Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

في الوقت الحقيقي ، بلونين تحفيز رامان تشتت التصوير من دماغ الفأر لتشخيص الأنسجة

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63484
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

يعد الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) تقنية تصوير قوية وغير مدمرة وخالية من الملصقات. أحد التطبيقات الناشئة هو تحفيز علم أنسجة رامان ، حيث يتم استخدام تصوير SRS بلونين في انتقالات رامان للبروتين والدهون لتوليد صور الهيماتوكسيلين الزائفة والإيوسين. هنا ، نوضح بروتوكولا لتصوير SRS ثنائي الألوان في الوقت الفعلي لتشخيص الأنسجة.

Abstract

ظهر الفحص المجهري لتشتت رامان المحفز (SRS) كتقنية تصوير بصري قوية لتشخيص الأنسجة. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن SRS بلونين قادرين على توفير صور مكافئة للهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) تسمح بتشخيص سريع وموثوق به لسرطان الدماغ. وقد مكنت هذه القدرة من تطبيقات تشخيص السرطان المثيرة أثناء الجراحة. يمكن إجراء تصوير SRS بلونين للأنسجة إما باستخدام مصدر ليزر بيكو ثانية أو فيمتو ثانية. يتمتع ليزر الفيمتو ثانية بميزة تمكين أوضاع التصوير المرنة، بما في ذلك التصوير الطيفي السريع والتصوير SRS ثنائي الألوان في الوقت الفعلي. عادة ما يتم استخدام نهج التركيز الطيفي مع نبضات الليزر النقيقة مع ليزر الفيمتو ثانية لتحقيق دقة طيفية عالية.

يمكن تحقيق الحصول على SRS بلونين من خلال التشكيل المتعامد والكشف عن القفل. إن تعقيد النقيق النبضي والتعديل والتوصيف هو عنق الزجاجة لاعتماد هذه الطريقة على نطاق واسع. توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتوضيح تنفيذ وتحسين SRS الذي يركز على الطيف والتصوير بلونين في الوقت الفعلي لأنسجة دماغ الفأر في الوضع epi-mode. يمكن استخدام هذا البروتوكول لمجموعة واسعة من تطبيقات التصوير SRS التي تستفيد من السرعة العالية وقدرة التصوير الطيفي ل SRS.

Introduction

يعتمد تشخيص الأنسجة التقليدي على بروتوكولات التلطيخ متبوعة بالفحص تحت المجهر الضوئي. إحدى طرق التلطيخ الشائعة التي يستخدمها علماء الأمراض هي تلطيخ H & E: يلطخ الهيماتوكسيلين نوى الخلايا باللون الأزرق الأرجواني ، ويلطخ الإيوسين المصفوفة خارج الخلية والسيتوبلازم الوردي. يبقى هذا التلطيخ البسيط هو المعيار الذهبي في علم الأمراض للعديد من مهام تشخيص الأنسجة ، وخاصة تشخيص السرطان. ومع ذلك ، فإن علم الأنسجة H & E ، وخاصة تقنية التقسيم المجمدة المستخدمة في الإعداد أثناء الجراحة ، لا يزال لديه قيود. إجراء التلطيخ هو عملية شاقة تنطوي على تضمين الأنسجة ، والتقسيم ، والتثبيت ، والتلطيخ1. وقت الاستجابة النموذجي هو 20 دقيقة أو أكثر. يمكن أن يصبح أداء H & E أثناء التقسيم المجمد في بعض الأحيان أكثر تحديا عندما تتم معالجة أقسام متعددة في وقت واحد بسبب الحاجة إلى تقييم الميزات الخلوية أو أنماط النمو في 3D لتقييم الهامش. علاوة على ذلك ، تتطلب التقنيات النسيجية أثناء الجراحة فنيين وأطباء مهرة. يعد الحد من عدد أخصائيي علم الأمراض المعتمدين من مجلس الإدارة في العديد من المستشفيات عائقا أمام الاستشارة أثناء الجراحة في كثير من الحالات. يمكن تخفيف هذه القيود مع اهتمامات التطور السريع في علم الأمراض الرقمي والتشخيص القائم على الذكاء الاصطناعي2. ومع ذلك ، فإن نتائج تلطيخ H & E متغيرة ، اعتمادا على خبرة الفني ، مما يمثل تحديات إضافية للتشخيص القائم على الكمبيوتر2.

ويمكن معالجة هذه التحديات باستخدام تقنيات التصوير البصري الخالية من الملصقات. واحدة من هذه التقنيات هي المجهر SRS. يستخدم SRS أشعة الليزر النبضية المتزامنة - المضخة و Stokes - لإثارة الاهتزازات الجزيئية بكفاءة عالية3. أظهرت التقارير الأخيرة أن تصوير SRS للبروتينات والدهون يمكن أن يولد صورا مكافئة ل H & E (المعروف أيضا باسم أنسجة رامان المحفزة أو SRH) مع أنسجة طازجة سليمة ، والتي تتجاوز الحاجة إلى أي معالجة للأنسجة ، وتقصر بشكل كبير الوقت اللازم للتشخيص ، وقد تم تكييفها أثناء الجراحة4. علاوة على ذلك ، يمكن أن يوفر تصوير SRS صورا ثلاثية الأبعاد ، والتي توفر معلومات إضافية للتشخيص عندما تكون الصور ثنائية الأبعاد غير كافية5. SRH غير متحيز ويولد صورا رقمية متاحة بسهولة للتشخيص القائم على الكمبيوتر. سرعان ما يظهر كحل ممكن لتشخيص السرطان أثناء الجراحة وتحليل هامش الورم ، خاصة في سرطان الدماغ6،7،8. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح تصوير SRS للتغيرات الكيميائية للأنسجة لتوفير معلومات تشخيصية مفيدة يمكن أن تساعد الأطباء على تقسيم أنواع السرطان المختلفة أو المراحل9 إلى طبقات.

على الرغم من إمكاناته الهائلة في تطبيقات تشخيص الأنسجة ، إلا أن تصوير SRS يقتصر في الغالب على المختبرات الأكاديمية المتخصصة في البصريات بسبب التعقيد المرتبط بمنصة التصوير ، والتي تشمل أشعة الليزر فائقة السرعة ، والمجهر الضوئي بالليزر ، وإلكترونيات الكشف المتطورة. يوفر هذا البروتوكول سير عمل مفصلا لإثبات استخدام مصدر ليزر فيمتو ثانية شائع لتصوير SRS ثنائي اللون في الوقت الفعلي وتوليد صور H&E الزائفة من أنسجة دماغ الماوس. وسيغطي البروتوكول الإجراءات التالية:

المحاذاة وتحسين النقيق
تستخدم معظم مخططات التصوير SRS إما ليزر بيكو ثانية أو فيمتو ثانية كمصدر للإثارة. مع ليزر الفيمتو ثانية ، يكون عرض النطاق الترددي لليزر أكبر بكثير من عرض خط رامان. للتغلب على هذا القيد، يتم استخدام نهج التركيز الطيفي لدق ليزر الفيمتو ثانية إلى مقياس زمني بيكو ثانية لتحقيق دقة طيفية ضيقة10. يتم تحقيق الدقة الطيفية المثلى فقط عندما يتم مطابقة النقيق الزمني (المعروف أيضا باسم تشتت تأخير المجموعة أو مجرد تشتت) بشكل صحيح للمضخة وليزر ستوكس. يتم عرض إجراء المحاذاة والخطوات اللازمة لتحسين تشتت أشعة الليزر باستخدام قضبان زجاجية عالية التشتت هنا.

معايرة التردد
ميزة التركيز الطيفي SRS هي أنه يمكن ضبط إثارة رامان بسرعة عن طريق تغيير التأخير الزمني بين المضخة وليزر ستوكس. يوفر هذا الضبط تصويرا سريعا واكتساب طيفيا موثوقا به مقارنة بضبط الأطوال الموجية لليزر. ومع ذلك ، فإن العلاقة الخطية بين تردد الإثارة والتأخير الزمني تتطلب معايرة خارجية. تستخدم المذيبات العضوية ذات قمم رامان المعروفة لمعايرة تردد رامان للتركيز الطيفي SRS.

تصوير بلونين في الوقت الفعلي
من المهم زيادة سرعة التصوير في تطبيقات تشخيص الأنسجة لتقصير الوقت اللازم لتحليل عينات الأنسجة الكبيرة. يغني التصوير المتزامن ثنائي اللون للدهون والبروتينات عن الحاجة إلى ضبط الليزر أو تأخير الوقت ، مما يزيد من سرعة التصوير بأكثر من الضعفين. ويتحقق ذلك باستخدام تقنية تعديل متعامدة جديدة وإزالة الدمود ثنائية القناة مع مضخم صوت القفل11. تصف هذه الورقة بروتوكول التشكيل المتعامد والحصول على صورة مزدوجة القناة.

التصوير SRS في وضع epi
يتم إجراء غالبية تصوير SRS المعروض حتى الآن في وضع الإرسال. يكتشف التصوير في الوضع Epi-mode الفوتونات المتناثرة من الأنسجة12. بالنسبة لتطبيقات علم الأمراض ، يمكن أن تكون العينات الجراحية كبيرة جدا. بالنسبة لتصوير وضع الإرسال ، غالبا ما يكون تقسيم الأنسجة ضروريا ، وهو ما يتطلب وقتا إضافيا بشكل غير مرغوب فيه. في المقابل ، يمكن أن يعمل التصوير في وضع epi مع عينات جراحية سليمة. ونظرا لأن الهدف نفسه يستخدم لجمع الضوء المتناثر عكسيا، فليست هناك حاجة أيضا إلى محاذاة مكثف ذي فتحة رقمية عالية مطلوب لتصوير الإرسال. وضع Epi-mode هو أيضا الخيار الوحيد عندما يكون تقسيم الأنسجة صعبا ، كما هو الحال مع العظام. لقد أثبتنا سابقا أنه بالنسبة لأنسجة المخ ، يوفر التصوير في وضع epi-mode جودة تصوير فائقة لسمك الأنسجة > 2 مم13. يستخدم هذا البروتوكول مقسم شعاع الاستقطاب (PBS) لجمع الفوتونات المتناثرة غير المستقطبة بواسطة الأنسجة. من الممكن جمع المزيد من الفوتونات باستخدام كاشف حلقي على حساب تعقيد تجميع الكاشف المخصص12. نهج PBS أبسط في التنفيذ (على غرار التألق) ، مع استخدام الصمام الثنائي الضوئي القياسي بالفعل للكشف عن وضع الإرسال.

توليد صور Pseudo-H&E
بمجرد جمع صور SRS بلونين ، يمكن إعادة تلوينها لمحاكاة تلطيخ H & E. توضح هذه الورقة الإجراء الخاص بتحويل صور SRS للدهون والبروتين إلى صور زائفة H & E SRS لتطبيقات علم الأمراض. يفصل البروتوكول التجريبي الخطوات الحاسمة اللازمة لإنشاء صور SRS عالية الجودة. الإجراء الموضح هنا لا ينطبق فقط على تشخيص الأنسجة ولكن أيضا يمكن تكييفه للعديد من تطبيقات التصوير SRS الفائقة الطيف الأخرى مثل التصوير الدوائي والتصوير الأيضي14,15.

متطلبات النظام العامة
يجب أن يكون نظام الليزر لهذا البروتوكول قادرا على إخراج 2 أشعة ليزر الفيمتو ثانية متزامنة. تتميز الأنظمة بشكل مثالي بمذبذب بصري بارامتري (OPO) لضبط الطول الموجي العريض لأحد حزم الليزر. يستخدم الإعداد في هذا البروتوكول نظام ليزر تجاري Insight DS+ ينتج ليزرين (شعاع ثابت واحد عند 1040 نانومتر وشعاع قابل للضبط قائم على OPO ، يتراوح من 680 إلى 1300 نانومتر) بمعدل تكرار يبلغ 80 ميجاهرتز. يمكن استخدام المجاهر الماسحة الضوئية بالليزر ، إما من كبرى الشركات المصنعة للمجهر أو المبنية في المنزل ، لتصوير SRS. المجهر المستخدم هو مجهر مسح بالليزر المستقيم مبني فوق إطار مجهر تجاري مستقيم. يتم استخدام زوج من مرايا galvo 5 مم لمسح شعاع الليزر. بالنسبة للمستخدمين الذين يختارون اعتماد مجهر مسح بالليزر محلي الصنع ، راجع بروتوكولا منشورا مسبقا لبناء مجهر مسح بالليزر16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع إجراءات التجارب باستخدام أدمغة فئران ثابتة ومجزأة تبلغ 200 ميكرومتر ، وفقا للبروتوكول (# 4395-01) المعتمد من قبل لجنة معهد رعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة واشنطن. يتم قتل الفئران من النوع البري (سلالة C57BL / 6J) بثاني أكسيد الكربون2. بعد ذلك ، يتم إجراء بضع القحف لاستخراج أدمغتهم للتثبيت في 4٪ من بارافورمالديهايد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات. يتم تضمين الأدمغة في خليط من الأغاروز بنسبة 3٪ و 0.3٪ من الجيلاتين ويتم تقسيمها إلى شرائح بسماكة 200 ميكرومتر بواسطة اهتزاز.

1. المحاذاة الأولية

ملاحظة: تأكد من مطابقة حجم الشعاع وتباعد كلا الذراعين للحصول على أفضل حساسية ودقة. قم بتجميع المضخة وعوارض ستوكس وضبط أحجامها قبل دخولها إلى المجهر الضوئي بالليزر. للقيام بذلك ، استخدم زوجا من العدسات اللونية لكل شعاع قبل دمجها على المرآة ثنائية اللون. دائما ارتداء نظارات الليزر المناسبة لمحاذاة شعاع.

  1. تجميع الشعاع
    1. قم بتركيب زوج من العدسات اللونية لشعاع المضخة. كنقطة انطلاق ، استخدم عدسة 100 مم وعدسة 200 مم لتكبير حجم شعاع الليزر بمقدار 2 ضعف. تأكد من أن مسافة العدستين تبلغ حوالي 300 مم. قم بمحاذاة شعاع المضخة من خلال مركز كلتا العدستين.
    2. ضع مرآة بعد العدسة الثانية لإرسال الشعاع نحو الحائط (على بعد 1 متر >). كن حذرا عند إرسال الشعاع عبر مسافات طويلة. تتبع الشعاع من المرآة إلى الحائط باستخدام بطاقة الأشعة تحت الحمراء وتحقق مما إذا كان الشعاع يتغير في الحجم. قم بتجميع الشعاع إذا تغير حجم الشعاع كدالة للمسافة.
      1. إذا كان الشعاع متقاربا (يتناقص حجمه مع الانتشار)، فحرك العدستين بشكل أقرب.
      2. إذا كان الشعاع متباعدا (يزداد حجمه مع الانتشار)، فحرك العدستين بعيدا عن بعضهما البعض. اضبط المسافة حتى يتم تجميع الشعاع.
    3. كرر الخطوتين 1.1.1 و1.1.2 لشعاع ستوكس لتجميع الحزمة.
  2. تعديل حجم الشعاع
    1. في حالة توفر ملف تعريف شعاع، قم بقياس حجم الحزمة المجمعة لكل شعاع. بدلا من ذلك ، قم بتقدير حجم الشعاع باستخدام بطاقة الأشعة تحت الحمراء والمسطرة للحصول على قطر شعاع يتراوح بين 4-5 مم.
    2. إذا كان حجم الشعاع صغيرا جدا أو كبيرا جدا، فقم بتغيير زوج العدسات المستخدم في الخطوة 1.1. اضبط زوج العدسات حتى يبلغ قطر كلا الحزمتين 4-5 مم.
      ملاحظة: تكبير الشعاع هو النسبة بين البعد البؤري للعدسة الثانية إلى العدسة الأولى (f2/f1).
  3. التداخل المكاني
    ملاحظة: يتطلب تصوير SRS دمج كل من أشعة الليزر في المكان والزمان لإثارة الاهتزازات الجزيئية. يوضح الشكل 1 مخططا لتصوير SRS ذو التركيز الطيفي.
    1. اجمع بين شعاعي الليزر عن طريق تثبيت مرآة ثنائية اللون مع العديد من مرايا التوجيه للتعديل. قم بتحسين التداخل المكاني للمضخة وستوكس من خلال مراقبة الحزم بعد المرآة ثنائية اللون في موقعين مختلفين متباعدين (~ 1 م). اضبط مرآة التوجيه بشكل متكرر قبل المرآة ثنائية اللون والمرآة ثنائية اللون لمحاذاة شعاع ستوكس مع شعاع المضخة.
      ملاحظة: إذا كان الحزمتان متداخلتين مكانيا في كلا الموضعين، فإنهما متداخلتان بما فيه الكفاية.
    2. تأكد من إرسال الحزم المدمجة إلى وسط مرايا المسح الضوئي للمجهر الضوئي بالليزر عن طريق ضبط زوج من مرايا التوجيه عندما تكون مرايا المسح الضوئي في وضع التوقف. تأكد من انتقال كلا الحزمتين عبر مركز هدف المجهر والمكثف.
    3. بعد المكثف ، استخدم زوجا آخر من العدسات بأطوال بؤرية تبلغ 100 مم و 30 مم ، على التوالي ، لترحيل الشعاع المرسل إلى الصمام الثنائي الضوئي. تأكد من احتواء كلا الحزمتين داخل الصمام الثنائي الضوئي وتثبيت مرشحين منخفضي التمرير لحجب شعاع ستوكس المعدل.

