In tempo reale, a due colori stimolato Raman Scattering Imaging del cervello di topo per la diagnosi dei tessuti

Summary

La microscopia A dispersione Raman stimolata (SRS) è una tecnica di imaging potente, non distruttiva e priva di etichette. Un'applicazione emergente è l'istologia Raman stimolata, in cui l'imaging SRS a due colori nelle transizioni Raman proteiche e lipidiche viene utilizzato per generare immagini di pseudo-ematossilina ed eosina. Qui, dimostriamo un protocollo per l'imaging SRS a due colori in tempo reale per la diagnosi dei tessuti.

Abstract

La microscopia a dispersione Raman stimolata (SRS) è emersa come una potente tecnica di imaging ottico per la diagnosi dei tessuti. Negli ultimi anni, la SRS a due colori ha dimostrato di essere in grado di fornire immagini equivalenti a ematossilina ed eosina (H & E) che consentono una diagnosi rapida e affidabile del cancro al cervello. Tale capacità ha permesso interessanti applicazioni di diagnosi intraoperatoria del cancro. L'imaging SRS a due colori del tessuto può essere eseguito con una sorgente laser a picosecondi o femtosecondi. I laser a femtosecondi hanno il vantaggio di abilitare modalità di imaging flessibili, tra cui l'imaging iperspettrale veloce e l'imaging SRS a due colori in tempo reale. Un approccio di messa a fuoco spettrale con impulsi laser cinguettati viene in genere utilizzato con laser a femtosecondi per ottenere un'elevata risoluzione spettrale.

L'acquisizione SRS a due colori può essere realizzata con modulazione ortogonale e rilevamento lock-in. La complessità del cinguettio, della modulazione e della caratterizzazione degli impulsi è un collo di bottiglia per l'adozione diffusa di questo metodo. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per dimostrare l'implementazione e l'ottimizzazione della messa a fuoco spettrale SRS e l'imaging a due colori in tempo reale del tessuto cerebrale del topo in modalità epi. Questo protocollo può essere utilizzato per un'ampia gamma di applicazioni di imaging SRS che sfruttano l'alta velocità e la capacità di imaging spettroscopico di SRS.

Introduction

La diagnostica tissutale tradizionale si basa su protocolli di colorazione seguiti da un esame al microscopio ottico. Un metodo di colorazione comune utilizzato dai patologi è la colorazione H & E: l'ematossilina colora i nuclei cellulari di un blu violaceo e l'eosina colora la matrice extracellulare e il citoplasma rosa. Questa semplice colorazione rimane il gold standard in patologia per molti compiti di diagnosi tissutale, in particolare la diagnosi del cancro. Tuttavia, l'istopatologia H& E, in particolare la tecnica di sezionamento congelato utilizzata in un ambiente intraoperatorio, ha ancora dei limiti. La procedura di colorazione è un processo laborioso che coinvolge l'incorporamento del tessuto, il sezionamento, la fissazione e la colorazione¹. Il tempo di consegna tipico è di 20 minuti o più. L'esecuzione di H & E durante il sezionamento congelato a volte può diventare più impegnativa quando più sezioni vengono elaborate contemporaneamente a causa della necessità di valutare le caratteristiche cellulari o i modelli di crescita in 3D per la valutazione del margine. Inoltre, le tecniche istologiche intraoperatorie richiedono tecnici e clinici specializzati. La limitazione del numero di patologi certificati in molti ospedali è un vincolo per la consultazione intraoperatoria in molti casi. Tali limitazioni possono essere alleviate con gli interessi di rapido sviluppo nella patologia digitale e nella diagnosi basata sull'intelligenza artificiale². Tuttavia, i risultati della colorazione H & E sono variabili, a seconda dell'esperienza del tecnico, il che presenta ulteriori sfide per la diagnosi basata su computer².

Queste sfide possono potenzialmente essere affrontate con tecniche di imaging ottico senza etichetta. Una di queste tecniche è la microscopia SRS. SRS utilizza laser pulsati sincronizzati ( pompa e Stokes - per eccitare le vibrazioni molecolari con alta efficienza³. Recenti rapporti hanno dimostrato che l'imaging SRS di proteine e lipidi può generare immagini equivalenti A&E (note anche come istologia Raman stimolata o SRH) con tessuto fresco intatto, che bypassa la necessità di qualsiasi elaborazione tissutale, riduce significativamente il tempo necessario per la diagnosi ed è stato adattato intraoperatoriamente⁴. Inoltre, l'imaging SRS può fornire immagini 3D, che offrono informazioni aggiuntive per la diagnosi quando le immagini 2D sono insufficienti⁵. SRH è imparziale e genera immagini digitali che sono prontamente disponibili per la diagnosi basata su computer. Emerge rapidamente come una possibile soluzione per la diagnosi intraoperatoria del cancro e l'analisi del margine tumorale, specialmente nel cancro al cervello ^6,7,8. Più recentemente, l'imaging SRS dei cambiamenti chimici del tessuto è stato anche suggerito per fornire utili informazioni diagnostiche che possono ulteriormente aiutare i medici a stratificare diversi tipi di cancro o stadi⁹.

Nonostante il suo enorme potenziale nelle applicazioni di diagnosi tissutale, l'imaging SRS è per lo più limitato ai laboratori accademici specializzati in ottica a causa della complessità associata alla piattaforma di imaging, che include laser ultraveloci, il microscopio a scansione laser e sofisticata elettronica di rilevamento. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro dettagliato per dimostrare l'uso di una comune sorgente laser a femtosecondi per l'imaging SRS a due colori in tempo reale e la generazione di immagini pseudo-H & E dal tessuto cerebrale del topo. Il protocollo riguarderà le seguenti procedure:

Allineamento e ottimizzazione del cinguettio
La maggior parte degli schemi di imaging SRS utilizza laser a picosecondi o femtosecondi come fonte di eccitazione. Con i laser a femtosecondi, la larghezza di banda del laser è molto più grande della larghezza di linea Raman. Per superare questa limitazione, viene utilizzato un approccio di messa a fuoco spettrale per cinguettare i laser a femtosecondi su una scala temporale di picosecondi per ottenere una risoluzione spettrale ristretta¹⁰. La risoluzione spettrale ottimale si ottiene solo quando il cinguettio temporale (noto anche come dispersione del ritardo di gruppo o semplicemente dispersione) è correttamente abbinato per la pompa e i laser Stokes. La procedura di allineamento e i passaggi necessari per ottimizzare la dispersione dei raggi laser utilizzando barre di vetro altamente dispersive sono dimostrati qui.

Calibrazione della frequenza
Un vantaggio della messa a fuoco spettrale SRS è che l'eccitazione Raman può essere rapidamente regolata modificando il ritardo temporale tra la pompa e i laser Stokes. Tale sintonizzazione offre immagini veloci e un'acquisizione spettrale affidabile rispetto alla sintonizzazione delle lunghezze d'onda laser. Tuttavia, la relazione lineare tra frequenza di eccitazione e ritardo temporale richiede una calibrazione esterna. I solventi organici con picchi Raman noti vengono utilizzati per calibrare la frequenza Raman per la messa a fuoco spettrale SRS.

Imaging a due colori in tempo reale
È importante aumentare la velocità di imaging nelle applicazioni di diagnosi tissutale per ridurre il tempo necessario per l'analisi di campioni di tessuto di grandi dimensioni. L'imaging SRS simultaneo a due colori di lipidi e proteine evita la necessità di sintonizzare il laser o il ritardo temporale, il che aumenta la velocità di imaging di oltre due volte. Ciò si ottiene utilizzando una nuova tecnica di modulazione ortogonale e demodulazione a doppio canale con un amplificatore lock-in¹¹. Questo articolo descrive il protocollo per la modulazione ortogonale e l'acquisizione di immagini a doppio canale.

Imaging SRS in modalità Epi
La maggior parte delle immagini SRS mostrate fino ad oggi viene eseguita in modalità di trasmissione. L'imaging in modalità epi rileva i fotoni retrodiffusi dal tessuto¹². Per le applicazioni di patologia, i campioni chirurgici possono essere piuttosto grandi. Per l'imaging in modalità di trasmissione, è spesso necessario il sezionamento dei tessuti, che richiede indesiderabilmente tempo extra. Al contrario, l'imaging in modalità epi può funzionare con campioni chirurgici intatti. Poiché lo stesso obiettivo viene utilizzato per raccogliere la luce retrodiffusa, non è inoltre necessario allineare un condensatore ad alta apertura numerica necessario per l'imaging della trasmissione. La modalità Epi è anche l'unica opzione quando il sezionamento dei tessuti è difficile, come con l'osso. In precedenza abbiamo dimostrato che per il tessuto cerebrale, l'imaging in modalità epi offre una qualità di imaging superiore per lo spessore del tessuto > 2 mm¹³. Questo protocollo utilizza uno splitter a fascio polarizzatore (PBS) per raccogliere fotoni sparsi depolarizzati dal tessuto. È possibile raccogliere più fotoni con un rivelatore anulare a scapito della complessità del gruppo rivelatore personalizzato¹². L'approccio PBS è più semplice da implementare (simile alla fluorescenza), con il fotodiodo standard già utilizzato per il rilevamento della modalità di trasmissione.

Generazione di immagini Pseudo-H&E
Una volta raccolte le immagini SRS a due colori, possono essere ricolorate per simulare la colorazione H & E. Questo documento dimostra la procedura per convertire le immagini SRS lipidiche e proteiche in immagini SRS pseudo-H & E per applicazioni patologiche. Il protocollo sperimentale descrive in dettaglio i passaggi critici necessari per generare immagini SRS di alta qualità. La procedura mostrata qui non è solo applicabile alla diagnosi tissutale, ma può anche essere adattata per molte altre applicazioni di imaging SRS iperspettrale come l'imaging farmacologico e l'imaging metabolico^14,15.

Requisiti generali di sistema
Il sistema laser per questo protocollo deve essere in grado di emettere 2 raggi laser sincronizzati a femtosecondi. I sistemi sono idealmente dotati di un oscillatore parametrico ottico (OPO) per la sintonizzazione ad ampia lunghezza d'onda di uno dei raggi laser. La configurazione di questo protocollo utilizza un sistema laser commerciale Insight DS + che emette due laser (un raggio fisso a 1.040 nm e un raggio sintonizzabile basato su OPO, che va da 680 a 1.300 nm) con una frequenza di ripetizione di 80 MHz. I microscopi a scansione laser, sia dei principali produttori di microscopi che costruiti in casa, possono essere utilizzati per l'imaging SRS. Il microscopio utilizzato è un microscopio a scansione laser verticale costruito sopra un telaio per microscopio verticale commerciale. Una coppia di specchi galvo da 5 mm viene utilizzata per scansionare il raggio laser. Per gli utenti che scelgono di adottare un microscopio a scansione laser costruito in casa, fare riferimento a un protocollo precedentemente pubblicato per la costruzione di un microscopio a scansione laser¹⁶.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state condotte con cervelli di topo a sezione fissa da 200 μm, in conformità con il protocollo (# 4395-01) approvato dall'Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Washington. I topi wild-type (ceppo C57BL/6J) vengono eutanasizzati con CO₂. Quindi, viene eseguita una craniotomia per estrarre i loro cervelli per la fissazione in paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato. I cervelli sono incorporati in una miscela di agarosio al 3% e gelatina allo 0,3% e sezionati in fette spesse 200 μm da un vibratoma.

1. Allineamento iniziale

NOTA: assicurarsi che le dimensioni del fascio e la divergenza di entrambi i bracci siano abbinate per la migliore sensibilità e risoluzione. Collimate la pompa e i raggi Stokes e regolate le loro dimensioni prima che entrino nel microscopio a scansione laser. Per fare questo, utilizzare un paio di lenti acromatiche per ogni fascio prima di combinarle sullo specchio dicroico. Indossare sempre occhiali laser adeguati per l'allineamento del fascio.

1. Collimazione del fascio
   1. Installare un paio di lenti acromatiche per il fascio della pompa. Come punto di partenza, utilizzare un obiettivo da 100 mm e un obiettivo da 200 mm per ingrandire le dimensioni del raggio laser di 2 volte. Assicurarsi che la distanza dei due obiettivi sia di circa 300 mm. Allineare il fascio della pompa attraverso il centro di entrambe le lenti.
   2. Posizionare uno specchio dopo la seconda lente per inviare il raggio verso una parete (>1 m di distanza). Fare attenzione quando si invia il raggio su lunghe distanze. Traccia il raggio dallo specchio alla parete con una scheda IR e controlla se il raggio cambia di dimensioni. Collimare il raggio se il raggio cambia di dimensioni in funzione della distanza.
      1. Se il fascio è convergente (diminuendo le dimensioni con la propagazione), avvicinare le due lenti.
      2. Se il fascio è divergente (aumentando le dimensioni con la propagazione), spostare le due lenti più lontano. Regolare la distanza fino a quando il raggio non è collimato.
   3. Ripetere i passaggi 1.1.1 e 1.1.2 affinché la trave di Stokes collimi la trave.
2. Regolazione della dimensione del fascio
   1. Se è disponibile un profilatore a fascio, misurare la dimensione del fascio collimato per ogni trave. In alternativa, stimare la dimensione del fascio utilizzando la scheda IR e un righello per ottenere un diametro del fascio di 4-5 mm.
   2. Se la dimensione del fascio è troppo piccola o troppo grande, modificare la coppia di obiettivi utilizzata nel passaggio 1.1. Regolare la coppia di lenti fino a quando entrambi i fasci hanno un diametro di 4-5 mm.
      NOTA: l'ingrandimento del fascio è il rapporto tra la lunghezza focale del secondo obiettivo e il primo obiettivo (f₂/f₁).
3. Sovrapposizione spaziale
   NOTA: l'imaging SRS richiede che entrambi i raggi laser siano combinati nello spazio e nel tempo per eccitare le vibrazioni molecolari. Uno schema dell'imaging SRS a messa a fuoco spettrale è mostrato nella Figura 1.
   1. Combina i due raggi laser installando uno specchio dicroico con diversi specchietti dello sterzo per la regolazione. Ottimizza la sovrapposizione spaziale della pompa e di Stokes monitorando i fasci dopo lo specchio dicroico in due diverse posizioni distanti (~1 m). Regolare iterativamente lo specchietto retrovisore prima dello specchio dicroico e dicroico per allineare il fascio di Stokes con il fascio della pompa.
      NOTA: se le due travi si sovrappongono spazialmente in entrambe le posizioni, sono sufficientemente sovrapposte.
   2. Assicurarsi che i raggi combinati vengano inviati al centro degli specchi di scansione del microscopio a scansione laser regolando una coppia di specchi sterzanti quando gli specchietti retrovisori sono parcheggiati. Assicurarsi che entrambi i fasci viaggino attraverso il centro dell'obiettivo del microscopio e il condensatore.
   3. Dopo il condensatore, utilizzare un'altra coppia di obiettivi con lunghezze focali di 100 mm e 30 mm, rispettivamente, per trasmettere il fascio trasmesso sul fotodiodo. Assicurarsi che entrambi i fasci siano contenuti all'interno del fotodiodo e installare due filtri passa-basso per bloccare il fascio di Stokes modulato.

2. Rilevamento del segnale SRS

1. Modulazione elettroottica (EOM)
   NOTA: EOM di 20 MHz viene utilizzato per modulare l'ampiezza di Stokes. Come discusso in seguito, l'EOM è derivato dal treno di impulsi laser a 80 MHz, necessario per la modulazione ortogonale. Altre frequenze di modulazione possono essere utilizzate se viene eseguito solo SRS monocolore o iperspettrale. In tal caso, la sincronizzazione della frequenza di modulazione con la frequenza laser non è necessaria. Un generatore di frequenza con un amplificatore di potenza RF può essere utilizzato per pilotare l'EOM. Di conseguenza, i passaggi 2.1.1-2.1.4 possono essere ignorati.
   1. Posiziona un campionatore di fascio nel percorso del fascio di Stokes per raccogliere il 10% del raggio e inviarlo a un fotodiodo veloce per rilevare il treno di impulsi a 80 MHz.
      NOTA: il segnale del fotodiodo viene inviato a un divisore di frequenza per generare un'uscita TTL a 20 MHz. Questa uscita viene ulteriormente inviata in un buffer fanout per replicare l'uscita in quattro uscite identiche a 20 MHz. Una delle uscite viene utilizzata per attivare l'oscilloscopio.
   2. Prendi una delle uscite del buffer fanout e filtrala con un filtro passabanda per ottenere un'onda sinusoidale a 20 MHz. Utilizzare un attenuatore RF per regolare la tensione da picco a picco di uscita a ~500 mV.
   3. Inviare l'uscita risultante a uno sfasatore, che consente la regolazione fine della fase RF con una sorgente di tensione. Inviare questa uscita a un amplificatore di potenza RF e collegare l'uscita dell'amplificatore all'EOM.
   4. Sblocca il fascio di Stokes e ottimizza la profondità di modulazione di EOM1 posizionando un fotodiodo nel percorso del fascio. Regolare la tensione EOM e la piastra a quarto d'onda fino a quando la profondità di modulazione (rapporto valle-picco) appare soddisfacente.
      NOTA: Alla modulazione di 20 MHz (1/4 della frequenza di ripetizione laser), sono previsti due impulsi ogni 50 ns.
2. Sovrapposizione temporale
   NOTA: la sovrapposizione temporale della pompa e di Stokes si ottiene ritardando uno dei due treni di impulsi laser con un catadiottro montato su uno stadio di ritardo (la Figura 1 mostra lo Stokes in ritardo). La sovrapposizione grossolana viene monitorata con l'oscilloscopio e la sovrapposizione fine viene monitorata dal segnale SRS. La sovrapposizione temporale fine può anche essere ottenuta con un autocorrelatore, se disponibile.
   1. Posizionare un fotodiodo dopo lo specchio dicroico per rilevare il raggio laser. Blocca prima la trave di Stokes. Ingrandire uno dei picchi di impulso della pompa sull'oscilloscopio. Posizionare un cursore verticale per contrassegnare la posizione temporale di questo picco con l'oscilloscopio.
   2. Bloccare il raggio della pompa e sbloccare il raggio di Stokes. Traduci lo stadio di ritardo in modo che corrisponda temporalmente la posizione di picco sull'oscilloscopio alla posizione contrassegnata nel passaggio precedente. Vedere la Figura 2 per una visualizzazione della sovrapposizione temporale di due fasci.
      1. (FACOLTATIVO) Se la traslazione dello stadio di ritardo è insufficiente per abbinare temporalmente i due raggi, spostare lo stadio di ritardo al centro del suo intervallo di movimento.
      2. Calcola la distanza di ritardo necessaria per abbinare i due fasci prendendo la differenza temporale tra i due fasci e moltiplicando la differenza per la velocità della luce per trovare la quantità di distanza necessaria per abbinare i due fasci temporalmente.
      3. Allungare il percorso del fascio del raggio più veloce o accorciare il percorso del raggio più lento per corrispondere approssimativamente al ritardo temporale di conseguenza.
   3. Preparare un campione di vetrino per microscopio con DMSO e nastro biadesivo come distanziatore per tenere il campione tra il vetrino e un coperchio.
   4. Posizionare il campione sul microscopio con il lato coverslip rivolto verso l'obiettivo del microscopio. Cambiare il microscopio con illuminazione a campo luminoso e osservare il campione dall'oculare. Trova il fuoco del campione trovando prima lo stato attivo sia nello strato superiore che in quello inferiore delle bolle d'aria nell'interfaccia vetro-nastro, quindi sposta lo stato attivo in modo che si trovi tra i due strati di nastro.
      NOTA: assicurarsi che i raggi laser siano bloccati prima di esaminare l'oculare.
   5. Impostare l'uscita del fascio sintonizzabile su 798 nm. In base al throughput ottico del condensatore, regolare la potenza ottica in modo che sia di ~ 40 mW ciascuno per la pompa e i fasci di Stokes alla messa a fuoco dell'obiettivo.
   6. Apri ScanImage in MATLAB (o altro software di scansione che controlla il microscopio) e fai clic sul pulsante FOCUS per avviare la scansione.
      NOTA: i raggi laser verranno scansionati raster attraverso il campione per generare un'immagine. L'uscita del segnale a bassa frequenza dal fotodiodo (<100 kHz) viene inviata direttamente nel canale 1 della scheda di acquisizione dati (denominato canale CC). L'uscita ad alta frequenza (>100 kHz) dal fotodiodo viene inviata all'amplificatore lock-in e l'uscita X del segnale dell'amplificatore lock-in viene inviata al canale 2 della scheda di acquisizione dati (denominato canale CA).
   7. Regolare lo specchietto retrovisore prima dello scanner galvo per centrare il segnale CC sul display del canale 1. Spostare lo stadio di ritardo motorizzato e osservare da vicino l'uscita di blocco mostrata sul display del canale 2 (cioè il canale CA).
      NOTA: quando la pompa e Stokes coincidono nel tempo, un segnale apparirà sul canale CA. È utile regolare la scala dei colori del canale CA per visualizzare la piccola variazione di intensità.
   8. Massimizza l'intensità del segnale CA regolando finemente il ritardo temporale. Regolare lo specchio dicroico per centrare il segnale SRS sul canale CA (mantenendo centrato il canale CC). Regolare la fase dell'amplificatore lock-in per massimizzare il segnale. Vedere la Figura 3 per un segnale soddisfacente.

3. Ottimizzazione della risoluzione spettrale

NOTA: la pompa e i fasci di Stokes che raggiungono il campione devono avere la stessa quantità di dispersione del ritardo di gruppo (GDD) per massimizzare la risoluzione spettrale. La dispersione dipende fortemente dall'impostazione sperimentale. La configurazione sperimentale qui descritta utilizza impulsi a femtosecondi a 1.040 nm e 800 nm come Stokes e pompa, rispettivamente. Le aste di vetro a pietra focaia densa (H-ZF52A) sono utilizzate come mezzo di allungamento degli impulsi.

1. Inserire 48 cm di un'asta di vetro altamente dispersiva (H-ZF52A o vetro flint denso equivalente) nel percorso del fascio di 800 nm. Stimare il GDD utilizzando Eq (1):
   (1)
   NOTA: GVD di vari materiali di vetro a diverse lunghezze d'onda può essere trovato dalla risorsa del database dell'indice di rifrazione. Ad esempio, H-ZF52A ha un GVD di 220,40 fs²/mm a 800 nm. Il GDD totale è 105792 fs².
2. Calcola quanti cm dell'asta di vetro dispersiva è necessario aggiungere al percorso del fascio di 1.040 nm per abbinare il GDD della pompa. Inserire la lunghezza appropriata delle barre di vetro dispersive nel percorso del fascio di 1.040 nm per corrispondere approssimativamente al GDD del raggio da 800 nm. Si noti che l'aggiunta di aste di vetro cambierà la sovrapposizione temporale delle due travi e potrebbe essere necessaria la regolazione del ritardo.
3. Calibrazione della risoluzione spettrale
   1. Fai un campione di vetrino al microscopio con DMSO. Posizionare il vetrino sul microscopio e controllare la potenza dei fasci che escono dal condensatore del microscopio. Regolare la potenza di conseguenza per avere ~ 40 mW ciascuno a fuoco del campione.
   2. Apri ScanImage da MATLAB. Trova il segnale SRS massimo scansionando attraverso lo stadio di ritardo, che corrisponde al picco Raman di 2.913 ^cm-1 di DMSO. Stimare la posizione dello stadio in base alla posizione dello stadio precedente con l'aumento della lunghezza del percorso ottico dovuto all'inserimento delle aste. Riallineare la sovrapposizione spaziale del fascio a causa della piccola deviazione del raggio quando vengono aggiunte aste di vetro.
   3. Salvare una scansione SRS iperspettrale scattando in sequenza una serie di immagini SRS mentre si sposta lo stadio motorizzato.
      NOTA: l'intervallo di scansione ritardata copre due picchi Raman, corrispondenti rispettivamente ai picchi Raman di ^{2.913 cm-1} e 2.994 ^cm-1 di DMSO. Queste due transizioni si osservano quando si utilizza una pompa da 800 nm e un laser Stokes da 1.040 nm.
   4. Traccia gli spettri SRS della soluzione DMSO utilizzando ImageJ o MATLAB. Adatta il grande picco DMSO 2.913 ^cm-1 a una funzione gaussiana o lorentziana in MATLAB per calcolare la larghezza completa a metà massimo (FWHM) del picco.
      NOTA: i risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 4. Se è presente un solo picco ampio, significa che la risoluzione spettrale è troppo scarsa per distinguere i due picchi e sono necessarie più aste di vetro, oppure che l'intervallo scansionato era troppo piccolo per rilevare il secondo picco. In genere, una risoluzione spettrale accettabile DMSO è ~ 20-25 ^cm-1 quando vengono utilizzate aste di vetro di lunghezza >60 cm. Una risoluzione inferiore viene spesso utilizzata per l'imaging tissutale per scambiare segnali più alti con impulsi più brevi¹⁷.
4. (FACOLTATIVO) Utilizzare un autocorrelatore o un FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) per determinare la durata dell'impulso di ciascun braccio per calcolare esattamente la quantità di GDD e la lunghezza delle aste necessarie per abbinare il GDD tra la pompa e lo Stokes.
5. Ripetere i passaggi 3.3.2-3.3.4 per diverse lunghezze di aste sul fascio di Stokes per trovare la risoluzione spettrale ottimale, il che significa che la migliore corrispondenza GDD è stata trovata sperimentalmente. Utilizzare più set di aste di vetro di lunghezza diversa per ottenere una risoluzione spettrale ottimale.

4. Caratterizzazione segnale-rumore (SNR)

1. Assicurarsi che il passaggio 4.2 venga eseguito dopo il completo allineamento spaziale e temporale.
2. Acquisire un'immagine SRS corrispondente al picco Raman di 2.913 ^cm-1 di DMSO. Aprite l'immagine in ImageJ e selezionate una piccola area al centro della cornice. Utilizzare la funzione di misura per calcolare la deviazione media e standard dei valori nell'area selezionata.
3. Dividere il valore medio dell'area selezionata per la deviazione standard per trovare il valore SNR, come in Eq (2).
   (2)
   NOTA: Un buon SNR per il sistema (con una costante di tempo di lock-in di 4 μs) che utilizza DMSO a 40 mw/40 mw a fuoco per entrambi i bracci è >800. Concentrazioni più basse di DMSO o minore potenza possono essere utilizzate per una stima più accurata dell'SNR se la scheda di acquisizione dati ha una profondità di bit limitata.
4. Se l'SNR è troppo basso, riallineare gli impulsi laser per ottimizzare la sovrapposizione spaziale, la sovrapposizione temporale, la corrispondenza tra dimensioni del fascio e collimazione e/o la corrispondenza di dispersione. Per un obiettivo con un collare di correzione dell'aberrazione, ottimizzare il segnale regolando il collare di correzione.

5. Calibrazione dell'asse di frequenza

NOTA: questo passaggio viene eseguito per correlare la posizione dello stadio di ritardo alla transizione Raman scansionata. È necessaria un'attenta selezione dei solventi per generare un "Raman Ruler" appropriato. DMSO è un solvente efficace per i legami CH in quanto ha due picchi Raman affilati a 2.913 ^cm-1 e 2.994 ^cm-1.

1. Salva una scansione iperspettrale con l'intervallo dello stadio di ritardo che copre i picchi Raman di ^{2.913 cm-1} e 2.994 ^cm-1 di DMSO. Salvare le posizioni dello stage corrispondenti al set di dati iperspettrale.
   NOTA: Il picco massimo globale dello spettro corrisponde allo spostamento Raman DMSO 2.913 ^cm-1 e il secondo picco massimo corrisponde allo spostamento Raman DMSO 2.994 ^cm-1 .
2. Eseguire la regressione lineare per le posizioni del palco e gli spostamenti Raman a 2.913 ^cm-1 e 2.994 ^cm-1. Usando l'equazione di regressione lineare che mette in relazione la posizione dello stadio con lo spostamento Raman, converti le posizioni di ritardo nelle frequenze Raman corrispondenti.

6. Modulazione ortogonale e imaging a due colori

NOTA: la fase di modulazione ortogonale è necessaria solo quando è necessaria l'imaging a due colori in tempo reale. Uno schema di questo schema è mostrato nella Figura 5. La modulazione ortogonale utilizza una coppia di EOM guidate a un quarto della frequenza laser (20 MHz per laser a 80 MHz) con uno sfasamento di 90° tra i due. Questa fase di modulazione ortogonale può essere saltata per l'imaging SRS a colore singolo o l'imaging SRS iperspettrale.

1. Modulazione EOM1
   1. Installare un PBS (PBS2), una piastra a quarto d'onda (QWP2) e un secondo EOM (EOM2) nel percorso del fascio di Stokes dopo il primo EOM. Scollegare l'ingresso del segnale a EOM2. Collegare l'ingresso del segnale a EOM1 e accenderlo.
   2. Modula il fascio di Stokes (fissato a 1.040 nm) a 20 MHz (f₀/4) inviando il raggio attraverso il primo EOM. Regola l'inclinazione e la posizione di EOM1 per assicurarti che il raggio colpisca dritto e centrato attraverso il cristallo EOM.
   3. Monitorare la profondità di modulazione osservando entrambe le polarizzazioni in uscita da PBS1 con due fotodiodi e visualizzando la modulazione su un oscilloscopio.
   4. Regolare la tensione QWP1, EOM1 e la fase dell'ingresso a 20 MHz (utilizzando uno sfasatore) per ottimizzare la profondità di modulazione del fascio trasmesso in modo che sia vicina al 100%. Vedere la Figura 2B per un'illustrazione di una buona profondità di modulazione.
2. Modulazione EOM2
   1. Scollegare EOM1 e collegare EOM2.
   2. Invia l'uscita ad alta tensione del secondo amplificatore a 20 MHz a EOM2. Regola l'inclinazione e la posizione di EOM2 per assicurarti che il raggio colpisca dritto e centrato attraverso il cristallo EOM.
   3. Ancora una volta, monitora la profondità di modulazione osservando entrambe le polarizzazioni che escono da PBS2 con un oscilloscopio. Regolare la tensione QWP2, EOM2 e lo sfasatore secondo necessità per ottenere una modulazione vicina al 100% per entrambe le polarizzazioni.
   4. Assicurarsi che la modulazione del treno di impulsi abbia uno sfasamento di 90° rispetto alla prima modulazione.
      NOTA: Se i due treni di impulsi della pompa non sono ortogonali a 90 °, la diafonia tra i due canali sarà un problema.
   5. Testare l'ortogonalità della modulazione accendendo e collegando sia EOM1 che EOM2. Monitorare entrambe le polarizzazioni divise da PBS2 con un oscilloscopio. Riottimare EOM1 e EOM2 singolarmente se il treno di impulsi dopo il secondo PBS non è simile alla Figura 2C.
   6. Installare un cristallo di quarzo birifrangente da 20 mm (BRC) e HWP a valle di EOM2. Collegare entrambe le EOM contemporaneamente e monitorare il treno di impulsi in modo che assomigli alla Figura 2D.
      NOTA: Per il cinguettio utilizzato in questo esperimento, 20 mm BRC induce un ritardo temporale che corrisponde a uno spostamento Raman di 80 ^cm-1 . Potrebbe essere necessaria una lunghezza BRC diversa se viene utilizzato un cinguettio diverso.
3. Taratura
   1. Calibrare il sistema utilizzando DMSO rilevando i segnali dall'uscita del canale X e Y dell'amplificatore lock-in (inviati ai canali 2 e 3 della scheda di acquisizione dati).
   2. Verificare se i segnali generati dal picco di 2.913 ^cm-1 dalla polarizzazione più veloce e quelli dalla polarizzazione più lenta sono vicini a 90° fuori fase sull'amplificatore lock-in. In caso contrario, regolare l'allineamento EOM fino a quando i due segnali non sono vicini a 90° fuori fase.
   3. Una volta completata la calibrazione, trova la posizione di ritardo che sonda la transizione proteica a 2.930 ^cm-1 per uno dei fasci ortogonali. Assicurarsi che l'altra polarizzazione sonde la transizione lipidica di 2.850 ^cm-1.

7. Imaging SRS in modalità Epi

NOTA: nello schema di imaging in modalità di trasmissione, l'obiettivo focalizza il laser nel campione e quindi una lente a condensatore dirige il raggio trasmesso verso un fotodiodo per il rilevamento lock-in. Nello schema di imaging epi-mode, la luce retrodiffusa e depolarizzata dal campione viene raccolta dall'obiettivo di messa a fuoco e isolata utilizzando uno splitter a fascio polarizzante. I fotoni isolati e retrodiffusi vengono inviati a un fotodiodo attraverso un paio di lenti a relè per il rilevamento del lock-in. La Figura 6 illustra lo schema di imaging epi-mode.

1. Installare un HWP prima che il fascio entri nel microscopio per modificare la polarizzazione del fascio che entra nel microscopio. Posizionare un PBS sopra l'obiettivo per consentire al fascio depolarizzato retroriflettente di raggiungere il rilevatore.
2. Utilizzare una coppia di obiettivi costituiti da una lente acromata da 75 mm e una lente asferica da 30 mm per trasmettere i fotoni retrodiffusi dall'apertura posteriore dell'obiettivo al fotorivelatore. Montare il rilevatore per raccogliere la luce retrodiffusa diretta dal PBS. Installare un filtro per impedire al fascio modulato di entrare nel rilevatore.
3. Posizionare il campione di tessuto sotto l'obiettivo. Poiché il condensatore non è necessario per l'imaging in modalità epi, rimuoverlo se è necessario più spazio.
4. Imaging
   1. Bloccare il raggio con un otturatore; far brillare una sorgente di luce bianca sul campione dal lato; e usa brightfield per trovare una messa a fuoco obiettiva.
   2. Sblocca entrambi i fasci e utilizza le posizioni di ritardo precalibrate per acquisire immagini SRS lipidiche e proteiche dal tessuto dalle due uscite dell'amplificatore lock-in.
   3. Regola il guadagno di lock-in e il fattore pixel bin per acquisire immagini di buona qualità.

8. Colorazione a falsi colori

1. Aprire lo stack di immagini con ImageJ.
2. Estrai le due immagini che corrispondono alla specie lipidica (2.850 ^cm-1) e proteica (2.930 ^cm-1) facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e facendo clic su Duplica.
3. Rinominare l'immagine lipidica in lipidi e l'immagine proteica in proteine.
4. Vai a | processo Image Calculator e le proteine performano sottrarre lipidi.
5. Combina le immagini andando su Image | | colore Unisci i canali, impostando i lipidi su verde e le proteine su blu. Aprire lo strumento canali immagine (Image | | colore Strumento Canali) e regola la luminosità e il contrasto (Image | Regolare | Luminosità/Contrasto).
6. Regola la luminosità e il contrasto per ogni canale utilizzando lo strumento canali . Per il canale lipidico, regolare il contrasto fino a quando le caratteristiche cellulari appaiono scure. Per il canale proteico, regolare il contrasto fino a quando le caratteristiche cellulari appaiono blu. Converti l'immagine verde/blu del canale unito in un'immagine RGB andando su Immagine | Tipo | Colore RGB. Esporta questa immagine tramite File | Salva con nome | Tiff.
   NOTA: per la falsa colorazione H & E, la combinazione di colori mostra il citoplasma rosa, mentre i nuclei sono blu-viola scuro.
7. Scarica lo script HE.m MATLAB dalla falsa risorsa script di colorazione H&E nella Tabella dei materiali.
8. Esegui lo script HE.m in MATLAB. Selezionare l'immagine RGB esportata dal passaggio precedente per generare un'immagine macchiata artificialmente H&E.
9. (FACOLTATIVO) Normalizza l'intensità dell'immagine per immagini con un campo visivo di grandi dimensioni perché l'immagine appare più scura nella periferia che al centro.
   1. Per eseguire la normalizzazione sul campo delle immagini, calcolare la media del maggior numero possibile di immagini. Quindi, rimuovete le feature di intensità con ImageJ (Process | Filtri | Gaussian Blur | Raggio=50).
   2. Misurare l'intensità massima dell'immagine sfocata (CTRL+M). Dividere l'immagine sfocata per l'intensità massima (Process | matematica | Dividere). Dividere l'immagine SRS raw per l'immagine sfocata (Process | | immagine Calcolatrice).

Representative Results

Ottimizzazione della risoluzione spettrale:
La dispersione attraverso un materiale è influenzata dal mezzo dispersivo (lunghezza e materiale) e dalla lunghezza d'onda. La modifica della lunghezza dell'asta di dispersione influisce sulla risoluzione spettrale e sulla dimensione del segnale. È una relazione di dare e avere che può essere pesata in modo diverso a seconda dell'applicazione. Le aste allungano l'impulso del fascio dall'essere largo in frequenza e stretto nel tempo ad essere stretto in frequenza e largo nel tempo. La Figura 7 mostra l'effetto delle diverse lunghezze delle aste sulla risoluzione spettrale. La Figura 7A mostra una risoluzione spettrale molto scarsa; questa configurazione non ha aste di cinguettio del vetro e i due picchi Raman di DMSO non sono affatto risolti. Nella Figura 7B,C, un aumento del numero di aste di cinguettio del vetro inizia a risolvere i due picchi. Infine, la Figura 7D mostra come il cinguettio abbinato risolve entrambi i picchi e può essere utilizzato per calibrare le posizioni dello stadio in base alla frequenza.

Calibrazione con DMSO:
DMSO ha due picchi Raman affilati a 2.913 e 2.994 ^cm-1 che sono convenienti per la calibrazione nella regione C-H. Una volta ottenuto uno spettro DMSO da una scansione SRS iperspettrale, una semplice regressione lineare converte la posizione dello stadio nello spostamento Raman. Se la risoluzione spettrale è scarsa (come mostrato nella Figura 7A) e i due picchi non sono separabili, allora la calibrazione con regressione lineare è impossibile. In questo caso, è necessaria una migliore corrispondenza della dispersione aggiungendo o rimuovendo aste di vetro. Le difficoltà più comuni nel trovare un segnale DMSO per la calibrazione sono dovute a errori nella sovrapposizione temporale o nella sovrapposizione spaziale dei due fasci. Prima di tentare la calibrazione DMSO, ripetere i passaggi di allineamento spaziale e temporale per ottimizzare il segnale SRS.

DMSO bicolore:
In SRS a due colori, due treni di impulsi di pompa vengono generati con polarizzazione ortogonale con un ritardo temporale fisso (dovuto a un cristallo birifrangente). La valutazione della profondità di modulazione e dello sfasamento di 90° viene effettuata con un fotodiodo seguito da un segnale DMSO SRS. La Figura 8 mostra la profondità di modulazione accettabile e la separazione temporale. Sebbene la risoluzione spettrale del DMSO nella Figura 8 non sia l'ideale, viene spesso sacrificata negli esperimenti di imaging tissutale per ottenere un segnale più alto con impulsi più brevi. La figura 9 mostra scarsi sfasamenti che danno origine a picchi invertiti o negativi.

SRS a due colori del tessuto cerebrale del topo in modalità epi:
Epi-mode (rilevamento di fotoni retrodiffusi) SRS viene utilizzato per l'imaging di tessuti spessi (>1 mm). La Figura 10A,B mostra l'imaging SRS bicolore in tempo reale a 2.850 ^cm-1 e 2.930 ^cm-1 di tessuto cerebrale di topo ex vivo. Le immagini grezze dei canali lipidico e proteico (Figura 10A,B) sono state codificate a colori per produrre una singola immagine raffigurante i contributi lipidici e proteici (Figura 10C). È stata eseguita una falsa colorazione H&E (Figura 10D) sulla Figura 10C per imitare la colorazione H&E. Una scarsa qualità di imaging può essere il risultato di un'ampia profondità di imaging o di una scarsa calibrazione (asse di frequenza o profondità di modulazione). La profondità di imaging tipica nel tessuto cerebrale è 100-200 μm¹³.

Figura 1: Schema della configurazione dell'imaging SRS a un colore. Costruzione di un microscopio SRS a focalizzazione spettrale in modalità di trasmissione. X e Y rappresentano le uscite ortogonali. Abbreviazioni: SRS = scattering Raman stimolato; DL = linea di ritardo basata su retroriflettore; Div = divisore; FB = buffer di fanout; AT = attenuatore; PS = sfasatore; PA = amplificatore di potenza; DCM = specchio dicroico; GM = specchi galvo; EOM = modulatore elettroottico; POM = specchio pick-off; PBS = splitter a fascio polarizzante, BRC = cristallo birifrangente; QWP = piastra a quarto d'onda; HWP: piastra a mezza onda; PD = fotodiodo; GR = asta di vetro; BB = Blocco fascio; SPF = filtro a passo corto; CL = lente collimante; BS = dimensione del fascio che cambia lente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sovrapposizione temporale rappresentativa. (A) La pompa e i fasci di Stokes si vedono essere temporaneamente sovrapposti sull'oscilloscopio. I cursori dell'oscilloscopio vengono utilizzati per contrassegnare le posizioni temporali della pompa e dei fasci di Stokes. Questa sovrapposizione è soddisfacente come punto di partenza per modificare ulteriormente la sovrapposizione temporale con una fase di ritardo. (B) Profondità di modulazione rappresentativa soddisfacente di una EOM a 20 MHz. (C) Modulazione soddisfacente degli impulsi mentre sono in uso due EOM. (D) Modulazione soddisfacente del treno di impulsi dopo l'installazione di cristallo di quarzo birifrangente e piastra a mezza onda sul braccio stokes doppiamente modulato. Abbreviazione: EOM = modulatore elettroottico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Segnali SRS e pompe rappresentativi. (A) Segnale della pompa disallineato rilevato nel canale CC. (B) Segnale SRS disallineato rilevato dal fotodiodo. (C) Segnale della pompa soddisfacente e centrato nel canale CC. (D) Segnale SRS soddisfacente centrato sul canale CA. Abbreviazione: SRS = scattering Raman stimolato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Caratterizzazione della risoluzione spettrale. Una funzione gaussiana era adatta al picco DMSO Raman ^{di 2.913 cm-1} . Il FWHM calcolato ha dato una risoluzione di 15 ^cm-1 per il sistema. Abbreviazioni: DMSO = dimetilsolfossido; FWHM = Larghezza completa a metà massimo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Schema della configurazione dell'imaging SRS a due colori. Costruzione di un microscopio SRS bicolore in modalità di trasmissione. X e Y rappresentano le uscite ortogonali. Abbreviazioni: DL = linea di ritardo basata su retroriflector; Div = divisore; FB = buffer di fanout; AT = attenuatore; PS = sfasatore; PA = amplificatore di potenza; DCM = specchio dicroico; GM = specchi galvo; EOM = modulatore elettroottico; PBS = spaccatelo polarizzante; BRC = cristallo birifrangente; QWP = piastra a quarto d'onda; HWP = piastra a mezza onda; PD = fotodiodo; GR = asta di vetro; BB = Beam Block, SPF = filtro shortpass; CL = lente collimante; POM = specchio pick-off; BS = dimensione del fascio che cambia lente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Schema della configurazione in modalità Epi dell'imaging SRS a due colori. Costruzione di un microscopio SRS bicolore in modalità epi. X e Y rappresentano le uscite ortogonali. Abbreviazioni: DL = linea di ritardo basata su retroriflector; Div = divisore; FB = buffer di fanout; AT = attenuatore; PS = sfasatore; PA = amplificatore di potenza; DCM = specchio dicroico; GM = specchi galvo; EOM = modulatore elettroottico; PBS = spaccatelo polarizzante; BRC = cristallo birifrangente; QWP = piastra a quarto d'onda; HWP = piastra a mezza onda; PD = fotodiodo; GR = asta di vetro; BB = Beam Block, BPF = filtro passa-banda; CL = lente collimante; POM = specchio pick-off; BS = dimensione del fascio che cambia lente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Ottimizzazione della risoluzione spettrale con il 25% di DMSO. (A) Per ottenere lo spettro DMSO sono state utilizzate barre di cinguettio di vetro zero. I due picchi non sono risolti. (B) Sono state utilizzate aste di cinguettio in vetro, 20 cm sul braccio della pompa e 24 cm sul braccio Stokes. Due picchi stanno iniziando a essere risolti a un punto soddisfacente. (C) Sono state utilizzate aste di cinguettio, pompa lunga 40 cm e Stokes lunga 24 cm, per ottenere uno spettro DMSO meglio risolto. (D) Sono state utilizzate aste di cinguettio, pompa lunga 64 cm e Stokes lunga 60 cm, per ottenere una risoluzione spettrale più elevata. Abbreviazione: DMSO = dimetilsolfossido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: SRS a due colori, polarizzazione variabile e ritardo temporale. Due treni di impulsi ritardati nel tempo di polarizzazione ortogonale (s & p) vengono utilizzati per visualizzare spettri DMSO per mostrare il ritardo temporale (e la differenza di frequenza Raman) tra le eccitazioni SRS. Abbreviazioni: DMSO = dimetilsolfossido; SRS = scattering Raman stimolato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Spettro SRS risultante da uno scarso sfasamento SRS a due colori. Un picco negativo di 2.994 ^cm-1 vicino alla posizione dello stadio 48 è indicativo di una scarsa differenza di fase. Abbreviazione: SRS = scattering Raman stimolato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Generazione di false colorazioni H&E bicolore di immagini SRS. (A) Immagine SRS della proteina grezza da un tessuto cerebrale di topo alla transizione di 2.930 ^cm-1 . (B) Immagine SRS lipidica grezza dal tessuto cerebrale del topo alla transizione 2.850 ^cm-1 . (C) Canali uniti e codificati per colore da A e B con contributo lipidico in verde e contributo proteico in blu. (D) La falsa ricolorazione H&E è stata eseguita su C per imitare la colorazione H&E per applicazioni patologiche. Barra della scala = 50 μm. Abbreviazioni: SRS = scattering Raman stimolato; H&E = ematossilina ed eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Lo schema di imaging SRS a due colori presentato in questo protocollo dipende dalla corretta implementazione dell'imaging SRS monocolore. Nell'imaging SRS a un colore, i passaggi critici sono l'allineamento spaziale, l'allineamento temporale, la profondità di modulazione e lo sfasamento. La combinazione spaziale dei due fasci è realizzata da uno specchio dicroico. Diversi specchi dello sterzo vengono utilizzati per la regolazione fine quando si inviano i raggi allo specchio dicroico. Una volta che i fasci sono combinati con lo specchio dicroico, l'allineamento spaziale può essere confermato scegliendo il percorso del fascio combinato con uno specchio da inviare verso un muro a >1 m di distanza mentre si controlla il raggio combinato per vedere se si sovrappone a una scheda IR. Seguendo l'allineamento spaziale attraverso il microscopio, la sovrapposizione temporale viene eseguita regolando la lunghezza del percorso con uno stadio di ritardo basato su retroriflettore, che ha il vantaggio di preservare l'allineamento spaziale. Il braccio da 1.040 nm è il raggio ritardato in questo protocollo. La sovrapposizione temporale è impossibile se lo stadio di ritardo non ha l'intervallo per far sì che i due fasci si sovrappongano temporalmente. In tal caso, potrebbe essere necessario spostare l'intero stadio di ritardo in una posizione diversa per garantire che la sovrapposizione temporale sia vicina all'intervallo di scansione intermedio. Ad esempio, se la differenza temporale tra i due fasci viene misurata come 6 ns, è necessario 1,8 m di regolazione. La regolazione richiesta denota la lunghezza di allungamento del percorso del raggio per il raggio più veloce o l'accorciamento del percorso del raggio per il raggio più lento.

