Echtzeit-, zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung des Mausgehirns für die Gewebediagnose

Summary

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine leistungsstarke, zerstörungsfreie und markierungsfreie Bildgebungstechnik. Eine aufkommende Anwendung ist die stimulierte Raman-Histologie, bei der die zweifarbige SRS-Bildgebung an den Protein- und Lipid-Raman-Übergängen verwendet wird, um Pseudo-Hämatoxylin- und Eosin-Bilder zu erzeugen. Hier demonstrieren wir ein Protokoll für die zweifarbige SRS-Bildgebung in Echtzeit für die Gewebediagnose.

Abstract

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) hat sich zu einem leistungsstarken optischen Bildgebungsverfahren für die Gewebediagnose entwickelt. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass zweifarbiges SRS in der Lage ist, Hämatoxylin und Eosin (H & E) -äquivalente Bilder zu liefern, die eine schnelle und zuverlässige Diagnose von Hirntumoren ermöglichen. Diese Fähigkeit hat aufregende intraoperative Krebsdiagnoseanwendungen ermöglicht. Die zweifarbige SRS-Bildgebung von Gewebe kann entweder mit einer Pikosekunden- oder Femtosekunden-Laserquelle durchgeführt werden. Femtosekundenlaser haben den Vorteil, dass sie flexible Bildgebungsmodi ermöglichen, einschließlich schneller hyperspektraler Bildgebung und zweifarbiger SRS-Bildgebung in Echtzeit. Ein spektraler Fokussierungsansatz mit chirped Laserpulsen wird typischerweise mit Femtosekundenlasern verwendet, um eine hohe spektrale Auflösung zu erreichen.

Die Zwei-Farben-SRS-Erfassung kann mit orthogonaler Modulation und Lock-in-Erkennung realisiert werden. Die Komplexität des Pulschirpens, der Modulation und der Charakterisierung ist ein Engpass für die weit verbreitete Einführung dieser Methode. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll, um die Implementierung und Optimierung von spektral fokussierendem SRS und der zweifarbigen Echtzeitbildgebung von Hirngewebe der Maus im Epi-Modus zu demonstrieren. Dieses Protokoll kann für eine breite Palette von SRS-Bildgebungsanwendungen verwendet werden, die die Hochgeschwindigkeits- und spektroskopische Bildgebungsfähigkeit von SRS nutzen.

Introduction

Die traditionelle Gewebediagnostik stützt sich auf Färbeprotokolle, gefolgt von einer Untersuchung unter einem optischen Mikroskop. Eine gängige Färbemethode, die von Pathologen verwendet wird, ist die H & E-Färbung: Hämatoxylin färbt Zellkerne in einem violetten Blau und Eosin färbt die extrazelluläre Matrix und das Zytoplasma rosa. Diese einfache Färbung bleibt der Goldstandard in der Pathologie für viele Aufgaben der Gewebediagnose, insbesondere für die Krebsdiagnose. Die H & E-Histopathologie, insbesondere die gefrorene Schnitttechnik, die in einer intraoperativen Umgebung verwendet wird, hat jedoch immer noch Einschränkungen. Das Färbeverfahren ist ein mühsamer Prozess, bei dem Gewebe eingebettet, geschnitten, fixiert und gefärbt^{wird 1}. Die typische Bearbeitungszeit beträgt 20 Minuten oder länger. Die Durchführung von H&E während des gefrorenen Abschnitts kann manchmal schwieriger werden, wenn mehrere Abschnitte gleichzeitig verarbeitet werden, da zelluläre Merkmale oder Wachstumsmuster in 3D zur Margenbewertung bewertet werden müssen. Darüber hinaus erfordern intraoperative histologische Techniken qualifizierte Techniker und Kliniker. Die Begrenzung der Anzahl der Board-zertifizierten Pathologen in vielen Krankenhäusern ist in vielen Fällen eine Einschränkung für die intraoperative Konsultation. Solche Einschränkungen können durch die schnellen Entwicklungsinteressen in der digitalen Pathologie und der auf künstlicher Intelligenz basierenden Diagnose^{gemildert werden 2}. Die H&E-Färbeergebnisse sind jedoch je nach Erfahrung des Technikers variabel, was zusätzliche Herausforderungen für die computergestützte Diagnose^{darstellt 2}.

Diese Herausforderungen können potenziell mit markierungsfreien optischen Bildgebungsverfahren angegangen werden. Eine solche Technik ist die SRS-Mikroskopie. SRS verwendet synchronisierte gepulste Laser – Pumpe und Stokes – um molekulare Schwingungen mit hoher Effizienz^{anzuregen 3}. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass die SRS-Bildgebung von Proteinen und Lipiden H & E-äquivalente Bilder (auch bekannt als stimulierte Raman-Histologie oder SRH) mit intaktem frischem Gewebe erzeugen kann, was die Notwendigkeit einer Gewebeverarbeitung umgeht, die für die Diagnose erforderliche Zeit signifikant verkürzt und intraoperativ angepasst^{wurde 4}. Darüber hinaus kann die SRS-Bildgebung 3D-Bilder liefern, was zusätzliche Informationen für die Diagnose bietet, wenn 2D-Bilder unzureichend sind⁵. SRH ist unvoreingenommen und generiert digitale Bilder, die für die computergestützte Diagnose leicht verfügbar sind. Es stellt sich schnell als mögliche Lösung für die intraoperative Krebsdiagnose und Tumorrandanalyse heraus, insbesondere bei Hirntumoren ^6,7,8. In jüngerer Zeit wurde auch vorgeschlagen, dass die SRS-Bildgebung chemischer Veränderungen des Gewebes nützliche diagnostische Informationen liefert, die Klinikern bei der Stratifizierung verschiedener Krebsarten oder -stadien⁹ helfen können.

Trotz ihres enormen Potenzials in der Gewebediagnose ist die SRS-Bildgebung aufgrund der Komplexität, die mit der Bildgebungsplattform verbunden ist, die ultraschnelle Laser, das Laserscanning-Mikroskop und anspruchsvolle Detektionselektronik umfasst, meist auf akademische Labors beschränkt, die auf Optik spezialisiert sind. Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Workflow, um die Verwendung einer gemeinsamen Femtosekunden-Laserquelle für die zweifarbige Echtzeit-SRS-Bildgebung und die Erzeugung von Pseudo-H & E-Bildern aus dem Hirngewebe der Maus zu demonstrieren. Das Protokoll deckt die folgenden Verfahren ab:

Ausrichtungs- und Chirp-Optimierung
Die meisten SRS-Bildgebungsschemata verwenden entweder Pikosekunden- oder Femtosekundenlaser als Anregungsquelle. Bei Femtosekundenlasern ist die Bandbreite des Lasers viel größer als die Raman-Linienbreite. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird ein spektraler Fokussierungsansatz verwendet, um die Femtosekundenlaser auf eine Pikosekunden-Zeitskala zu chirpen, um eine enge spektrale Auflösung¹⁰ zu erreichen. Eine optimale spektrale Auflösung wird nur erreicht, wenn das zeitliche Zwitschern (auch bekannt als Gruppenverzögerungsdispersion oder nur Dispersion) für die Pumpe und die Stokes-Laser richtig abgestimmt ist. Hier werden das Ausrichtungsverfahren und die notwendigen Schritte zur Optimierung der Dispergierung der Laserstrahlen mit hochdispersiven Glasstäben demonstriert.

Frequenzkalibrierung
Ein Vorteil der spektralen Fokussierung SRS besteht darin, dass die Raman-Anregung schnell abgestimmt werden kann, indem die Zeitverzögerung zwischen der Pumpe und den Stokes-Lasern geändert wird. Eine solche Abstimmung ermöglicht eine schnelle Bildgebung und zuverlässige spektrale Erfassung im Vergleich zur Abstimmung von Laserwellenlängen. Die lineare Beziehung zwischen Anregungsfrequenz und Zeitverzögerung erfordert jedoch eine externe Kalibrierung. Organische Lösungsmittel mit bekannten Raman-Peaks werden verwendet, um die Raman-Frequenz für die spektrale Fokussierung von SRS zu kalibrieren.