2. الكشف عن إشارة SRS

  1. التشكيل الكهروضوئي (EOM)
    ملاحظة: تستخدم EOM من 20 ميغاهيرتز لتعديل سعة ستوكس. وكما نوقش لاحقا، فإن EOM مشتق من قطار نبضات الليزر 80 ميغاهرتز، وهو مطلوب للتعديل المتعامد. يمكن استخدام ترددات التشكيل الأخرى إذا تم إجراء SRS أحادي اللون أو فائق الطيف فقط. في هذه الحالة ، لا يلزم مزامنة تردد التشكيل مع تردد الليزر. يمكن استخدام مولد تردد مزود بمضخم طاقة RF لتشغيل EOM. ونتيجة لذلك، يمكن تخطي الخطوات 2.1.1-2.1.4.
    1. ضع جهاز أخذ عينات الشعاع في مسار شعاع ستوكس لالتقاط 10٪ من الشعاع وإرساله إلى صمام ثنائي ضوئي سريع للكشف عن قطار النبض 80 ميجاهرتز.
      ملاحظة: يتم إرسال إشارة الصمام الثنائي الضوئي إلى مقسم تردد لتوليد خرج TTL بسرعة 20 ميجاهرتز. يتم إرسال هذا الإخراج أيضا إلى مخزن مؤقت للنشر لتكرار الإخراج إلى أربعة مخرجات متطابقة بسرعة 20 ميجاهرتز. يتم استخدام أحد المخرجات لتشغيل الذبذبات.
    2. خذ أحد مخرجات المخزن المؤقت للمروحة وقم بتصفيته باستخدام مرشح ممر النطاق الترددي للحصول على موجة جيبية بسرعة 20 ميجاهرتز. استخدم مخفف RF لضبط جهد الإخراج من الذروة إلى الذروة إلى ~ 500 mV.
    3. أرسل الناتج الناتج إلى محول الطور ، والذي يسمح بالتعديل الدقيق لمرحلة RF باستخدام مصدر الجهد. أرسل هذا الإخراج إلى مضخم طاقة RF وقم بتوصيل خرج مكبر الصوت ب EOM.
    4. قم بإلغاء حظر شعاع Stokes وتحسين عمق التشكيل ل EOM1 عن طريق وضع صمام ثنائي ضوئي في مسار الحزمة. اضبط جهد EOM ولوحة ربع الموجة حتى يبدو عمق التشكيل (نسبة الوادي إلى الذروة) مرضيا.
      ملاحظة: عند التشكيل بسرعة 20 ميجاهرتز (1/4 من معدل تكرار الليزر)، من المتوقع حدوث نبضتين كل 50 نانوثانية.
  2. التداخل الزمني
    ملاحظة: يتم تحقيق التداخل الزمني للمضخة وستوكس عن طريق تأخير أحد قطاري نبض الليزر باستخدام عاكس رجعي مثبت على مرحلة تأخير (يوضح الشكل 1 تأخر ستوكس). يتم رصد التداخل الخشن مع الذبذبات ، ويتم مراقبة التداخل الدقيق بواسطة إشارة SRS. يمكن أيضا تحقيق تداخل زمني دقيق باستخدام رابط تلقائي إن وجد.
    1. ضع صودا ضوئيا بعد المرآة ثنائية اللون للكشف عن شعاع الليزر. حظر شعاع ستوكس أولا. قم بتكبير إحدى قمم نبض المضخة على منظار الذبذبات. ضع مؤشرا رأسيا لتحديد الموضع الزمني لهذه الذروة باستخدام منظار الذبذبات.
    2. قم بحظر شعاع المضخة وقم بإلغاء حظر شعاع ستوكس. ترجم مرحلة التأخير لمطابقة موضع الذروة على منظار الذبذبات مؤقتا إلى الموضع المحدد في الخطوة السابقة. انظر الشكل 2 للاطلاع على عرض للتداخل الزمني لحزمتين.
      1. (اختياري) إذا كانت ترجمة مرحلة التأخير غير كافية لمطابقة الحزمتين مؤقتا، فانقل مرحلة التأخير إلى منتصف نطاق حركتها.
      2. احسب مسافة التأخير المطلوبة لمطابقة الحزمتين عن طريق أخذ الفرق الزمني بين الحزمتين وضرب الفرق في سرعة الضوء لإيجاد مقدار المسافة اللازمة لمطابقة الحزمتين زمنيا.
      3. قم بإطالة مسار الشعاع للشعاع الأسرع أو تقصير مسار الشعاع للشعاع الأبطأ لمطابقة التأخير الزمني تقريبا وفقا لذلك.
    3. قم بإعداد عينة شريحة مجهرية باستخدام DMSO وشريط على الوجهين كفاصل لتثبيت العينة بين الشريحة والغطاء الانزلاقي.
    4. ضع العينة على المجهر مع جانب الغطاء المواجه لهدف المجهر. قم بتغيير المجهر إلى إضاءة ساطعة وراقب العينة من النظارة. أوجد تركيز العينة عن طريق إيجاد التركيز البؤري أولا في كل من الطبقة العلوية والسفلية من فقاعات الهواء في واجهة الشريط الزجاجي، ثم حرك التركيز البؤري ليكون بين طبقتي الشريط.
      ملاحظة: تأكد من حظر أشعة الليزر قبل النظر إلى العين.
    5. اضبط خرج الشعاع القابل للضبط على 798 نانومتر. استنادا إلى الإنتاجية البصرية للمكثف ، اضبط الطاقة البصرية لتكون ~ 40 ميجاوات لكل من المضخة وحزم Stokes عند التركيز الموضوعي.
    6. افتح ScanImage في MATLAB (أو برامج المسح الضوئي الأخرى التي تتحكم في المجهر) وانقر فوق الزر المسمى FOCUS لبدء المسح الضوئي.
      ملاحظة: سيتم مسح أشعة الليزر ضوئيا نقطا عبر العينة لإنشاء صورة. يتم إرسال خرج الإشارة منخفضة التردد من الصمام الثنائي الضوئي (<100 كيلو هرتز) مباشرة إلى القناة 1 من بطاقة الحصول على البيانات (يشار إليها باسم قناة DC). يتم إرسال الإخراج عالي التردد (>100 كيلو هرتز) من الصمام الثنائي الضوئي إلى مضخم الصوت ، ويتم إرسال الإخراج X لإشارة مضخم القفل إلى القناة 2 من بطاقة الحصول على البيانات (يشار إليها باسم قناة التيار المتردد).
    7. اضبط مرآة التوجيه قبل الماسح الضوئي galvo لتوسيط إشارة التيار المستمر على شاشة القناة 1. حرك مرحلة التأخير الآلية وراقب عن كثب مخرجات القفل المعروضة على شاشة القناة 2 (أي قناة التيار المتردد).
      ملاحظة: عندما تتزامن المضخة مع ستوكس في الوقت المناسب، ستظهر إشارة على قناة التيار المتردد. من المفيد ضبط مقياس الألوان لقناة التيار المتردد لعرض تغيير الكثافة الصغير.
    8. قم بزيادة كثافة إشارة التيار المتردد إلى أقصى حد عن طريق ضبط التأخير الزمني بدقة. اضبط المرآة ثنائية اللون لتوسيط إشارة SRS على قناة التيار المتردد (مع الحفاظ على توسيط قناة التيار المستمر). اضبط مرحلة مضخم الصوت القفل لزيادة الإشارة إلى أقصى حد. انظر الشكل 3 للحصول على إشارة مرضية.

3. تحسين الدقة الطيفية

ملاحظة: يجب أن تحتوي المضخة وعوارض ستوكس التي تصل إلى العينة على نفس القدر من تشتت تأخير المجموعة (GDD) لتحقيق أقصى قدر من الدقة الطيفية. يعتمد التشتت بشكل كبير على الإعداد التجريبي. يستخدم الإعداد التجريبي الموصوف هنا نبضات الفيمتو ثانية عند 1040 نانومتر و 800 نانومتر مثل ستوكس ومضخة ، على التوالي. تستخدم قضبان زجاج الصوان الكثيفة (H-ZF52A) كوسط لتمديد النبض.

  1. أدخل 48 سم من قضيب زجاجي شديد التشتت (H-ZF52A أو ما يعادله من زجاج الصوان الكثيف) في مسار شعاع 800 نانومتر. تقدير GDD باستخدام Eq (1):
    Equation 1 (1)
    ملاحظة: يمكن العثور على GVD لمختلف المواد الزجاجية بأطوال موجية مختلفة من مورد قاعدة بيانات معامل الانكسار. على سبيل المثال ، يحتوي H-ZF52A على GVD يبلغ 220.40 fs2 / mm عند 800 نانومتر. إجمالي GDD هو 105792 fs2.
  2. احسب عدد سنتيمترات القضيب الزجاجي المشتت المطلوب إضافته إلى مسار الشعاع 1040 نانومتر لمطابقة GDD للمضخة. أدخل الطول المناسب للقضبان الزجاجية المشتتة في مسار الشعاع 1040 نانومتر لمطابقة GDD لشعاع 800 نانومتر تقريبا. لاحظ أن إضافة قضبان زجاجية ستغير التداخل الزمني للحزمتين ، وقد يكون من الضروري تعديل التأخير.
  3. معايرة الاستبانة الطيفية
    1. قم بعمل عينة شريحة مجهرية باستخدام DMSO. ضع الشريحة على المجهر وتحقق من قوة الحزم الخارجة من مكثف المجهر. اضبط الطاقة وفقا لذلك للحصول على ~ 40 ميجاوات لكل منها عند تركيز العينة.
    2. افتح ScanImage من MATLAB. ابحث عن إشارة SRS القصوى عن طريق المسح الضوئي خلال مرحلة التأخير ، والتي تتوافق مع ذروة رامان 2,913 cm-1 من DMSO. تقدير موضع المرحلة بناء على موضع المرحلة السابقة مع زيادة طول المسار البصري بسبب إدخال قضبان. أعد محاذاة التداخل المكاني للشعاع بسبب الانحراف الصغير للشعاع عند إضافة قضبان زجاجية.
    3. احفظ فحص SRS فائق الطيف عن طريق التقاط سلسلة من صور SRS بالتتابع أثناء تحريك المرحلة الآلية.
      ملاحظة: يغطي نطاق المسح الضوئي المتأخر قمتين من قمم رامان، المقابلة لقمم رامان البالغة 2,913 سم-1 و2,994 سم-1 في DMSO، على التوالي. لوحظت هاتان الانتقالتان عند استخدام مضخة 800 نانومتر وليزر ستوكس 1040 نانومتر.
    4. ارسم أطياف SRS لحل DMSO باستخدام ImageJ أو MATLAB. قم بتركيب قمة DMSO الكبيرة التي تبلغ 2,913 سم-1 مع دالة Gaussian أو Lorentzian في MATLAB لحساب العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) للذروة.
      ملاحظة: تظهر النتائج التمثيلية في الشكل 4. إذا كانت هناك قمة عريضة واحدة فقط ، فهذا يعني إما أن الدقة الطيفية ضعيفة للغاية بحيث لا يمكن التمييز بين القمتين وأن هناك حاجة إلى المزيد من القضبان الزجاجية ، أو أن النطاق الممسوح ضوئيا كان صغيرا جدا للكشف عن الذروة الثانية. عادة ما تكون الدقة الطيفية المقبولة DMSO هي ~ 20-25 cm-1 عند استخدام قضبان زجاجية بطول >60 سم. غالبا ما يتم استخدام دقة أقل لتصوير الأنسجة للتداول للحصول على إشارات أعلى مع نبضات أقصر17.
  4. (اختياري) استخدم جهاز ربط تلقائي أو FROG (بوابة بصرية يتم حلها بالتردد) لتحديد مدة النبض لكل ذراع لحساب كمية GDD بالضبط وطول القضبان اللازمة لمطابقة GDD بين المضخة و Stokes.
  5. كرر الخطوات 3.3.2-3.3.4 لأطوال القضبان المختلفة على شعاع ستوكس للعثور على الدقة الطيفية المثلى، مما يعني أنه تم العثور على أفضل تطابق GDD تجريبيا. استخدم مجموعات متعددة من القضبان الزجاجية التي تختلف في الطول لتحقيق الدقة الطيفية المثلى.

4. توصيف الإشارة إلى الضوضاء (SNR)

  1. تأكد من تنفيذ الخطوة 4.2 بعد المحاذاة المكانية والزمانية الكاملة.
  2. احصل على صورة SRS المقابلة لقمة رامان 2,913 cm-1 من DMSO. افتح الصورة في ImageJ وحدد مساحة صغيرة في وسط الإطار. استخدم دالة القياس لحساب المتوسط والانحراف المعياري للقيم في المنطقة المحددة.
  3. اقسم القيمة المتوسطة للمساحة المحددة على الانحراف المعياري لإيجاد قيمة SNR، كما في Eq (2).
    Equation 2 (2)
    ملاحظة: إن SNR الجيد للنظام (مع ثابت وقت قفل يبلغ 4 ميكروثانية) باستخدام DMSO عند 40 mw / 40 mw في التركيز البؤري لكلا الذراعين هو >800. يمكن استخدام تركيزات أقل من DMSO أو طاقة أقل لتقدير أكثر دقة ل SNR إذا كانت بطاقة الحصول على البيانات ذات عمق بت محدود.
  4. إذا كان SNR منخفضا جدا ، فأعد محاذاة نبضات الليزر لتحسين التداخل المكاني ، والتداخل الزمني ، ومطابقة حجم / ترتيب الشعاع ، و / أو مطابقة التشتت. للحصول على هدف مع طوق تصحيح الانحراف ، قم بتحسين الإشارة عن طريق ضبط طوق التصحيح.

5. معايرة محور التردد

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لربط موضع مرحلة التأخير بانتقال Raman الممسوح ضوئيا. مطلوب اختيار دقيق للمذيبات لإنشاء "حاكم رامان" مناسب. DMSO هو مذيب فعال لسندات CH لأنه يحتوي على قمتين حادتين من قمم رامان عند 2,913 cm-1 و 2,994 cm-1.

  1. احفظ المسح الطيفي الفائق مع نطاق المرحلة المتأخرة الذي يغطي قمم رامان 2,913 سم-1 و2,994 سم-1 في DMSO. احفظ مواضع المرحلة المقابلة لمجموعة البيانات فائقة الطيف.
    ملاحظة: تتوافق الذروة القصوى العالمية للطيف مع إزاحة رامان DMSO 2,913 cm-1 وتتوافق الذروة القصوى الثانية مع إزاحة DMSO 2,994 cm-1 Raman.
  2. قم بإجراء الانحدار الخطي لمواضع المرحلة وتحولات رامان عند 2,913 سم-1 و 2,994 سم-1. باستخدام معادلة الانحدار الخطي التي تربط موضع المرحلة بإزاحة رامان ، قم بتحويل مواضع التأخير إلى ترددات رامان المقابلة.

6. التشكيل المتعامد والتصوير بلونين

ملاحظة: لا تكون خطوة التشكيل المتعامد ضرورية إلا عند الحاجة إلى تصوير ثنائي الألوان في الوقت الفعلي. ويبين الشكل 5 مخططا لهذا المخطط. يستخدم التشكيل المتعامد زوجا من EOMs مدفوعة بربع تردد الليزر (20 ميجاهرتز ليزر 80 ميجاهرتز) مع تحول طور 90 درجة بين الاثنين. يمكن تخطي خطوة التشكيل المتعامد هذه لتصوير SRS أحادي اللون أو تصوير SRS فائق الطيف.

  1. تعديل EOM1
    1. قم بتثبيت PBS (PBS2) ولوحة ربع موجة (QWP2) وEOM ثانية (EOM2) في مسار شعاع Stokes بعد EOM الأول. افصل إدخال الإشارة إلى EOM2. قم بتوصيل إدخال الإشارة ب EOM1 وقم بتشغيله.
    2. قم بتعديل شعاع ستوكس (الثابت عند 1040 نانومتر) عند 20 ميجاهرتز (f0/4) عن طريق إرسال الشعاع عبر EOM الأول. اضبط إمالة EOM1 وموضعها للتأكد من أن الشعاع يصطدم بشكل مستقيم ويتمركز عبر بلورة EOM.
    3. راقب عمق التشكيل من خلال مراقبة كلا الاستقطابين الخارجين من PBS1 باستخدام اثنين من الثنائيات الضوئية وعرض التشكيل على منظار الذبذبات.
    4. اضبط جهد QWP1 و EOM1 وطور إدخال 20 ميجاهرتز (باستخدام مبدل طور) لتحسين عمق التشكيل للشعاع المرسل ليكون قريبا من 100٪. انظر الشكل 2 باء للحصول على توضيح لعمق التشكيل الجيد.
  2. تعديل EOM2
    1. افصل EOM1 وقم بتوصيل EOM2.
    2. أرسل خرج الجهد العالي للمضخم الثاني بسرعة 20 ميجاهرتز إلى EOM2. اضبط إمالة EOM2 وموضعها للتأكد من أن الشعاع يصطدم بشكل مستقيم ويتمركز عبر بلورة EOM.
    3. مرة أخرى ، راقب عمق التشكيل من خلال النظر إلى كل من الاستقطابات القادمة من PBS2 باستخدام منظار الذبذبات. اضبط جهد QWP2 و EOM2 ومبدل الطور حسب الحاجة لتحقيق تعديل يقترب من 100٪ لكلا الاستقطابين.
    4. تأكد من أن تعديل قطار النبض لديه تحول طور 90 درجة من التشكيل الأول.
      ملاحظة: إذا لم يكن قطاران نبض المضخة متعامدين بزاوية 90 درجة، فسيكون الحديث المتبادل بين القناتين مشكلة.
    5. اختبر تعامد التشكيل عن طريق تشغيل كل من EOM1 وEOM2 وتوصيلهما. راقب كلا الاستقطابين اللذين يتم تقسيمهما بواسطة PBS2 باستخدام منظار الذبذبات. أعد تحسين EOM1 و EOM2 بشكل فردي إذا كان قطار النبض بعد PBS الثاني لا يشبه الشكل 2C.
    6. قم بتركيب بلورة كوارتز ثنائية الانكسار (BRC) مقاس 20 مم و HWP في اتجاه المصب من EOM2. قم بتوصيل كل من EOMs في وقت واحد ومراقبة قطار النبض بحيث يشبه الشكل 2D.
      ملاحظة: بالنسبة للزقزقة المستخدمة في هذه التجربة، يؤدي BRC مقاس 20 مم إلى تأخير زمني يتوافق مع إزاحة رامان 80 سم-1 . قد تكون هناك حاجة إلى طول BRC مختلف إذا تم استخدام زقزقة مختلفة.
  3. المعايره
    1. قم بمعايرة النظام باستخدام DMSO عن طريق اكتشاف الإشارات من مخرجات قناة مضخم الصوت X و Y (المرسلة إلى القناتين 2 و 3 من بطاقة الحصول على البيانات).
    2. تحقق مما إذا كانت الإشارات الناتجة عن ذروة 2,913 cm-1 من الاستقطاب الأسرع وتلك الناتجة عن الاستقطاب الأبطأ قريبة من 90 درجة خارج الطور على مكبر الصوت المقفل. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط محاذاة EOM حتى تقترب الإشارتان من 90 درجة خارج الطور.
    3. بمجرد اكتمال المعايرة، أوجد موضع التأخير الذي يسبر انتقال البروتين عند 2,930 سم-1 لأحد الحزم المتعامدة. تأكد من أن الاستقطاب الآخر يسبر انتقال الدهون من 2850 سم إلى 1.

7. التصوير SRS وضع epi

ملاحظة: في مخطط التصوير في وضع الإرسال، يركز الهدف الليزر في العينة، ثم توجه عدسة المكثف الشعاع المرسل إلى صمام ثنائي ضوئي للكشف عن القفل. في مخطط التصوير في الوضع epi-mode ، يتم استعادة الضوء الذي يتم تشتيته وإزالة استقطابه بواسطة العينة بواسطة هدف التركيز البؤري وعزله باستخدام مقسم شعاع الاستقطاب. يتم إرسال الفوتونات المعزولة والمتناثرة إلى الصمام الثنائي الضوئي من خلال زوج من عدسات الترحيل للكشف عن القفل. ويصور الشكل 6 مخطط التصوير بالوضع الفوقي.

  1. قم بتثبيت HWP قبل دخول الشعاع إلى المجهر لتغيير استقطاب الحزمة التي تدخل المجهر. ضع PBS فوق الهدف للسماح للشعاع المنعكس الخلفي غير المستقطب بالوصول إلى الكاشف.
  2. استخدم زوجا من العدسات يتكون من عدسة أكرومات 75 مم وعدسة شبه كروية 30 مم لنقل الفوتونات المتناثرة من الفتحة الخلفية للهدف إلى الكاشف الضوئي. قم بتركيب الكاشف لجمع الضوء المتناثر الخلفي الموجه بواسطة PBS. قم بتثبيت مرشح لمنع الشعاع المعدل من دخول الكاشف.
  3. ضع عينة الأنسجة تحت الهدف. نظرا لأن المكثف غير ضروري للتصوير في وضع epi ، فقم بإزالته إذا كانت هناك حاجة إلى مساحة أكبر.
  4. التصوير
    1. منع الشعاع مع مصراع ؛ تسليط مصدر ضوء أبيض على العينة من الجانب ؛ واستخدم برايتفيلد للعثور على تركيز موضوعي.
    2. قم بإلغاء حظر كل من الحزم واستخدم مواضع التأخير المعايرة مسبقا للحصول على صور SRS للدهون والبروتين من الأنسجة من مخرجي مضخم الصوت المقفل.
    3. اضبط كسب القفل وعامل حاوية البكسل للحصول على صور عالية الجودة.

8. تلطيخ اللون الزائف

  1. افتح مكدس الصور باستخدام ImageJ.
  2. اسحب الصورتين اللتين تتوافقان مع أنواع الدهون (2,850 سم-1) والبروتين (2,930 سم-1) بالنقر بزر الماوس الأيمن على الصورة والنقر على مكرر.
  3. إعادة تسمية صورة الدهون إلى الدهون وصورة البروتين إلى البروتينات.
  4. انتقل إلى | العملية حاسبة الصور وأداء البروتينات طرح الدهون.
  5. دمج الصور عن طريق الانتقال إلى صورة | | الألوان دمج القنوات ، ووضع الدهون إلى اللون الأخضر والبروتينات إلى اللون الأزرق. افتح أداة قنوات الصور (Image | | الألوان أداة القنوات) وضبط السطوع والتباين (الصورة | ضبط | السطوع/التباين).
  6. اضبط السطوع والتباين لكل قناة باستخدام أداة القنوات . بالنسبة لقناة الدهون، اضبط التباين حتى تظهر الميزات الخلوية داكنة. بالنسبة لقناة البروتين ، اضبط التباين حتى تظهر الميزات الخلوية باللون الأزرق. قم بتحويل صورة القناة الخضراء / الزرقاء المدمجة إلى صورة RGB بالانتقال إلى صورة | النوع | RGB اللون. تصدير هذه الصورة حسب ملف | وفر باسم| تيب.
    ملاحظة: بالنسبة لتلطيخ H&E الزائف ، يظهر نظام الألوان السيتوبلازم الوردي ، في حين أن النوى زرقاء أرجوانية داكنة.
  7. قم بتنزيل البرنامج النصي HE.m MATLAB من مورد البرنامج النصي الزائف H&E تلطيخ في جدول المواد.
  8. قم بتشغيل البرنامج النصي HE.m في MATLAB. حدد صورة RGB المصدرة من الخطوة السابقة لإنشاء صورة مصطنعة H&E ملطخة.
  9. (اختياري) تطبيع كثافة الصورة للتصوير بمجال الرؤية الكبير لأن الصورة تبدو أغمق في المحيط منها في المنتصف.
    1. لإجراء تطبيع ميداني للصور، قم بمتوسط أكبر عدد ممكن من الصور. ثم قم بإزالة ميزات الكثافة باستخدام ImageJ (| العملية | الفلاتر | الغاوسية الضبابية نصف القطر = 50).
    2. قياس أقصى كثافة للصورة غير الواضحة (Ctrl+M). قسمة الصورة غير الواضحة على الحد الأقصى للكثافة (العملية | | الرياضيات قسمة). قسم صورة SRS الخام على الصورة غير الواضحة (معالجة | صورة | آلة حاسبة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحسين الدقة الطيفية:
يتأثر التشتت من خلال مادة ما بالوسط المشتت (الطول والمادة) والطول الموجي. يؤثر تغيير طول قضيب التشتت على الدقة الطيفية وحجم الإشارة. إنها علاقة أخذ وعطاء يمكن وزنها بشكل مختلف اعتمادا على التطبيق. تمتد القضبان نبضة الشعاع من كونها واسعة في التردد وضيقة في الوقت المناسب إلى ضيقة في التردد وواسعة في الوقت المناسب. ويبين الشكل 7 تأثير اختلاف أطوال القضبان على الاستبانة الطيفية. ويبين الشكل 7 ألف الاستبانة الطيفية الضعيفة جدا؛ لا يحتوي هذا الإعداد على قضبان نقيق زجاجية ، ولا يتم حل قمتي Raman من DMSO على الإطلاق. في الشكل 7B ، C ، تبدأ الزيادة في عدد قضبان النقيق الزجاجية في حل القمتين. وأخيرا، يوضح الشكل 7D كيف أن النقيق المطابق يحل كلا القمتين ويمكن استخدامه لمعايرة مواضع المرحلة إلى التردد.

المعايرة باستخدام DMSO:
يحتوي DMSO على قمتين حادتين من قمم رامان عند 2,913 و 2,994 cm-1 مناسبتين للمعايرة في منطقة C-H . بمجرد الحصول على طيف DMSO من مسح SRS فائق الطيف ، يقوم الانحدار الخطي البسيط بتحويل موضع المرحلة إلى إزاحة رامان. إذا كانت الاستبانة الطيفية ضعيفة (كما هو موضح في الشكل 7A) وكانت القمتان غير قابلتين للفصل ، فإن المعايرة مع الانحدار الخطي تكون مستحيلة. في هذه الحالة ، من الضروري تحسين مطابقة التشتت إما عن طريق إضافة أو إزالة قضبان زجاجية. وترجع الصعوبات الأكثر شيوعا في العثور على إشارة DMSO للمعايرة إلى أخطاء في التداخل الزمني أو التداخل المكاني للحزمتين. قبل محاولة معايرة DMSO، كرر خطوات المحاذاة المكانية والزمنية لتحسين إشارة SRS.

اثنين من الألوان DMSO:
في SRS ثنائي اللون ، يتم إنشاء اثنين من قطارات نبض المضخة مع استقطاب متعامد مع تأخير زمني ثابت (بسبب بلورة ثنائية الانكسار). يتم تقييم عمق التشكيل وتحول الطور 90 درجة باستخدام صمام ثنائي ضوئي متبوعا بإشارة DMSO SRS. ويبين الشكل 8 عمق التشكيل المقبول والفصل الزمني. على الرغم من أن الدقة الطيفية ل DMSO في الشكل 8 ليست مثالية ، إلا أنه غالبا ما يتم التضحية بها في تجارب تصوير الأنسجة لتحقيق إشارة أعلى مع نبضات أقصر. ويبين الشكل 9 التحولات الطورية الضعيفة التي تؤدي إلى قمم مقلوبة أو سلبية.

SRS ثنائي اللون من أنسجة دماغ الفأر في وضع epi-mode:
يستخدم وضع epi-mode (الكشف عن الفوتونات المتناثرة عكسيا) SRS لتصوير الأنسجة السميكة (>1 مم). يوضح الشكل 10A,B تصوير SRS ثنائي الألوان في الوقت الفعلي عند 2,850 سم-1 و 2,930 سم-1 من أنسجة دماغ الفئران خارج الجسم الحي. تم ترميز الصور الخام من قنوات الدهون والبروتين (الشكل 10A و B) بالألوان لإنتاج صورة واحدة تصور مساهمات الدهون والبروتين (الشكل 10C). تم إجراء تلطيخ H & E خاطئ (الشكل 10D) على الشكل 10C لتقليد تلطيخ H & E. يمكن أن تكون جودة التصوير الرديئة نتيجة لعمق التصوير الكبير أو ضعف المعايرة (محور التردد أو عمق التعديل). عمق التصوير النموذجي في أنسجة المخ هو 100-200 ميكرومتر13.

Figure 1
الشكل 1: مخطط لإعداد التصوير SRS بلون واحد. بناء مجهر SRS ذو تركيز طيفي في وضع الإرسال. يمثل X و Y المخرجات المتعامدة. الاختصارات: SRS = تحفيز تشتت رامان. DL = خط التأخير القائم على العاكس الرجعي ؛ Div = مقسم; FB = مخزن مؤقت للنشر; AT = المخفف; PS = محول الطور; PA = مضخم الطاقة; DCM = مرآة ثنائية اللون ؛ GM = مرايا galvo ؛ EOM = المغير الكهروبصري; POM = مرآة الالتقاط. PBS = مقسم شعاع الاستقطاب ، BRC = بلورة ثنائية الانكسار ؛ QWP = لوحة ربع موجة; HWP: لوحة نصف موجة. PD = الصمام الثنائي الضوئي; GR = قضيب زجاجي. BB = كتلة شعاع; SPF = مرشح الممر القصير; CL = عدسة تجميعية. BS = عدسة تغيير حجم الشعاع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التداخل الزمني التمثيلي . (أ) ينظر إلى المضخة وعوارض ستوكس على أنها متداخلة زمنيا على الذبذبات. تستخدم مؤشرات الذبذبات لتحديد المواضع الزمنية للمضخة وحزم ستوكس. هذا التداخل مرض كنقطة انطلاق لمزيد من تعديل التداخل الزمني مع مرحلة التأخير. (ب) عمق تشكيل تمثيلي مرض لبعثة مراقبة خارجية واحدة عند MHz 20. (C) تشكيل نبضي مرض أثناء استخدام اثنين من EOMs. (د) تعديل قطار النبض بشكل مرض بعد تركيب بلورة الكوارتز ثنائية الانعكاس ولوحة نصف الموجة على ذراع ستوكس المعدل بشكل مضاعف. اختصار: EOM = المغير الكهروبصري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: SRS التمثيلية وإشارات المضخة. (أ) إشارة مضخة غير محاذاة مكتشفة في قناة التيار المستمر. (ب) إشارة SRS المنحرفة التي يكتشفها الصمام الثنائي الضوئي. (ج) إشارة مضخة مرضية ومركزة في قناة التيار المستمر. (د) إشارة SRS مرضية تتمحور حول قناة التيار المتردد. اختصار: SRS = تحفيز تشتت رامان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توصيف الاستبانة الطيفية. كانت الدالة الغاوسية مناسبة لقمة رامان DMSO التي تبلغ 2,913 سم-1 . أعطى FWHM المحسوب دقة 15 cm-1 للنظام. الاختصارات: DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسايد; FWHM = العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مخطط لإعداد التصوير SRS بلونين. بناء مجهر SRS ثنائي اللون في وضع الإرسال. يمثل X و Y المخرجات المتعامدة. الاختصارات: DL = خط التأخير القائم على العاكس الرجعي ؛ Div = مقسم; FB = مخزن مؤقت للنشر; AT = المخفف; PS = محول الطور; PA = مضخم الطاقة; DCM = مرآة ثنائية اللون ؛ GM = مرايا galvo ؛ EOM = المغير الكهروبصري; PBS = مقسم شعاع الاستقطاب ؛ BRC = بلورة ثنائية الانكسار. QWP = لوحة ربع موجة; HWP = لوحة نصف موجة. PD = الصمام الثنائي الضوئي; GR = قضيب زجاجي. BB = كتلة شعاع ، SPF = مرشح الممر القصير ؛ CL = عدسة تجميعية. POM = مرآة الالتقاط. BS = عدسة تغيير حجم الشعاع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: مخطط لإعداد وضع Epi-mode للتصوير SRS بلونين. بناء مجهر SRS بلونين في وضع epi. يمثل X و Y المخرجات المتعامدة. الاختصارات: DL = خط التأخير القائم على العاكس الرجعي ؛ Div = مقسم; FB = مخزن مؤقت للنشر; AT = المخفف; PS = محول الطور; PA = مضخم الطاقة; DCM = مرآة ثنائية اللون ؛ GM = مرايا galvo ؛ EOM = المغير الكهروبصري; PBS = مقسم شعاع الاستقطاب ؛ BRC = بلورة ثنائية الانكسار. QWP = لوحة ربع موجة; HWP = لوحة نصف موجة. PD = الصمام الثنائي الضوئي; GR = قضيب زجاجي. BB = كتلة شعاع ، BPF = مرشح تمرير النطاق الترددي ؛ CL = عدسة تجميعية. POM = مرآة الالتقاط. BS = عدسة تغيير حجم الشعاع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تحسين الاستبانة الطيفية بنسبة 25٪ DMSO . (A) تم استخدام قضبان النقيق الزجاجية الصفرية للحصول على طيف DMSO. لم يتم حل القمتين. (ب) استخدمت قضبان زقزقة زجاجية، 20 سم على ذراع المضخة و 24 سم على ذراع ستوكس. وقد بدأ حل ذروتين إلى نقطة مرضية. (ج) استخدمت قضبان النقيق ، مضخة طولها 40 سم و 24 سم ستوكس ، للحصول على طيف DMSO أفضل حلا. (د) استخدمت قضبان النقيق ، مضخة طولها 64 سم و 60 سم ستوكس ، للحصول على دقة طيفية أعلى. اختصار: DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسايد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: SRS ثنائي اللون ، استقطاب متفاوت وتأخير زمني. يتم استخدام اثنين من قطارات النبض المتأخرة زمنيا من الاستقطاب المتعامد (s&p) لتصوير أطياف DMSO لإظهار التأخير الزمني (وفرق تردد رامان) بين الإثارة SRS. الاختصارات: DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسايد; SRS = تحفيز تشتت رامان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: طيف SRS الناتج عن تحول ضعيف في مرحلة SRS بلونين. تشير الذروة السالبة 2,994 cm-1 بالقرب من موضع المرحلة 48 إلى ضعف فرق الطور. اختصار: SRS = تحفيز تشتت رامان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: توليد تلطيخ H&E زائف بلورين لصور SRS. (أ) صورة SRS للبروتين الخام من أنسجة دماغ الفأر عند الانتقال 2,930 cm-1. (ب) صورة SRS للدهون الخام من أنسجة دماغ الفأر عند الانتقال 2850 سم-1. (ج) القنوات المدمجة والمرمزة بالألوان من A و B مع مساهمة الدهون باللون الأخضر ومساهمة البروتين باللون الأزرق. (د) تم إجراء إعادة تلوين H & E كاذبة على C لتقليد تلطيخ H & E للتطبيقات المرضية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: SRS = تحفيز تشتت رامان. H & E = الهيماتوكسيلين والإيوزين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعتمد نظام التصوير SRS ثنائي اللون المقدم في هذا البروتوكول على التنفيذ السليم لتصوير SRS بلون واحد. في تصوير SRS بلون واحد ، تتمثل الخطوات الحاسمة في المحاذاة المكانية والمحاذاة الزمنية وعمق التشكيل وتحول الطور. يتم إنجاز الجمع بين الحزمتين مكانيا بواسطة مرآة ثنائية اللون. يتم استخدام العديد من مرايا التوجيه للضبط الدقيق عند إرسال الحزم إلى المرآة ثنائية اللون. بمجرد دمج الحزم مع المرآة ثنائية اللون ، يمكن تأكيد المحاذاة المكانية عن طريق التقاط مسار الشعاع المشترك مع مرآة لإرسالها نحو جدار على بعد >1 متر أثناء التحقق من الشعاع المشترك لمعرفة ما إذا كان يتداخل مع بطاقة الأشعة تحت الحمراء. بعد المحاذاة المكانية من خلال المجهر ، يتم تنفيذ التداخل الزمني عن طريق ضبط طول المسار مع مرحلة تأخير قائمة على العاكس الرجعي ، والتي لها فائدة في الحفاظ على المحاذاة المكانية. ذراع 1040 نانومتر هو الشعاع المتأخر في هذا البروتوكول. التداخل الزمني مستحيل إذا لم يكن لمرحلة التأخير المدى الكافي للتسبب في تداخل الحزمتين مؤقتا. وفي هذه الحالة، قد يكون من الضروري نقل مرحلة التأخير بأكملها إلى موقع مختلف لضمان أن يكون التداخل الزمني قريبا من نطاق منتصف نطاق التأخير في الفحص. على سبيل المثال ، إذا تم قياس الفرق الزمني بين الحزمتين على أنه 6 ns، فيجب إجراء 1.8 متر من التعديل. يشير التعديل المطلوب إلى طول استطالة مسار الشعاع للشعاع الأسرع أو تقصير مسار الشعاع للشعاع الأبطأ.

إلى جانب المحاذاة ، تعد مطابقة حجم الشعاع وتعديل شعاع ستوكس مهمة أيضا لزيادة إشارة SRS إلى أقصى حد. من الناحية المثالية ، يجب تجميع كلا الحزمتين في المستوى الموضوعي ومطابقة حجم فتحة الظهر الهدف. من المفيد التحقق من التجميع وحجم الشعاع إذا كان المستوى الموضوعي مكشوفا للمستخدم. إذا كان الشعاع متقاربا أو متباعدا ، فمن الضروري ضبط العدسة الثانية لزوج عدسات التصادم لتحقيق التصادم (خطوة البروتوكول 1.1). وبالمثل ، إذا كان حجم الشعاع صغيرا جدا عند الفتحة الخلفية الموضوعية ، فيجب استخدام زوج عدسة مع تكبير عال (خطوة البروتوكول 1.2). يتدرج SRS خطيا مع عمق التشكيل لشعاع ستوكس. من المهم التأكد من أن ارتفاع النبض في الوادي <10٪ من ارتفاع النبض في الذروة على الذبذبات. التعديل الضعيف لشعاع ستوكس يترجم مباشرة إلى SNR ضعيف.

عند استخدام ليزر الفيمتو ثانية لتصوير SRS ، يكون التركيز الطيفي ضروريا لتحويل التأخير الزمني بين المضخة و Stokes إلى إزاحة تردد رامان. يعتمد عامل التحويل على كمية النقيق المطبقة. من الأهمية بمكان مطابقة GDD للمضخة و Stokes لتحقيق الدقة الطيفية المثلى. يمكن تقدير GDD بناء على طول مادة التشتت المستخدمة و GVD الخاص بها. على سبيل المثال ، يحتوي قضيب زجاج الصوان الكثيف SF11 على GVD يبلغ 123.270 fs 2 / mm عند 1040 nm و 187.486 fs2 / mm عند 800 nm. بالنسبة ل 240 مم من SF11 في مسار الشعاع 800 نانومتر، GDD هو 240 مم × 187.486 fs 2/mm = 45000 fs2. بالنسبة إلى 240 مم من SF11 في مسار الشعاع 1040 نانومتر، يكون GDD 240 مم × 123.270 fs 2/mm = 30000 fs2. يعني حساب المثال هذا أنه يجب إضافة قضبان زجاجية إضافية إلى ذراع 1040 نانومتر ، أو يجب إزالة قضبان زجاجية من ذراع 800 نانومتر لمطابقة GDD. لتحقيق دقة طيفية أعلى ، يلزم وجود GDD أكبر ، مما يعني قضبان أطول. ومع ذلك، عند حساب GDD، تم إهمال المساهمات المقدمة من بعثة مراقبي الانتخابات والهدف. يتم تحديد المطابقة الفعلية ل GDD تجريبيا من خلال إيجاد أفضل دقة طيفية لأطوال القضبان المحددة على المضخة أو ستوكس. الحسابات بمثابة خطوة بداية جيدة. لا يزال التحسين التجريبي من خلال الإضافة التكرارية وإزالة قضبان الزجاج ضروريا لتحسين الدقة الطيفية.

من المهم أن ندرك أن النقيق الكبير يوفر دقة طيفية أعلى ولكن على حساب كثافة الإشارة. تعتبر الزقزقة الأصغر والنبضات الأقصر مفيدة لتصوير الأنسجة في منطقة C-H لأن قمم رامان للبروتين والدهون واسعة. يمكن تداول الدقة الطيفية المنخفضة للحصول على إشارة SRS أعلى (أو سرعة تصوير أسرع) دون التضحية بتباين الأنسجة بلونين17. في التطبيقات الأخرى التي تحتاج إلى دقة طيفية عالية ، خاصة في منطقة بصمات الأصابع ، من الضروري تطبيق زقزقة أكبر باستخدام قضبان زجاجية طويلة. بدلا من ذلك ، قد يكون من الأسهل استخدام نقالات الصريف للحصول على نبضات أطول (لمدة نبض أطول من 3 ps). ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية على الليزر التجاري المستخدم هو عرض النطاق الترددي الطيفي. تعتمد التغطية الطيفية ل SRS ذات التركيز الطيفي على عرض النطاق الترددي لليزر الإثارة. يحتوي نظام الليزر المستخدم على تغطية طيفية عادة حوالي 200-250 سم-1. وهذا بالكاد يكفي لتغطية منطقة C-H. عادة ما تكون هناك حاجة إلى تغطية طيفية أكبر لحل الأنواع الكيميائية للتصوير في منطقة بصمات الأصابع. يمكن معالجة هذه المشكلة باستخدام وظيفة إضافية ليزر الألياف التي توسع عرض النطاق الترددي لليزر ستوكس من 6 نانومتر إلى 60 نانومتر18. هناك قيد مهم آخر على تقنية التصوير SRS ذات اللونين وهو أنه يتم مراقبة انتقالين فقط. سيكون هذا النهج غير مناسب للعينات المعقدة مع العديد من قمم رامان المتداخلة أو الأنواع المتعددة.

توفر طريقة التصوير SRS ثنائية اللون في الوقت الفعلي تصويرا عالي السرعة للأنسجة عن طريق إزالة الحاجة إلى الليزر أو الضبط المتأخر. ومع ذلك، من الصعب الإعداد بسبب التحديات التي تواجه تحقيق عمق تشكيل شبه مثالي لكل من وحدات مراقبة الهوية. من الأفضل تحسين EOM1 و EOM2 بشكل مستقل. إذا كان EOM1 قيد التشغيل، فيجب فصل EOM2 والعكس صحيح. بمجرد تحسين كلا التعديلين إلى ما يقرب من الكمال (>95٪ من عمق التشكيل) ، يتم توصيل كل من EOMs لتمكين التشكيل المتعامد. يعتمد طول التأخير الزمني بين قطاري النبض المتعامدين على طول BRC والنقيق. طريقة التشكيل هذه ليست مجدية على الفور للتطبيقات السريرية حيث أن هناك حاجة إلى إلكترونيات معقدة لتوفير قطارين نبضيين للترددات اللاسلكية مع تحول طور قابل للضبط لدفع اثنين من EOMs. كما يجب أن تكون محاذاة EOM شبه مثالية لضمان الإرسال العالي والتشكيل الجيد والتعامد بين القناتين. تنطبق هذه التقنية بشكل عام على التطبيقات الأخرى التي تتطلب تصويرا سريعا ومتزامنا لقمتي رامان بسبب تغيرات الحركة أو العينة. ومن الأمثلة على ذلك قياسات درجة حرارة الماء أو تتبع الأجسام المتحركة مثل قطرات الدهون أو العضيات11,19.

مطلوب ليزر ألياف قوي للتطبيقات السريرية المستقبلية4. ويمكن أيضا توسيع نطاق النهج الموصوف في البروتوكول لتحسين سرعة الاكتساب حتى معدل الفيديو، وهو أمر مهم لمسح عينات الأنسجة الكبيرة في غضون فترة زمنية معقولة. إذا لم يكن وقت التصوير أو القطع الأثرية المتحركة مصدر قلق ، فيمكن الحصول على صور SRS للبروتين والدهون بالتتابع عن طريق تحريك مرحلة التأخير الآلية إطارا تلو الآخر. طريقة تصوير SRS أخرى في الوقت الفعلي بلونين هي مخطط ثنائي الطور يعيد تدوير شعاع Stokes لتوفير نفس القناتين المتعامدتين20. ومع ذلك ، فإن تنفيذ المخطط ثنائي الطور يتطلب محاذاة إضافية تتضمن ثلاثة عوارض. كما يتطلب مطابقة حجم الشعاع وتباعد ثلاثة أشعة ليزر. ومن السبل المحتملة لتحسين كلتا التقنيتين للتغلب على حد اللونين المتزامنين دمج ليزر ألياف قابل للضبط بسرعة لاستكشاف مناطق طيفية محددة21. معالجة الصور هي نفسها كما هو موضح في البروتوكول لإنشاء صور H & E محاكاة.

أخيرا ، يوضح هذا البروتوكول تصوير SRS في الوضع epi-mode. عادة ما يولد صورا أقل جودة مقارنة بتصوير وضع الإرسال لأقسام الأنسجة الرقيقة بسبب انخفاض قوة المضخة التي تصل إلى الكاشف13. بالنسبة لتصوير الأنسجة السميكة (>1-2 مم) أو العينات شديدة التشتت (على سبيل المثال ، أنسجة العظام) ، يمكن أن يؤدي التصوير في وضع epi-mode أداء أفضل من تصوير وضع الإرسال. عند تصوير الأنسجة الطازجة مثل أنسجة المخ ، يقتصر عمق تصوير SRS عادة على 200-300 ميكرومتر. بالنسبة للأنسجة الثابتة ، يكون التشتت أقوى ، وعمق التصوير 100-200 ميكرومتر. يمكن تحقيق تصوير أعمق باستخدام طاقة أعلى أو تصحيح انحراف أو مسح بصري22,23. ومع ذلك ، فإن التصوير بالوضع epi-mode هو نهج مفضل لتشخيص الأنسجة لأنه لا يتطلب أي تقسيم للأنسجة ، والمحاذاة أبسط بدون مكثف NA العالي. ستستفيد تطبيقات تشخيص الأنسجة المستقبلية من التصوير السريع والكبير على عينات جراحية سليمة متبوعا بالتعلم الآلي / التشخيص القائم على التعلم العميق. البروتوكول المعروض هنا مناسب أيضا للتطبيقات في الجسم الحي ، مثل تصوير الدماغ أو تصوير الجلد ، حيث يعد التصوير في وضع epi هو الخيار الوحيد ، والتصوير عالي السرعة مهم لتجنب التحف الحركية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل NIH R35 GM133435 إلى D.F.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Achromatic Lens THORLABS AC254-100-B Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter Minicircuits BBP-21.4+ Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens THORLABS AC254-200-B Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate Union Optic WPA2210-650-1100-M25.4 Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate Union Optic WPA4210-650-1100-M25.4 Broadband quarter waveplate
Beam Sampler THORLABS BSN11 10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror THORLABS DMSP1000 Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 472301 Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator THORLABS EO-AM-NR-C1 Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script Matlab https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer PRL-414B Pulse Research Lab 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode THORLABS DET10A2 Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider PRL-220A Pulse Research Lab TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods Union Optic CYLROD01 High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+ Newport Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. 
Lock-in Amplifier Liquid Instruments Moku Lab Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors THORLABS BB05-E03-10 Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage Zaber X-DMQ12P-DE52 Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor Nikon CSC1003 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope Tektronix TDS7054 Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter SigaTek SF50A2 For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode Hamamatsu Corp S3994-01 Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter Union Optic PBS9025-620-1000 Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database refractiveindex.info
Retro-reflector Edmund Optics 34-408 BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier Minicircuits ZHL-1-2W+ Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors Cambridge Technologies 6215H We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage Vidrio ScanImage Basic Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter THORLABS FESH1000 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope Nikon Eclipse FN1 Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective Olympus XLPLN25XWMP2 The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  2. Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
  3. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  4. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).
  5. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  6. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  7. Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).
  8. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  9. Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
  10. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  11. Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  14. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  15. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  16. Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).
  17. Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).
  18. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  19. Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
  20. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  21. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  22. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  23. Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 180،
في الوقت الحقيقي ، بلونين تحفيز رامان تشتت التصوير من دماغ الفأر لتشخيص الأنسجة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espinoza, R., Wong, B., Fu, D.… More

Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis. J. Vis. Exp. (180), e63484, doi:10.3791/63484 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter