Summary
受激拉曼散射（SRS）显微镜是一种功能强大、无损且无标记的成像技术。一种新兴应用是刺激拉曼组织学，其中蛋白质和脂质拉曼转变处的双色SRS成像用于生成假苏木精和曙红图像。在这里，我们演示了用于组织诊断的实时双色SRS成像方案。
Abstract
受激拉曼散射（SRS）显微镜已成为一种用于组织诊断的强大光学成像技术。近年来，双色SRS已被证明能够提供苏木精和曙红（H&E）等效的图像，从而可以快速可靠地诊断脑癌。这种能力使令人兴奋的术中癌症诊断应用成为可能。组织的双色SRS成像可以使用皮秒或飞秒激光源完成。飞秒激光器具有支持灵活成像模式的优势，包括快速高光谱成像和实时双色SRS成像。具有啁啾激光脉冲的光谱聚焦方法通常与飞秒激光器一起使用，以实现高光谱分辨率。
双色SRS采集可通过正交调制和锁相检测实现。脉冲啁啾、调制和表征的复杂性是该方法广泛采用的瓶颈。本文提供了一个详细的协议，以演示光谱聚焦SRS的实现和优化，以及在外延模式下小鼠脑组织的实时双色成像。该协议可用于广泛的SRS成像应用，这些应用利用了SRS的高速和光谱成像能力。
Introduction
传统的组织诊断依赖于染色方案，然后在光学显微镜下进行检查。病理学家使用的一种常见染色方法是H&E染色：苏木精将细胞核染色为紫蓝色，曙红将细胞外基质染色为粉红色。这种简单的染色仍然是许多组织诊断任务的病理学的金标准，特别是癌症诊断。然而，H&E组织病理学，特别是在术中环境中使用的冷冻切片技术，仍然存在局限性。染色过程是一个费力的过程，涉及组织包埋，切片，固定和染色1。典型的周转时间为20分钟或更长时间。当一次处理多个切片时，在冷冻切片期间执行H&E有时会变得更具挑战性，因为需要在3D中评估细胞特征或生长模式以进行边缘评估。此外，术中组织学技术需要熟练的技术人员和临床医生。在许多情况下，许多医院董事会认证的病理学家数量的限制是术中咨询的一个限制因素。随着数字病理学和基于人工智能的诊断的快速发展兴趣，这种局限性可能会得到缓解2.然而，根据技术人员的经验，H&E染色结果是可变的，这给基于计算机的诊断带来了额外的挑战2。
这些挑战可以通过无标记光学成像技术来解决。其中一种技术是SRS显微镜。SRS 使用同步脉冲激光器（泵浦和斯托克斯）以高效率激发分子振动3.最近的报告表明，蛋白质和脂质的SRS成像可以产生具有完整新鲜组织的H&E等效图像（也称为刺激拉曼组织学或SRH），这绕过了任何组织处理的需要，显着缩短了诊断所需的时间，并且已经在术中进行了调整4。此外，SRS成像可以提供3D图像，当2D图像不足时，它为诊断提供了额外的信息5。SRH是无偏倚的，并生成随时可用于基于计算机的诊断的数字图像。它很快成为术中癌症诊断和肿瘤边缘分析的可能解决方案，特别是在脑癌中6，7，8。最近，还建议对组织的化学变化进行SRS成像，以提供有用的诊断信息，进一步帮助临床医生对不同的癌症类型或9期进行分层。
尽管SRS成像在组织诊断应用中具有巨大的潜力，但由于成像平台的复杂性，包括超快激光器，激光扫描显微镜和复杂的检测电子设备，SRS成像主要局限于专门从事光学的学术实验室。该协议提供了一个详细的工作流程，以演示使用常见的飞秒激光源进行实时双色SRS成像以及从小鼠脑组织生成伪H&E图像。该协议将涵盖以下过程：
对齐和啁啾优化
大多数SRS成像方案使用皮秒或飞秒激光器作为激发源。对于飞秒激光器，激光器的带宽远大于拉曼线宽。为了克服这一限制，使用光谱聚焦方法将飞秒激光器啁啾到皮秒时间尺度，以实现窄光谱分辨率10。只有当时间啁啾（也称为群延迟色散或仅色散）与泵浦和斯托克斯激光器正确匹配时，才能实现最佳光谱分辨率。这里演示了使用高色散玻璃棒优化激光束色散的对准过程和步骤。
频率校准
光谱聚焦SRS的一个优点是，可以通过改变泵浦和斯托克斯激光器之间的时间延迟来快速调谐拉曼激发。与调谐激光波长相比，这种调谐提供了快速成像和可靠的光谱采集。然而，激励频率和时间延迟之间的线性关系需要外部校准。具有已知拉曼峰的有机溶剂用于校准光谱聚焦SRS的拉曼频率。
实时双色成像
提高组织诊断应用中的成像速度以缩短分析大型组织标本所需的时间非常重要。同时对脂质和蛋白质进行双色SRS成像，无需调整激光或延时，从而使成像速度提高了两倍以上。这是通过使用一种新颖的正交调制技术和带有锁相放大器11的双通道解调来实现的。本文介绍了正交调制和双通道图像采集的协议。
外延模式 SRS 成像
迄今为止显示的大多数SRS成像都是在传输模式下进行的。Epi模式成像检测来自组织12的反向散射光子。对于病理学应用，手术标本可能相当大。对于透射模式成像，通常需要组织切片，这不需要额外的时间。相比之下，表观成像可以处理完整的手术标本。由于使用相同的物镜来收集反向散射光，因此也不需要对准透射成像所需的高数值孔径聚光镜。当组织切片困难时，外延模式也是唯一的选择，例如骨骼。以前我们已经证明，对于脑组织，外延模式成像为组织厚度>2 mm13提供了卓越的成像质量。该协议使用偏振分束器（PBS）来收集由组织去极化的散射光子。可以用环形探测器收集更多的光子，但代价是定制探测器组件12的复杂性。PBS方法更易于实现（类似于荧光），标准光电二极管已经用于传输模式检测。
伪 H&E 图像生成
一旦收集了双色SRS图像，就可以对其进行重新着色以模拟H&E染色。本文演示了将脂质和蛋白质SRS图像转换为伪H&E SRS图像以用于病理学应用的过程。实验方案详细说明了生成高质量SRS图像所需的关键步骤。这里显示的程序不仅适用于组织诊断，而且可以适用于许多其他高光谱SRS成像应用，例如药物成像和代谢成像14，15。
一般系统要求
用于该协议的激光系统必须能够输出2个同步飞秒激光束。理想情况下，系统具有光学参数振荡器（OPO），用于其中一束激光束的宽波长调谐。该协议中的设置使用商用激光系统Insight DS+，该系统输出两个激光器（一个1，040 nm的固定光束和一个基于OPO的可调谐光束，范围从680到1，300 nm），重复率为80 MHz。使用的显微镜是建立在商用正置显微镜框架之上的直立激光扫描显微镜。一对5毫米振镜用于扫描激光束。对于选择采用自制激光扫描显微镜的用户，请参阅先前发布的激光扫描显微镜构建方案16。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验动物程序均根据华盛顿大学动物护理和使用委员会研究所（IACUC）批准的协议（#4395-01）使用200μm，固定，切片的小鼠大脑进行。野生型小鼠（C57BL / 6J菌株）用CO2安乐死。然后，进行开颅手术以提取他们的大脑以固定在磷酸盐缓冲盐水中的4%多聚甲醛中。将大脑嵌入3%琼脂糖和0.3%明胶混合物中，并通过振动切片机切片成200μm厚的切片。
1. 初始对齐
注：确保光束尺寸和两个臂的发散度匹配，以获得最佳灵敏度和分辨率。在泵浦和斯托克斯光束进入激光扫描显微镜之前，将其准直并调整其尺寸。为此，请先对每束光束使用一对消色差透镜，然后再将它们组合在二向色镜上。始终佩戴适当的激光护目镜进行光束对准。
- 光束准直
- 为泵浦光束安装一对消色差透镜。作为起点，使用100 mm镜头和200 mm镜头将激光束尺寸放大2倍。确保两个镜头的距离约为 300 mm。通过两个透镜的中心对齐泵浦光束。
- 在第二个透镜后放置一面镜子，将光束朝向墙壁（>1米远）。远距离发送光束时要小心。使用红外卡跟踪从镜子到墙壁的光束，并检查光束的大小是否发生变化。如果光束的大小随距离而变化，则准直光束。
- 如果光束正在会聚（随着传播而减小尺寸），请将两个透镜移近。
- 如果光束发散（随着传播而增加尺寸），请将两个透镜进一步分开。调整距离，直到光束准直。
- 重复步骤 1.1.1 和 1.1.2，斯托克斯光束使光束准直。
- 光束尺寸调整
- 如果光束轮廓仪可用，请测量每个光束的准直光束尺寸。或者，使用红外卡和标尺估计光束尺寸，以获得4-5 mm的光束直径。
- 如果光束尺寸太小或太大，请更改步骤1.1中使用的透镜对。调整透镜对，直到两个光束的直径均为4-5 mm。
注：光束的放大倍率是第二个镜头的焦距与第一个镜头的焦距之比（f2/f1）。
- 空间重叠
注意：SRS成像需要在空间和时间上结合两个激光束以激发分子振动。光谱聚焦SRS成像的示意图如图 1所示。- 通过安装一个二向色镜和几个转向镜进行调整，将两个激光束组合在一起。通过监测二向色镜后两个相距很远（约1米）的不同位置的光束，优化泵和斯托克斯的空间重叠。在二向色镜和二向色镜之前迭代调整转向镜，使斯托克斯光束与泵光束对齐。
注意：如果两个梁在两个位置的空间重叠，则它们充分重叠。 - 当扫描镜处于停放位置时，通过调整一对转向镜，确保将组合光束发送到激光扫描显微镜扫描镜的中心。确保两束光束都穿过显微镜物镜和聚光镜的中心。
- 在聚光镜之后，使用另一对焦距分别为100 mm和30 mm的透镜，将透射光束传递到光电二极管上。确保两个光束都包含在光电二极管内，并安装两个低通滤波器以阻挡调制的斯托克斯光束。
- 通过安装一个二向色镜和几个转向镜进行调整，将两个激光束组合在一起。通过监测二向色镜后两个相距很远（约1米）的不同位置的光束，优化泵和斯托克斯的空间重叠。在二向色镜和二向色镜之前迭代调整转向镜，使斯托克斯光束与泵光束对齐。
2. SRS信号检测
- 电光调制
注：20 MHz 的 EOM 用于调制斯托克斯幅度。如后文所述，EOM源自正交调制所需的80 MHz激光脉冲序列。如果仅执行单色或高光谱SRS，则可以使用其他调制频率。在这种情况下，调制频率与激光频率的同步是不必要的。带有RF功率放大器的频率发生器可用于驱动EOM。因此，可以跳过步骤 2.1.1-2.1.4。- 在斯托克斯光束路径中放置一个光束采样器，以拾取10%的光束，并将其发送到快速光电二极管以检测80 MHz脉冲序列。
注意：光电二极管信号被发送到分频器以产生20 MHz TTL输出。该输出进一步发送到扇出缓冲器，以将输出复制到四个相同的20 MHz输出中。其中一个输出用于触发示波器。 - 取扇出缓冲器的一个输出，并用带通滤波器对其进行滤波，以获得20 MHz正弦波。使用RF衰减器将输出峰峰值电压调节至~500 mV。
- 将得到的输出发送到移相器，从而允许使用电压源对RF相位进行微调。将此输出发送到RF功率放大器，并将放大器的输出连接到EOM。
- 通过在光束路径中放置光电二极管来解锁斯托克斯光束并优化EOM1的调制深度。调整EOM电压和四分之一波板，直到调制深度（谷峰比）看起来令人满意。
注意：在20 MHz调制（激光重复率的1/4）下，预计每50 ns有两个脉冲。
- 在斯托克斯光束路径中放置一个光束采样器，以拾取10%的光束，并将其发送到快速光电二极管以检测80 MHz脉冲序列。
- 时间重叠
注意：泵浦和斯托克斯的时间重叠是通过延迟两个激光脉冲序列中的一个，并将反射器安装在延迟级上来实现的（图1 显示了斯托克斯被延迟）。用示波器监测粗重叠，用SRS信号监测细重叠。如果可用，也可以使用自相关器实现精细的时间重叠。- 在二向色镜后放置光电二极管以检测激光束。首先阻挡斯托克斯光束。放大示波器上的其中一个泵脉冲峰值。放置垂直光标，用示波器标记此峰值的时间位置。
- 阻挡泵梁并疏通斯托克斯梁。转换延迟级，以将示波器上的峰值位置与上一步中的标记位置暂时匹配。有关两个光束的时间重叠的显示，请参见 图2 。
- （可选）如果延迟级的平移不足以在时间上匹配两个光束，则将延迟级移动到其运动范围的中间。
- 通过获取两束之间的时间差并将差值乘以光速来计算匹配两束光束所需的延迟距离，以找到在时间上匹配两束光束所需的距离量。
- 拉长较快光束的光束路径或缩短较慢光束的光束路径，以相应地大致匹配时间延迟。
- 用DMSO和双面胶带作为垫片准备显微镜载玻片样品，以将样品固定在载玻片和盖玻片之间。
- 将样品放在显微镜上，盖玻片面朝向显微镜物镜。将显微镜更换为明场照明，并从目镜观察样品。首先在玻璃胶带界面处的气泡的顶部和底层找到焦点，然后将焦点移动到两层胶带之间，从而找到样品的焦点。
注：在观察目镜之前，请确保激光束被阻挡。 - 将可调谐光束输出设置为 798 nm。根据聚光镜的光吞吐量，将目标焦点处的泵浦和斯托克斯光束的光功率调整为约40 mW。
- 在MATLAB（或其他控制显微镜的扫描软件）中打开 ScanImage ，然后单击标有 FOCUS 的按钮开始扫描。
注意：激光束将通过样品进行光栅扫描以生成图像。光电二极管输出的低频信号（<100 kHz）直接发送到数据采集卡的通道1（称为直流通道）。光电二极管的高频输出（>100 kHz）被送入锁相放大器，锁相放大器信号的X输出被送入数据采集卡的通道2（称为交流通道）。 - 在电流扫描器之前调整转向镜，使直流信号在通道1显示屏上居中。移动电动延迟级，并密切观察通道2（即交流通道）显示屏上显示的锁相输出。
注：当泵和斯托克斯在时间上重合时，交流通道上将显示一个信号。调整交流通道的色阶以显示较小的强度变化是有帮助的。 - 通过微调时延，最大限度地提高交流信号强度。调整二向色镜以将 SRS 信号居中放在交流通道上（同时保持直流通道居中）。调整锁相放大器的相位，使信号最大化。有关满意的信号，请参见 图 3 。
3. 光谱分辨率优化
注意：到达样品的泵和斯托克斯光束应具有相同量的群延迟色散（GDD），以最大限度地提高光谱分辨率。色散在很大程度上取决于实验设置。这里描述的实验装置分别利用1，040 nm和800 nm的飞秒脉冲作为斯托克斯和泵。使用致密的燧石玻璃棒（H-ZF52A）作为脉冲拉伸介质。
- 将48厘米的高色散玻璃棒（H-ZF52A或等效的致密燧石玻璃）插入800 nm光束路径中。使用等式 （1） 估计 GDD：
（1）
注：不同波长的各种玻璃材料的GVD可以从折射率数据库资源中找到。例如，H-ZF52A 在 800 nm 时的 GVD 为 220.40 fs2/mm。总 GDD 为 105792fs 2。 - 计算需要多少厘米的色散玻璃棒才能添加到1，040 nm光束路径中以匹配泵的GDD。将适当长度的色散玻璃棒插入1，040 nm光束路径，以大致匹配800 nm光束的GDD。请注意，添加玻璃棒会改变两个光束的时间重叠，可能需要调整延迟。
- 校准光谱分辨率
- 用DMSO制作显微镜载玻片样品。将载玻片放在显微镜上，并检查从显微镜聚光镜发出的光束的功率。相应地调整功率，使其在采样焦点下每个具有约40 mW。
- 从 MATLAB 打开 ScanImage 。通过扫描延迟级找到最大的SRS信号，延迟级对应于DMSO的2，913 cm-1 拉曼峰。根据前一级位置估计载物台位置，由于插入棒而增加光程长度。重新对齐光束空间重叠，因为添加玻璃棒时光束的偏差很小。
- 通过在移动电动载物台的同时按顺序拍摄一系列SRS图像来保存高光谱SRS扫描。
注意：延迟扫描范围涵盖两个拉曼峰，分别对应于DMSO的2，913 cm-1 和2，994 cm-1 拉曼峰。当使用800 nm泵浦和1，040 nm Stokes激光器时，观察到这两种跃迁。 - 使用ImageJ或MATLAB绘制出DMSO解决方案的SRS光谱。将大型 DMSO 2，913 cm-1 峰拟合到 MATLAB 中的高斯或洛伦兹函数，以计算峰的半极全宽 （FWHM）。
注：代表性结果如图 4所示。如果只存在一个宽峰，则意味着光谱分辨率太差而无法区分两个峰，并且需要更多的玻璃棒，或者扫描的范围太小而无法检测到第二个峰。通常，当使用长度为>60 cm的玻璃棒时，可接受的光谱分辨率DMSO约为20-25 cm-1 。较低的分辨率通常用于组织成像，以较短的脉冲17换取较高的信号。
- （可选）使用自相关器或FROG（频率分辨光学门控）来确定每个臂的脉冲持续时间，以精确计算GDD的量和匹配泵和斯托克斯之间的GDD所需的杆的长度。
- 对斯托克斯光束上不同长度的棒重复步骤3.3.2-3.3.4，以找到最佳光谱分辨率，这意味着已通过实验找到了最佳的GDD匹配。使用多组长度不同的玻璃棒，以达到最佳的光谱分辨率。
（1）4. 信噪比 （SNR） 表征
- 确保在完成空间和时间对齐后执行步骤 4.2。
- 获取与DMSO的2，913 cm-1 拉曼峰相对应的SRS图像。在 ImageJ 中打开图像，然后选择帧中心的一个小区域。使用 测量 函数可以计算所选区域中值的均值和标准差。
- 将所选区域的平均值除以标准差以找到 SNR 值，如方程式 （2） 所示。
（二）
注：对于双臂，在对焦时使用 DMSO 时，系统的良好 SNR（锁定时间常数为 4 μs）为 40 mw/40 mw，>800。如果数据采集卡的位深度有限，则可以使用较低浓度的DMSO或较低的功率来更准确地估计SNR。 - 如果SNR太低，请重新对准激光脉冲以优化空间重叠、时间重叠、光束尺寸/准直匹配和/或色散匹配。对于具有像差校正环的物镜，通过调整校正环来优化信号。
（二）5. 频率轴校准
注：执行此步骤是为了将延迟级位置与扫描的拉曼过渡相关联。需要仔细选择溶剂才能产生合适的“拉曼标尺”。DMSO是CH键的有效溶剂，因为它在2，913 cm-1 和2，994 cm-1处有两个尖锐的拉曼峰。
- 保存延迟级范围覆盖DMSO的2，913 cm-1 和2，994 cm-1 拉曼峰的高光谱扫描。保存与高光谱数据集对应的载物台位置。
注意：光谱的全局最大峰对应于DMSO 2，913 cm-1 拉曼位移，第二个最大峰对应于DMSO 2，994 cm-1 拉曼位移。 - 对载物台位置和拉曼位移在2，913 cm-1 和2，994 cm-1处执行线性回归。使用将载物台位置与拉曼位移相关联的线性回归方程，将延迟位置转换为相应的拉曼频率。
6. 正交调制和双色成像
注意：只有在需要实时双色成像时，才需要正交调制步骤。该方案的原理图如图 5所示。正交调制使用一对以激光频率的四分之一（80 MHz激光器为20 MHz）驱动的EOM，两者之间相移为90°。对于单色SRS成像或高光谱SRS成像，可以跳过此正交调制步骤。
- EOM1 调制
- 在第一个 EOM 之后，将 PBS （PBS2）、四分之一波板 （QWP2） 和第二个 EOM （EOM2） 安装到斯托克斯波束路径中。拔下 EOM2 的信号输入。将信号输入插入 EOM1 并将其打开。
- 通过将斯托克斯光束（固定在1，040 nm）调制为20 MHz（f0/4）的斯托克斯光束，方法是将光束发送到第一个EOM。调整EOM1的倾斜度和位置，以确保光束通过EOM晶体直射并居中。
- 通过观察使用两个光电二极管从PBS1流出的两个偏振并在示波器上显示调制，来监控调制深度。
- 调整20 MHz输入的QWP1、EOM1电压和相位（使用移相器），以优化发射光束的调制深度，使其接近100%。有关良好调制深度的说明，请参见 图2B 。
- EOM2 调制
- 拔下 EOM1 并插入 EOM2。
- 将第二个放大器的20 MHz高压输出发送到EOM2。调整EOM2的倾斜度和位置，以确保光束通过EOM晶体直射并居中。
- 再次，通过用示波器观察PBS2发出的两个偏振来监测调制深度。根据需要调整 QWP2、EOM2 电压和移相器，以实现两个极化的接近 100% 的调制。
- 确保脉冲序列调制与第一次调制相比相移为 90°。
注：如果两个泵脉冲序列不是90°正交的，则两个通道之间的串扰将是一个问题。 - 通过打开并插入 EOM1 和 EOM2 来测试调制的正交性。用示波器监测PBS2分裂的两个偏振。如果第二个PBS之后的脉冲序列与 图2C不同，则分别重新优化EOM1和EOM2。
- 在 EOM2 的下游安装一个 20 mm 双折射石英晶体 （BRC） 和 HWP。同时插入两个 EOM 并监控脉冲序列，使其类似于 图 2D。
注意：对于本实验中使用的啁啾声，20 mm BRC诱导的时间延迟对应于80 cm-1 拉曼位移。如果使用不同的啁啾声，则可能需要不同的 BRC 长度。
- 校准
- 通过检测来自锁相放大器 X 和 Y 通道输出（发送到数据采集卡的通道 2 和 3）的信号，使用 DMSO 校准系统。
- 检查锁相放大器上由较快偏振产生的2，913 cm-1 峰值和较慢偏振产生的信号是否接近90°异相。如果不是这种情况，请调整 EOM 对齐方式，直到两个信号接近 90° 异相。
- 校准完成后，找到在2，930 cm-1 处探测其中一个正交束的蛋白质转变的延迟位置。确保另一个极化探头的脂质跃迁为2，850 cm-1。
7. 外延模式 SRS 成像
注意：在透射模式成像方案中，物镜将激光聚焦到样品中，然后聚光透镜将透射光束引导至光电二极管进行锁相检测。在外延模式成像方案中，由样品反向散射和去极化的光被聚焦物镜重新收集并使用偏振分束器进行隔离。隔离和反向散射光子通过一对中继透镜发送到光电二极管，以进行锁相检测。 图6 描述了外延模式成像方案。
- 在光束进入显微镜之前安装HWP，以改变进入显微镜的光束的偏振。将PBS放在物镜上方，使去极化的背反射光束到达探测器。
- 使用一对由75 mm消色差透镜和30 mm非球面透镜组成的透镜，将背向散射光子从物镜的后孔径传递到光电探测器。安装探测器以收集PBS指示的反向散射光。安装滤波器以阻止调制光束进入探测器。
- 将组织样品置于物镜下方。由于外延模式成像不需要聚光镜，因此如果需要更多空间，请将其移除。
- 成像
- 用百叶窗阻挡光束;将白光源从侧面照射到样品上;并使用明场来找到客观焦点。
- 解锁两个光束，并使用预校准的延迟位置从锁相放大器的两个输出从组织中获取脂质和蛋白质SRS图像。
- 调整锁相增益和像素箱位因子，以获得高质量的图像。
8. 假色染色
- 使用 ImageJ 打开图像堆栈。
- 通过右键单击图像并单击“复制”，提取对应于脂质（2，850 cm-1）和蛋白质（2，930 cm-1）物种的两个图像。
- 将脂质图像重命名为 脂质 ，将蛋白质图像重命名为 蛋白质。
- 转到 流程|图像计算器 并执行 蛋白质 减去 脂质。
- 通过转到图像|来合并 图像颜色|合并通道，将 脂质 设置为 绿色 ， 将蛋白质 设置为 蓝色。打开 图像通道 工具（图像|颜色|通道工具）并调整亮度和对比度（图像|调整|亮度/对比度）。
- 使用 通道工具调整 每个通道的亮度和对比度。对于脂质通道，调整对比度，直到细胞特征变暗。对于蛋白质通道，调整对比度，直到细胞特征显示为蓝色。通过转到“图像|将合并的通道绿色/蓝色图像转换为 RGB 图像类型 |RGB 颜色。通过文件|导出此图像 另存为|蒂夫。
注意：对于假H&E染色，配色方案显示粉红色细胞质，而细胞核为深蓝紫色。 - 从 材料表中的假H&E染色脚本资源下载HE.m MATLAB脚本。
- 在 MATLAB 中运行 HE.m 脚本。从上一步中选择导出的RGB图像，以生成人为的H&E染色图像。
- （可选）归一化大视场成像的图像强度，因为图像在外围看起来比在中心更暗。
- 要对图像执行场归一化，请对尽可能多的图像求平均值。然后，使用 ImageJ（处理|过滤器|高斯模糊|半径 = 50）。
- 测量模糊图像的最大强度 （Ctrl+M）。将模糊图像除以最大强度（处理|数学|除法）。将原始 SRS 图像除以模糊图像（处理|图像|计算器）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
优化光谱分辨率：
通过材料的色散受色散介质（长度和材料）和波长的影响。改变色散棒长度会影响光谱分辨率和信号尺寸。这是一种给予和接受的关系，可以根据应用的不同而进行不同的权衡。视杆将光束脉冲从频率宽、时间窄到频率窄、时间宽拉伸。 图7 显示了改变棒长度对光谱分辨率的影响。 图7A 显示光谱分辨率非常差;这种设置没有玻璃啁啾棒，DMSO的两个拉曼峰根本没有分辨。在 图7B，C中，玻璃啁啾棒数量的增加开始解析两个峰值。最后， 图7D 显示了匹配的啁啾声如何解析两个峰值，并可用于根据频率校准载物台位置。
使用 DMSO 进行校准：
DMSO在2，913和2，994 cm-1 处有两个尖锐的拉曼峰，便于在C-H区域进行校准。从高光谱SRS扫描获得DMSO频谱后，简单的线性回归将载物台位置转换为拉曼位移。如果光谱分辨率较差（如图 7A所示），并且两个峰不可分离，则无法使用线性回归进行校准。在这种情况下，通过添加或移除玻璃棒需要更好的色散匹配。寻找用于校准的DMSO信号最常见的困难是由于两个光束的时间重叠或空间重叠中的错误。在尝试DMSO校准之前，请重复空间和时间对齐步骤以优化SRS信号。
双色 DMSO：
在双色SRS中，两个泵脉冲序列以正交极化产生，具有固定的时间延迟（由于双折射晶体）。调制深度和90°相移的评估是通过光电二极管和DMSO SRS信号完成的。 图8 显示了可接受的调制深度和时间分离。虽然 图8 中DMSO的光谱分辨率并不理想，但在组织成像实验中经常牺牲它，以获得具有较短脉冲的更高信号。 图9 显示了产生反转或负峰值的不良相移。
外延模式下小鼠脑组织的双色SRS：
Epi-mode（检测反向散射光子）SRS用于成像厚组织（>1 mm）。图10A，B显示了在2，850 cm-1和2，930 cm-1的离体小鼠脑组织处的实时双色SRS成像。将来自脂质和蛋白质通道的原始图像（图10A，B）进行颜色编码以产生描绘脂质和蛋白质贡献的单个图像（图10C）。在图10C上进行假H&E染色（图10D）以模拟H&E染色。成像质量差可能是成像深度大或校准（频率轴或调制深度）差的结果。脑组织中的典型成像深度为100-200μm13。
图1：单色SRS成像设置示意图。 在透射模式下构建光谱聚焦SRS显微镜。X 和 Y 表示正交输出。缩写：SRS =受激拉曼散射;DL = 基于反光镜的延迟块;Div = 除法器;FB = 扇出缓冲区;AT = 衰减器;PS = 移相器;PA = 功率放大器;DCM = 二向色镜;GM = 镀锌镜;EOM = 电光调制器;POM = 拾取镜;PBS = 偏振分束器， BRC = 双折射晶体;QWP = 四分之一波片;HWP：半波片;PD = 光电二极管;GR = 玻璃棒;BB = 光束块;SPF = 短通滤波器;CL = 准直透镜;BS = 光束尺寸变化镜头。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：代表性的时间重叠。（A） 泵和斯托克斯光束在示波器上显示为时间重叠。示波器光标用于标记泵和斯托克斯光束的时间位置。这种重叠作为进一步调整具有延迟阶段的时间重叠的起点是令人满意的。（B） 在 20 MHz 时一个 EOM 的代表性调制深度令人满意。（C） 在使用两个 EOM 时，脉冲调制令人满意。（D）双折射石英晶体和半波片安装在双调制斯托克斯臂上后，脉冲序列调制令人满意。缩写：EOM = 电光调制器。请点击此处查看此图的大图。
图 3：代表性 SRS 和泵信号。 （A） 在直流通道中检测到泵信号未对准。（B） 光电二极管检测到的SRS信号未对准。（C）直流通道中令人满意的、居中的泵信号。（D） 以交流信道为中心的令人满意的SRS信号。缩写：SRS = 受激拉曼散射。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：光谱分辨率表征。 高斯函数与2，913 cm-1 拉曼DMSO峰拟合。计算出的FWHM给出了该系统的15 cm-1 分辨率。简称：DMSO=二甲基亚砜;FWHM = 半最大值处的全宽。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：双色 SRS 成像设置示意图。 在透射模式下构建双色SRS显微镜。X 和 Y 表示正交输出。缩写：DL =基于反光镜的延迟线;Div = 除法器;FB = 扇出缓冲区;AT = 衰减器;PS = 移相器;PA = 功率放大器;DCM = 二向色镜;GM = 镀锌镜;EOM = 电光调制器;PBS = 偏振分束器;BRC = 双折射晶体;QWP = 四分之一波片;HWP = 半波片;PD = 光电二极管;GR = 玻璃棒;BB = 光束块，SPF = 短通滤波器;CL = 准直透镜;POM = 拾取镜;BS = 光束尺寸变化镜头。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：双色 SRS 成像 Epi 模式设置示意图。 在外显模式下构建双色SRS显微镜。X 和 Y 表示正交输出。缩写：DL =基于反光镜的延迟线;Div = 除法器;FB = 扇出缓冲区;AT = 衰减器;PS = 移相器;PA = 功率放大器;DCM = 二向色镜;GM = 镀锌镜;EOM = 电光调制器;PBS = 偏振分束器;BRC = 双折射晶体;QWP = 四分之一波片;HWP = 半波片;PD = 光电二极管;GR = 玻璃棒;BB = 波束，BPF = 带通滤波器;CL = 准直透镜;POM = 拾取镜;BS = 光束尺寸变化镜头。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：使用 25% 的 DMSO 优化光谱分辨率。 （A） 使用零玻璃啁啾棒获得 DMSO 光谱。两个峰值未解决。（B）使用了玻璃啁啾棒，泵臂上为20厘米，斯托克斯臂为24厘米。两个峰值开始被解析到一个令人满意的点。（C）使用40 cm长的泵和24 cm长的Stokes的啁啾棒，以获得更好的分辨DMSO光谱。（D）使用64厘米长的泵和60厘米长的斯托克斯的啁啾棒，以获得更高的光谱分辨率。简称：DMSO=二甲基亚砜。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：双色 SRS，不同的偏振和时间延迟。 两个正交偏振（s&p）的延时脉冲序列用于对DMSO光谱进行成像，以显示SRS激励之间的时间延迟（和拉曼频率差）。简称：DMSO=二甲基亚砜;SRS = 受激拉曼散射。 请点击此处查看此图的大图。
图 9：由较差的双色 SRS 相移引起的 SRS 光谱。 在48级位置附近出现负的2，994 cm-1 峰表明相位差较差。缩写：SRS = 受激拉曼散射。 请点击此处查看此图的大图。
图10：生成SRS图像的假双色H&E染色。（A）来自小鼠脑组织在2，930 cm-1 过渡处的原始蛋白质SRS图像。（B）来自小鼠脑组织在2，850 cm-1 过渡处的原始脂质SRS图像。（C）来自 A 和 B 的合并和颜色编码通道，其中脂质贡献为绿色，蛋白质贡献为蓝色。（D）在 C 上进行错误的H&E重新着色，以模仿H&E染色用于病理学应用。比例尺 = 50 μm。缩写：SRS =受激拉曼散射;H&E = 苏木精和曙红。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该协议中介绍的双色SRS成像方案取决于单色SRS成像的正确实施。在单色SRS成像中，关键步骤是空间对准、时间对准、调制深度和相移。在空间上，两个光束的组合是通过二向色镜完成的。在将光束发送到二向色镜时，使用几个转向镜进行微调。一旦光束与二向色镜组合，就可以通过用镜子选择组合光束路径以发送到>1 m外的墙壁来确认空间对齐，同时检查组合光束以查看它是否与IR卡重叠。通过显微镜进行空间对准后，通过使用基于反光镜的延迟级调整路径长度来执行时间重叠，这具有保持空间对齐的优点。1，040 nm臂是该协议中的延迟光束。如果延迟级不具有导致两个光束在时间上重叠的范围，则不可能进行时间重叠。在这种情况下，可能需要将整个延迟阶段移动到其他位置，以确保时间重叠接近延迟扫描的中间范围。例如，如果两个光束之间的时间差测量为6 ns，则需要1.8 m的调整。所需的调整表示较快光束的光束路径伸长长度或较慢光束的光束路径缩短。
除了对准之外，斯托克斯光束的光束尺寸匹配和调制对于最大化SRS信号也很重要。理想情况下，两个光束都应在物镜平面上准直，并与物镜后孔径的大小相匹配。如果物镜平面暴露给用户，则检查准直和光束尺寸非常有用。如果光束正在收敛或发散，则需要调整准直透镜对的第二透镜以实现准直（协议步骤1.1）。同样，如果物镜后孔的光束尺寸太小，则需要使用具有高放大倍率的镜头对（协议步骤1.2）。SRS与斯托克斯光束的调制深度线性缩放。必须确保谷值处的脉冲高度<示波器峰值处脉冲高度的 10%。斯托克斯光束调制不良直接转化为较差的SNR。
当使用飞秒激光器进行SRS成像时，需要光谱聚焦将泵浦和斯托克斯之间的时间延迟转换为拉曼频移。转换因子取决于应用的啁啾量。匹配泵和斯托克斯的GDD以实现最佳光谱分辨率至关重要。GDD可以根据所用分散材料的长度及其GVD进行估算。例如，SF11 致密燧石玻璃棒在 1，040 nm 时的 GVD 为123.270 fs 2/mm，在 800 nm 时为 187.486 fs2/mm。对于 800 nm 光束路径中 240 mm 的 SF11，GDD 为 240 mm × 187.486 fs2/mm = 45，000 fs2。对于 1，040 nm 光束路径中 240 mm 的 SF11，GDD 为 240 mm × 123.270 fs2/mm = 30，000 fs2。此示例计算意味着应在 1，040 nm 臂上添加额外的玻璃棒，或者应从 800 nm 臂上移除玻璃棒以匹配 GDD。为了实现更高的光谱分辨率，需要更大的GDD，这意味着更长的棒。然而，在计算GDD时，EOM的贡献和目标被忽视了。GDD的实际匹配是通过在泵或斯托克斯上找到给定杆长度的最佳光谱分辨率通过实验确定的。计算是一个很好的开始步骤。通过迭代添加和去除玻璃棒进行实验优化对于优化光谱分辨率仍然是必要的。
重要的是要认识到，大啁啾声提供更高的光谱分辨率，但以牺牲信号强度为代价。较小的啁啾声和较短的脉冲有利于C-H区域的组织成像，因为蛋白质和脂质拉曼峰很宽。较低的光谱分辨率可以换取较高的SRS信号（或更快的成像速度），而不会牺牲双色组织对比度17。在需要高光谱分辨率的其他应用中，特别是在指纹区域，有必要使用长玻璃棒施加更大的啁啾声。或者，使用光栅担架获得更长的脉冲（脉冲持续时间超过3 ps）可能更容易。然而，所用商用激光器的一个主要限制是其光谱带宽。光谱聚焦SRS的光谱覆盖范围取决于激发激光器的带宽。所使用的激光系统的光谱覆盖范围通常约为200-250 cm-1。这勉强足以覆盖C-H区域。通常需要更大的光谱覆盖范围来解析指纹区域成像的化学物质。这个问题可以通过光纤激光器插件来解决，该附加组件将斯托克斯激光器的带宽从6 nm扩大到60 nm18。双色SRS成像技术的另一个重要限制是仅监视两个过渡。这种方法不适用于具有许多重叠的拉曼峰或多个物种的复杂样品。
实时双色SRS成像方法通过消除对激光或延迟调谐的需求，提供高速组织成像。然而，由于在两种 EOM 实现近乎完美的调制深度方面存在挑战，因此很难设置。最好独立优化 EOM1 和 EOM2。如果 EOM1 处于打开状态，则必须拔下 EOM2， 反之亦然。一旦两个调制都优化到近乎完美（>95%调制深度），两个 EOM 连接以实现正交调制。两个正交脉冲序列之间的时间延迟长度取决于 BRC 的长度和啁啾声。这种调制方法对于临床应用来说并不立即可行，因为需要复杂的电子设备来提供两个具有可调相移的RF脉冲序列来驱动两个EOM。EOM的对准也需要接近完美，以确保两个通道之间的高传输，良好的调制和正交性。该技术通常适用于由于运动或样品变化而需要对两个拉曼峰进行快速、同步成像的其他应用。示例包括水温测量或跟踪移动物体如脂滴或细胞器11、19。
未来的临床应用需要一个强大的光纤激光器4.该协议描述的方法也可以扩展，以提高采集速度，达到视频速率，这对于在合理时间内扫描大型组织标本非常重要。如果成像时间或运动伪影不是问题，则可以通过逐帧移动电动延迟级来按顺序获取蛋白质和脂质SRS图像。另一种实时的双色SRS成像方法是双相方案，它回收斯托克斯光束以提供相同的两个正交通道20。然而，双相方案的实施需要涉及三个光束的额外对准。它还需要匹配光束尺寸和三个激光束的发散。改进这两种技术以克服同时双色限制的潜在途径是结合快速可调光纤激光器来探测特定的光谱区域21。图像的处理与协议中概述的相同，以生成模拟的H&E图像。
最后，该协议演示了外延模式SRS成像。与薄组织切片的透射模式成像相比，它通常生成较低质量的图像，因为到达检测器13的泵浦功率较低。对于厚组织成像（>1-2 mm）或高散射的样品（例如骨组织），外延模式成像可以比透射模式成像表现得更好。当对新鲜组织如脑组织进行成像时，SRS成像深度通常限制在200-300μm。对于固定组织，散射更强，成像深度为100-200μm。通过更高的功率、像差校正或光学清除 22，23 可实现更深的成像。然而，外延模式成像是组织诊断的首选方法，因为它不需要任何组织切片，并且没有高NA聚光镜的对准更简单。未来的组织诊断应用将受益于对完整手术标本的快速、大面积成像，然后是基于机器学习/深度学习的诊断。这里介绍的方案也适用于体内应用，例如脑成像或皮肤成像，其中外延模式成像是唯一的选择，高速成像对于避免运动伪影非常重要。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了NIH R35 GM133435至D.F.的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-100-B | Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm |
| 20 MHz bandpass filter | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω |
| 200 mm Achromatic Lens | THORLABS | AC254-200-B | Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm |
| Achromatic Half Waveplate | Union Optic | WPA2210-650-1100-M25.4 | Broadband half waveplate |
| Achromatic Quarter Waveplate | Union Optic | WPA4210-650-1100-M25.4 | Broadband quarter waveplate |
| Beam Sampler | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plate Beamsplitter |
| Dichroic Mirror | THORLABS | DMSP1000 | Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used. |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | 472301 | Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used. |
| Electrooptic Amplitude Modulator | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used. |
| False H&E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in |
| Fast Photodiode | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Rise Time |
| Frequency Divider | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output. |
| Highly Dispersive Glass Rods | Union Optic | CYLROD01 | High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. | |
| Lock-in Amplifier | Liquid Instruments | Moku Lab | Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well. |
| Mirrors | THORLABS | BB05-E03-10 | Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used. |
| Motorized Delay Stage | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work. |
| Oil Immersion Condensor | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used. |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS7054 | Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work. |
| Phase Shifter | SigaTek | SF50A2 | For shifting the phase of the modulation frequency |
| Photodiode | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used. |
| Polarizing Beam Splitter | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Broadband polarizing beamsplitter |
| Refactive Index Database | refractiveindex.info | ||
| Retro-reflector | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used. |
| RF Power Amplifier | Minicircuits | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω |
| Scan Mirrors | Cambridge Technologies | 6215H | We used a 5mm mirror set with silver coating |
| ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Laser scanning microscope control software |
| Shortpass Filter | THORLABS | FESH1000 | 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary. |
| Upright Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope. |
| Water Immersion Objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used. |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
- Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).
- Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
- Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
- Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).
- Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).
- Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
- Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
- Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
- Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
- Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
- Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
- Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
- Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).
- Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).
- Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
- Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
- He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
- Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
- Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
- Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).