Zweifarbige Echtzeit-Bildgebung
Es ist wichtig, die Bildgebungsgeschwindigkeit in Gewebediagnoseanwendungen zu erhöhen, um die Zeit für die Analyse großer Gewebeproben zu verkürzen. Durch die gleichzeitige zweifarbige SRS-Bildgebung von Lipiden und Proteinen entfällt die Notwendigkeit, den Laser oder die Zeitverzögerung abzustimmen, was die Bildgebungsgeschwindigkeit um mehr als das Doppelte erhöht. Dies wird durch die Verwendung einer neuartigen orthogonalen Modulationstechnik und einer zweikanaligen Demodulation mit einem Lock-in-Verstärker¹¹ erreicht. Dieses Papier beschreibt das Protokoll für orthogonale Modulation und zweikanalige Bildaufnahme.

Epi-Mode-SRS-Bildgebung
Der Großteil der bisher gezeigten SRS-Bildgebung wird im Übertragungsmodus durchgeführt. Die Epimode-Bildgebung erkennt rückgestreute Photonen aus Gewebe¹². Für pathologische Anwendungen können chirurgische Proben ziemlich groß sein. Für die Bildgebung im Übertragungsmodus ist häufig eine Gewebeschnittaufnahme erforderlich, die unerwünschterweise zusätzliche Zeit in Anspruch nimmt. Im Gegensatz dazu kann die Epimode-Bildgebung mit intakten chirurgischen Proben arbeiten. Da das gleiche Ziel verwendet wird, um rückgestreutes Licht zu sammeln, ist es auch nicht erforderlich, einen Kondensator mit hoher numerischer Apertur, der für die Transmissionsbildgebung erforderlich ist, auszurichten. Der Epi-Modus ist auch die einzige Option, wenn der Gewebeschnitt schwierig ist, z. B. bei Knochen. Zuvor haben wir gezeigt, dass die Epimode-Bildgebung für Hirngewebe eine überlegene Bildgebungsqualität für die Gewebedicke > 2 mm¹³ bietet. Dieses Protokoll verwendet einen polarisierenden Strahlteiler (PBS), um gestreute Photonen zu sammeln, die durch Gewebe depolarisiert sind. Es ist möglich, mehr Photonen mit einem ringförmigen Detektor auf Kosten der Komplexität der kundenspezifischen Detektorbaugruppe^{zu sammeln 12}. Der PBS-Ansatz ist einfacher zu implementieren (ähnlich wie bei der Fluoreszenz), wobei die Standard-Fotodiode bereits für die Transmissionsmodusdetektion verwendet wird.

Pseudo-H&E-Bildgenerierung
Sobald zweifarbige SRS-Bilder gesammelt wurden, können sie neu eingefärbt werden, um H & E-Färbungen zu simulieren. Dieses Papier demonstriert das Verfahren zur Umwandlung von Lipid- und Protein-SRS-Bildern in Pseudo-H & E SRS-Bilder für pathologische Anwendungen. Das experimentelle Protokoll beschreibt kritische Schritte, die erforderlich sind, um qualitativ hochwertige SRS-Bilder zu erzeugen. Das hier gezeigte Verfahren ist nicht nur für die Gewebediagnostik anwendbar, sondern kann auch für viele andere hyperspektrale SRS-Bildgebungsanwendungen wie Arzneimittelbildgebung und metabolische Bildgebung^{angepasst werden 14,15}.

Allgemeine Systemanforderungen
Das Lasersystem für dieses Protokoll muss in der Lage sein, 2 synchronisierte Femtosekunden-Laserstrahlen auszugeben. Die Systeme verfügen idealerweise über einen optischen parametrischen Oszillator (OPO) zur Breitwellenlängenabstimmung eines der Laserstrahlen. Der Aufbau in diesem Protokoll verwendet ein kommerzielles Lasersystem Insight DS+, das zwei Laser (einen festen Strahl bei 1.040 nm und einen OPO-basierten abstimmbaren Strahl im Bereich von 680 bis 1.300 nm) mit einer Wiederholrate von 80 MHz ausgibt. Laserscanning-Mikroskope, entweder von großen Mikroskopherstellern oder selbst gebaut, können für die SRS-Bildgebung verwendet werden. Das verwendete Mikroskop ist ein aufrechtes Laser-Scanning-Mikroskop, das auf einem handelsüblichen aufrechten Mikroskoprahmen aufgebaut ist. Ein Paar 5-mm-Galvospiegel wird verwendet, um den Laserstrahl zu scannen. Für Benutzer, die sich für ein selbstgebautes Laserscanning-Mikroskop entscheiden, verweisen wir auf ein zuvor veröffentlichtes Protokoll für die Konstruktion eines Laserscanning-Mikroskops¹⁶.

Protocol

Alle experimentellen Tierverfahren wurden mit 200 μm, festsitzenden, geschnittenen Mäusegehirnen gemäß dem Protokoll (# 4395-01) durchgeführt, das vom Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Washington genehmigt wurde. Wildtyp-Mäuse (C57BL/6J-Stamm) werden mit CO₂ eingeschläfert. Dann wird eine Kraniotomie durchgeführt, um ihr Gehirn zur Fixierung in 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu extrahieren. Die Gehirne sind in eine Mischung aus 3% Agarose und 0,3% Gelatine eingebettet und durch ein Vibratom in 200 μm dicke Scheiben geschnitten.

1. Anfängliche Ausrichtung

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Strahlgröße und die Divergenz beider Arme für beste Empfindlichkeit und Auflösung aufeinander abgestimmt sind. Kollimieren Sie die Pumpe und die Stokes-Strahlen und passen Sie ihre Größen an, bevor sie in das Laserscanning-Mikroskop gelangen. Verwenden Sie dazu ein Paar achromatische Linsen für jeden Strahl, bevor Sie sie auf dem dichroitischen Spiegel kombinieren. Tragen Sie immer die richtige Laserbrille für die Strahlausrichtung.

1. Strahlkollimation
   1. Installieren Sie ein Paar achromatische Linsen für den Pumpstrahl. Verwenden Sie als Ausgangspunkt ein 100-mm-Objektiv und ein 200-mm-Objektiv, um die Laserstrahlgröße um das 2-fache zu vergrößern. Stellen Sie sicher, dass der Abstand der beiden Linsen ungefähr 300 mm beträgt. Richten Sie den Pumpstrahl durch die Mitte beider Linsen aus.
   2. Platzieren Sie einen Spiegel nach der zweiten Linse, um den Strahl gegen eine Wand (>1 m entfernt) zu senden. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Strahl über große Entfernungen senden. Verfolgen Sie den Strahl vom Spiegel zur Wand mit einer IR-Karte und prüfen Sie, ob sich der Strahl in der Größe ändert. Kollimieren Sie den Balken, wenn sich die Größe des Balkens in Abhängigkeit von der Entfernung ändert.
      1. Wenn der Strahl konvergiert (abnehmende Größe mit Ausbreitung), bewegen Sie die beiden Linsen näher.
      2. Wenn der Strahl divergiert (zunehmende Größe mit der Ausbreitung), bewegen Sie die beiden Linsen weiter auseinander. Passen Sie den Abstand an, bis der Balken kollimiert ist.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.1 und 1.1.2, damit der Stokes-Strahl den Strahl kollimiert.
2. Anpassung der Strahlgröße
   1. Wenn ein Strahlprofiler verfügbar ist, messen Sie die kollimierte Strahlgröße für jeden Strahl. Alternativ können Sie die Strahlgröße mit der IR-Karte und einem Lineal schätzen, um einen Balkendurchmesser von 4-5 mm zu erhalten.
   2. Wenn die Strahlgröße zu klein oder zu groß ist, ändern Sie das in Schritt 1.1 verwendete Objektivpaar. Stellen Sie das Linsenpaar ein, bis beide Strahlen einen Durchmesser von 4-5 mm haben.
      HINWEIS: Die Vergrößerung des Strahls ist das Verhältnis zwischen der Brennweite der zweiten Linse zur ersten Linse (f₂/f₁).
3. Räumliche Überlappung
   HINWEIS: Die SRS-Bildgebung erfordert, dass beide Laserstrahlen in Raum und Zeit kombiniert werden, um molekulare Schwingungen anzuregen. Ein Schema der spektral fokussierenden SRS-Bildgebung ist in Abbildung 1 dargestellt.
   1. Kombinieren Sie die beiden Laserstrahlen, indem Sie einen dichroitischen Spiegel mit mehreren Lenkspiegeln zur Einstellung installieren. Optimieren Sie die räumliche Überlappung von Pumpe und Stokes, indem Sie die Strahlen nach dem dichroitischen Spiegel an zwei verschiedenen Positionen weit voneinander entfernt (~ 1 m) überwachen. Stellen Sie den Lenkspiegel iterativ vor dem dichroitischen und dem dichroitischen Spiegel ein, um den Stokes-Strahl mit dem Pumpenstrahl auszurichten.
      HINWEIS: Wenn sich die beiden Balken an beiden Positionen räumlich überlappen, sind sie ausreichend überlappt.
   2. Stellen Sie sicher, dass die kombinierten Strahlen in die Mitte der Scanspiegel des Laserscanning-Mikroskops geschickt werden, indem Sie ein Paar Lenkspiegel einstellen, wenn sich die Scanspiegel in der geparkten Position befinden. Stellen Sie sicher, dass beide Strahlen durch die Mitte des Mikroskopobjektivs und des Kondensators wandern.
   3. Verwenden Sie nach dem Kondensator ein weiteres Paar Linsen mit Brennweiten von 100 mm bzw. 30 mm, um den übertragenen Strahl auf die Fotodiode zu leiten. Stellen Sie sicher, dass beide Strahlen in der Fotodiode enthalten sind, und installieren Sie zwei Tiefpassfilter, um den modulierten Stokes-Strahl zu blockieren.

2. SRS-Signalerkennung

1. Elektrooptische Modulation (EOM)
   HINWEIS: EOM von 20 MHz wird verwendet, um die Stokes-Amplitude zu modulieren. Wie später diskutiert, leitet sich das EOM vom 80-MHz-Laserpulszug ab, der für die orthogonale Modulation benötigt wird. Andere Modulationsfrequenzen können verwendet werden, wenn nur einfarbiges oder hyperspektrales SRS durchgeführt wird. In diesem Fall ist eine Synchronisation der Modulationsfrequenz mit der Laserfrequenz nicht erforderlich. Ein Frequenzgenerator mit HF-Leistungsverstärker kann verwendet werden, um die EOM anzutreiben. Daher können die Schritte 2.1.1-2.1.4 übersprungen werden.
   1. Platzieren Sie einen Strahlsampler im Stokes-Strahlpfad, um 10% des Strahls aufzunehmen, und senden Sie ihn an eine schnelle Fotodiode, um den 80-MHz-Pulszug zu erkennen.
      HINWEIS: Das Photodiodensignal wird an einen Frequenzteiler gesendet, um einen 20-MHz-TTL-Ausgang zu erzeugen. Dieser Ausgang wird außerdem in einen Fanout-Puffer gesendet, um den Ausgang in vier identische 20-MHz-Ausgänge zu replizieren. Einer der Ausgänge wird verwendet, um das Oszilloskop auszulösen.
   2. Nehmen Sie einen der Ausgänge des Fanout-Puffers und filtern Sie ihn mit einem Bandpassfilter, um eine sinusförmige Welle von 20 MHz zu erhalten. Verwenden Sie ein HF-Dämpfungsglied, um die Ausgangsspannung von Spitze zu Spitze auf ~ 500 mV einzustellen.
   3. Senden Sie den resultierenden Ausgang an einen Phasenschieber, der eine Feineinstellung der HF-Phase mit einer Spannungsquelle ermöglicht. Senden Sie diesen Ausgang an einen HF-Leistungsverstärker und schließen Sie den Ausgang des Verstärkers an die EOM an.
   4. Entsperren Sie den Stokes-Strahl und optimieren Sie die Modulationstiefe von EOM1, indem Sie eine Fotodiode im Strahlpfad platzieren. Stellen Sie die EOM-Spannung und die Viertelwellenplatte so lange ein, bis die Modulationstiefe (Tal-zu-Peak-Verhältnis) zufriedenstellend erscheint.
      HINWEIS: Bei einer Modulation von 20 MHz (1/4 der Laserwiederholrate) werden alle 50 ns zwei Pulse erwartet.
2. Zeitliche Überlappung
   HINWEIS: Die zeitliche Überlappung der Pumpe und von Stokes wird durch Verzögerung einer der beiden Laserpulszüge mit einem Retroreflektor erreicht, der auf einer Verzögerungsstufe montiert ist (Abbildung 1 zeigt, dass der Stokes verzögert wird). Grobe Überlappung wird mit dem Oszilloskop überwacht, und feine Überlappung wird durch das SRS-Signal überwacht. Feine zeitliche Überlappungen können auch mit einem Autokorrelator erreicht werden, sofern verfügbar.
   1. Platzieren Sie eine Fotodiode nach dem dichroitischen Spiegel, um den Laserstrahl zu erkennen. Blockieren Sie zuerst den Stokes-Balken. Zoomen Sie auf eine der Pumpenpulsspitzen des Oszilloskops. Platzieren Sie einen vertikalen Cursor, um die zeitliche Position dieses Peaks mit dem Oszilloskop zu markieren.
   2. Blockieren Sie den Pumpenstrahl und entsperren Sie den Stokes-Strahl. Übersetzen Sie die Verzögerungsstufe so, dass die Spitzenposition auf dem Oszilloskop zeitlich an die markierte Position im vorherigen Schritt angepasst wird. Siehe Abbildung 2 für eine Darstellung der zeitlichen Überlappung zweier Balken.
      1. (OPTIONAL) Wenn die Verschiebung der Verzögerungsstufe nicht ausreicht, um die beiden Balken zeitlich anzupassen, verschieben Sie die Verzögerungsstufe in die Mitte ihres Bewegungsbereichs.
      2. Berechnen Sie den Verzögerungsabstand, der erforderlich ist, um die beiden Strahlen anzupassen, indem Sie die zeitliche Differenz zwischen den beiden Strahlen nehmen und die Differenz mit der Lichtgeschwindigkeit multiplizieren, um die Entfernung zu ermitteln, die benötigt wird, um die beiden Strahlen zeitlich anzupassen.
      3. Verlängern Sie den Balkenweg des schnelleren Strahls oder verkürzen Sie den Balkenweg des langsameren Strahls, um ihn in etwa der zeitlichen Verzögerung entsprechend anzupassen.
   3. Bereiten Sie eine Objektträgerprobe mit DMSO und doppelseitigem Klebeband als Abstandshalter vor, um die Probe zwischen dem Objektträger und einem Deckglas zu halten.
   4. Legen Sie die Probe auf das Mikroskop, wobei die Deckglasseite dem Mikroskopobjektiv zugewandt ist. Wechseln Sie das Mikroskop auf Hellfeldbeleuchtung und beobachten Sie die Probe vom Okular aus. Finden Sie den Fokus der Probe, indem Sie zuerst den Fokus sowohl an der oberen als auch an der unteren Schicht der Luftblasen an der Glas-Band-Schnittstelle finden und dann den Fokus zwischen die beiden Bandschichten verschieben.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Laserstrahlen blockiert sind, bevor Sie in das Okular schauen.
   5. Stellen Sie den abstimmbaren Strahlausgang auf 798 nm ein. Passen Sie basierend auf dem optischen Durchsatz des Kondensators die optische Leistung auf jeweils ~ 40 mW für die Pumpe und die Stokes-Strahlen im Objektivfokus an.
   6. Öffnen Sie ScanImage in MATLAB (oder einer anderen Scansoftware, die das Mikroskop steuert) und klicken Sie auf die Schaltfläche FOCUS, um den Scanvorgang zu starten.
      HINWEIS: Die Laserstrahlen werden durch die Probe gerastert, um ein Bild zu erzeugen. Der niederfrequente Signalausgang der Photodiode (<100 kHz) wird direkt in Kanal 1 der Datenerfassungskarte (sogenannter DC-Kanal) gesendet. Der Hochfrequenzausgang (>100 kHz) der Fotodiode wird in den Lock-in-Verstärker gesendet, und der X-Ausgang des Lock-in-Verstärkersignals wird an Kanal 2 der Datenerfassungskarte (als AC-Kanal bezeichnet) gesendet.
   7. Stellen Sie den Lenkspiegel vor dem Galvo-Scanner so ein, dass er das DC-Signal auf dem Kanal-1-Display zentriert. Bewegen Sie die motorisierte Verzögerungsstufe und beobachten Sie genau den Lock-in-Ausgang, der auf dem Display von Kanal 2 (d. h. AC-Kanal) angezeigt wird.
      HINWEIS: Wenn die Pumpe und Stokes rechtzeitig zusammenfallen, wird ein Signal auf dem AC-Kanal angezeigt. Es ist hilfreich, die Farbskala des AC-Kanals anzupassen, um die kleine Intensitätsänderung anzuzeigen.
   8. Maximieren Sie die AC-Signalintensität, indem Sie die Zeitverzögerung fein einstellen. Stellen Sie den dichroitischen Spiegel so ein, dass er das SRS-Signal auf dem AC-Kanal zentriert (während der DC-Kanal zentriert bleibt). Stellen Sie die Phase des Lock-in-Verstärkers ein, um das Signal zu maximieren. Siehe Abbildung 3 für ein zufriedenstellendes Signal.

3. Optimierung der spektralen Auflösung

HINWEIS: Die Pumpe und die Stokes-Strahlen, die die Probe erreichen, sollten die gleiche Menge an Gruppenverzögerungsdispersion (GDD) aufweisen, um die spektrale Auflösung zu maximieren. Die Ausbreitung hängt stark vom Versuchsaufbau ab. Der hier beschriebene Versuchsaufbau nutzt Femtosekundenpulse bei 1.040 nm bzw. 800 nm als Stokes bzw. Pumpe. Als pulsdehnendes Medium werden dichte Feuersteinglasstäbe (H-ZF52A) verwendet.

1. Führen Sie 48 cm eines hochdispersiven Glasstabs (H-ZF52A oder gleichwertiges dichtes Feuersteinglas) in den 800-nm-Balkenweg ein. Schätzen Sie die GDD mit Eq (1):
   (1)
   HINWEIS: GVD verschiedener Glasmaterialien mit unterschiedlichen Wellenlängen kann aus der Brechungsindex-Datenbankressource gefunden werden. Zum Beispiel hat H-ZF52A eine GVD von 220,40 fs²/mm bei 800 nm. Die Gesamt-GDD beträgt 105792 fs².
2. Berechnen Sie, wie viele cm des dispersiven Glasstabs erforderlich sind, um den Strahlengang von 1.040 nm entsprechend dem GDD der Pumpe hinzuzufügen. Fügen Sie die entsprechende Länge der dispersiven Glasstäbe in den Strahlpfad von 1.040 nm ein, um in etwa der GDD des 800-nm-Strahls zu entsprechen. Beachten Sie, dass das Hinzufügen von Glasstäben die zeitliche Überlappung der beiden Balken ändert und eine Anpassung der Verzögerung erforderlich sein kann.
3. Kalibrierung der spektralen Auflösung
   1. Machen Sie eine Objektträgerprobe mit DMSO. Legen Sie den Objektträger auf das Mikroskop und überprüfen Sie die Stärke der Strahlen, die aus dem Mikroskopkondensator kommen. Stellen Sie die Leistung entsprechend ein, um bei Probenfokus jeweils ~ 40 mW zu haben.
   2. Öffnen Sie ScanImage aus MATLAB. Finden Sie das maximale SRS-Signal, indem Sie durch die Verzögerungsstufe scannen, die dem 2.913 ^{cm-1 Raman-Peak} von DMSO entspricht. Schätzen Sie die Bühnenposition basierend auf der vorherigen Bühnenposition mit der erhöhten optischen Weglänge aufgrund des Einsetzens von Stäben. Richten Sie die räumliche Überlappung des Balkens aufgrund der geringen Abweichung des Balkens beim Hinzufügen von Glasstäben neu aus.
   3. Speichern Sie einen hyperspektralen SRS-Scan, indem Sie nacheinander eine Reihe von SRS-Bildern aufnehmen, während Sie die motorisierte Stufe bewegen.
      HINWEIS: Der Verzögerungsscanbereich umfasst zwei Raman-Peaks, die den 2.913 cm-1 bzw. 2.994 ^{cm-1 Raman-Peaks} von DMSO entsprechen. Diese beiden Übergänge werden beobachtet, wenn eine 800-nm-Pumpe und ein 1.040-nm-Stokes-Laser verwendet werden.
   4. Zeichnen Sie die SRS-Spektren der DMSO-Lösung mit ImageJ oder MATLAB auf. Passen Sie den großen DMSO 2.913 ^cm-1 Peak an eine Gaußsche oder Lorentzsche Funktion in MATLAB an, um die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) des Peaks zu berechnen.
      HINWEIS: Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. Wenn nur ein breiter Peak vorhanden ist, bedeutet dies, dass entweder die spektrale Auflösung zu schlecht ist, um die beiden Peaks zu unterscheiden, und mehr Glasstäbe erforderlich sind, oder der gescannte Bereich war zu klein, um den zweiten Peak zu erkennen. Typischerweise ist eine akzeptable spektrale Auflösung DMSO ~ 20-25 ^cm-1, wenn Glasstäbe Länge von >60 cm verwendet werden. Eine niedrigere Auflösung wird oft für die Gewebebildgebung verwendet, um für höhere Signale mit kürzeren Impulsen¹⁷ zu handeln.
4. (OPTIONAL) Verwenden Sie einen Autokorrelator oder einen FROG (Frequency-Resolved Optical Gating), um die Pulsdauer jedes Arms zu bestimmen, um genau die Menge an GDD und die Länge der Stäbe zu berechnen, die benötigt werden, um die GDD zwischen der Pumpe und dem Stokes abzugleichen.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.2-3.3.4 für verschiedene Stablängen am Stokes-Strahl, um die optimale spektrale Auflösung zu finden, was bedeutet, dass die beste GDD-Übereinstimmung experimentell gefunden wurde. Verwenden Sie mehrere Sätze von Glasstäben, die sich in der Länge unterscheiden, um eine optimale spektrale Auflösung zu erreichen.

4. Signal-Rausch-Charakterisierung (SNR)

1. Stellen Sie sicher, dass Schritt 4.2 nach vollständiger räumlicher und zeitlicher Ausrichtung ausgeführt wird.
2. Erfassen Sie ein SRS-Bild, das dem 2.913 ^{cm-1 Raman-Peak} von DMSO entspricht. Öffnen Sie das Bild in ImageJ, und wählen Sie einen kleinen Bereich in der Mitte des Rahmens aus. Verwenden Sie die Messfunktion, um den Mittelwert und die Standardabweichung von Werten im ausgewählten Bereich zu berechnen.
3. Teilen Sie den Mittelwert der ausgewählten Fläche durch die Standardabweichung, um den SNR-Wert zu ermitteln, wie in Eq (2).
   (2)
   HINWEIS: Ein guter SNR für das System (mit einer Lock-in-Zeitkonstante von 4 μs) mit DMSO bei 40 mw/40 mw im Fokus für beide Arme beträgt >800. Niedrigere DMSO-Konzentrationen oder eine geringere Leistung können für eine genauere Schätzung des SNR verwendet werden, wenn die Datenerfassungskarte eine begrenzte Bittiefe aufweist.
4. Wenn der SNR zu niedrig ist, richten Sie die Laserpulse neu aus, um die räumliche Überlappung, die zeitliche Überlappung, die Strahlgrößen-/Kollimationsanpassung und/oder die Dispersionsanpassung zu optimieren. Für ein Objektiv mit einem Aberrationskorrekturkragen optimieren Sie das Signal, indem Sie das Korrekturhalsband anpassen.

5. Kalibrierung der Frequenzachse

HINWEIS: Dieser Schritt wird ausgeführt, um die Position der Verzögerungsstufe mit dem gescannten Raman-Übergang in Beziehung zu setzen. Eine sorgfältige Auswahl der Lösungsmittel ist erforderlich, um ein geeignetes "Raman-Lineal" zu erzeugen. DMSO ist ein wirksames Lösungsmittel für CH-Bindungen, da es zwei scharfe ^{Raman-Spitzen} bei 2.913 cm-1 und 2.994 ^cm-1 aufweist.

1. Speichern Sie einen hyperspektralen Scan mit dem Delay-Stage-Bereich, der die 2.913 ^cm-1 und 2.994 cm-1 ^{Raman-Spitzen} von DMSO abdeckt. Speichern Sie die Bühnenpositionen, die dem hyperspektralen Datensatz entsprechen.
   HINWEIS: Der globale maximale Peak des Spektrums entspricht der DMSO 2.913 ^cm-1 Raman-Verschiebung und der zweite maximale Peak entspricht der DMSO 2.994 cm-1 ^{Raman-Verschiebung.}
2. Führen Sie eine lineare Regression für die Bühnenpositionen und ^{Raman-Verschiebungen} bei 2.913 cm-1 und 2.994 ^cm-1 durch. Verwenden Sie die lineare Regressionsgleichung, die die Stufenposition mit der Raman-Verschiebung in Beziehung setzt, und konvertieren Sie die Verzögerungspositionen in die entsprechenden Raman-Frequenzen.

6. Orthogonale Modulation und zweifarbige Bildgebung

HINWEIS: Der orthogonale Modulationsschritt ist nur erforderlich, wenn eine zweifarbige Echtzeit-Bildgebung erforderlich ist. Ein Schema dieses Schemas ist in Abbildung 5 dargestellt. Die orthogonale Modulation verwendet ein Paar EOMs, die mit einem Viertel der Laserfrequenz (20 MHz für 80 MHz Laser) mit einer 90°-Phasenverschiebung zwischen den beiden angetrieben werden. Dieser orthogonale Modulationsschritt kann für die einfarbige SRS-Bildgebung oder die hyperspektrale SRS-Bildgebung übersprungen werden.

1. EOM1-Modulation
   1. Installieren Sie ein PBS (PBS2), eine Viertelwellenplatte (QWP2) und ein zweites EOM (EOM2) in den Stokes-Strahlpfad nach dem ersten EOM. Trennen Sie den Signaleingang von EOM2. Schließen Sie den Signaleingang an EOM1 an und schalten Sie ihn ein.
   2. Modulieren Sie den Stokes-Strahl (fixiert bei 1.040 nm) bei 20 MHz (f₀/4), indem Sie den Strahl durch die erste EOM senden. Passen Sie die Neigung und Position von EOM1 an, um sicherzustellen, dass der Strahl gerade und zentriert durch den EOM-Kristall schlägt.
   3. Überwachen Sie die Modulationstiefe, indem Sie beide Polarisationen aus PBS1 mit zwei Fotodioden beobachten und die Modulation auf einem Oszilloskop anzeigen.
   4. Stellen Sie die QWP1-, EOM1-Spannung und die Phase des 20-MHz-Eingangs (mit einem Phasenschieber) ein, um die Modulationstiefe des übertragenen Strahls auf nahezu 100 % zu optimieren. Siehe Abbildung 2B für eine Veranschaulichung der guten Modulationstiefe.
2. EOM2-Modulation
   1. Trennen Sie EOM1 und schließen Sie EOM2 an.
   2. Senden Sie den Hochspannungsausgang des zweiten Verstärkers mit 20 MHz an EOM2. Passen Sie die Neigung und Position von EOM2 an, um sicherzustellen, dass der Strahl gerade und zentriert durch den EOM-Kristall schlägt.
   3. Überwachen Sie erneut die Modulationstiefe, indem Sie beide Polarisationen, die aus PBS2 kommen, mit einem Oszilloskop betrachten. Stellen Sie die QWP2-, EOM2-Spannung und den Phasenschieber nach Bedarf ein, um eine Modulation von nahezu 100% für beide Polarisationen zu erreichen.
   4. Stellen Sie sicher, dass die Pulszugmodulation eine 90°-Phasenverschiebung gegenüber der ersten Modulation aufweist.
      HINWEIS: Wenn die beiden Pumpenimpulse nicht um 90° orthogonal sind, ist das Übersprechen zwischen den beiden Kanälen ein Problem.
   5. Testen Sie die Orthogonalität der Modulation, indem Sie sowohl EOM1 als auch EOM2 einschalten und anschließen. Überwachen Sie beide Polarisationen, die durch PBS2 gespalten werden, mit einem Oszilloskop. Optimieren Sie EOM1 und EOM2 einzeln, wenn die Impulsfolge nach dem zweiten PBS Abbildung 2C nicht ähnelt.
   6. Installieren Sie einen 20 mm doppelbrechenden Quarzkristall (BRC) und HWP nach EOM2. Schließen Sie beide EOMs gleichzeitig an, und überwachen Sie den Pulszug so, dass er Abbildung 2D ähnelt.
      HINWEIS: Für das in diesem Experiment verwendete Zwitschern induziert 20 mm BRC eine Zeitverzögerung, die einer 80 ^{cm-1 Raman-Verschiebung} entspricht. Eine andere BRC-Länge kann erforderlich sein, wenn ein anderer Chirp verwendet wird.
3. Kalibrierung
   1. Kalibrieren Sie das System mit DMSO, indem Sie Signale vom X- und Y-Kanalausgang des Lock-in-Verstärkers erkennen (gesendet an die Kanäle 2 und 3 der Datenerfassungskarte).
   2. Prüfen Sie, ob die Signale, die durch den 2.913 cm-1 Peak von der schnelleren Polarisation und der von der langsameren Polarisation erzeugt werden, am ^{Lock-in-Verstärker} nahezu 90° phasenverschoben sind. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie die EOM-Ausrichtung an, bis die beiden Signale fast 90° phasenverschoben sind.
   3. Sobald die Kalibrierung abgeschlossen ist, finden Sie die Verzögerungsposition, die den Proteinübergang bei 2.930 ^cm-1 für einen der orthogonalen Strahlen untersucht. Stellen Sie sicher, dass die andere Polarisation den Lipidübergang von 2.850 ^cm-1 untersucht.

7. Epi-Mode-SRS-Bildgebung

HINWEIS: Im Transmissionsmodus-Bildgebungsschema fokussiert das Objektiv den Laser in die Probe, und dann lenkt eine Kondensatorlinse den durchgelassenen Strahl zur Lock-in-Erkennung auf eine Fotodiode. Im Epimode-Bildgebungsschema wird Licht, das von der Probe zurückgestreut und depolarisiert wird, vom Fokussierobjektiv gesammelt und mit einem polarisierenden Strahlteiler isoliert. Die isolierten und rückgestreuten Photonen werden über ein Paar Relaislinsen zur Lock-in-Erkennung an eine Fotodiode gesendet. Abbildung 6 zeigt das Epimodus-Bildgebungsschema.

1. Installieren Sie ein HWP, bevor der Strahl in das Mikroskop eintritt, um die Polarisation des Strahls zu ändern, der in das Mikroskop eindringt. Platzieren Sie ein PBS über dem Objektiv, damit der depolarisierte rückreflektierte Strahl den Detektor erreichen kann.
2. Verwenden Sie ein Paar Linsen, bestehend aus einer 75-mm-Achromatlinse und einer 30-mm-Assphärenlinse, um die rückgestreuten Photonen von der hinteren Öffnung des Objektivs an den Photodetektor weiterzuleiten. Montieren Sie den Detektor, um das vom PBS geleitete Rückstreulicht zu sammeln. Installieren Sie einen Filter, um das Eindringen des modulierten Strahls in den Detektor zu verhindern.
3. Legen Sie die Gewebeprobe unter das Objektiv. Da der Kondensator für die Epi-Mode-Bildgebung nicht erforderlich ist, entfernen Sie ihn, wenn mehr Platz benötigt wird.
4. Bildgebung
   1. Blockieren Sie den Balken mit einem Verschluss; eine weiße Lichtquelle von der Seite auf die Probe zu richten; und verwenden Sie Hellfeld, um den objektiven Fokus zu finden.
   2. Entsperren Sie beide Strahlen und verwenden Sie die vorkalibrierten Verzögerungspositionen, um Lipid- und Protein-SRS-Bilder aus dem Gewebe von den beiden Ausgängen des Lock-in-Verstärkers zu erfassen.
   3. Passen Sie die Lock-in-Verstärkung und den Pixel-Bin-Faktor an, um Bilder in guter Qualität zu erhalten.

8. Falschfarbenfärbung

1. Öffnen Sie den Image-Stack mit ImageJ.
2. Ziehen Sie die beiden Bilder heraus, die der Lipid- (2.850 ^cm-1) und Proteinart (2.930 ^cm-1) entsprechen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild klicken und auf Duplizieren klicken.
3. Benennen Sie das Lipidbild in Lipide und das Proteinbild in Proteine um.
4. Gehe zu | verarbeiten Image Calculator und Perform Proteine subtrahieren Lipide.
5. Kombinieren Sie die Bilder, indem Sie zu Image | gehen Farbe | Verschmelzen Sie Kanäle, indem Sie Lipide auf Grün und Proteine auf Blau setzen. Öffnen Sie das Werkzeug Bildkanäle (Image | Farbe | Channels Tool) und passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an (Image | | anpassen B. Helligkeit/Kontrast).
6. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast für jeden Kanal mit dem Kanalwerkzeug an. Passen Sie für den Lipidkanal den Kontrast an, bis die zellulären Merkmale dunkel erscheinen. Passen Sie für den Proteinkanal den Kontrast an, bis die Zellmerkmale blau erscheinen. Konvertieren Sie das zusammengeführte Grün/Blau-Bild des Kanals in ein RGB-Bild, indem Sie zu Image | wechseln Typ | RGB-Farbe. Exportieren Sie dieses Bild nach Datei | Als | speichern Tiff.
   HINWEIS: Bei falscher H & E-Färbung zeigt das Farbschema rosa Zytoplasma, während die Kerne dunkelblau-violett sind.
7. Laden Sie das HE.m MATLAB-Skript aus der falschen H&E-Färbeskriptressource in der Materialtabelle herunter.
8. Führen Sie das Skript HE.m in MATLAB aus. Wählen Sie das exportierte RGB-Bild aus dem vorherigen Schritt aus, um ein künstlich H&E-gefärbtes Bild zu erzeugen.
9. (OPTIONAL) Normalisieren Sie die Bildintensität für große Sichtfeldaufnahmen, da das Bild in der Peripherie dunkler erscheint als in der Mitte.
   1. Um eine Feldnormalisierung der Bilder durchzuführen, sollten Sie so viele Bilder wie möglich mitteln. Entfernen Sie dann die Intensitäts-Features mit ImageJ (Process | Filtert | Gaußsche Unschärfe | Radius=50).
   2. Messen Sie die maximale Intensität des verschwommenen Bildes (Strg+M). Teilen Sie das verschwommene Bild durch die maximale Intensität (Process | Mathe-| Teilen). Teilen Sie das SRS-Rohbild durch das verschwommene Bild (Process | Bild | Rechner).

Representative Results

Optimierung der spektralen Auflösung:
Die Ausbreitung durch ein Material wird durch das dispersive Medium (Länge und Material) und die Wellenlänge beeinflusst. Eine Änderung der Dispersionsstablänge wirkt sich auf die spektrale Auflösung und die Signalgröße aus. Es handelt sich um eine Geben-Nehmen-Beziehung, die je nach Anwendung unterschiedlich abgewogen werden kann. Die Stäbe strecken den Strahlpuls von breit in der Frequenz und schmal in der Zeit zu eng in der Frequenz und breit in der Zeit. Abbildung 7 zeigt den Einfluss unterschiedlicher Stablängen auf die spektrale Auflösung. Abbildung 7A zeigt eine sehr schlechte spektrale Auflösung; Dieses Setup hat keine Glaszwitscherstäbe, und die beiden Raman-Gipfel von DMSO sind überhaupt nicht gelöst. In Abbildung 7B,C beginnt eine Zunahme der Anzahl der zwitschernden Glasstäbe die beiden Spitzen aufzulösen. Schließlich zeigt Abbildung 7D, wie das abgestimmte Zwitschern beide Spitzen auflöst und verwendet werden kann, um die Bühnenpositionen auf die Frequenz zu kalibrieren.

Kalibrierung mit DMSO:
DMSO hat zwei scharfe Raman-Spitzen bei 2.913 und 2.994 cm-1, die für die Kalibrierung im ^C-H-Bereich geeignet sind. Sobald ein DMSO-Spektrum aus einem hyperspektralen SRS-Scan erhalten wurde, konvertiert eine einfache lineare Regression die Bühnenposition in die Raman-Verschiebung. Wenn die spektrale Auflösung schlecht ist (wie in Abbildung 7A gezeigt) und die beiden Peaks nicht trennbar sind, ist eine Kalibrierung mit linearer Regression unmöglich. In diesem Fall ist eine bessere Dispersionsanpassung erforderlich, indem entweder Glasstäbe hinzugefügt oder entfernt werden. Die häufigsten Schwierigkeiten bei der Suche nach einem DMSO-Signal für die Kalibrierung sind auf Fehler bei der zeitlichen Überlappung oder der räumlichen Überlappung der beiden Strahlen zurückzuführen. Bevor Sie die DMSO-Kalibrierung versuchen, wiederholen Sie die räumlichen und zeitlichen Ausrichtungsschritte, um das SRS-Signal zu optimieren.

Zweifarbiges DMSO:
Bei zweifarbigem SRS werden zwei Pumpenimpulszüge mit orthogonaler Polarisation mit fester Zeitverzögerung (aufgrund eines doppelbrechenden Kristalls) erzeugt. Die Auswertung der Modulationstiefe und der 90°-Phasenverschiebung erfolgt mit einer Photodiode, gefolgt von einem DMSO-SRS-Signal. Abbildung 8 zeigt eine akzeptable Modulationstiefe und zeitliche Trennung. Obwohl die spektrale Auflösung von DMSO in Abbildung 8 nicht ideal ist, wird sie in Gewebebildgebungsexperimenten oft geopfert, um ein höheres Signal mit kürzeren Pulsen zu erreichen. Abbildung 9 zeigt schlechte Phasenverschiebungen, die zu invertierten oder negativen Spitzen führen.

Zweifarbiges SRS des Hirngewebes der Maus im Epi-Modus:
Epi-Modus (Detektion von rückgestreuten Photonen) SRS wird für die Abbildung von dickem Gewebe (>1 mm) verwendet. Abbildung 10A,B zeigt die zweifarbige SRS-Bildgebung in Echtzeit bei 2.850 cm-1 und 2.930 ^{cm-1 Ex-vivo-Hirngewebe} der Maus. Die Rohbilder aus den Lipid- und Proteinkanälen (Abbildung 10A,B) wurden farbcodiert, um ein einzelnes Bild zu erzeugen, das Lipid- und Proteinbeiträge darstellt (Abbildung 10C). Eine falsche H&E-Färbung (Abbildung 10D) in Abbildung 10C wurde durchgeführt, um die H&E-Färbung nachzuahmen. Eine schlechte Bildqualität kann auf eine große Abbildungstiefe oder eine schlechte Kalibrierung (Frequenzachse oder Modulationstiefe) zurückzuführen sein. Die typische Abbildungstiefe im Hirngewebe beträgt 100-200 μm¹³.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des einfarbigen SRS-Imaging-Setups. Aufbau eines spektral fokussierenden SRS-Mikroskops im Transmissionsmodus. X und Y stellen die orthogonalen Ausgänge dar. Abkürzungen: SRS = stimulierte Raman-Streuung; DL = retroreflektorbasierte Verzögerungsleitung; Div = Teiler; FB = Fanout-Puffer; AT = Dämpfungsglied; PS = Phasenschieber; PA = Endstufe; DCM = dichroitischer Spiegel; GM = Galvo-Spiegel; EOM = elektrooptischer Modulator; POM = Pick-off-Spiegel; PBS = polarisierender Strahlteiler, BRC = doppelbrechender Kristall; QWP = Viertelwellenplatte; HWP: Halbwellenplatte; PD = Fotodiode; GR = Glasstab; BB = Balkenblock; SPF = Kurzpassfilter; CL = Kollimationslinse; BS = Strahlgrößenänderung des Objektivs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Repräsentative zeitliche Überlappung . (A) Die Pumpe und die Stokes-Strahlen sind auf dem Oszilloskop zeitlich überlappt. Oszilloskop-Cursor werden verwendet, um die zeitlichen Positionen der Pumpe und der Stokes-Strahlen zu markieren. Diese Überlappung ist zufriedenstellend als Ausgangspunkt, um die zeitliche Überlappung mit einer Verzögerungsstufe weiter zu optimieren. (B) Zufriedenstellende repräsentative Modulationstiefe von einem EOM bei 20 MHz. (C) Zufriedenstellende Pulsmodulation, während zwei EOMs verwendet werden. (D) Zufriedenstellende Pulszugmodulation nach doppelbrechender Quarz- und Halbwellenplatteninstallation am doppelt modulierten Stokes-Arm. Abkürzung: EOM = electrooptic modulator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentative SRS- und Pumpensignale. (A) Falsch ausgerichtetes Pumpensignal im Gleichkanal erkannt. (B) Falsch ausgerichtetes SRS-Signal, das von einer Fotodiode erkannt wird. (C) Zufriedenstellendes, zentriertes Pumpensignal im DC-Kanal. (D) Zufriedenstellendes SRS-Signal, das auf dem AC-Kanal zentriert ist. Abkürzung: SRS = stimulierte Raman-Streuung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Charakterisierung der spektralen Auflösung. Eine Gaußsche Funktion wurde an den 2.913 ^cm-1 Raman DMSO Peak angepasst. Die FWHM-Berechnung ergab eine Auflösung von 15 ^cm-1 für das System. Abkürzungen: DMSO = Dimethylsulfoxid; FWHM = volle Breite bei halbem Maximum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Schematische Darstellung des zweifarbigen SRS-Imaging-Setups. Aufbau eines zweifarbigen SRS-Mikroskops im Transmissionsmodus. X und Y stellen die orthogonalen Ausgänge dar. Abkürzungen: DL = retroreflektorbasierte Verzögerungsleitung; Div = Teiler; FB = Fanout-Puffer; AT = Dämpfungsglied; PS = Phasenschieber; PA = Endstufe; DCM = dichroitischer Spiegel; GM = Galvo-Spiegel; EOM = elektrooptischer Modulator; PBS = polarisierender Strahlteiler; BRC = doppelbrechender Kristall; QWP = Viertelwellenplatte; HWP = Halbwellenplatte; PD = Fotodiode; GR = Glasstab; BB = Strahlblock, SPF = Kurzpassfilter; CL = Kollimationslinse; POM = Pick-off-Spiegel; BS = Strahlgrößenänderung des Objektivs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Schematische Darstellung des Epi-Mode-Setups für die zweifarbige SRS-Bildgebung. Aufbau eines zweifarbigen SRS-Mikroskops im Epi-Modus. X und Y stellen die orthogonalen Ausgänge dar. Abkürzungen: DL = retroreflektorbasierte Verzögerungsleitung; Div = Teiler; FB = Fanout-Puffer; AT = Dämpfungsglied; PS = Phasenschieber; PA = Endstufe; DCM = dichroitischer Spiegel; GM = Galvo-Spiegel; EOM = elektrooptischer Modulator; PBS = polarisierender Strahlteiler; BRC = doppelbrechender Kristall; QWP = Viertelwellenplatte; HWP = Halbwellenplatte; PD = Fotodiode; GR = Glasstab; BB = Beam Block, BPF = Bandpassfilter; CL = Kollimationslinse; POM = Pick-off-Spiegel; BS = Strahlgrößenänderung des Objektivs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Optimierung der spektralen Auflösung mit 25% DMSO. (A) Null-Glas-Zwitscherstäbe wurden verwendet, um das DMSO-Spektrum zu erhalten. Die beiden Gipfel sind nicht gelöst. (B) Es wurden Zwitscherstäbe aus Glas verwendet, 20 cm am Pumpenarm und 24 cm am Stokes-Arm. Zwei Spitzen beginnen sich zu einem zufriedenstellenden Punkt aufzulösen. (C) Es wurden Zwitscherstäbe verwendet, eine 40 cm lange Pumpe und eine 24 cm lange Stokes, um ein besser aufgelöstes DMSO-Spektrum zu erhalten. (D) Es wurden Zwitscherstäbe verwendet, 64 cm lange Pumpe und 60 cm lange Stokes, um eine höhere spektrale Auflösung zu erhalten. Abkürzung: DMSO = Dimethylsulfoxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Zweifarbiges SRS, variierende Polarisation und Zeitverzögerung. Zwei zeitverzögerte Pulszüge der orthogonalen Polarisation (s & p) werden verwendet, um DMSO-Spektren abzubilden, um die Zeitverzögerung (und Raman-Frequenzdifferenz) zwischen den SRS-Anregungen zu zeigen. Abkürzungen: DMSO = Dimethylsulfoxid; SRS = stimulierte Raman-Streuung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: SRS-Spektrum, das sich aus einer schlechten zweifarbigen SRS-Phasenverschiebung ergibt. Ein negativer Peak von 2.994 ^cm-1 in der Nähe von Bühnenposition 48 weist auf eine schlechte Phasendifferenz hin. Abkürzung: SRS = stimulierte Raman-Streuung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 10: Erzeugung falscher zweifarbiger H&E-Färbung von SRS-Bildern. (A) Rohprotein SRS-Bild aus einem Gehirngewebe der Maus am Übergang von 2.930 ^cm-1. (B) Rohes Lipid-SRS-Bild aus dem Hirngewebe der Maus am Übergang von 2.850 ^cm-1. (C) Zusammengeführte und farbcodierte Kanäle von A und B mit Lipidbeitrag in Grün und Proteinbeitrag in Blau. (D) Falsche H & E-Umfärbung wurde auf C durchgeführt, um die H & E-Färbung für pathologische Anwendungen nachzuahmen. Maßstabsleiste = 50 μm. Abkürzungen: SRS = stimulierte Raman-Streuung; H&E = Hämatoxylin und Eosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Das in diesem Protokoll vorgestellte zweifarbige SRS-Bildgebungsschema hängt von der ordnungsgemäßen Implementierung der einfarbigen SRS-Bildgebung ab. Bei der einfarbigen SRS-Bildgebung sind die kritischen Schritte die räumliche Ausrichtung, die zeitliche Ausrichtung, die Modulationstiefe und die Phasenverschiebung. Die räumliche Kombination der beiden Balken wird durch einen dichroitischen Spiegel erreicht. Mehrere Lenkspiegel werden zur Feineinstellung verwendet, wenn die Strahlen zum dichroitischen Spiegel geschickt werden. Sobald die Balken mit dem dichroitischen Spiegel kombiniert wurden, kann die räumliche Ausrichtung bestätigt werden, indem der kombinierte Balkenpfad mit einem Spiegel ausgewählt wird, um ihn zu einer Wand > 1 m entfernt zu senden, während der kombinierte Strahl überprüft wird, um festzustellen, ob er sich mit einer IR-Karte überlappt. Nach der räumlichen Ausrichtung durch das Mikroskop erfolgt die zeitliche Überlappung durch Anpassung der Weglänge mit einer retroreflektorbasierten Verzögerungsstufe, die den Vorteil hat, dass die räumliche Ausrichtung erhalten bleibt. Der 1.040-nm-Arm ist der verzögerte Strahl in diesem Protokoll. Eine zeitliche Überlappung ist nicht möglich, wenn die Verzögerungsstufe nicht über die Reichweite verfügt, die dazu führt, dass sich die beiden Balken zeitlich überlappen. In diesem Fall kann es erforderlich sein, die gesamte Verzögerungsstufe an einen anderen Ort zu verschieben, um sicherzustellen, dass die zeitliche Überlappung nahe der Mitte des Verzögerungsscanbereichs liegt. Wenn beispielsweise die zeitliche Differenz zwischen den beiden Balken als 6 ns gemessen wird, sind 1,8 m Anpassung erforderlich. Die erforderliche Anpassung bezeichnet die Länge der Dehnung des Balkenpfades für den schnelleren Balken oder die Verkürzung des Balkenwegs für den langsameren Balken.

Neben der Ausrichtung sind auch die Anpassung der Strahlgröße und die Modulation des Stokes-Strahls wichtig, um das SRS-Signal zu maximieren. Idealerweise sollten beide Strahlen auf der Zielebene kollimiert werden und der Größe der Objektivrückblende entsprechen. Es ist sinnvoll, Kollimation und Strahlgröße zu überprüfen, wenn die Zielebene dem Benutzer ausgesetzt ist. Wenn der Strahl konvergiert oder divergiert, ist es notwendig, die zweite Linse des Kollimationslinsenpaares anzupassen, um eine Kollimation zu erreichen (Protokollschritt 1.1). Wenn die Strahlgröße an der Objektivrückblende zu klein ist, muss ein Linsenpaar mit hoher Vergrößerung verwendet werden (Protokollschritt 1.2). SRS skaliert linear mit der Modulationstiefe des Stokes-Strahls. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Pulshöhe im Tal <10% der Pulshöhe am Gipfel des Oszilloskops beträgt. Eine schlechte Modulation des Stokes-Strahls führt direkt zu einem schlechten SNR.

Bei der Verwendung von Femtosekundenlasern für die SRS-Bildgebung ist eine spektrale Fokussierung erforderlich, um die Zeitverzögerung zwischen Pumpe und Stokes in Raman-Frequenzverschiebung umzuwandeln. Der Umrechnungsfaktor hängt von der Menge des angewendeten Chirps ab. Es ist wichtig, die GDD der Pumpe und Stokes anzupassen, um eine optimale spektrale Auflösung zu erreichen. Die GDD kann basierend auf der Länge des verwendeten Dispersionsmaterials und seiner GVD geschätzt werden. Zum Beispiel hat der SF11 dichte Feuersteinglasstab einen GVD von 123.270 fs 2/mm bei 1.040 nm und 187.486 fs²/mm bei 800 nm. Für 240 mm SF11 im 800 nm Strahlweg beträgt GDD 240 mm × 187.486 fs 2/mm = 45.000 fs². Für 240 mm SF11 im 1.040 nm Strahlweg beträgt die GDD 240 mm × 123.270 fs 2/mm = 30.000 fs². Diese Beispielberechnung bedeutet, dass dem 1.040-nm-Arm zusätzliche Glasstäbe hinzugefügt werden sollten oder dass Glasstäbe vom 800-nm-Arm entfernt werden sollten, um GDD zu entsprechen. Um eine höhere spektrale Auflösung zu erreichen, ist eine größere GDD erforderlich, was längere Stäbchen bedeutet. Bei der Berechnung der GDD wurden jedoch die Beiträge der EOM und der Zielsetzung vernachlässigt. Die tatsächliche Übereinstimmung von GDD wird experimentell bestimmt, indem die beste spektrale Auflösung für die gegebenen Stablängen an der Pumpe oder dem Stokes gefunden wird. Die Berechnungen dienen als guter Einstiegsschritt. Eine experimentelle Optimierung durch iteratives An- und Absetzen von Glasstäben ist nach wie vor notwendig, um die spektrale Auflösung zu optimieren.

Es ist wichtig zu erkennen, dass ein großer Chirp eine höhere spektrale Auflösung bietet, jedoch auf Kosten der Signalintensität. Kleinere Zwitschern und kürzere Pulse sind für die Gewebebildgebung in der C-H-Region von Vorteil, da Protein- und Lipid-Raman-Peaks breit sind. Eine niedrigere spektrale Auflösung kann gegen ein höheres SRS-Signal (oder eine schnellere Abbildungsgeschwindigkeit) eingetauscht werden, ohne den zweifarbigen Gewebekontrast^{zu beeinträchtigen 17}. In anderen Anwendungen, bei denen eine hohe spektrale Auflösung erforderlich ist, insbesondere im Fingerabdruckbereich, ist es notwendig, ein größeres Zwitschern mit langen Glasstäben aufzutragen. Alternativ kann es einfacher sein, Gittertragen zu verwenden, um längere Impulse zu erhalten (für eine Pulsdauer von mehr als 3 ps). Eine Haupteinschränkung des verwendeten kommerziellen Lasers ist jedoch seine spektrale Bandbreite. Die spektrale Abdeckung von spektral fokussierenden SRS hängt von der Bandbreite der Anregungslaser ab. Das verwendete Lasersystem hat eine spektrale Abdeckung, die typischerweise bei 200-250 ^cm-1 liegt. Dies reicht kaum aus, um die C-H-Region abzudecken. Eine größere spektrale Abdeckung ist typischerweise erforderlich, um chemische Spezies für die Bildgebung im Fingerabdruckbereich aufzulösen. Dieses Problem kann mit einem Faserlaser-Add-on behoben werden, das die Bandbreite des Stokes-Lasers von 6 nm auf 60 nm¹⁸ erweitert. Eine weitere wichtige Einschränkung der zweifarbigen SRS-Bildgebungstechnik besteht darin, dass nur zwei Übergänge überwacht werden. Dieser Ansatz wäre für komplexe Proben mit vielen überlappenden Raman-Peaks oder mehreren Arten ungeeignet.

Das Echtzeit-Zwei-Farben-SRS-Bildgebungsverfahren ermöglicht eine Hochgeschwindigkeits-Gewebebildgebung, indem es die Notwendigkeit einer Laser- oder Verzögerungsabstimmung überflüssig macht. Es ist jedoch schwierig einzurichten, da es schwierig ist, eine nahezu perfekte Modulationstiefe für beide EOMs zu erreichen. Es ist am besten, EOM1 und EOM2 unabhängig voneinander zu optimieren. Wenn EOM1 eingeschaltet ist, muss EOM2 ausgesteckt werden und umgekehrt. Sobald beide Modulationen nahezu perfekt optimiert sind (>95% Modulationstiefe), werden beide EOMs miteinander verbunden, um eine orthogonale Modulation zu ermöglichen. Die Länge der Zeitverzögerung zwischen den beiden orthogonalen Pulszügen ist abhängig von der Länge des BRC und des Chirps. Diese Modulationsmethode ist für klinische Anwendungen nicht sofort durchführbar, da komplexe Elektronik benötigt wird, um zwei HF-Pulszüge mit einer abstimmbaren Phasenverschiebung zur Ansteuerung der beiden EOMs bereitzustellen. Die Ausrichtung des EOM muss auch nahezu perfekt sein, um eine hohe Transmission, eine gute Modulation und Orthogonalität zwischen den beiden Kanälen zu gewährleisten. Diese Technik ist im Allgemeinen auf andere Anwendungen anwendbar, die eine schnelle, gleichzeitige Abbildung von zwei Raman-Peaks aufgrund von Bewegungs- oder Probenänderungen erfordern. Beispiele hierfür sind Wassertemperaturmessungen oder die Verfolgung von sich bewegenden Objekten wie Lipidtröpfchen oder Organellen^11,19.

Für zukünftige klinische Anwendungen ist ein robuster Faserlaser erforderlich⁴. Der im Protokoll beschriebene Ansatz könnte auch erweitert werden, um die Erfassungsgeschwindigkeit bis zur Videorate zu verbessern, was wichtig ist, um große Gewebeproben innerhalb einer angemessenen Zeit zu scannen. Wenn die Bildgebungszeit oder Bewegungsartefakte kein Problem darstellen, können Protein- und Lipid-SRS-Bilder nacheinander erfasst werden, indem die motorisierte Verzögerung Bild für Bild verschoben wird. Ein weiteres zweifarbiges SRS-Bildgebungsverfahren in Echtzeit ist ein zweiphasiges Schema, das den Stokes-Strahl recycelt, um die gleichen beiden orthogonalen Kanäle²⁰ bereitzustellen. Die Implementierung des zweiphasigen Schemas erfordert jedoch eine zusätzliche Ausrichtung, die drei Balken umfasst. Es erfordert auch die Anpassung der Strahlgröße und der Divergenz von drei Laserstrahlen. Ein möglicher Weg, um beide Techniken zu verbessern, um die gleichzeitige Zwei-Farben-Grenze zu überwinden, ist der Einbau eines schnell abstimmbaren Faserlasers zur Untersuchung spezifischer Spektralbereiche²¹. Die Verarbeitung von Bildern ist die gleiche wie im Protokoll beschrieben, um simulierte H & E-Bilder zu generieren.

Schließlich demonstriert dieses Protokoll die Epi-Mode-SRS-Bildgebung. Es erzeugt typischerweise Bilder von geringerer Qualität im Vergleich zur Transmissionsmodus-Bildgebung für dünne Gewebeschnitte, da die Pumpleistung den Detektor¹³ erreicht. Für die Bildgebung von Dickgewebe (>1-2 mm) oder Proben, die stark streuend sind (z. B. Knochengewebe), kann die Epimode-Bildgebung besser funktionieren als die Bildgebung im Übertragungsmodus. Bei der Abbildung von frischem Gewebe wie Hirngewebe ist die SRS-Bildgebungstiefe typischerweise auf 200-300 μm begrenzt. Bei festsitzendem Gewebe ist die Streuung stärker und die Abbildungstiefe beträgt 100-200 μm. Tiefere Bildgebung kann mit höherer Leistung, Aberrationskorrektur oder optischem Clearing^22,23 erreicht werden. Dennoch ist die Epi-Mode-Bildgebung ein bevorzugter Ansatz für die Gewebediagnose, da keine Gewebedurchtrennung erforderlich ist und die Ausrichtung ohne den hohen NA-Kondensator einfacher ist. Zukünftige Anwendungen in der Gewebediagnose werden von einer schnellen, großflächigen Bildgebung an intakten chirurgischen Proben profitieren, gefolgt von maschinellem Lernen / Deep-Learning-basierter Diagnose. Das hier vorgestellte Protokoll eignet sich auch für In-vivo-Anwendungen wie Gehirnbildgebung oder Hautbildgebung, bei denen die Epimode-Bildgebung die einzige Option ist und Hochgeschwindigkeitsbildgebung wichtig ist, um Bewegungsartefakte zu vermeiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.