecA37, SecA321 e SecY292 sono mostrati rispettivamente come sfere magenta, viola e ciano. A-C sono viste laterali del complesso e D è una vista dall'alto. SecA è mostrato in grigio chiaro, SecYEG è mostrato in grigio scuro e il presunto sito di legame, il THF, è mostrato in verde. (E) Schema del costrutto della chimera SecA-PhoA, che collega la proteina SecA alla preproteina PhoA attraverso un linker Ser-Gly (non disegnato in scala). I siti di etichettatura sulla porzione PhoA della chimera sono indicati in blu, verde, giallo e rosso, corrispondenti ai residui 2, 22, 37 e 45. (F) Diagramma a nastro della struttura cristallina della proteina B. subtilis SecA (PDBID: 1M6N) colorato per dominio in cui i domini leganti nucleotidi 1 e 2 sono mostrati rispettivamente in blu e azzurro, il dominio di reticolazione preproteica è mostrato in oro, l'elica centrale in verde, il dito a due elica in ciano, il dominio dell'ala elicoidale in verde scuro e il linker C-terminale in rosso26 . Il C-terminus non strutturato funge da modello del peptide del segnale PhoA legato sulla base di un precedente studio di mappatura FRET2. (G) Spettri di fluorescenza allo stato stazionario del solo donatore e campioni donatore-accettore della coppia SECA37-AF647 e PhoA2-AF488 FRET e della coppia SECA37-AF647 e PhoA22-AF488 FRET. La riduzione dell'intensità del donatore per il campione donatore-accettore è indicativa del trasferimento di energia. Un maggiore trasferimento di energia si verifica da PhoA22 rispetto al sito PhoA2 in base alla diminuzione dell'intensità del donatore. (H) Spettri di decadimento solo donatore di fluorescenza a risoluzione temporale (magenta) e donatore-accettore (magenta leggero) della coppia SECA37-AF647 e PhoA22-AF488 FRET. La funzione di risposta dello strumento è mostrata in grigio. Il complesso donatore-accettore dà un decadimento più breve e di conseguenza una vita più veloce coerente con il trasferimento di energia. Tutte le strutture molecolari sono state generate con il file PDB indicato e PyMOL50. La Figura 1E-H è stata modificata da Zhang et al.3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Interfaccia utente del programma FluorEssence. (A) La finestra di apertura è mostrata con un cerchio attorno alla M rossa. Questo deve essere cliccato per collegare il programma con il fluorometro. (B) La finestra di configurazione dell'esperimento illustra le diverse aree (mono, rivelatori, accessori) in cui sono inseriti i parametri rilevanti per la scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Gusci a distanza FRET determinati per la posizione SecA-PhoA2. I gusci a distanza FRET costruiti a partire dalle distanze FRET e dalle incertezze associate (Tabella 1) sono rappresentati sul complesso SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (A-C) Gusci a distanza FRET per la posizione PhoA2 costruiti rispettivamente con SecA37 (magenta), SecA321 (viola) e SecY292 (ciano), rispettivamente in posizione centrale. Le conchiglie sono colorate in base al residuo centrale. (D) L'intersezione dei tre gusci FRET definisce la posizione di PhoA2, mostrata in blu. (E-H) Le viste sono ruotate di circa 180° dall'A al D. Tutte le strutture molecolari sono state generate con il file PDB indicato e PyMOL50. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Gusci a distanza FRET determinati per la posizione SecA-PhoA22. I gusci a distanza FRET costruiti a partire dalle distanze FRET e dalle incertezze associate (Tabella 1) sono rappresentati sul complesso SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). (A-C) GUSCI DI DISTANZA FRET per la posizione PhoA22 costruiti con SecA37 (magenta), SecA321 (viola) e SecY292 (ciano), rispettivamente in posizione centrale. Le conchiglie sono colorate in base al residuo centrale. (D) L'intersezione dei tre gusci FRET definisce la posizione di PhoA22, mostrata in giallo. (E-H) Le viste sono ruotate di circa 180° dall'A al D. Tutte le strutture molecolari sono state generate con il file PDB indicato e PyMOL50. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Posizioni mappate FRET di PhoA2, PhoA22, PhoA37 e PhoA45 proiettate sulla struttura cocristallina seca-geobacillus thermodenitrificans SecYE (PDBID: 5EUL). (A) Colorazione della SecA-SecYE come nella Figura 1. Il substrato peptidico OmpA inserito all'estremità del THF è mostrato in rosa. Le regioni mappate FRET sono state generate in presenza di ATP-γS, con PhoA2 mostrato in blu, PhoA22 in verde, PhoA37 in giallo e PhoA45 in rosso. Le regioni di sovrapposizione sono mostrate in oliva (PhoA22 e PhoA37) e arancione (PhoA37 e PhoA45). Il substrato peptidico (residui 749-791, ciano) è stato asportato dalla struttura originale e modellato nella presunta regione di legame senza alcuna alterazione della struttura (cerchiata in rosso). (B) Vista ingrandita del substrato peptidico modellato. I residui 2 (Lys), 22 (Tyr) e 37 (Gly) del substrato peptidico OmpA sono rappresentati in forma di bastone in blu, verde e giallo, rispettivamente. Questi residui nei peptidi modellati mostrano un eccellente accordo con le posizioni mappate FRET previste. Per chiarezza, il nanocorpo nella struttura originale è stato omesso. Questa cifra è stata modificata da Zhang et al.3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

sito etichettato sul complesso SecA-PhoA-SecYEG Sito etichettato sulla porzione peptidica PhoA di SecA-PhoA Chimera
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 PhoA37-AF488 PhoA45-AF488
SecA 37-AF467-PhoA
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
Efficienza FRET 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
distanza 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SecA321-AF647-PhoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
Efficienza FRET 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
distanza 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 PhoA22-AF647 PhoA37-AF647 PhoA45-AF647
SecY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
Efficienza FRET 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
distanza 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
adattato dal riferimento 3.
I valori R0 indicati in angstrom sono stati calcolati come descritto nel testo
L'efficienza FRET è stata calcolata dalla diminuzione dell'intensità di fluorescenza del donatore in presenza dell'accettore come descritto. L'errore viene segnalato come SD da tre misurazioni indipendenti.
Le distanze donatore-accettore (R) sono indicate in angstrom e calcolate come descritto nel testo. L'errore riportato deriva da una considerazione dell'errore sperimentale e di quello derivante dall'orientamento dei coloranti.  L'orientamento del colorante è stimato dall'anisotropia di fluorescenza allo stato stazionario

Tabella 1: Efficienze di trasferimento e distanze determinate per il complesso SecA-PhoA-SecYEG. Le efficienze FRET, le distanze e i valori R0 sono indicati per le 12 distanze utilizzate per mappare il sito di legame preproteico.

Figura supplementare 1: Guscio di distanza FRET, mostrato in punti rosa, determinato per il residuo SecA37 e il residuo PhoA 37 sul complesso SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A è mostrato in grigio chiaro, SecYEG è mostrato in grigio scuro e il residuo SecA37 è mostrato in magenta. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Guscio di distanza FRET, mostrato in punti rosa, determinato per il residuo SecA321 e il residuo PhoA 37 sul complesso SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A è mostrato in grigio chiaro, SecYEG è mostrato in grigio scuro e il residuo SecA321 è mostrato in viola. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Guscio di distanza FRET, mostrato in punti rosa, determinato per il residuo SecY292 e il residuo PhoA 37 sul complesso SecA-SecYEG (PDBID: 3DIN). Sec A è mostrato in grigio chiaro, SecYEG è mostrato in grigio scuro e il residuo SecY292 è mostrato in ciano. Fare clic qui per scaricare questo file.

File integrativo. Fare clic qui per scaricare questo file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Attraverso l'uso della metodologia di mappatura FRET, abbiamo identificato il sito di legame della sequenza di segnale sulla proteina SecA. È importante sottolineare che la presenza di una struttura cristallina 3D del complesso ha notevolmente facilitato il nostro studio. La forza di questa metodologia di mappatura risiede nella capacità di utilizzare una struttura esistente per identificare le posizioni per l'etichettatura. Questa metodologia non può essere utilizzata per determinare una struttura 3D; tuttavia, la determinazione degli elementi strutturali56, il perfezionamento di una struttura esistente49, la determinazione di una posizione del sito di legame 2,32 o la delucidazione del moto dinamico57, sono tutte possibili applicazioni di questo metodo.

Nel complesso SecYEG-SecA-PhoA, i tre siti di etichettatura formano un triangolo attorno al presunto sito di legame (Figura 1). L'impiego di misurazioni di distanza multiple dai vertici di questo triangolo allo stesso residuo affina le informazioni sulla posizione in modo simile ai metodi di navigazione GPS. Tre siti, SecA37, SecA341 e SecY292, sono stati identificati su SecA e SecY insieme a quattro siti, PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 nella sequenza del segnale e nella regione di maturazione precoce della preproteina per dare un totale di 12 distanze per mappare la posizione del peptide del segnale (Tabella 1). È importante sottolineare che, per migliorare l'accuratezza delle misurazioni della distanza, i siti di etichettatura dovrebbero essere situati in regioni relativamente statiche della proteina, ad esempio in elementi di struttura secondaria piuttosto che in loop. Inoltre, i siti dovrebbero anche trovarsi in luoghi relativamente accessibili al solvente per facilitare e aumentare l'efficienza dell'etichettatura. All'interno del complesso SecA-PhoA-SecYEG, le prestazioni delle misurazioni della distanza dai siti del triangolo o dai vertici ai residui nel substrato di legame erano sufficienti per localizzare i residui nel substrato di legame a un'area relativamente piccola (Figura 3D, H e Figura 4D, H). L'identificazione dell'area intersecata dalle misurazioni a distanza multipla affina significativamente la posizione da quella della misurazione della singola distanza, come mostrato in Figura 3 e Figura 4. Pertanto, quando si utilizza questo metodo, la misurazione di più distanze è fortemente raccomandata. Sebbene questo metodo possa identificare regioni di molecole coinvolte nel legame, ad esempio, non fornisce informazioni strutturali precise; tali informazioni sono meglio ottenute da altri metodi strutturali come i raggi X, nmr e crio-EM. Le distanze FRET possono essere utilizzate per perfezionare efficacemente una struttura esistente 18,19 o un modello, in questo caso, che non era possibile in quanto non esiste un modello della sequenza di segnale legata alla SecA.

Per garantire che l'etichettatura del colorante avvenga solo nelle posizioni desiderate e che le misurazioni della distanza FRET siano accurate, è preferibile l'uso della mutagenesi per l'etichettatura. La generazione di un mutante senza Cys richiede una mutazione relativamente conservativa dei residui di Cys in Ser o residui simili nella proteina altrimenti wild-type usando metodi di mutagenesi diretti al sito. Nel presente studio, le mutazioni di Cys sono state introdotte nelle versioni prive di Cys di SecA e SecYEG per l'etichettatura37. L'attività della proteina mutante è stata verificata con un test di crescita seguito da un saggio in vitro di ATPasi verde malachite41,42. I saggi di attività rilevanti dipendono dalla funzione della proteina, ad esempio per le proteine leganti il DNA, un test di legame del DNA sarebbe appropriato58. La mancata garanzia dell'etichettatura in una sola posizione può portare all'etichettatura di più di un sito con lo stesso colorante, il che complica significativamente le determinazioni della distanza. Pertanto, l'introduzione di una seconda etichetta sulla stessa proteina può essere fatta attraverso l'incorporazione di aminoacidi innaturali mediante mutagenesi diretta al sito. Abbiamo impiegato questa metodologia per etichettare la chimera SecA-PhoA in luoghi distinti dai residui di Cys introducendo l'amminoacido innaturale, p-azidofenilalanina ed etichettando con chimica del clic39,40.

Un'ulteriore considerazione importante di questo metodo è la scelta dei coloranti utilizzati e il valore R0 associato. Dopo l'identificazione dei potenziali siti di etichettatura, le distanze da misurare possono essere stimate dalla struttura 3D. Con queste informazioni, i ricercatori possono scegliere coppie di coloranti con valori R0 che coprono l'intervallo desiderato di distanze previste. Ad esempio, la coppia di coloranti AF488-AF647 ha un R0 calcolato di 55,7 Å che fornisce un buon intervallo per i siti di etichettatura situati a circa 40-75 Å di distanza dal presunto sito di legame. Sebbene i valori R0 calcolati nel passaggio 2.2 siano utili per scegliere quale coppia di coloranti utilizzare per il sistema, l'attaccamento dei coloranti alla proteina può alterare significativamente le loro proprietà. Per una maggiore precisione, i valori di R0 devono essere calcolati da esperimenti in situ eseguiti con proteine marcate (fasi 3.1 - 3.6.5).

La misurazione dell'efficienza di trasferimento può essere effettuata monitorando l'emissione di fluorescenza allo stato stazionario e osservando una diminuzione delle emissioni dei donatori o un aumento delle emissioni degli accettori. Sebbene l'osservazione di entrambi gli effetti sia auspicabile, l'efficienza può essere calcolata da entrambi come descritto 5,8. L'efficienza può anche essere calcolata dalla diminuzione della vita del donatore nel campione donatore-accettore rispetto al campione solo donatore. Si raccomanda la determinazione dell'efficienza con più di un metodo, in particolare l'uso di metodi risolti nel tempo per stabilire l'omogeneità relativa delle efficienze misurate.

Il metodo di mappatura ci ha anche permesso di determinare l'orientamento relativo della sequenza del segnale e le regioni mature precoci della preproteina PhoA rispetto alla SecA e al sito di legame putativo. Una struttura cristallina a raggi X SecA-SecYEG e un successivo studio crio-EM hanno fornito chiarezza sulla struttura della sequenza del segnale e sulla regione della prima maturità della preproteina rispetto al canale e alla SecA34,35. Nella struttura a raggi X, i residui 1-41 della preproteina OmpA sono stati attaccati alla punta del dito a due eliche e visualizzati in una struttura a forcina nel canale (mostrata in rosa, Figura 5). Le posizioni dei quattro residui di PhoA nella chimera SecA-PhoA sono state mappate su questa struttura utilizzando lo stesso protocollo descritto sopra. Come mostrato nella Figura 5, la posizione dei residui di PhoA37 e PhoA45 (giallo, arancione, rosso) è compresa tra PhoA2 e PhoA22, con PhoA45 più vicino a PhoA2. Questi risultati, in particolare la posizione di PhoA45, hanno suggerito che la preproteina PhoA stava formando una struttura a forcina.

Per convalidare ulteriormente il nostro sito di legame identificato con FRET, abbiamo eseguito un confronto delle nostre posizioni mappate con quelle della preproteina OmpA, asportando la struttura di preproteine 41 residui dal canale e modellandola nelle regioni definite dalla mappatura FRET (Figura 5, ciano). Senza alcuna alterazione della struttura a raggi X preproteina, troviamo che le posizioni dei residui 2, 22 e 37 (mostrati in blu, verde e giallo) sulla struttura asportata del frammento preproteico OmpA concordano notevolmente bene con le posizioni mappate FRET (Figura 5B) e suggeriscono che la forcina si formi prima dell'ingresso del canale. La preproteina OmpA termina al residuo 41 nella struttura cristallina a raggi X; tuttavia, il C-terminale di SecY, che non è strutturato, fornisce un'indicazione della possibile posizione di PhoA45. Nella nostra struttura modellata, l'anello della forcina si trova alla bocca del canale, pronto a facilitare la traslocazione della preproteina attraverso la membrana. Pertanto, in questo esempio, la metodologia di mappatura FRET migliora le informazioni esistenti della struttura statica SecA-SecYEG, fornendo un suggerimento del movimento dinamico necessario per la traslocazione delle proteine attraverso la membrana. Sebbene non sia adatto per determinazioni di strutture de novo , se sono disponibili informazioni strutturali tridimensionali, la metodologia di mappatura FRET può favorire l'attuale comprensione delle relazioni struttura-funzione, attraverso la delucidazione di siti di legame e moti dinamici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione R15GM135904 del National Institutes of Health (assegnata all'IM) e dalla sovvenzione GM110552 del National Institutes of Health (assegnata al DBO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Biochimica Numero 181 fluorescenza trasferimento di energia SecA traslocazione proteica mappatura FRET
Förster Resonance Energy Transfer Mapping: una nuova metodologia per chiarire le caratteristiche strutturali globali
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter