Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kartläggning av Resonansenergiöverföring: En ny metod för att belysa globala strukturella egenskaper

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63433
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

Summary

Studien beskriver metodiken för FRET-kartläggning inklusive val av märkningsställen, val av färgämnen, förvärv och dataanalys. Denna metod är effektiv för att bestämma bindningsställen, konformationsförändringar och dynamiska rörelser i proteinsystem och är mest användbar om den utförs tillsammans med befintlig 3D-strukturell information.

Abstract

Försterresonansenergiöverföring (FRET) är en etablerad fluorescensbaserad metod som används för att framgångsrikt mäta avstånd i och mellan biomolekyler in vitro såväl som inom celler. I FRET relaterar effektiviteten av energiöverföring, mätt genom förändringar i fluorescensintensitet eller livslängd, till avståndet mellan två fluorescerande molekyler eller etiketter. Bestämning av dynamik och konformationsförändringar från avstånden är bara några exempel på tillämpningar av denna metod på biologiska system. Under vissa förhållanden kan denna metod lägga till och förbättra befintliga röntgenkristallstrukturer genom att ge information om dynamik, flexibilitet och anpassning till bindningsytor. Vi beskriver användningen av FRET och tillhörande avståndsbestämningar för att belysa strukturella egenskaper, genom identifiering av ett bindningsställe eller orienteringar av dimerunderenheter. Genom omdömesgilla val av märkningsplatser, och ofta användning av flera märkningsstrategier, har vi framgångsrikt tillämpat dessa kartläggningsmetoder för att bestämma globala strukturella egenskaper i ett protein-DNA-komplex och SecA-SecYEG-proteintranslokationssystemet. I SecA-SecYEG-systemet har vi använt FRET-kartläggningsmetoder för att identifiera preproteinbindningsstället och bestämma den lokala konformationen av den bundna signalsekvensregionen. Denna studie beskriver stegen för att utföra FRET-kartläggningsstudier, inklusive identifiering av lämpliga märkningsställen, diskussion om möjliga etiketter inklusive icke-inhemska aminosyrarester, märkningsprocedurer, hur man utför mätningar och tolkning av data.

Introduction

För proteiner leder belysning av dynamik tillsammans med 3-dimensionell (3-D) strukturell kunskap till en ökad förståelse för struktur-funktionssamband mellan biomolekylära system. Strukturella metoder, såsom röntgenkristallografi och kryogen elektronmikroskopi, fångar en statisk struktur och kräver ofta bestämning av flera strukturer för att belysa aspekter av biomolekylbindning och dynamik1. I den här artikeln beskrivs en lösningsbaserad metod för att mappa globala strukturella element, till exempel bindningsställen eller bindningsinteraktioner, som potentiellt är mer tillfälliga och mindre enkla att fångas upp med statiska metoder. Starka kandidatsystem för denna metodik är sådana där en 3D-struktur tidigare har bestämts genom röntgenkristallografi, NMR-spektroskopi eller andra strukturella metoder. I det här fallet utnyttjar vi röntgenkristallstrukturen i SecA-SecYEG-komplexet, en central aktör i proteinets allmänna sekretoriska väg, för att kartlägga placeringen av ett signalpeptidbindningsställe med hjälp av Förster-resonansenergiöverföring (FRET) före transporten av preproteinet över membranet2. Manipulation av det biologiska systemet genom genetiska modifieringar i kombination med vår kunskap om 3D-strukturen möjliggjorde bestämning av konformationen av signalsekvensen och den tidiga mogna regionen omedelbart före införande i kanal 3.

FRET innebär strålningsfri överföring av energi från en molekyl (givare) till en annan (acceptor) på ett avståndsberoende sätt som är genom rymden 4,5. Effektiviteten av denna överföring övervakas antingen genom en minskning av givaren eller en ökning av acceptorns fluorescensintensitet. Energiöverföringens effektivitet kan beskrivas som

E = R06/(R06 + R6)

där R0-värdet är det avstånd på vilket överföringen är 50% effektiv6. Tekniken har tidigare beskrivits som en molekylär linjal och är effektiv för att bestämma avstånd i intervallet 2,5-12 nm, beroende på identiteten hos donator-acceptorfärgerna 4,7,8,9. Givarens fluorescensintensiteter och livslängder med eller utan acceptor gör det möjligt att bestämma överföringseffektivitet och följaktligen avstånd 5,8. På grund av teknikens tillgänglighet, metodens känslighet och användarvänlighet har FRET också funnit bred tillämpning inom områden som enmolekylär fluorescensspektroskopi och konfokalmikroskopi6. Tillkomsten av fluorescerande proteiner såsom grönt fluorescerande protein har gjort observationen av intracellulär dynamik och levande cellavbildning relativt lätt10,11. Många FRET-applikationer som dessa diskuteras i detalj i det här virtuella problemet.

I denna studie fokuserar vi särskilt på användningen av FRET-mätningar för att ge avståndsvärden för att bestämma strukturella detaljer. Tidigare har FRET-mätningar effektivt använts för att bestämma konformationen av DNA-molekyler när de är bundna till protein 12,13,14, proteinernas inre dynamik och proteinbindningsinteraktioner 15,16,17. Fördelarna med denna metod ligger i förmågan att bestämma flexibla och dynamiska strukturella element i en lösning med relativt låga mängder material. Signifikant är denna metod särskilt effektiv när den används tillsammans med befintlig strukturell information och kan inte användas som ett medel för 3D-strukturbestämning. Metoden ger den bästa insikten och förfining av struktur om arbetet bygger på befintlig strukturell information ofta i kombination med beräkningssimulering18,19. Här beskrivs användningen av avstånd erhållna från steady-state och tidsupplösta FRET-mätningar för att kartlägga ett bindningsställe, vars placering inte var känd, på en befintlig kristallografisk struktur av SecA-SecYEG-komplexet, stora proteiner i den allmänna sekretoriska vägen3.

Den allmänna sekretoriska vägen, ett mycket bevarat system från prokaryoter till eukaryoter till arkéer, förmedlar transporten av proteiner antingen över eller in i membranet till deras funktionella plats i cellen. För gramnegativa bakterier, såsom E. coli, organismen som används i vår studie, sätts proteiner in i eller translokeras över det inre membranet till periplasman. Det bakteriella SecY-kanalkomplexet (kallat translocon) koordinerar med andra proteiner för att translokera det nyligen syntetiserade proteinet, vilket riktas till dess korrekta plats i cellen genom en signalsekvens som vanligtvis ligger vid N-terminalen20,21. För proteiner bundna till periplasman associerar ATPase SecA-proteinet med ribosomens utgångstunnel och med preproteinet efter att cirka 100 rester har översatts22. Tillsammans med SecB-chaperonproteinet upprätthåller det preproteinet i ett utfällt tillstånd. SecA binder till SecYEG-translokonet, och genom många cykler av ATP-hydrolys underlättar proteintransporten över membranet 23,24.

SecA är ett multidomänprotein som finns i cytosoliska och membranbundna former. Ett homodimeriskt protein i cytosolen, SecA består av en preproteinbindning eller tvärbindningsdomän25, två nukleotidbindande domäner, en spiralformad vingdomän, en spiralformad ställningsdomän och de två helixfingerna (THF) 26,27,28,29 (figur 1). I tidigare kristallografiska studier av SecA-SecYEG-komplexet föreslog placeringen av THF att den var aktivt involverad i proteintranslokation och efterföljande tvärbindningsexperiment med signalpeptid fastställde ytterligare betydelsen av denna region vid proteintranslokation 30,31. Tidigare studier, med hjälp av FRET-kartläggningsmetoden, visade att exogena signalpeptider binder till denna region av SecA 2,32. För att fullt ut förstå konformationen och placeringen av signalsekvensen och den tidiga mogna regionen av preproteinet före införande i SecYEG-kanalen skapades en proteinchimär där signalsekvensen och resterna av den tidiga mogna regionen fästes till SecA genom en Ser-Gly-länkare (Figur 1). Med hjälp av denna biologiskt livskraftiga konstruktion visades det vidare att signalsekvensen och den tidiga mogna regionen av preproteinet binder till THF på ett parallellt sätt2. Därefter användes FRET-kartläggningsmetoden för att belysa konformationen och placeringen av signalsekvensen och den tidiga mogna regionen i närvaro av SecYEG enligt beskrivningen nedan3.

Kunskap om 3D-strukturen i SecA-SecYEG-komplexet33,34,35 och den möjliga platsen för bindningsstället gjorde det möjligt för oss att på ett klokt sätt placera givaracceptoretiketter på platser där skärningspunkten mellan enskilda FRET-avstånd identifierar bindningsställets plats. Dessa FRET-kartläggningsmätningar avslöjade att signalsekvensen och den tidiga mogna regionen av preproteinet bildar en hårnål med spetsen belägen vid mynningen av SecYEG-kanalen, vilket visar att hårnålsstrukturen är mallad före kanalinsättning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Val av märkningswebbplatser

  1. Identifiera minst tre potentiella märkningsställen för att triangulera det förmodade bindningsstället på de befintliga proteinstrukturerna. I detta fall identifierades SecA, SecYEG och preprotein bundet till SecA genom genetisk fusion2.
    1. Välj märkningsställen inom 25-75 Å från det förmodade bindningsstället och i relativt statiska områden av proteinet bestämmer avståndet det specifika FRET-färgparet som ska användas36. Leta reda på märkningsställena i proteinregioner som är relativt åtskilda från varandra, så platserna beskriver hörnen i en triangel med det förmodade bindningsstället beläget i mitten (figur 1A-D).
    2. Introducera eller identifiera cysteinrester (Cys) på märkningsställen av intresse för ett protein som inte har några andra Cys-rester, för att förbättra märkningseffektiviteten för den specifika platsen37,38.
    3. Introducera onaturliga aminosyror, t.ex. p-azidofenylalanin för märkning med klickkemi, för att effektivt märka ett protein i två distinkta positioner med olika färgämnen39,40.
    4. Testa Cys-mutanterna för funktionsförlust. Verifiera aktiviteten hos den Cys-mindre mutanten och den onaturliga aminosyramutanten med hjälp av en lämplig aktivitetsanalys. I detta fall verifierades aktiviteten med en tillväxtanalys följt av en in vitro malakitgrön ATPas-analys 32,41,42

2. Märkning av proteinet

  1. Rena proteinet eller proteinerna av intresse till minst 95% renhet för korrekt märkning. Rena SecA- och SecYEG-proteiner enligt protokoll som beskrivs i referens3. Se till att du har minst 5 μg renat protein för detta steg, eftersom lite protein kommer att gå förlorat under märkningsprocessen.
  2. Välj två färgämnen för FRET-mätningar beroende på deras R0-värde och de förutsagda avstånden mellan märkta platser. Uppskatta R0-värden och observera att donatorutsläpp och acceptorabsorbans överlappar varandra med hjälp av informationen från fluorescerande proteindatabasen, vilket också ger spektra för vanliga färgämnen (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    OBS: R0 definieras som det avstånd vid vilket överföringseffektiviteten är 50% för ett givet färgpar. För kartläggningsexperiment bör förutsagda avstånd ligga nära R0-värdet för färgämnesparet för att säkerställa att avstånd kan mätas exakt.
  3. Märk de positioner som anges i steg 1.1.1. med färgparet donator-acceptor.
    1. Märk proteinet enligt tillverkarens instruktioner med särskild uppmärksamhet på parametrar som optimal proteinkoncentration, temperatur, pH, tidslängd och buffert för de specifika färgämnen som används43,44.
    2. Bered proteinet i en koncentration av 1-2 mg/ml eller cirka 10 μM i en 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) buffert. Lös upp färgämnet i dimetylformamid (DMF) eller dimetylsulfoxid (DMSO) till en slutlig koncentration av 1 mM. Tillsätt färgämnet droppvis till lösningen under omrörning för att nå ett färgämne: proteinmolärt förhållande på 5:1 (50 μM färgämne: 10 μM protein).
    3. Låt reaktionen pågå i 4 timmar vid rumstemperatur (RT) i en injektionsflaska av glas med försiktig gungning eller över natten vid 4 °C. Stoppa reaktionen genom att tillsätta β-merkaptoetanol.
      OBS: Om protein inte är kompatibelt med Tris-buffert kan fosfat- eller HEPES-buffertar användas. Behåll pH i intervallet 7,0-7,5. Om proteinet har disulfidbindningar, tillsätt ett reduktionsmedel såsom DTT eller TCEP före märkning. Ta bort DTT genom dialys eller gelfiltrering innan du tillsätter färgämne.
  4. För noggranna FRET-mätningar avlägsna det fria färgämnet med en centrifugalkoncentrator med en lämplig molekylviktsavgränsning (MWCO) för att låta det fria färgämnet strömma igenom samtidigt som det märkta proteinet behålls.
    1. Förbered koncentratormembranet genom att placera ~ 1 ml vatten i den övre delen av en 3 ml koncentrator och centrifugera sedan vattnet genom membranet (minst 10 min vid 4 300 x g).
    2. Avlägsna fritt färgämne genom att centrifugera märkt prov i koncentratorn (20 min vid 4 300 x g). Upprepa 3-4 gånger och kassera flödet igenom.
    3. Kontrollera märkningseffektiviteten för det märkta proteinet med UV-Vis-absorptionsspektroskopi.
      OBS: FRET-mätningar kräver märkningseffektivitet på 50% eller mer. Lägre märkningseffektivitet minskar FRET-signalen och kan leda till felaktigheter i mätningen.
    4. Få ett UV-Vis-spektrum av det märkta proteinet med ett intervall från 250-700 nm för att observera både proteinabsorptionsbandet och färgämnets maximala absorptionsband. Mät absorbansen vid färgämnets absorptionstopp och vid 280 nm för protein.
    5. Bestäm koncentrationen av protein och korrigera för eventuella bidrag från färgämnet med hjälp av korrektionsfaktorn, CF, och följande ekvationer45,46:
      Equation 1
      där C är koncentrationen av proteinet (M), A280 är provets absorbans vid 280 nm, Amax är absorbansen vid färgämnesabsorptionsmaximum, ε protein är extinktionskoefficienten för proteinet vid 280 nm och CF är korrektionsfaktorn, A'280/A'max, där A'280 är absorbansen vid 280 nm och A'max är absorbansen vid toppmaximum endast för färgämnet.
    6. Bestäm märkningseffektiviteten med hjälp av följande ekvation:
      Equation 2
      där εfärgämne är färgämnets molära extinktionskoefficient, C är koncentrationen av proteinet som bestäms i steg 2.4.5 och E är märkningseffektiviteten. Upprepa steg 2.4.2 tills märkningseffektivitetsvärdet har platåerat och är mindre än 100 %.

3. Bestäm R 0-värdena

  1. Mät R0-värdena på plats. Förbered två proteinprover i samma koncentration av totalt protein, 4 μM, ett med proteinet märkt med endast donatorfärgämnet och ett med proteinet märkt med endast acceptorfärgämnet. För SecA fungerar en proteinkoncentration på 4 μM SecA-monomer bra för dessa mätningar.
    1. Förbered provvolymer på 2,5 ml för en kyvett på 1 cm x 1 cm, 600 μl för en kyvett på 5 mm x 5 mm eller 200 μl för en kyvett på 3 mm x 3 mm.
  2. Slå på fluorometern och öppna spektralförvärvs- och analysprogrammet i fluorescensprogramvaran om du använder en spektrofluorometer. Klicka på det röda M för att ansluta datorn till instrumentet (figur 2A) och välj Emissions Spectra.
    1. Ange skanningsparametrar som excitationsvåglängd, intervallet för emissionsskanning, temperatur och provväxlarposition med menyalternativet Samla experiment (bild 2B).
    2. Klicka på RTC och optimera instrumentinställningarna (t.ex. spektralslitsar) genom att övervaka fluorescensemissionen på toppen med hjälp av en excitationsvåglängd inställd på färgämnets absorptionsmaximum. För SecA ställer du in följande inställningar: bandpass som 1 nm; Excitations- och emissionsslitsar som 1 respektive 1,5 mm, med temperaturen vid 25 °C och omrörningshastigheten vid 250 rpm.
      OBS: Överskrid inte instrumentets kapacitet per sekund (cps) (vanligtvis 2 x 106 cps).
  3. Placera det donatormärkta proteinprovet i provhållaren och klicka på Kör för att generera en emissionsskanning av proteinet märkt med endast donatorfärgämnet (endast donatorprotein) genom att spänna provet vid färgabsorptionsmaximum (t.ex. 488 nm för AF488) och skanna över utsläppstoppen (505-750 nm för endast givare SecA-protein märkt med AF488).
  4. Upprätta en baslinje för genomsökningen genom att förlänga skanningen 25–50 nm förbi slutet av toppen. Mät kvantutbytet av proteinet endast för givare genom att utföra absorptions- och fluorescensmätningar på prover med olika koncentrationer enligt beskrivningen47. Behåll samma slitsinställningar för dessa mätningar.
    1. Använd fritt donatorfärgämne som referens för kvantutbytet. Få minst fyra mätningar av proteinet endast för givare och det fria färgämnet i olika koncentrationer för en exakt bestämning.
    2. Plotta fluorescensintensiteten eller det integrerade området kontra absorbansen för proteinet endast för givare och det fria färgämnet eller referensen. Bestäm sluttningarna för proteinet endast för givare (lutningD) och referensen (lutningR).
    3. Kvantutbyte (Φ) beräknas med hjälp av följande ekvation:
      Equation 3
      här är ΦD kvantutbytet för givarens enda protein, ΦR är kvantutbytet för det fria färgämnet (detta kan vanligtvis erhållas från tillverkaren), LutningD och LutningR är sluttningarna som bestäms i steg 3.4.2 för givaren endast protein och referens respektive ηD och ηR representerar brytningsindexet för proteinet som endast är givare respektive de referensfria färglösningarna 47.
  5. Få ett absorptionsspektrum av ditt acceptor-protein med hjälp av en 1 cm pathlength cell. Generera ett extinktionskoefficientspektrum för ditt acceptor-endast protein genom att dividera absorptionsspektrumet med färgämneskoncentrationen.
  6. Generera den spektrala överlappningsintegralen, J (λ) med hjälp av ett grafiskt analysprogram. Ett standardkalkylbladsprogram (t.ex. kalkylblad) kan också användas för denna process.
    1. Multiplicera fluorescensemissionsspektrumet för det endast donatorproteinet (steg 3.4) med extinktionskoefficientspektrumet för det endast acceptorproteinet för att generera överlappningsspektrumet.
    2. Multiplicera det resulterande överlappningsspektrumet med λ4.
    3. Bestäm området under kurvan genom att integrera överlappningsområdet. Överlappningsregionen definieras som det område där givarens emissionsspektrum multiplicerat med acceptorutrotningskoefficientspektrumet ger positiva värden. Den spektrala överlappningsintegralen definieras som:
      Equation 4
      där FD (λ) är emissionsspektrumet för proteinet med endast givare (erhållet i steg 3.4) och εA(λ) är extinktionskoefficientspektrumet för proteinet med enbart acceptor och har enheter av M-1 cm-1 (erhållet i steg 3.5). Den resulterande spektrala överlappningsintegralen bör ha enheter av M-1 cm-1nm4.
    4. Normalisera den spektrala överlappningsintegralen. Dela överlappningsintegralen med det integrerade området för givarens enda proteinspektrum över samma spektralområde:
      Equation 5
    5. Beräkna R0-värdet i Å med hjälp av följande ekvation:
      Equation 6
      där κ2 är orienteringsfaktorn, vanligtvis tagen som 2/3 för fritt roterande färgämnen, η är brytningsindexet och kan approximeras som 1,33 för utspädda vattenlösningar, QD är givarens kvantutbyte (steg 3.4) och J(λ) är den spektrala överlappningsintegralen som bestäms i steg 3.6.35. OBS: Om färgämnena inte roterar fritt kan korrigeringar införas enligt beskrivningen av Ivanov 48 och implementeras av Auclair49 och Zhang 2,3.

4. Utför FRET-spektralmätningar

  1. Förbered endast givarprotein, acceptorprotein och givaracceptorproteinprover i samma koncentration; en koncentration på 4 μM rekommenderas. Använd 200 μL lösning, om du använder en 3 mm x 3 mm kyvett, 600 μL om du använder en kyvett på 5 mm x 5 mm, eller 2,5 ml om du använder en kyvett på 1 cm x 1 cm.
    1. Förbered proteinprovet från donatoracceptorn genom att använda lika stora molära mängder av endast givaren och endast acceptorprotein.
    2. Behåll samma mängd märkt prov endast i kontrolldonator och acceptera endast proteinprover genom införande av omärkt protein i lika molär mängd till antingen endast givaren eller endast acceptorprover. Till exempel, för lösningar med samma koncentration, skulle varje FRET-prov endast för givare innehålla 100 μL protein endast för givare och 100 μL omärkt protein för en volym på 200 μL.
  2. Generera fluorescensemissionsspektra endast för givaren, endast acceptor och givaracceptorprover. Optimera signalen enligt beskrivningen i steg 3.2. När du har optimerat behålls samma inställningar för alla exempel.
    1. Skaffa endast givarskanningen enligt beskrivningen i steg 3.3. Excitera lösningen vid donatorfärgabsorptionsabsorptionsmaximum och skanna över givarens och (förväntade) acceptorutsläppstoppar.
    2. Byt antingen ut provet till proteinet med endast acceptor eller ändra provväxlarens position till kyvetten som innehåller endast acceptorproteinet.
    3. Få en emissionsskanning av proteinet märkt med endast acceptorfärgämne (endast acceptorprotein) med samma inställningar som i steg 4.2.1. Excitera provet vid donatorns excitationsvåglängd.
      OBS: Detta spektrum ger en korrigering för mängden acceptor exciterad vid givarens våglängd (FA i steg 5.1.2)
    4. Byt ut provet till givaracceptorproteinprovet eller ändra provväxlarens position till kyvetten som innehåller det givaracceptormärkta proteinet.
    5. Skaffa en emissionsskanning av proteinprovet från givaracceptorn med samma inställningar som i steg 4.2.1 och 4.2.3.
    6. För alla spektra, korrigera för bakgrundsfluorescens genom att subtrahera bakgrundsantalet som uppmätts i slutet av skanningen.
  3. Mät endast givarens livslängd och prover från givare och acceptorprover som utarbetats enligt beskrivningen i steg 4.1.2. Använd ett tidskorrelerat fluorescensinstrument med en fotonräkning som kan mäta och lösa fluorescerande sönderfall i tidsintervallet nanosekunder (10-9 s).
    OBS: För FRET-färgpar, matcha excitationsljuskällan till absorptionsgränsen för donatorfärgämnet.
    1. Slå på instrumentet. Öppna förvärvsprogramvaran, använd instrumentstyrningsprogramvaran för datainsamling med fluorescensspektrometern.
    2. För förvärv, välj TCSPC Decay, med ett tidsintervall på 55 ns, en förstärkning på 1 och 4096 kanaler.
    3. Få en instrumentresponsfunktion (IRF) med hjälp av en lösning av icke-mejerikräm eller kommersiell spridningslösning och övervaka spridningen vid 490 nm. Justera slitsinställningen och använd neutrala densitetsfilter efter behov för att upprätthålla en tillräckligt låg räkningshastighet för att undvika pulspåfyllning5. Klicka på Acceptera och sedan på Start. Detta kommer att starta förvärvet.
      OBS: En maximal räkningshastighet på 4000 cps används för en repetitionshastighet på 180 kHz.
    4. Samla IRF vid 490 nm tills toppkanalen har högst 20 000 räkningar. Samla en IRF före och efter mätning av varje fluorescensförfall.
    5. Erhålla fluorescensförfall endast hos givaren och givaracceptorprover genom att övervaka fluorescensemissionen vid givarens emissionsvåglängd, 520 nm.
    6. Justera slitsinställningarna för en maximal räkningshastighet på 4000 cps eller mindre. Slitsinställningar är vanligtvis 15-20 nm bandpass för proteinprover. Samla sönderfallet tills 20 000 räkningar erhålls i toppkanalen.
  4. Analysera sönderfallet eller fluorescensintensiteten (I) som en funktion av tiden (t) för fluorescenslivslängden (τ). Anpassa sönderfallet till en summa av exponentiella med följande ekvation:
    Equation 7
    där αI är den preexponentiella faktorn för deni: e komponenten och τI är livstiden. Passformen är reconvolverad med IRF för att matcha fluorescensförfallet. Bedöm kvaliteten på passformen från de reducerade Χ2-parametrarna .

5. Analys av FRET-data

  1. Beräkna FRET-effektivitet från minskningen av givarintensiteten hos givaracceptorprovet i förhållande till givaren endast med följande ekvation.
    Equation 8
    där FDA är fluorescensintensiteten för givaracceptorprovet och FD är fluorescensintensiteten hos givarens enda prov vid toppen av givarens fluorescens. Använd de integrerade områdena i topparna om data är bullriga.
    1. Korrekt för eventuella skillnader i märkning mellan endast givaren och givaracceptorprover. Beräkna korrigeringar baserat på givarens grad av märkning enligt följande.
      Equation 9
      där fDA är givarmärkningseffektiviteten i givaracceptorprovet och fD är märkningseffektiviteten i det enda givarprovet.
    2. Korrekt för eventuella bidrag från acceptorns fluorescens till det givarexciterade spektrumet genom subtraktion av proteinspektrumet endast acceptor (steg 4.2) från givar-acceptorproteinspektrumet.
      Equation 14
    3. Korrekt för skillnaderna i märkningseffektivitet för acceptorn endast protein i förhållande till givar-acceptorproteinprovet som ger följande ekvation för beräkning av effektivitet:
      Equation 10
      där fA betecknar bråkdelen av acceptormärkningen. Denna ekvation inkluderar alla korrigeringar på grund av färgämnesmärkning och acceptorfluorescens.
    4. Beräkna FRET-avstånd från verkningsgraden med hjälp av följande ekvation:
      Equation 11
      med användning av R 0-värdet som erhölls i steg 3.6.5.
    5. Beräkna FRET-effektivitet med hjälp av fluorescenslivslängder endast för givaren och givaracceptorprover uppmätta i steg 4.3.3-4.3.5:
      Equation 12
    6. Använd den amplitudviktade livslängden för att beräkna FRET-effektivitet och jämföra med steady-state-resultat5.
      Equation 13
    7. Beräkna avståndet som i steg 5.1.4 från verkningsgraden bestämd av fluorescenslivslängden. Jämför steady-state och tidsupplösta värden för FRET-effektivitet och avstånd och se till att de ligger inom fel från varandra.

6. Kartläggning av avstånden

  1. Använd de beräknade avstånden för att kartlägga bindningsplatsen på den tredimensionella strukturen. Beräkna avstånden och felen för alla färgpar och platser som undersökts med hjälp av ekvationen i steg 5.1.4 och R0-värden som erhållits i steg 3.6.5 för varje FRET-par.
    1. Använd ett 3D grafiskt visningsprogram som PyMOL50 för att kartlägga avstånden till strukturen (skript som ges i tilläggsfil). Kommandon från skriptet kan matas in direkt i kommandofönstret med lämplig avståndsinformation.
    2. Generera ett skal för varje uppmätt avstånd och tillhörande fel (figur 3, figur 4, kompletterande siffror 1-3).
    3. Kartlägg positionen genom skärningspunkten mellan de olika skalen (kompletterande figur 1-3). Signalpeptidbindningsstället kartlades genom de tre olika platserna på SecA och SecYEG och fyra olika platser på signalpeptid (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna studie fokuserade på att bestämma placeringen av preproteinbindningsstället på SecA före införande av preproteinet i SecYEG-kanalen. För att kartlägga bindningsstället utfördes FRET-experiment mellan olika regioner av preproteinet och tre distinkta platser på SecA- och SecYEG-proteinerna (figur 1A-D). Från de erhållna avstånden och tredimensionella strukturerna av SecA, SecYEG och preproteinet förutspåddes placeringen av preproteinbindningsstället. I stället för att använda tre separata enheter (SecA, SecYEG och preprotein) för att utföra dessa mätningar, kopplades PhoA-signalsekvensen till SecA genom genetisk modifiering efter införlivande av en Gly-Ser-länkare 2,3. För lätt märkning med färgämnen infördes Cys-rester eller bärnstensmutationer vid resterna 2, 22, 35 och 45 i PhoA-preproteinet (figur 1E).

Identifiering av webbplatser och märkning
Ett förmodat bindningsställe för signalsekvensen hade tidigare identifierats med hjälp av liknande FRET-kartläggningsmetoder 2,32. Dessa och andra studier hade identifierat tvåhelixfingeret (THF) och preproteinkorslänkningsdomänen som möjliga bindningsställen för signalpeptid med en föreslagen orientering i en parallell position till THF 33,51,52,53,54 (figur 1F). Således gjordes identifiering av potentiella märkningsställen på SecA- och SecYEG-proteinerna baserat på placeringen av det förmodade bindningsstället i SecA- och SecYEG-kristallstrukturen (visas i grönt i figur 1A-D). Tre platser valdes för att triangulera positionen för det förmodade bindningsstället, där i huvudsak de tre platserna bildar en triangel runt det förmodade bindningsstället. Som visas i figur 1 låg de tre platserna inom bindningsställets FRET-intervall (50-70 Å). Färgparet Alexa Fluor 488 (AF488) och Alexa Fluor 647 (AF647) valdes, eftersom R0-värdet på 55,7 Å36 motsvarar de förväntade avstånden mellan de märkta platserna och det förmodade bindningsstället som säkerställer mätnoggrannhet.

De tre platserna som valts för märkning, SecA37, SecA321 och SecY292 (visas som magenta-, violetta- och cyansfärer i figur 1A-D) är belägna i hela proteinkomplexet och bildar en triangel runt det förmodade bindningsstället. De tre platserna muterades separat till Cys-rester i en Cys-mindre mutant för att säkerställa att endast rätt position märktes 2,37. För SecY292-experimenten märktes PhoA-preproteinställena med AF647 och SecY-rest 292 märktes med AF488 med användning av maleimidkemi. I det chimära proteinet märktes platserna SecA37 och SecA321 med AF647 och förproteinet märktes med AF488. I det chimära proteinet SecA-PhoA muterades resterna 2, 22, 37 och 45 i PhoA-preproteinsegmentet till ett gult kodon i enskilda proteiner. De gula kodonmutationerna möjliggjorde införandet av onaturlig aminosyra, p-azidofenylalanin, vid de positioner, som därefter märktes med AF488 med hjälp av klickkemi39,40. Varje mutation genererades och märktes oberoende för att säkerställa korrekt, differentiell märkning av proteinkomponenterna. Graden av märkning bestämdes för alla proteiner och behövde i allmänhet vara 50% eller bättre för att fortsätta med provet.

Bestämning av överföringseffektivitet och avstånd
Innan energiöverföringsmätningarna utfördes bestämdes givarens kvantutbyte, överlappningsintegral och R0-värden (steg 3.4-3.6). Donatorns kvantutbyte mättes i förhållande till färgämnet, fluorescein, som har ett kvantutbyte på 0,79 i 0,1 M NaOH47. Absorptions- och fluorescensemissionsspektra erhölls vid en serie koncentrationer för att generera en linjär absorptionsdiagram i förhållande till fluorescensemissionsintensiteten för att bestämma kvantutbytet. I dessa mätningar är det viktigt att mäta absorptionen i det linjära området (0,1-1,0) och alla utsläppsmätningar måste genereras med samma slitsinställningar. Eftersom dessa värden används för att bestämma överlappningsintegraler och R0-värden , bör de mätas under FRET-förhållanden. Proteinlokal miljö påverkar djupt färgämnesemissionen och följaktligen bör givarkvantutbyten mätas för var och en av de undersökta platserna. Vi noterar att webbplatser på SecA och SecYEG påverkar R0-värdena starkare än de på PhoA-delen av chimären. För färgpar med samma SecA- eller SecYEG-plats ligger R0-värdena vanligtvis inom 5 Å från varandra; medan R0-värdena kan skilja sig åt med så mycket som 20 Å för de två olika SecA-platserna (resterna 37 mot 321), vilket understryker vikten av att bestämma R0-värden för varje färgämnespar (tabell 1).

Beräkningen av R0 förutsätter att givar- och acceptorfärgämnena roterar fritt och graden till vilken färgämnena inte roterar bidrar till den totala osäkerheten i mätningen. För att på lämpligt sätt ta hänsyn till färgämnenas relativa rörelse och deras orienteringar utfördes steady-state fluorescensanisotropimätningar på alla donator- och acceptorfärgämnen i de olika märkningspositionerna. Dessa värden, som låg i intervallet 0,10-0,21, användes för att beräkna felet i samband med avståndsmätningarna 2,3,48. De relativt höga anisotropivärdena som observerats för både donator- och acceptorfärgämnena motsvarar en minskning av färgrotationen, vilket är oförenligt med antagandet om fri rotation. Bristen på fri rotation genererar ett fel på 19%-25% i avståndsberäkningarna. Som framgår av tabell 1 ledde detta till en genomsnittlig osäkerhet i de uppmätta avstånden på högst ± 15 Å. Vid kartläggning av FRET-avstånden är dessa osäkerheter i avståndsmätningarna en viktig faktor, som diskuteras nedan.

Det beräknade avståndet mellan givar-acceptorpar baseras på förhållandet mellan effektivitet och avstånd, där en högre effektivitet är en indikation på givar-acceptorpar åtskilda av ett kortare avstånd. För att bestämma FRET-effektivitet erhålls fluorescensemissionsspektra exciterade vid givarens excitationsvåglängd (488 nm) på endast givar- och donatoracceptorprover. Vanligtvis innebär en minskning av givarens utsläppsintensitet närvaron av energiöverföring (steg 5.1). Figur 1G visar givaracceptorspektra för SecA 37-återstoden med antingen rest 2 eller 22 av PhoA-chimären. SecA37-återstoden är märkt med AF647 eller acceptorfärgämnet, och PhoA-resterna är märkta med AF488 eller donatorfärgämnet. Vid båda positionerna reduceras donatorfluorescensen och en liten ökning av acceptorns fluorescensintensitet kan ses i givaracceptorproverna. Eftersom excitation sker vid donatorexcitationsvåglängden på 488 nm, vilket inte direkt exciterar acceptorn, är varje acceptorfluorescens observerad resultat av energiöverföring. Således är minskningen av givarintensitet och samtidig ökning av acceptorintensiteten resultatet av energiöverföring mellan de två färgämnena. Signifikant är givarens fluorescensintensitet högre för PhoA2-positionen (blå) i förhållande till PhoA22-positionen (gul) i närvaro av acceptorn. Denna relativa skillnad i minskningen av givarintensiteten indikerar att energiöverföringen mellan PhoA2-återstoden och SecA37-återstoden är svagare än överföringen mellan PhoA22- och SecA37-resterna, vilket innebär att PhoA2-återstoden ligger längre bort från SecA37 än PhoA22. Avstånd bestäms från förhållandet mellan effektivitet och R0-värden (steg 5.1.4).

Eftersom de stationära fluorescensmätningarna kunde representera ett genomsnitt på två eller flera avstånd, utförde vi också tidsupplösta fluorescensmätningar. För dessa experiment mäts donatorfärgämnets livslängd i närvaro och frånvaro av acceptorn (figur 1G). Om det fanns två distinkta energiöverföringsprocesser som bidrog till den uppmätta steady-state fluorescenseffektiviteten, skulle de observeras som diskreta livslängder, förutsatt att de kunde lösas inom instrumentets tidsupplösning. För att förbättra förmågan att lösa livslängderna bör 10 000 räkningar eller mer samlas in på toppen; Topphöjden eller toppkanalantalet måste dock balanseras med tidpunkten för förvärvet och potentiell skada på provet. Tidsupplösta mätningar gav en enda livstid för varje donator-acceptorpar som överensstämmer med endast en orientering eller ett avstånd mellan färgämnena. Vi noterar att små skillnader i avståndet som observerats i de områden som avslöjas av vår FRET-kartläggningsteknik inte skulle leda till lösbara livslängder i vårt system. Dessutom överensstämde verkningsgraden enligt de tidsupplösta fluorescensmätningarna väl med dem som bestämdes från steady-state-mätningarna, vilket gav ytterligare stöd för att de uppmätta verkningsgraderna härrör från endast ett avstånd mellan färgparen3.

Kartläggning av FRET-avstånden på den 3-dimensionella strukturen
Mätningarna av resonansenergiöverföring ger tillräcklig avståndsinformation för att identifiera bindningsstället och orienteringen av signalsekvensen på SecA. De tre platserna på SecA och SecYEG tillsammans med de fyra positionerna i PhoA-regionen i SecA-PhoA-chimären ger de 12 olika avstånd som används för att kartlägga bindningsplatsen (tabell 1). De tolv avstånden kartlades på den tredimensionella röntgenkokristallstrukturen i Thermotoga maritima SecA-SecYEG-komplexet (PDBID: 3DIN) för att identifiera bindningsstället för signalsekvensen33. Strukturen hos SecA-SecYEG-komplexet liknar den som observerats i E. coli , vilket framgår av en in vivo fotocrosslinking-studie55.

Vi använder resterna av PhoA-signalsekvensen i Början (PhoA2) och Slutet (PhoA22) i SecA-PhoA-chimären för att illustrera hur restplatser identifierades på SecA-SecYEG-komplexet. Eftersom energiöverföring kan ske i alla riktningar beskriver FRET-avstånden och tillhörande fel ett sfäriskt skal, med en av färgplatserna från givar-acceptorparet betecknat som centrum. I denna studie bildar resterna SecA37, SecA321 och SecY292 centrum för tre sfäriska skal som beskriver placeringen av PhoA2-återstoden av signalsekvensen. Visualisering av de överlappande regionerna som härrör från de tre separata platserna, SecA37 (magenta), SecA321 (lila) och SecY292 (cyan) visas i figur 3. Endast en del av varje FRET-skal skär med proteinstrukturen, och resterna och ryggraden som faller inom det skalet markeras. Således visas proteinregionerna inom skalet som definieras av SecA37-PhoA2-avståndet i magenta (figur 3A,E), medan regionerna definierade av SecA321-PhoA2- och SecY292-PhoA2-skalen visas i lila (figur 3B,F) respektive cyan (figur 3C,G). Det förmodade bindningsstället, som huvudsakligen består av tvåhelixfingeret, visas i grönt.

Som visas i figur 3 definierar vart och ett av dessa FRET-skal en relativt stor del av proteinkomplexet. För alla tre platserna skär FRET-skalet med det förmodade bindningsstället; men för SecA321-återstoden är till exempel det korsade området mindre och ligger mot fingrarnas ändar med signifikant överlappning med den spiralformade ställningsdomänen. Skärningspunkten eller det gemensamma området för alla tre FRET-skalen (figur 3D,H), definierar placeringen av PhoA2-återstoden. Detta område är betydligt mindre än varje FRET-skal och omfattar endast en liten del av THF med ett stort bidrag från spiralställningen. Skripten som används för att generera FRET-skalen och de korsade områdena för det molekylära visualiseringsprogrammet, PyMOL, ges i kompletterande information. Delar av skalen visualiseras som rosa prickar på SecA-SecYEG-komplexet i kompletterande siffror 1-3.

En liknande strategi användes för att identifiera platsen för PhoA22-återstoden. FRET-skalen som definieras av PhoA22 FRET-avstånden (figur 4A-C, E-G) beskriver ett mindre område i förhållande till PhoA2-återstoden (figur 4D, Hjämfört med figur 3D, H). Vi tolkar denna skillnad som att PhoA2-resterna och tillhörande region är mer flexibla och labila än PhoA22. Signifikant är att det område som tillskrivs PhoA22-återstoden ligger närmare spetsen av THF och mynningen av SecYEG-kanalen, med regioner i SecY identifierade i det gemensamma området (figur 3D, H). Alla tre färgparningar identifierar regioner tillsammans med det förmodade bindningsstället; De korsade gemensamma utrymmena centrerar dock PhoA22-platsen (figur 4D,H) i motsatt ände av THF i förhållande till PhoA2-platsen (figur 3D,H). Dessa fynd tyder på att signalsekvensen för preproteinet som sträcker sig från rester 2-22, ligger längs THF i ett relativt ostrukturerat tillstånd. Detta resultat överensstämmer med tidigare studier som tyder på att signalsekvensen binder till proteinet längs THF i ett utökat tillstånd och att den C-terminala änden av SecA i B. subtilis-kristallstrukturen i huvudsak modellerar signalpeptidens struktur och upptar samma plats (visas i röd figur 1F)2,26 . Vi använde ett liknande tillvägagångssätt för att identifiera två platser i den tidiga mogna regionen (rester 37 och 45) av SecA-PhoA-preproteinchimeren för att ytterligare definiera bindningen och orienteringen av signalsekvensen och den tidiga mogna regionen som diskuteras nedan. I andra studier har FRET-avstånd använts effektivt för att förfina en befintlig struktur eller molekylär dynamik simiulation-härledd modell 18,19,56; vi kunde inte göra detta, eftersom det inte finns någon struktur för signalsekvensen bunden till SecA.  

Figure 1
Figur 1: Märkningsställen i SecA-SecYEG-komplexet med representativa FRET-spektra (A-D) Fyra olika vyer av SecA-SecYEG-samkristallstrukturen (PDBID: 3DIN)33 där märkningsställena för SecA37, SecA321 och SecY292 visas som magenta-, violetta- respektive cyansfärer. A-C är sidovyer av komplexet och D är en toppvy. SecA visas i ljusgrått, SecYEG visas i mörkgrått och det förmodade bindningsstället, THF, visas i grönt. (E) Schematisk över SecA-PhoA-chimärkonstruktionen, som förbinder SecA-proteinet med PhoA-preproteinet genom en Ser-Gly-länkare (inte ritad i skala). Märkningsställena på PhoA-delen av chimären anges i blått, grönt, gult och rött, vilket motsvarar resterna 2, 22, 37 och 45. (F) Banddiagram över kristallstrukturen för B. subtilis SecA-protein (PDBID: 1M6N) färgat efter domän där nukleotidbindande domäner 1 och 2 visas i blått respektive ljusblått, preprotein-tvärbindningsdomänen visas i guld, den centrala spiralen i grönt, tvåhelixfingret i cyan, den spiralformade vingdomänen i mörkgrön och C-terminallänkaren i rött26 . Den ostrukturerade C-terminalen fungerar som en modell av den bundna PhoA-signalpeptid baserat på en tidigare FRET-kartläggningsstudie2. (G) Steady-state fluorescensspektra för endast givaren och givaracceptorprover av SecA37-AF647 och PhoA2-AF488 FRET-paret och SecA37-AF647 och PhoA22-AF488 FRET-paret. Minskningen av givarintensiteten för givaracceptorprovet är ett tecken på energiöverföring. Större energiöverföring sker från PhoA22 i förhållande till PhoA2-platsen baserat på minskningen av givarintensiteten. (H) Endast tidsupplöst fluorescensdonator (magenta) och donatoracceptor (lätt magenta) sönderfallsspektra för SecA37-AF647 och PhoA22-AF488 FRET-paret. Instrumentets responsfunktion visas i grått. Givar-acceptorkomplexet ger ett kortare sönderfall och följaktligen en snabbare livslängd som överensstämmer med energiöverföring. Alla molekylära strukturer genererades med den angivna PDB-filen och PyMOL50. Figur 1E-H har modifierats från Zhang et al.3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Användargränssnitt för FluorEssence-programmet. Detta måste klickas för att ansluta programmet till fluorometern. (B) Experimentuppställningsfönstret illustrerar de olika områden (monos, detektorer, tillbehör) där skanningsrelevanta parametrar anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: FRET-avståndsskal bestämda för SecA-PhoA2-positionen. FRET-avståndsskal konstruerade från FRET-avstånden och tillhörande osäkerheter (tabell 1) avbildas på SecA-SecYEG-komplexet (PDBID: 3DIN). (A-C) FRET-avståndsskal för PhoA2-platsen konstruerad med SecA37 (magenta), SecA321 (violett) respektive SecY292 (cyan) i mittpositionen. Skalen är färgade enligt mittresten. (D) Skärningspunkten mellan de tre FRET-skalen definierar placeringen av PhoA2, visad i blått. (E-H) Vyer roteras cirka 180° från A-D. Alla molekylära strukturer genererades med den angivna PDB-filen och PyMOL50. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: FRET-avståndsskal bestämda för SecA-PhoA22-positionen. FRET-avståndsskal konstruerade från FRET-avstånden och tillhörande osäkerheter (tabell 1) avbildas på SecA-SecYEG-komplexet (PDBID: 3DIN). (A-C) FRET-avståndsskal för PhoA22-platsen konstruerade med SecA37 (magenta), SecA321 (violett) respektive SecY292 (cyan) i mittpositionen. Skalen är färgade enligt mittresten. (D) Skärningspunkten mellan de tre FRET-skalen definierar placeringen av PhoA22, visad i gult. (E-H) Vyer roteras cirka 180° från A-D. Alla molekylära strukturer genererades med den angivna PDB-filen och PyMOL50. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: FRET-mappade platser för PhoA2, PhoA22, PhoA37 och PhoA45 projicerade på B. subtilis SecA -Geobacillus thermodenitrificans SecYE cocrystalstruktur (PDBID: 5EUL). (A) Färgning av SecA-SecYE som i figur 1. OmpA-peptidsubstratet som sätts in i slutet av THF visas i rosa. FRET-mappade regioner genererades i närvaro av ATP-γS, med PhoA2 som visas i blått, PhoA22 i grönt, PhoA37 i gult och PhoA45 i rött. Överlappningsregioner visas i oliv (PhoA22 och PhoA37) och orange (PhoA37 och PhoA45). Peptidsubstratet (rester 749-791, cyan) skars ut från den ursprungliga strukturen och modellerades in i det förmodade bindningsområdet utan några förändringar i strukturen (inringad i rött). (B) Förstorad vy av det modellerade peptidsubstratet. Rester 2 (Lys), 22 (Tyr) och 37 (Gly) av OmpA-peptidsubstratet avbildas i stickform i blått, grönt respektive gult. Dessa rester i de modellerade peptiderna uppvisar utmärkt överensstämmelse med de förutsagda FRET-kartlagda platserna. För tydlighetens skull har nanokroppen i den ursprungliga strukturen utelämnats. Denna siffra har modifierats från Zhang et al.3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

märkt webbplats på SecA-PhoA-SecYEG-komplexet Märkt webbplats på PhoA-peptiddelen av SecA-PhoA Chimera
PhoA2-AF488 PhoA22-AF488 PhoA37-AF488 PhoA45-AF488
SekA 37-AF467-FoA
R0 = 57 R0 = 57 R0 = 57 R0 = 60
FRET-effektivitet 0.27 +/- .01 0.52 +/- .02 0.39 +/- .03 0.36 +/- .03
avstånd 67 +/- 15 56 +/- 12 62 +/- 13 66 +/- 15
SecA321-AF647-FoA
R0 = 40 R0 = 38 R0 = 37 R0 = 38
FRET-effektivitet 0.16 +/- .04 0.62  +/- .01 0.39 +/- 0.02 0.43 +/- 0.02
avstånd 53 +/- 11 34.9  +/- 7.3 39.7 +/- 7.9 39.7  +/- 7.5
PhoA2-AF647 PhoA22-AF647 PhoA37-AF647 PhoA45-AF647
SekY292-AF488 EG
R0 = 57 R0 = 50 R0 = 53 R0 = 54
FRET-effektivitet 0.25 +/- .06 0.46 +/- .06 0.24 +/- .05 0.30 +/- .01
avstånd 68 +/- 15 51.3 +/- 9.2 64 +/- 14 62 +/- 13
anpassad från referens 3.
R0-värden som anges i ångström beräknades enligt beskrivningen i texten
FRET-effektiviteten beräknades utifrån minskningen av givarens fluorescensintensitet i närvaro av acceptorn enligt beskrivningen. Felet rapporteras som SD från tre oberoende mätningar.
Avstånd mellan givare och acceptor (R) anges i ångström och beräknas enligt beskrivningen i texten. Det rapporterade felet beror på en bedömning av experimentfelet och det som härrör från färgämnenas orientering.  Färgorientering uppskattas från steady state fluorescensanisotropi

Tabell 1: Överföringseffektivitet och avstånd fastställda för SecA-PhoA-SecYEG-komplexet. FRET-effektivitet, avstånd och R0-värden ges för de 12 avstånd som används för att kartlägga preproteinbindningsstället.

Kompletterande figur 1: FRET-avståndsskal, visat i rosa prickar, bestämt för SecA37-återstoden och PhoA 37-återstoden på SecA-SecYEG-komplexet (PDBID: 3DIN). Sek A visas i ljusgrått, SecYEG visas i mörkgrått och SecA37-återstoden visas i magenta. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: FRET-avståndsskal, visat i rosa prickar, bestämt för SecA321-återstoden och PhoA 37-återstoden på SecA-SecYEG-komplexet (PDBID: 3DIN). Sek A visas i ljusgrått, SecYEG visas i mörkgrått och SecA321-återstoden visas i violett. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: FRET-avståndsskal, visat i rosa prickar, bestämt för SecY292-återstoden och PhoA 37-återstoden på SecA-SecYEG-komplexet (PDBID: 3DIN). Sek A visas i ljusgrått, SecYEG visas i mörkgrått och SecY292-återstoden visas i cyan. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Genom att använda FRET-kartläggningsmetoden identifierade vi signalsekvensbindningsstället på SecA-proteinet. Det är viktigt att närvaron av en 3D-kristallstruktur av komplexet underlättade vår studie. Styrkan i denna kartläggningsmetodik ligger i förmågan att använda en befintlig struktur för att identifiera platser för märkning. Denna metod kan inte användas för att bestämma en 3D-struktur; Bestämning av strukturella element56, förfining av en befintlig struktur49, bestämning av en bindningsplatsplats 2,32 eller belysning av dynamisk rörelse57 är dock alla möjliga tillämpningar av denna metod.

I SecYEG-SecA-PhoA-komplexet bildar de tre märkningsställena en triangel runt det förmodade bindningsstället (figur 1). Användningen av flera avståndsmätningar från hörnen av denna triangel till samma rest förfinar platsinformationen som liknar GPS-navigeringsmetoder. Tre platser, SecA37, SecA341 och SecY292, identifierades på SecA och SecY tillsammans med fyra platser, PhoA2, PhoA22, PhoA37, PhoA45 i signalsekvensen och tidig mogen region av preproteinet för att ge totalt 12 avstånd för att kartlägga platsen för signalpeptid (tabell 1). Viktigt är att för att förbättra noggrannheten i avståndsmätningarna bör märkningsställen placeras i relativt statiska områden av proteinet, såsom i sekundära strukturelement snarare än slingor. Dessutom bör webbplatser också vara på platser som är relativt tillgängliga för lösningsmedel för att underlätta och öka effektiviteten i märkningen. Inom SecA-PhoA-SecYEG-komplexet var utförandet av avståndsmätningar från triangelplatserna eller hörnen till rester i det bindande substratet tillräckligt för att lokalisera resterna i det bindande substratet till ett relativt litet område (figur 3D, H och figur 4D, H). Identifiering av det korsade området från mätningarna med flera avstånd förfinar avsevärt platsen från mätningen av enstaka avstånd, som visas i figur 3 och figur 4. Således, när du använder denna metod, rekommenderas mätning av flera avstånd starkt. Även om denna metod kan identifiera regioner av molekyler som är involverade i bindning, till exempel, ger den inte exakt strukturell information; sådan information erhålls bäst från andra strukturella metoder såsom röntgen, NMR och kryo-EM. FRET-avstånd kan användas för att effektivt förfina en befintlig struktur 18,19 eller modell, i detta fall, som inte var möjlig eftersom det inte finns någon modell av signalsekvensen bunden till SecA.

För att säkerställa att färgämnesmärkning sker på endast önskade platser och att FRET-avståndsmätningar är korrekta, är användning av mutagenes för märkning att föredra. Generering av en Cys-mindre mutant kräver relativt konservativ mutation av Cys-rester till Ser eller liknande rester i det annars vilda proteinet med hjälp av platsriktade mutagenesmetoder. I den aktuella studien introducerades Cys-mutationer i Cys-fria versioner av SecA och SecYEG för märkning37. Aktiviteten hos mutantproteinet verifierades med en tillväxtanalys följt av en in vitro malakitgrön ATPas-analys41,42. Relevanta aktivitetsanalyser beror på proteinets funktion, till exempel för DNA-bindande proteiner skulle en DNA-bindande analys vara lämplig58. Underlåtenhet att säkerställa märkning på endast en plats kan leda till märkning av mer än en plats med samma färgämne, vilket väsentligt komplicerar avståndsbestämningarna. Således kan införandet av en andra etikett på samma protein göras genom införlivande av onaturlig aminosyra genom platsstyrd mutagenes. Vi använde denna metod för att märka SecA-PhoA-chimären på platser som skiljer sig från Cys-rester genom att införa den onaturliga aminosyran, p-azidofenylalanin och märkning med klickkemi39,40.

Ett ytterligare viktigt övervägande av denna metod är valet av färgämnen som används och det tillhörande R0-värdet . Efter identifiering av de potentiella märkningsplatserna kan avstånden som ska mätas uppskattas från 3D-strukturen. Med denna information kan utredare välja färgämnen par med R0-värden som sträcker sig över önskat intervall av förväntade avstånd. Till exempel har färgämnesparet AF488-AF647 en beräknad R0 på 55,7 Å vilket ger ett bra intervall för märkningsplatser som ligger uppskattningsvis 40-75 Å bort från det förmodade bindningsstället. Även om R0-värdena som beräknas i steg 2.2 är användbara för att välja vilket färgpar som ska användas för ditt system, kan fastsättning av färgämnena i proteinet förändra deras egenskaper avsevärt. För större noggrannhet bör R0-värden beräknas från in situ-experiment utförda med märkt protein (steg 3.1 - 3.6.5).

Mätning av överföringseffektivitet kan göras antingen genom att övervaka steady-state fluorescensutsläpp och observera antingen en minskning av givarutsläpp eller en ökning av acceptorutsläpp. Även om det är önskvärt att observera båda effekterna kan verkningsgraden beräknas från någon av dem enligt beskrivningen 5,8. Effektiviteten kan också beräknas utifrån minskningen av givarens livslängd i givaracceptorprovet i förhållande till provet som endast är givare. Bestämning av verkningsgrad med mer än en metod rekommenderas, särskilt användning av tidsupplösta metoder för att fastställa den relativa homogeniteten hos de uppmätta verkningsgraderna.

Kartläggningsmetoden gjorde det också möjligt för oss att bestämma den relativa orienteringen av signalsekvensen och de tidiga mogna regionerna av PhoA-preproteinet i förhållande till SecA och det förmodade bindningsstället. En SecA-SecYEG röntgenkristallstruktur och efterföljande kryo-EM-studie gav klarhet om signalsekvensens struktur och den tidiga mogna regionen av preproteinet med avseende på kanalen och SecA34,35. I röntgenstrukturen fästes rester 1-41 av OmpA-preproteinet på spetsen av tvåhelixfingeret och visualiserades i en hårnålsstruktur i kanalen (visas i rosa, figur 5). Platserna för de fyra PhoA-resterna i SecA-PhoA-chimären kartlades på denna struktur med samma protokoll som beskrivits ovan. Som visas i figur 5 är placeringen av resterna av PhoA37 och PhoA45 (gul, orange, röd) mellan PhoA2 och PhoA22, med PhoA45 närmare PhoA2. Dessa fynd, särskilt placeringen av PhoA45, föreslog att PhoA-preproteinet bildade en hårnålsstruktur.

För att ytterligare validera vårt FRET-identifierade bindningsställe utförde vi en jämförelse av våra kartlagda platser med OmpA-preproteinet genom att excitera 41-restförproteinstrukturen från kanalen och modellera den till de regioner som definieras av FRET-kartläggning (Figur 5, cyan). Utan någon förändring av preproteinröntgenstrukturen finner vi att platserna för resterna 2, 22 och 37 (visas i blått, grönt och gult) på OmpA-preproteinfragmentets utskurna struktur överensstämmer anmärkningsvärt bra med de FRET-kartlagda platserna (figur 5B) och föreslår att hårnålsformerna före kanalinträde. OmpA-preproteinet slutar vid rest 41 i röntgenkristallstrukturen; C-terminalen i SecY, som är ostrukturerad, ger dock en indikation på den möjliga platsen för PhoA45. I vår modellerade struktur sitter hårnålsslingan vid kanalens mynning, redo att underlätta translokationen av förproteinet över membranet. I det här exemplet förbättrar SÅLEDES FRET-kartläggningsmetoden befintlig information om den statiska SecA-SecYEG-strukturen genom att ge en antydan om den dynamiska rörelse som behövs för proteintranslokation över membranet. Även om den inte är lämplig för de novo-strukturbestämningar, om 3-dimensionell strukturell information finns tillgänglig, kan FRET-kartläggningsmetoden främja den nuvarande förståelsen av struktur-funktionssamband genom att belysa bindningsställen och dynamiska rörelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-bidrag R15GM135904 (tilldelat IM) och National Institutes of Health Grant GM110552 (tilldelat DBO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
490 nm LED laser Horiba 1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne Life Technologies A20347
Agar Difco DF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne Life Technologies A10254
Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne Life Technologies S10904
Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne Life Technologies S10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO) Sigma UFC805008
Dodecylmaltoside (DDM) Anatrace D310
E. coli alkaline phosphatase signal peptide SP22 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
extended signal peptide SP41 Biomolecules Midwest N/A Synthesized custom item
FluorEssence Horiba version 2.4 spectral acquisition program for Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometer Horiba N/A
GlobalsWE Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine spectral analysis program for time-resolved decays
H­4­Azido­Phe­OH BACHEM 4020250.0001
LB (Miller) Broth Fisher Scientific BP9723
Ludox HS-40 colloidal silica (40 wt.% suspension in H2O) Sigma-Aldrich 420816 dilution is needed to make a proper scattering solution
PTI Felix GX Horiba version 4.1.0.4096 spectral acquisition program for PTI Time Master Instrument
PTI Time Master Instrument Horiba NA
Pymol Molecular Graphics Program Schrodinger version 2.4
Water bath Thermo Scientific NESLAB RTE 10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488 (2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492 (2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140 (2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433 (2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622 (2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872 (2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Tags

Biokemi utgåva 181 fluorescens energiöverföring SecA proteintranslokation FRET-kartläggning
Kartläggning av Resonansenergiöverföring: En ny metod för att belysa globala strukturella egenskaper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Northrop, J., Oliver, D. B.,… More

Northrop, J., Oliver, D. B., Mukerji, I. Förster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features. J. Vis. Exp. (181), e63433, doi:10.3791/63433 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter