Realtid, tvåfärgad stimulerad Raman-spridningsavbildning av mushjärnan för vävnadsdiagnos

Summary

Stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi är en kraftfull, icke-destruktiv och etikettfri bildteknik. En framväxande tillämpning är stimulerad Raman-histologi, där tvåfärgad SRS-avbildning vid protein- och lipid Raman-övergångarna används för att generera pseudo-hematoxylin- och eosinbilder. Här demonstrerar vi ett protokoll för realtid, tvåfärgad SRS-avbildning för vävnadsdiagnos.

Abstract

Stimulerad Raman-spridning (SRS) mikroskopi har uppstått som en kraftfull optisk bildteknik för vävnadsdiagnos. Under de senaste åren har tvåfärgade SRS visat sig kunna ge hematoxylin och eosin (H & E) -ekvivalenta bilder som möjliggör snabb och tillförlitlig diagnos av hjärncancer. Sådan förmåga har möjliggjort spännande intraoperativa cancerdiagnosapplikationer. Tvåfärgad SRS-avbildning av vävnad kan göras med antingen en pikosekund eller femtosekund laserkälla. Femtosekundlasrar har fördelen att de möjliggör flexibla bildlägen, inklusive snabb hyperspektral avbildning och SRS-avbildning i realtid i två färger. En spektralfokuseringsmetod med chirped laserpulser används vanligtvis med femtosekundlasrar för att uppnå hög spektral upplösning.

Tvåfärgs SRS-förvärv kan realiseras med ortogonal modulering och inlåsningsdetektering. Komplexiteten i pulsklanderi, modulering och karakterisering är en flaskhals för det utbredda antagandet av denna metod. Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för att demonstrera implementering och optimering av spektralfokuserande SRS och realtids, tvåfärgad avbildning av mushjärnvävnad i epi-läge. Detta protokoll kan användas för ett brett spektrum av SRS-bildapplikationer som utnyttjar SRS: s höghastighets- och spektroskopiska bildkapacitet.

Introduction

Traditionell vävnadsdiagnostik bygger på färgningsprotokoll följt av undersökning under ett optiskt mikroskop. En vanlig färgningsmetod som används av patologer är H & E-färgning: hematoxylin fläckar cellkärnor en purpurblå och eosin fläckar den extracellulära matrisen och cytoplasman rosa. Denna enkla färgning förblir guldstandarden inom patologi för många vävnadsdiagnosuppgifter, särskilt cancerdiagnos. H&E-histopatologi, särskilt den frysta sektioneringstekniken som används i en intraoperativ miljö, har dock fortfarande begränsningar. Färgningsförfarandet är en mödosam process som involverar vävnadsinbäddning, sektionering, fixering och färgning¹. Den typiska handläggningstiden är 20 minuter eller längre. Att utföra H&E under fryst sektionering kan ibland bli mer utmanande när flera sektioner bearbetas samtidigt på grund av behovet av att utvärdera cellulära funktioner eller tillväxtmönster i 3D för marginalbedömning. Dessutom kräver intraoperativa histologiska tekniker skickliga tekniker och kliniker. Begränsning av antalet styrelsecertifierade patologer på många sjukhus är i många fall en begränsning för intraoperativ konsultation. Sådana begränsningar kan lindras med de snabba utvecklingsintressena för digital patologi och artificiell intelligensbaserad diagnos². H&E-färgningsresultaten varierar dock beroende på teknikerns erfarenhet, vilket innebär ytterligare utmaningar för datorbaserad diagnos².

Dessa utmaningar kan potentiellt hanteras med etikettfria optiska bildtekniker. En sådan teknik är SRS-mikroskopi. SRS använder synkroniserade pulserade lasrar - pump och Stokes - för att excitera molekylära vibrationer med hög effektivitet³. Nya rapporter har visat att SRS-avbildning av proteiner och lipider kan generera H&E-ekvivalenta bilder (även känd som stimulerad Raman-histologi eller SRH) med intakt färsk vävnad, vilket kringgår behovet av vävnadsbehandling, förkortar avsevärt den tid som behövs för diagnos och har anpassats intraoperativt⁴. Dessutom kan SRS-avbildning ge 3D-bilder, vilket ger ytterligare information för diagnos när 2D-bilder är otillräckliga⁵. SRH är opartisk och genererar digitala bilder som är lättillgängliga för datorbaserad diagnos. Det framträder snabbt som en möjlig lösning för intraoperativ cancerdiagnos och tumörmarginalanalys, särskilt vid hjärncancer ^6,7,8. På senare tid har SRS-avbildning av kemiska förändringar i vävnad också föreslagits för att ge användbar diagnostisk information som ytterligare kan hjälpa kliniker att stratifiera olika cancertyper eller steg⁹.

Trots sin enorma potential i vävnadsdiagnosapplikationer är SRS-avbildning mestadels begränsad till akademiska laboratorier specialiserade på optik på grund av komplexiteten i samband med bildplattformen, som inkluderar ultrasnabba lasrar, laserskanningsmikroskopet och sofistikerad detektionselektronik. Detta protokoll ger ett detaljerat arbetsflöde för att demonstrera användningen av en gemensam femtosekundlaserkälla för realtid, tvåfärgad SRS-avbildning och generering av pseudo-H & E-bilder från mushjärnvävnad. Protokollet kommer att omfatta följande förfaranden:

Justering och chirp optimering
De flesta SRS-bildscheman använder antingen pikosekund- eller femtosekundlasrar som excitationskälla. Med femtosekundlasrar är laserns bandbredd mycket större än Raman-linjebredden. För att övervinna denna begränsning används en spektral fokuseringsmetod för att kvittra femtosekundlasrarna till en pikosekunds tidsskala för att uppnå smal spektral upplösning¹⁰. Optimal spektral upplösning uppnås endast när den temporala chirp (även känd som gruppfördröjningsdispersionen eller bara dispersionen) är korrekt matchad för pumpen och Stokes-lasrarna. Justeringsförfarandet och de steg som behövs för att optimera spridningen av laserstrålarna med hjälp av högdispersiva glasstavar demonstreras här.

Frekvenskalibrering
En fördel med spektralfokusering SRS är att Raman-excitationen snabbt kan ställas in genom att ändra tidsfördröjningen mellan pumpen och Stokes-lasrarna. Sådan inställning ger snabb avbildning och tillförlitligt spektralförvärv jämfört med att ställa in laservåglängder. Det linjära förhållandet mellan excitationsfrekvens och tidsfördröjning kräver emellertid extern kalibrering. Organiska lösningsmedel med kända Raman-toppar används för att kalibrera Raman-frekvensen för spektralfokusering SRS.

Tvåfärgsavbildning i realtid
Det är viktigt att öka bildhastigheten i vävnadsdiagnosapplikationer för att förkorta den tid som behövs för att analysera stora vävnadsprover. Samtidig tvåfärgad SRS-avbildning av lipider och proteiner eliminerar behovet av att ställa in lasern eller tidsfördröjningen, vilket ökar bildhastigheten med mer än två gånger. Detta uppnås genom att använda en ny ortogonal moduleringsteknik och dubbelkanalig demodulering med en inlåsningsförstärkare¹¹. Detta dokument beskriver protokollet för ortogonal modulering och tvåkanalig bildförvärv.

Epi-mode SRS-avbildning
Majoriteten av SRS-avbildning som hittills visats utförs i överföringsläge. Epi-mode-avbildning detekterar bakåtstänkta fotoner från vävnad¹². För patologiska applikationer kan kirurgiska prover vara ganska stora. För avbildning av överföringsläge är vävnadssektion ofta nödvändig, vilket oönskat kräver extra tid. Däremot kan epi-mode-avbildning fungera med intakta kirurgiska prover. Eftersom samma mål används för att samla in bakåtstiterat ljus finns det inte heller något behov av att justera en kondensor med hög numerisk bländare som krävs för överföringsavbildning. Epi-mode är också det enda alternativet när vävnadssektion är svårt, till exempel med ben. Tidigare har vi visat att för hjärnvävnad erbjuder epi-mode-avbildning överlägsen bildkvalitet för vävnadstjocklek > 2 mm¹³. Detta protokoll använder en polariserande stråldelare (PBS) för att samla spridda fotoner depolariserade av vävnad. Det är möjligt att samla fler fotoner med en ringformig detektor på bekostnad av komplexiteten hos anpassad detektormontering¹². PBS-metoden är enklare att implementera (liknande fluorescens), med standardfotodioden som redan används för detektering av överföringsläge.

Pseudo-H&E bildgenerering
När tvåfärgade SRS-bilder har samlats in kan de färgas om för att simulera H&E-färgning. Detta dokument visar proceduren för att konvertera lipid- och protein SRS-bilder till pseudo-H & E SRS-bilder för patologiska applikationer. Det experimentella protokollet beskriver kritiska steg som behövs för att generera högkvalitativa SRS-bilder. Förfarandet som visas här är inte bara tillämpligt på vävnadsdiagnos utan kan också anpassas för många andra hyperspektrala SRS-avbildningsapplikationer som läkemedelsavbildning och metabolisk avbildning^14,15.

Allmänna systemkrav
Lasersystemet för detta protokoll måste kunna mata ut 2 synkroniserade femtosekundlaserstrålar. Systemen har idealiskt en optisk parametrisk oscillator (OPO) för bred våglängdsinställning av en av laserstrålarna. Installationen i detta protokoll använder ett kommersiellt lasersystem Insight DS + som matar ut två lasrar (en fast stråle vid 1 040 nm och en OPO-baserad avstämbar stråle, från 680 till 1 300 nm) med en repetitionshastighet på 80 MHz. Laserskanningsmikroskop, antingen från stora mikroskoptillverkare eller hembyggda, kan användas för SRS-avbildning. Det använda mikroskopet är ett upprätt laserskanningsmikroskop byggt ovanpå en kommersiell upprätt mikroskopram. Ett par 5 mm galvospeglar används för att skanna laserstrålen. För användare som väljer att anta ett hembyggt laserskanningsmikroskop, se ett tidigare publicerat protokoll för konstruktion av ett laserskanningsmikroskop¹⁶.

Protocol

Alla försöksdjursförsök utfördes med 200 μm, fasta, sektionerade mushjärlor, i enlighet med protokollet (# 4395-01) godkänt av Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Washington. Vilda möss (C57BL /6J-stammen) avlivas med CO₂. Därefter utförs en kraniotomi för att extrahera sina hjärnor för fixering i 4% paraformaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning. Hjärnorna är inbäddade i en 3% agaros och 0,3% gelatinblandning och delas upp i 200 μm tjocka skivor av en vibratom.

1. Inledande anpassning

OBS: Se till att strålstorleken och divergensen hos båda armarna matchas för bästa känslighet och upplösning. Kolimera pumpen och Stokes-strålarna och justera deras storlekar innan de går in i laserskanningsmikroskopet. För att göra detta, använd ett par akromatiska linser för varje stråle innan du kombinerar dem på den dikroiska spegeln. Använd alltid ordentliga laserglasögon för stråljustering.

1. Strålkollimation
   1. Installera ett par akromatiska linser för pumpstrålen. Som utgångspunkt kan du använda ett 100 mm-objektiv och ett 200 mm-objektiv för att förstora laserstrålens storlek med 2 gånger. Se till att avståndet mellan de två linserna är ungefär 300 mm. Rikta pumpstrålen genom mitten av båda linserna.
   2. Placera en spegel efter den andra linsen för att skicka strålen mot en vägg (>1 m bort). Var försiktig när du skickar strålen över långa avstånd. Spåra strålen från spegeln till väggen med ett IR-kort och kontrollera om strålen ändras i storlek. Collimate strålen om strålen ändras i storlek som en funktion av avståndet.
      1. Om strålen konvergerar (minskar storleken med förökning), flytta de två linserna närmare.
      2. Om strålen avviker (ökar storleken med utbredningen), flytta de två linserna längre ifrån varandra. Justera avståndet tills strålen är kollimerad.
   3. Upprepa steg 1.1.1 och 1.1.2 för Stokes-strålen för att kollidera strålen.
2. Justering av balkstorlek
   1. Om en balkprofilerare är tillgänglig, mät den kollimerade strålstorleken för varje balk. Alternativt kan du uppskatta strålstorleken med IR-kortet och en linjal för att få en stråldiameter på 4-5 mm.
   2. Om strålstorleken är för liten eller för stor ändrar du linsparet som används i steg 1.1. Justera linsparet tills båda strålarna har en diameter på 4-5 mm.
      OBS: Förstoringen av strålen är förhållandet mellan brännvidden för den andra linsen och den första linsen (f₂/f₁).
3. Rumslig överlappning
   OBS: SRS-avbildning kräver att båda laserstrålarna kombineras i rum och tid för att excitera molekylära vibrationer. Ett schema över den spektralfokuserande SRS-avbildningen visas i figur 1.
   1. Kombinera de två laserstrålarna genom att installera en dikroisk spegel med flera styrspeglar för justering. Optimera den rumsliga överlappningen av pumpen och Stokes genom att övervaka balkar efter den dikroiska spegeln i två olika positioner långt ifrån varandra (~ 1 m). Justera styrspegeln iterativt före dikroiken och den dikroiska spegeln för att rikta in Stokes-strålen mot pumpstrålen.
      OBS: Om de två strålarna är rumsligt överlappande i båda positionerna överlappar de tillräckligt.
   2. Se till att de kombinerade strålarna skickas till mitten av skanningsspeglarna i laserskanningsmikroskopet genom att justera ett par styrspeglar när skanningsspeglarna är parkerade. Se till att båda strålarna färdas genom mitten av mikroskopmålet och kondensorn.
   3. Efter kondensorn, använd ett annat par linser med brännvidder på 100 mm respektive 30 mm för att vidarebefordra den överförda strålen till fotodioden. Se till att båda strålarna finns i fotodioden och installera två lågpassfilter för att blockera den modulerade Stokes-strålen.

2. SRS-signaldetektering

1. Elektrooptisk modulering (EOM)
   OBS: EOM på 20 MHz används för att modulera Stokes-amplituden. Som diskuterats senare härrör EOM från 80 MHz laserpulståget, vilket krävs för ortogonal modulering. Andra moduleringsfrekvenser kan användas om endast enfärgad eller hyperspektral SRS utförs. I så fall är synkronisering av moduleringsfrekvens till laserfrekvens onödig. En frekvensgenerator med en RF-effektförstärkare kan användas för att driva EOM. Därför kan steg 2.1.1-2.1.4 hoppas över.
   1. Placera en strålprovtagare i Stokes strålbana för att plocka upp 10% av strålen och skicka den till en snabb fotodiod för att detektera 80 MHz pulståget.
      OBS: Fotodiodsignalen skickas till en frekvensdelare för att generera en 20 MHz TTL-utgång. Denna utgång skickas vidare till en fläktbuffert för att replikera utgången till fyra identiska 20 MHz-utgångar. En av utgångarna används för att utlösa oscilloskopet.
   2. Ta en av utgångarna från fläktbufferten och filtrera den med ett bandpassfilter för att få en 20 MHz sinusformad våg. Använd en RF-dämpare för att justera den utgående topp-till-topp-spänningen till ~ 500 mV.
   3. Skicka den resulterande utgången till en fasskiftare, vilket möjliggör finjustering av RF-fasen med en spänningskälla. Skicka denna utgång till en RF-effektförstärkare och anslut förstärkarens utgång till EOM.
   4. Avblockera Stokes-strålen och optimera moduleringsdjupet för EOM1 genom att placera en fotodiod i strålbanan. Justera EOM-spänningen och kvartsvågsplattan tills moduleringsdjupet (dal-topp-förhållandet) verkar tillfredsställande.
      OBS: Vid 20 MHz modulering (1/4 av laserrepetitionshastigheten) förväntas två pulser var 50: e ns.
2. Tidsmässig överlappning
   OBS: Tidsmässig överlappning av pumpen och Stokes uppnås genom att fördröja ett av de två laserpulstågen med en reflektor monterad på ett förseningssteg (figur 1 visar att Stokes försenas). Grov överlappning övervakas med oscilloskopet och fin överlappning övervakas av SRS-signalen. Fin tidsmässig överlappning kan också uppnås med en autokorrelator om tillgänglig.
   1. Placera en fotodiod efter den dikroiska spegeln för att detektera laserstrålen. Blockera Stokes-strålen först. Zooma in på en av pumpens pulstoppar på oscilloskopet. Placera en vertikal markör för att markera den tidsmässiga positionen för denna topp med oscilloskopet.
   2. Blockera pumpstrålen och avblockera Stokes-strålen. Översätt fördröjningssteget så att det temporärt matchar topppositionen på oscilloskopet med den markerade positionen i föregående steg. Se figur 2 för en visning av den tidsmässiga överlappningen av två balkar.
      1. (VALFRITT) Om översättningen av fördröjningssteget är otillräcklig för att temporärt matcha de två strålarna, flytta sedan fördröjningssteget till mitten av dess rörelseområde.
      2. Beräkna fördröjningsavståndet som krävs för att matcha de två strålarna genom att ta den tidsmässiga skillnaden mellan de två strålarna och multiplicera skillnaden med ljusets hastighet för att hitta den mängd avstånd som behövs för att matcha de två strålarna temporärt.
      3. Förläng strålbanan för den snabbare strålen eller förkorta strålbanan för den långsammare strålen för att ungefär matcha den tidsmässiga fördröjningen i enlighet därefter.
   3. Förbered ett mikroskopbildprov med DMSO och dubbelsidig tejp som en distans för att hålla provet mellan bilden och en täckglas.
   4. Placera provet på mikroskopet med täcksidan vänd mot mikroskopmålet. Byt mikroskopet till ljusfältsbelysning och observera provet från okularet. Hitta provets fokus genom att först hitta fokus på både det övre och nedre lagret av luftbubblor vid glasbandsgränssnittet och sedan flytta fokus för att vara mellan de två lagren av tejp.
      OBS: Se till att laserstrålarna är blockerade innan du tittar in i okularet.
   5. Ställ in den avstämbara strålutgången på 798 nm. Baserat på kondensorns optiska genomströmning, justera den optiska effekten till ~ 40 mW vardera för pumpen och Stokes-strålarna vid objektivfokus.
   6. Öppna ScanImage i MATLAB (eller annan skanningsprogramvara som styr mikroskopet) och klicka på knappen märkt FOCUS för att börja skanna.
      OBS: Laserstrålarna kommer att rasterskannas genom provet för att generera en bild. Den lågfrekventa signalutgången från fotodioden (<100 kHz) skickas direkt till kanal 1 på datainsamlingskortet (kallad likströmskanalen). Högfrekvensutgången (>100 kHz) från fotodioden skickas in i inlåsningsförstärkaren och X-utgången från inlåsningsförstärkarsignalen skickas till kanal 2 på datainsamlingskortet (kallad AC-kanalen).
   7. Justera styrspegeln före galvoskannern för att centrera likströmssignalen på kanal 1-displayen. Flytta det motoriserade fördröjningssteget och observera noga inlåsningsutgången som visas på kanal 2-displayen (dvs. AC-kanal).
      OBS: När pumpen och Stokes sammanfaller i tid kommer en signal att dyka upp på AC-kanalen. Det är bra att justera AC-kanalens färgskala för att visa den lilla intensitetsförändringen.
   8. Maximera AC-signalintensiteten genom att finjustera tidsfördröjningen. Justera den dikroiska spegeln för att centrera SRS-signalen på AC-kanalen (samtidigt som likströmskanalen hålls centrerad). Justera inlåsningsförstärkarens fas för att maximera signalen. Se figur 3 för en tillfredsställande signal.

3. Optimering av spektral upplösning

OBS: Pumpen och Stokes-strålarna som når provet bör ha samma mängd gruppfördröjningsdispersion (GDD) för att maximera spektralupplösningen. Spridningen beror starkt på den experimentella inställningen. Den experimentella inställningen som beskrivs här använder femtosekundpulser vid 1 040 nm och 800 nm som Stokes respektive pump. Täta flintglasstavar (H-ZF52A) används som pulssträckande medium.

1. För in 48 cm av en mycket dispersiv glasstav (H-ZF52A eller motsvarande tätt flintglas) i 800 nm strålbanan. Uppskatta GDD med Eq (1):
   (1)
   OBS: GVD av olika glasmaterial vid olika våglängder kan hittas från brytningsindexdatabasresursen. Till exempel har H-ZF52A en GVD på 220,40 fs²/mm vid 800 nm. Den totala GDD är 105792 fs².
2. Beräkna hur många cm av den dispersiva glasstången som krävs för att lägga till 1 040 nm strålbanan för att matcha pumpens GDD. Sätt in lämplig längd på dispersiva glasstavar till strålbanan på 1 040 nm för att ungefär matcha GDD för 800 nm-strålen. Observera att tillsatsen av glasstavar kommer att förändra den tidsmässiga överlappningen av de två balkarna, och justering av fördröjning kan vara nödvändig.
3. Kalibrering av spektral upplösning
   1. Gör ett mikroskopbildprov med DMSO. Placera bilden på mikroskopet och kontrollera kraften hos strålarna som kommer ut ur mikroskopkondensorn. Justera effekten därefter så att den har ~ 40 mW vardera vid provfokus.
   2. Öppna ScanImage från MATLAB. Hitta den maximala SRS-signalen genom att skanna genom fördröjningssteget, vilket motsvarar 2 913 ^{cm-1 Raman-toppen} av DMSO. Uppskatta scenpositionen baserat på föregående stegposition med den ökade optiska banlängden på grund av införandet av stavar. Justera strålens rumsliga överlappning på grund av strålens lilla avvikelse när glasstavar läggs till.
   3. Spara en hyperspektral SRS-skanning genom att sekventiellt ta en serie SRS-bilder medan du flyttar det motoriserade steget.
      OBS: Fördröjningsskanningsområdet täcker två Raman-toppar, motsvarande 2 913 ^cm-1 respektive 2 994 ^{cm-1 Raman-toppar} i DMSO. Dessa två övergångar observeras vid användning av en 800 nm pump och 1 040 nm Stokes laser.
   4. Rita ut SRS-spektra för DMSO-lösningen med hjälp av antingen ImageJ eller MATLAB. Montera den stora DMSO 2 913 ^cm-1-toppen på en Gaussisk eller Lorentziansk funktion i MATLAB för att beräkna toppens fulla bredd vid halv maximum (FWHM).
      OBS: Representativa resultat visas i figur 4. Om bara en bred topp är närvarande betyder det antingen att spektralupplösningen är för dålig för att skilja de två topparna och fler glasstavar krävs, eller så var det skannade området för litet för att detektera den andra toppen. Typiskt är en acceptabel spektral upplösning DMSO ~ 20-25 ^cm-1 när glasstavar längd på >60 cm används. En lägre upplösning används ofta för vävnadsavbildning för att handla för högre signaler med kortare pulser¹⁷.
4. (VALFRITT) Använd en autokorrelator eller en FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) för att bestämma pulslängden för varje arm för att beräkna exakt mängden GDD och längden på stavarna som behövs för att matcha GDD mellan pumpen och Stokes.
5. Upprepa steg 3.3.2-3.3.4 för olika stavlängder på Stokes-strålen för att hitta den optimala spektralupplösningen, vilket innebär att den bästa GDD-matchningen har hittats experimentellt. Använd flera uppsättningar glasstavar som skiljer sig åt i längd för att uppnå optimal spektral upplösning.

4. Karakterisering av signal till brus (SNR)

1. Kontrollera att steg 4.2 utförs efter fullständig rumslig och tidsmässig justering.
2. Skaffa en SRS-bild som motsvarar 2 913 ^{cm-1 Raman-toppen} på DMSO. Öppna bilden i ImageJ och välj ett litet område i mitten av ramen. Använd måttfunktionen för att beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för värden i det valda området.
3. Dela medelvärdet för det valda området med standardavvikelsen för att hitta SNR-värdet, som i Eq (2).
   (2)
   OBS: En bra SNR för systemet (med en inlåsningstidskonstant på 4 μs) med DMSO vid 40 mw / 40 mw i fokus för båda armarna är > 800. Lägre koncentrationer av DMSO eller lägre effekt kan användas för en mer exakt uppskattning av SNR om datainsamlingskortet har ett begränsat bitdjup.
4. Om SNR är för låg justerar du laserpulserna för att optimera rumslig överlappning, temporal överlappning, matchning av strålstorlek/kollimation och/eller dispersionsmatchning. För ett mål med en aberrationskorrigeringskrage, optimera signalen genom att justera korrigeringskragen.

5. Kalibrering av frekvensaxel

OBS: Detta steg utförs för att relatera fördröjningsstegets position till den skannade Raman-övergången. Noggrant urval av lösningsmedel krävs för att generera en lämplig "Raman Ruler". DMSO är ett effektivt lösningsmedel för CH-bindningar eftersom det har två skarpa Raman-toppar på 2 913 ^cm-1 och 2 994 ^cm-1.

1. Spara en hyperspektral skanning med fördröjningsstegsområdet som täcker 2 913 ^cm-1 och 2 994 ^{cm-1 Raman-toppar} på DMSO. Spara de scenpositioner som motsvarar den hyperspektrala datauppsättningen.
   OBS: Spektrumets globala maximala topp motsvarar DMSO 2,913 ^{cm-1 Raman-skiftet} och den andra maximala toppen motsvarar DMSO 2,994 ^{cm-1 Raman-skiftet} .
2. Utför linjär regression för scenpositionerna och Raman skiftar vid 2 913 ^cm-1 och 2 994 ^cm-1. Använd den linjära regressionsekvationen som relaterar scenpositionen till Raman-skiftet, konvertera fördröjningspositionerna till motsvarande Raman-frekvenser.

6. Ortogonal modulering och tvåfärgsavbildning

OBS: Det ortogonala moduleringssteget är endast nödvändigt när tvåfärgsavbildning i realtid behövs. Ett schema över detta schema visas i figur 5. Den ortogonala moduleringen använder ett par valobservatörer som drivs vid en fjärdedel av laserfrekvensen (20 MHz för 80 MHz laser) med en 90 ° fasförskjutning mellan de två. Detta ortogonala moduleringssteg kan hoppas över för enfärgad SRS-avbildning eller hyperspektral SRS-avbildning.

1. Modulering av EOM1
   1. Installera en PBS (PBS2), en kvartsvågsplatta (QWP2) och en andra EOM (EOM2) i Stokes strålbana efter den första valenergin. Koppla ur signalingången till EOM2. Anslut signalingången till EOM1 och slå på den.
   2. Modulera Stokes-strålen (fixerad vid 1 040 nm) vid 20 MHz (f₀/4) genom att skicka strålen genom den första EOM. Justera lutningen och läget för EOM1 för att säkerställa att strålen träffar rakt och centrerat genom EOM-kristallen.
   3. Övervaka moduleringsdjupet genom att observera båda polarisationerna som kommer ut ur PBS1 med två fotodioder och visa moduleringen på ett oscilloskop.
   4. Justera QWP1-, EOM1-spänningen och fasen för 20 MHz-ingången (med hjälp av en fasskiftare) för att optimera moduleringsdjupet för den överförda strålen så att den är nära 100%. Se figur 2B för en illustration av bra moduleringsdjup.
2. Modulering av EOM2
   1. Koppla ur EOM1 och anslut EOM2.
   2. Skicka in högspänningsutgången för den andra förstärkaren vid 20 MHz till EOM2. Justera lutningen och läget för EOM2 för att säkerställa att strålen träffar rakt och centrerat genom EOM-kristallen.
   3. Återigen, övervaka moduleringsdjupet genom att titta på båda polarisationerna som kommer ut ur PBS2 med ett oscilloskop. Justera QWP2-, EOM2-spänningen och fasskiftaren efter behov för att uppnå nära 100% modulering för båda polarisationerna.
   4. Se till att pulstågets modulering har en 90° fasförskjutning från den första moduleringen.
      OBS: Om de två pumppulstågen inte är 90 ° ortogonala kommer överhörning mellan de två kanalerna att vara ett problem.
   5. Testa modulationens ortogonalitet genom att slå på och ansluta både EOM1 och EOM2. Övervaka båda polarisationerna som delas av PBS2 med ett oscilloskop. Optimera om EOM1 och EOM2 individuellt om pulståget efter det andra PBS inte liknar figur 2C.
   6. Installera en 20 mm birefringent kvartskristall (BRC) och HWP nedströms EOM2. Anslut båda valobservatörerna samtidigt och övervaka pulståget så att det liknar figur 2D.
      OBS: För chirp som används i detta experiment inducerar 20 mm BRC en tidsfördröjning som motsvarar en 80 ^cm-1 Raman-förskjutning. En annan BRC-längd kan behövas om en annan chirp används.
3. Kalibrering
   1. Kalibrera systemet med DMSO genom att detektera signaler från inlåsningsförstärkaren X och Y-kanalutgången (skickas till kanalerna 2 och 3 på datainsamlingskortet).
   2. Kontrollera om signalerna som genereras av 2 913 ^cm-1-toppen från den snabbare polarisationen och att från den långsammare polarisationen är nära 90 ° ur fas på inlåsningsförstärkaren. Om så inte är fallet, justera valbarmerns inriktning tills de två signalerna är nära 90° ur fas.
   3. När kalibreringen är klar, hitta fördröjningspositionen som undersöker proteinövergången vid 2 930 ^cm-1 för en av de ortogonala strålarna. Se till att den andra polarisationen undersöker lipidövergången på 2 850 ^cm-1.

7. Epi-mode SRS-avbildning

OBS: I överföringslägesavbildningsschemat fokuserar målet lasern i provet, och sedan leder en kondensorlins den överförda strålen till en fotodiod för inlåsningsdetektering. I epi-mode-bildschemat återkallas ljus som är bakåtstänkt och depolariserat av provet av fokuseringsmålet och isoleras med hjälp av en polariserande stråldelare. De isolerade och bakåtstänkta fotonerna skickas till en fotodiod genom ett par relälinser för inlåsningsdetektering. Figur 6 visar epi-mode-bildschemat.

1. Installera en HWP innan strålen kommer in i mikroskopet för att ändra polarisationen av strålen som går in i mikroskopet. Placera en PBS ovanför målet så att den depolariserade bakåtreflekterade strålen kan nå detektorn.
2. Använd ett par linser bestående av en 75 mm akromat lins och en 30 mm asfärisk lins för att vidarebefordra de bakåtstänkta fotonerna från målets bakre bländare till fotodetektorn. Montera detektorn för att samla upp det bakåtstänkta ljuset som riktas av PBS. Installera ett filter för att blockera den modulerade strålen från att komma in i detektorn.
3. Placera vävnadsprovet under målet. Eftersom kondensorn är onödig för epi-mode-avbildning, ta bort den om mer utrymme krävs.
4. Imaging
   1. Blockera strålen med en slutare; lysa en vit ljuskälla på provet från sidan; och använd ljusfält för att hitta objektivt fokus.
   2. Avblockera båda strålarna och använd de förkalibrerade fördröjningspositionerna för att förvärva lipid- och protein-SRS-bilder från vävnad från de två utgångarna från inlåsningsförstärkaren.
   3. Justera inlåsningsförstärkningen och pixelfackfaktorn för att få bilder av god kvalitet.

8. Färgning med falsk färg

1. Öppna bildstacken med ImageJ.
2. Dra ut de två bilderna som motsvarar lipid (2 850 ^cm-1) och protein (2 930 ^cm-1) arter genom att högerklicka på bilden och klicka på Duplicera.
3. Byt namn på lipidbilden till lipider och proteinbilden till proteiner.
4. Gå till Process | Bildkalkylator och utföra proteiner subtraherar lipider.
5. Kombinera bilderna genom att gå till Bild | Färg | Slå samman kanaler, ställa in lipider till grönt och proteiner till blått. Öppna bildkanalverktyget (Bild | Färg | Kanalverktyg) och justera ljusstyrka och kontrast (Bild | Justera | Ljusstyrka/kontrast).
6. Justera ljusstyrkan och kontrasten för varje kanal med hjälp av kanalverktyget . För lipidkanalen justerar du kontrasten tills de cellulära funktionerna verkar mörka. För proteinkanalen justerar du kontrasten tills de cellulära funktionerna visas blåa. Konvertera den sammanslagna kanalens gröna/blå bild till en RGB-bild genom att gå till Bild | Typ | RGB-färg. Exportera den här bilden med Arkiv | Spara som | Tiff.
   OBS: För falsk H & E-färgning visar färgschemat rosa cytoplasma, medan kärnorna är mörkblå-lila.
7. Ladda ned HE.m MATLAB-skriptet från den falska H&E-färgningsskriptresursen i materialförteckningen.
8. Kör HE.m-skriptet i MATLAB. Välj den exporterade RGB-bilden från föregående steg för att generera en artificiellt H&E-färgad bild.
9. (VALFRITT) Normalisera bildintensiteten för stora bildfältsavbildningar eftersom bilden verkar mörkare i periferin än i mitten.
   1. För att utföra fältnormalisering av bilderna, genomsnittligt så många bilder som möjligt. Ta sedan bort intensitetsfunktionerna med ImageJ (Process | Filtrerar | Gaussisk oskärpa | Radie = 50).
   2. Mät den maximala intensiteten för den suddiga bilden (Ctrl + M). Dela den suddiga bilden med maximal intensitet (Process | Matematik | Dela). Dela den råa SRS-bilden med den suddiga bilden (Process | Bild | Kalkylator).

Representative Results

Optimera spektral upplösning:
Dispersion genom ett material påverkas av det dispersiva mediet (längd och material) och våglängd. Ändring av dispersionsstångens längd påverkar spektralupplösningen och signalstorleken. Det är ett ge-och-ta-förhållande som kan vägas olika beroende på ansökan. Stavarna sträcker ut strålpulsen från att vara bred i frekvens och smal i tid till att vara smal i frekvens och bred i tiden. Figur 7 visar effekten av varierande stavlängder på spektralupplösningen. Figur 7A visar mycket dålig spektral upplösning; denna inställning har inga glasklockstänger, och de två Raman-topparna från DMSO är inte lösta alls. I figur 7B,C börjar en ökning av antalet glasklockande stavar lösa de två topparna. Slutligen visar figur 7D hur matchat kvitter löser båda topparna och kan användas för att kalibrera scenpositioner till frekvens.

Kalibrering med DMSO:
DMSO har två skarpa Raman-toppar på 2 913 och 2 994 ^cm-1 som är lämpliga för kalibrering i C-H-regionen. När ett DMSO-spektrum erhålls från en hyperspektral SRS-skanning omvandlar en enkel linjär regression scenpositionen till Raman-skiftet. Om spektralupplösningen är dålig (som visas i figur 7A) och de två topparna inte är separerbara, är kalibrering med linjär regression omöjlig. I detta fall är bättre dispersionsmatchning nödvändig genom att antingen lägga till eller ta bort glasstavar. De vanligaste svårigheterna att hitta en DMSO-signal för kalibrering beror på fel i antingen tidsmässig överlappning eller rumslig överlappning av de två strålarna. Innan du försöker DMSO-kalibrering ska du upprepa stegen för rumslig och tidsmässig justering för att optimera SRS-signalen.

Tvåfärgad DMSO:
I tvåfärgade SRS genereras två pumppulståg med ortogonal polarisation med en fast tidsfördröjning (på grund av en dubbelrefringent kristall). Utvärdering av moduleringsdjup och 90 ° fasförskjutning görs med en fotodiod följt av en DMSO SRS-signal. Figur 8 visar acceptabelt moduleringsdjup och tidsmässig separation. Även om spektralupplösningen av DMSO i figur 8 inte är idealisk, offras den ofta i vävnadsavbildningsexperiment för att uppnå en högre signal med kortare pulser. Figur 9 visar dåliga fasförskjutningar som ger upphov till inverterade eller negativa toppar.

Tvåfärgade SRS av mushjärnvävnad i epi-läge:
Epi-mode (detektering av bakåtstänkta fotoner) SRS används för avbildning av tjock vävnad (>1 mm). Figur 10A, B visar realtid, tvåfärgad SRS-avbildning vid 2 850 ^cm-1 och 2 930 ^cm-1 av ex vivo mus hjärnvävnad. De råa bilderna från lipid- och proteinkanalerna (figur 10A,B) färgkodades för att producera en enda bild som visar lipid- och proteinbidrag (figur 10C). Falsk H&E-färgning utfördes (figur 10D) på figur 10C för att efterlikna H&E-färgning. Dålig bildkvalitet kan bero på stort bilddjup eller dålig kalibrering (frekvensaxel eller moduleringsdjup). Det typiska bilddjupet i hjärnvävnad är 100-200 μm¹³.

Bild 1: Schematisk inställning av SRS-avbildning i en färg. Konstruktion av ett spektralfokuserande SRS-mikroskop i överföringsläge. X och Y representerar de ortogonala utgångarna. Förkortningar: SRS = stimulerad Raman-spridning; DL = retroreflektorbaserad fördröjningslinje, Div = avdelare; FB = fläktbuffert; AT = dämpare; PS = fasskiftare; PA = effektförstärkare; DCM = dikroisk spegel; GM = galvo speglar; EOM = elektrooptisk modulator; POM = pick-off spegel; PBS = polariserande stråldelare, BRC = birefringent kristall; QWP = kvartsvågsplatta; HWP: halvvågsplatta; PD = fotodiod; GR = glasstång; BB = Balkblock; SPF = shortpassfilter; CL = samverkande lins; BS = strålstorleksbyte lins. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Representativ tidsmässig överlappning. (A) Pumpen och Stokes-strålarna ses vara temporärt överlappade på oscilloskopet. Oscilloskopmarkörer används för att markera pumpens och Stokes-strålarnas tidsmässiga positioner. Denna överlappning är tillfredsställande som utgångspunkt för att ytterligare justera tidsmässig överlappning med ett fördröjningssteg. (B) Tillfredsställande representativt moduleringsdjup för en valobservatörsuppdrag vid 20 MHz. (C) Tillfredsställande pulsmodulering medan två valobservatörsuppdrag används. (D) Tillfredsställande pulstågsmodulering efter birefringent kvartskristall och halvvågsplattinstallation på den dubbelt modulerade Stokes-armen. Förkortning: EOM = elektrooptisk modulator. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Representativa SRS- och pumpsignaler. (A) Feljusterad pumpsignal detekterad i likströmskanalen. (B) Feljusterad SRS-signal detekterad av fotodiod. (C) Tillfredsställande, centrerad pumpsignal i likströmskanalen. (D) Tillfredsställande SRS-signal centrerad på växelströmskanalen. Förkortning: SRS = stimulerad Raman-spridning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Spektral upplösningskarakterisering. En gaussisk funktion passade till 2 913 ^cm-1 Raman DMSO-toppen. FWHM-beräknad gav en upplösning på 15 ^cm-1 för systemet. Förkortningar: DMSO = dimetylsulfoxid; FWHM = Full bredd vid halv max. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Schema över tvåfärgade SRS-avbildningsinställningar. Konstruktion av ett tvåfärgat SRS-mikroskop i överföringsläget. X och Y representerar de ortogonala utgångarna. Förkortningar: DL = retroreflektorbaserad fördröjningslinje; Div = avdelare; FB = fläktbuffert; AT = dämpare; PS = fasskiftare; PA = effektförstärkare; DCM = dikroisk spegel; GM = galvo speglar; EOM = elektrooptisk modulator; PBS = polariserande stråldelare; BRC = birefringent kristall; QWP = kvartsvågsplatta; HWP = halvvågsplatta; PD = fotodiod; GR = glasstång; BB = Strålblock, SPF = kortpassfilter; CL = samverkande lins; POM = pick-off spegel; BS = strålstorleksbyte lins. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Schematisk för tvåfärgad SRS-avbildning Epi-mode-uppsättning. Konstruktion av ett tvåfärgat SRS-mikroskop i epi-läge. X och Y representerar de ortogonala utgångarna. Förkortningar: DL = retroreflektorbaserad fördröjningslinje; Div = avdelare; FB = fläktbuffert; AT = dämpare; PS = fasskiftare; PA = effektförstärkare; DCM = dikroisk spegel; GM = galvo speglar; EOM = elektrooptisk modulator; PBS = polariserande stråldelare; BRC = birefringent kristall; QWP = kvartsvågsplatta; HWP = halvvågsplatta; PD = fotodiod; GR = glasstång; BB = Strålblock, BPF = bandpassfilter; CL = samverkande lins; POM = pick-off spegel; BS = strålstorleksbyte lins. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7: Optimera spektral upplösningen med 25% DMSO. (A) Noll glas chirping stavar användes för att erhålla DMSO-spektrumet. De två topparna är inte lösta. (B) Kvittrande stavar av glas användes, 20 cm på pumparmen och 24 cm på Stokes arm. Två toppar börjar lösas till en tillfredsställande punkt. (C) Kvittrande stavar användes, 40 cm lång pump och 24 cm långa Stokes, för att få ett bättre upplöst DMSO-spektrum. (D) Kvittrande stavar användes, 64 cm lång pump och 60 cm långa Stokes, för att uppnå högre spektral upplösning. Förkortning: DMSO = dimetylsulfoxid. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 8: Tvåfärgade SRS, varierande polarisation och tidsfördröjning. Två tidsfördröjda pulståg med ortogonal polarisation (s & p) används för att avbilda DMSO-spektra för att visa tidsfördröjningen (och Raman-frekvensskillnaden) mellan SRS-excitationerna. Förkortningar: DMSO = dimetylsulfoxid; SRS = stimulerad Raman-spridning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 9: SRS-spektrum till följd av en dålig tvåfärgad SRS-fasförskjutning. En negativ topp på 2 994 ^cm-1 nära scenposition 48 är ett tecken på dålig fasskillnad. Förkortning: SRS = stimulerad Raman-spridning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 10: Generering av falsk tvåfärgad H&E-färgning av SRS-bilder. (A) SRS-bild av råprotein från en mushjärnvävnad vid övergången på 2 930 ^cm-1 . (B) Rå lipid SRS-bild från musens hjärnvävnad vid övergången på 2 850 ^cm-1 . (C) Sammanslagna och färgkodade kanaler från A och B med lipidbidrag i grönt och proteinbidrag i blått. (D) Falsk H &E-omfärgning utfördes på C för att efterlikna H & E-färgning för patologiska applikationer. Skalstång = 50 μm. Förkortningar: SRS = stimulerad Raman-spridning; H&E = hematoxylin och eosin. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Det tvåfärgade SRS-avbildningsschemat som presenteras i detta protokoll hänger på korrekt implementering av enfärgad SRS-avbildning. I enfärgad SRS-avbildning är de kritiska stegen rumslig inriktning, tidsmässig inriktning, moduleringsdjup och fasförskjutning. Rumslig kombination av de två strålarna åstadkoms av en dikroisk spegel. Flera styrspeglar används för finjustering när balkarna skickas till dikrospegeln. När balkarna har kombinerats med den dikroiska spegeln kan rumslig inriktning bekräftas genom att plocka bort den kombinerade strålbanan med en spegel för att skicka mot en vägg >1 m bort medan du kontrollerar den kombinerade strålen för att se om den överlappar med ett IR-kort. Efter rumslig anpassning genom mikroskopet utförs den tidsmässiga överlappningen genom att justera banlängden med ett retroreflektorbaserat fördröjningssteg, vilket har fördelen att bevara rumslig anpassning. 1 040 nm-armen är den fördröjda strålen i detta protokoll. Tidsmässig överlappning är omöjlig om fördröjningssteget inte har räckvidden för att få de två strålarna att överlappa varandra temporärt. I så fall kan det vara nödvändigt att flytta hela fördröjningssteget till en annan plats för att säkerställa att den tidsmässiga överlappningen ligger nära mitten av fördröjningsgenomsökningsområdet. Till exempel, om den tidsmässiga skillnaden mellan de två strålarna mäts som 6 ns, krävs 1,8 m justering. Den justering som krävs betecknar längden på förlängningen av strålbanan för den snabbare strålen eller förkortningen av strålbanan för den långsammare strålen.

Förutom justering är strålstorleksmatchning och modulering av Stokes-strålen också viktiga för att maximera SRS-signalen. Helst bör båda strålarna vara kollimerade vid målplanet och matcha storleken på objektivets bakre bländare. Det är användbart att kontrollera kollimation och strålstorlek om målplanet exponeras för användaren. Om strålen konvergerar eller avviker är det nödvändigt att justera den andra linsen i kollimationslinsparet för att uppnå kollimation (protokollsteg 1.1). På samma sätt, om strålstorleken är för liten vid objektivets bakre bländare, måste ett linspar med hög förstoring användas (protokollsteg 1.2). SRS skalar linjärt med moduleringsdjupet för Stokes-strålen. Det är viktigt att se till att pulshöjden vid dalen är <10% av pulshöjden vid toppen på oscilloskopet. Dålig modulering av Stokes-strålen översätts direkt till dålig SNR.

Vid användning av femtosekundlasrar för SRS-avbildning är spektralfokusering nödvändig för att konvertera tidsfördröjningen mellan pumpen och Stokes till Raman-frekvensförskjutning. Omvandlingsfaktorn beror på mängden chirp som appliceras. Det är viktigt att matcha pumpens och Stokes GDD för att uppnå optimal spektral upplösning. GDD kan uppskattas baserat på längden på det dispersionsmaterial som används och dess GVD. Till exempel har SF11 tät flintglasstång en GVD på 123.270 fs² / mm vid 1,040 nm och 187.486 fs² / mm vid 800 nm. För 240 mm SF11 i 800 nm-strålbanan är GDD 240 mm × 187.486 fs²/mm = 45 000 fs². För 240 mm SF11 i strålbanan 1 040 nm är GDD 240 mm × 123,270 fs²/mm = 30 000 fs². Denna exempelberäkning innebär att ytterligare glasstavar ska läggas till 1 040 nm-armen, eller att glasstavar ska tas bort från 800 nm-armen för att matcha GDD. För att uppnå högre spektral upplösning krävs en större GDD, vilket innebär längre stavar. Vid beräkningen av GDD har dock bidragen från valberedningsman och målet försummats. Den faktiska matchningen av GDD bestäms experimentellt genom att hitta den bästa spektrala upplösningen för de givna stavlängderna på pumpen eller Stokes. Beräkningarna fungerar som ett bra startsteg. Experimentell optimering genom iterativ tillsats och borttagning av glasstavar är fortfarande nödvändig för att optimera spektralupplösningen.

Det är viktigt att inse att en stor chirp ger högre spektral upplösning men på bekostnad av signalintensiteten. Mindre chirps och kortare pulser är fördelaktiga för vävnadsavbildning i C-H-regionen eftersom protein- och lipid Raman-toppar är breda. Lägre spektral upplösning kan bytas mot en högre SRS-signal (eller snabbare bildhastighet) utan att offra tvåfärgad vävnadskontrast¹⁷. I andra applikationer där hög spektral upplösning behövs, särskilt i fingeravtrycksområdet, är det nödvändigt att applicera en större chirp med långa glasstavar. Alternativt kan det vara lättare att använda gallerbårar för att få längre pulser (för pulslängd längre än 3 ps). En huvudbegränsning av den använda kommersiella lasern är emellertid dess spektrala bandbredd. Den spektrala täckningen av spektralfokuserande SRS beror på excitationslasrarnas bandbredd. Det använda lasersystemet har en spektral täckning vanligtvis runt 200-250 ^cm-1. Detta är knappt tillräckligt för att täcka C-H-regionen. En större spektral täckning behövs vanligtvis för att lösa kemiska arter för avbildning i fingeravtrycksområdet. Detta problem kan åtgärdas med ett fiberlasertillägg som breddar stokeslaserns bandbredd från 6 nm till 60 nm¹⁸. En annan viktig begränsning för den tvåfärgade SRS-bildtekniken är att endast två övergångar övervakas. Detta tillvägagångssätt skulle vara olämpligt för komplexa prover med många överlappande Raman-toppar eller flera arter.

Den tvåfärgade SRS-avbildningsmetoden i realtid ger höghastighetsvävnadsavbildning genom att ta bort behovet av laser eller fördröjning. Det är dock svårt att installera på grund av utmaningarna med att uppnå nästan perfekt moduleringsdjup för båda valobservatörsuppdragen. Det är bäst att optimera EOM1 och EOM2 oberoende. Om EOM1 är aktiverat måste EOM2 kopplas ur och vice versa. När båda moduleringarna är optimerade till nästan perfektion (>95% moduleringsdjup) är båda valobservatörerna anslutna för att möjliggöra ortogonal modulering. Längden på tidsfördröjningen mellan de två ortogonala pulstågen beror på längden på BRC och chirp. Denna moduleringsmetod är inte omedelbart genomförbar för kliniska tillämpningar eftersom komplex elektronik behövs för att tillhandahålla två RF-pulståg med en avstämbar fasförskjutning för att driva de två valobservatörerna. Anpassningen av EOM måste också vara nästan perfekt för att säkerställa hög överföring, god modulering och ortogonalitet mellan de två kanalerna. Denna teknik är allmänt tillämplig på andra applikationer som kräver snabb, samtidig avbildning av två Raman-toppar på grund av rörelse- eller provförändringar. Exempel inkluderar vattentemperaturmätningar eller spårning av rörliga föremål som lipiddroppar eller organeller^11,19.

En robust fiberlaser krävs för framtida kliniska tillämpningar⁴. Det tillvägagångssätt som beskrivs i protokollet kan också utvidgas för att förbättra förvärvshastigheten upp till videohastigheten, vilket är viktigt för att skanna stora vävnadsprover inom rimlig tid. Om avbildningstid eller rörelseartefakter inte är ett problem, kan protein- och lipid SRS-bilder förvärvas sekventiellt genom att flytta det motoriserade fördröjningssteget ram för ram. En annan realtids, tvåfärgad SRS-avbildningsmetod är ett tvåfasschema som återvinner Stokes-strålen för att ge samma två ortogonala kanaler²⁰. Implementeringen av tvåfasschemat kräver dock extra inriktning som involverar tre balkar. Det kräver också matchning av strålstorleken och divergensen av tre laserstrålar. En potentiell väg att förbättra båda teknikerna för att övervinna den samtidiga tvåfärgsgränsen är införlivandet av en snabbt avstämbar fiberlaser för att undersöka specifika spektralregioner²¹. Bearbetningen av bilder är densamma som beskrivs i protokollet för att generera simulerade H&E-bilder.

Slutligen visar detta protokoll epi-mode SRS-avbildning. Det genererar vanligtvis bilder av lägre kvalitet jämfört med avbildning av överföringsläge för tunna vävnadssektioner på grund av den lägre pumpeffekten som når detektorn¹³. För tjockvävnadsavbildning (>1-2 mm) eller prover som är mycket spridda (t.ex. benvävnad) kan epi-mode-avbildning fungera bättre än överföringslägesavbildning. Vid avbildning av färsk vävnad som hjärnvävnad är SRS-bilddjupet vanligtvis begränsat till 200-300 μm. För fast vävnad är spridningen starkare och bilddjupet är 100-200 μm. Djupare avbildning kan uppnås med högre effekt, aberrationskorrigering eller optisk rensning ^22,23. Ändå är epi-mode-avbildning ett föredraget tillvägagångssätt för vävnadsdiagnos eftersom det inte kräver någon vävnadssektion, och inriktningen är enklare utan den höga NA-kondensorn. Framtida vävnadsdiagnosapplikationer kommer att dra nytta av snabb, stor områdesavbildning på intakta kirurgiska prover följt av maskininlärning / djupinlärningsbaserad diagnos. Protokollet som presenteras här är också lämpligt för in vivo-applikationer, såsom hjärnavbildning eller hudavbildning, där epi-mode-avbildning är det enda alternativet, och höghastighetsavbildning är viktigt för att undvika rörelseartefakter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.