Oltre all'allineamento, anche la corrispondenza delle dimensioni del fascio e la modulazione del fascio di Stokes sono importanti per massimizzare il segnale SRS. Idealmente, entrambi i fasci dovrebbero essere collimati sul piano dell'obiettivo e corrispondere alle dimensioni dell'apertura posteriore dell'obiettivo. È utile controllare la collimazione e la dimensione del fascio se il piano dell'obiettivo è esposto all'utente. Se il fascio è convergente o divergente, è necessario regolare la seconda lente della coppia di lenti di collimazione per ottenere la collimazione (fase di protocollo 1.1). Allo stesso modo, se la dimensione del fascio è troppo piccola all'apertura posteriore dell'obiettivo, è necessario utilizzare una coppia di obiettivi con ingrandimento elevato (passaggio del protocollo 1.2). SRS scala linearmente con la profondità di modulazione del fascio di Stokes. È importante assicurarsi che l'altezza dell'impulso a valle sia <10% dell'altezza dell'impulso al picco sull'oscilloscopio. Una scarsa modulazione del fascio di Stokes si traduce direttamente in un SNR scadente.

Quando si utilizzano laser a femtosecondi per l'imaging SRS, la messa a fuoco spettrale è necessaria per convertire il ritardo temporale tra la pompa e Stokes in spostamento di frequenza Raman. Il fattore di conversione dipende dalla quantità di cinguettio applicato. È fondamentale abbinare il GDD della pompa e Stokes per ottenere una risoluzione spettrale ottimale. Il GDD può essere stimato in base alla lunghezza del materiale di dispersione utilizzato e al suo GVD. Ad esempio, l'asta di vetro flint denso SF11 ha un GVD di 123.270 fs² / mm a 1.040 nm e 187.486 fs² / mm a 800 nm. Per 240 mm di SF11 nel percorso del fascio di 800 nm, GDD è 240 mm × 187.486 fs²/mm = 45.000 fs². Per 240 mm di SF11 nel percorso del fascio di 1.040 nm, il GDD è di 240 mm × 123.270 fs²/mm = 30.000 fs². Questo esempio di calcolo significa che ulteriori barre di vetro devono essere aggiunte al braccio da 1.040 nm o che le aste di vetro devono essere rimosse dal braccio da 800 nm per corrispondere a GDD. Per ottenere una risoluzione spettrale più elevata, è necessario un GDD più grande, il che significa aste più lunghe. Tuttavia, nel calcolo della GDD, i contributi della missione di osservazione elettorale e l'obiettivo sono stati trascurati. L'effettiva corrispondenza di GDD è determinata sperimentalmente trovando la migliore risoluzione spettrale per le lunghezze delle aste date sulla pompa o sullo Stokes. I calcoli servono come un buon passo iniziale. L'ottimizzazione sperimentale attraverso l'aggiunta iterativa e la rimozione di barre di vetro è ancora necessaria per ottimizzare la risoluzione spettrale.

È importante rendersi conto che un grande cinguettio fornisce una risoluzione spettrale più elevata ma a scapito dell'intensità del segnale. Cinguettii più piccoli e impulsi più brevi sono utili per l'imaging tissutale nella regione C-H perché i picchi raman di proteine e lipidi sono ampi. Una risoluzione spettrale inferiore può essere scambiata per un segnale SRS più elevato (o una maggiore velocità di imaging) senza sacrificare il contrasto del tessuto a due^{colori 17}. In altre applicazioni in cui è necessaria un'elevata risoluzione spettrale, specialmente nella regione delle impronte digitali, è necessario applicare un cinguettio più grande utilizzando lunghe aste di vetro. In alternativa, potrebbe essere più facile utilizzare barelle a griglia per ottenere impulsi più lunghi (per una durata dell'impulso superiore a 3 ps). Tuttavia, una delle principali limitazioni del laser commerciale utilizzato è la sua larghezza di banda spettrale. La copertura spettrale dell'SRS a fuoco spettrale dipende dalla larghezza di banda dei laser di eccitazione. Il sistema laser utilizzato ha una copertura spettrale tipicamente di circa 200-250 ^cm-1. Questo è appena sufficiente per coprire la regione C-H. Una copertura spettrale più ampia è in genere necessaria per risolvere le specie chimiche per l'imaging nella regione delle impronte digitali. Questo problema può essere risolto con un componente aggiuntivo laser a fibra che amplia la larghezza di banda del laser Stokes da 6 nm a 60 nm¹⁸. Un'altra importante limitazione alla tecnica di imaging SRS a due colori è che vengono monitorate solo due transizioni. Questo approccio non sarebbe adatto per campioni complessi con molti picchi Raman sovrapposti o più specie.

Il metodo di imaging SRS a due colori in tempo reale offre l'imaging tissutale ad alta velocità eliminando la necessità di sintonizzazione laser o ritardata. Tuttavia, è difficile da configurare a causa delle sfide nel raggiungimento di una profondità di modulazione quasi perfetta per entrambe le missioni di osservazione elettorale. È meglio ottimizzare EOM1 e EOM2 in modo indipendente. Se EOM1 è attivo, EOM2 deve essere scollegato e viceversa. Una volta che entrambe le modulazioni sono ottimizzate quasi alla perfezione (profondità di modulazione >95%), entrambe le EOM sono collegate per consentire la modulazione ortogonale. La durata del ritardo temporale tra i due treni di impulsi ortogonali dipende dalla lunghezza del BRC e del cinguettio. Questo metodo di modulazione non è immediatamente fattibile per le applicazioni cliniche in quanto è necessaria un'elettronica complessa per fornire a due treni di impulsi RF uno sfasamento sintonizzabile per guidare le due EOM. Anche l'allineamento dell'EOM deve essere quasi perfetto per garantire un'elevata trasmissione, una buona modulazione e un'ortogonalità tra i due canali. Questa tecnica è generalmente applicabile ad altre applicazioni che richiedono l'imaging rapido e simultaneo di due picchi Raman a causa di cambiamenti di movimento o campione. Gli esempi includono misurazioni della temperatura dell'acqua o tracciamento di oggetti in movimento come goccioline lipidiche o organelli^11,19.

Un laser a fibra robusto è necessario per future applicazioni cliniche⁴. L'approccio descritto dal protocollo potrebbe anche essere esteso per migliorare la velocità di acquisizione fino alla velocità video, che è importante per scansionare campioni di tessuto di grandi dimensioni entro un tempo ragionevole. Se il tempo di imaging o gli artefatti di movimento non sono un problema, le immagini SRS di proteine e lipidi possono essere acquisite in sequenza spostando lo stadio di ritardo motorizzato fotogramma per fotogramma. Un altro metodo di imaging SRS a due colori in tempo reale è uno schema a doppia fase che ricicla il fascio di Stokes per fornire gli stessi due canali ortogonali²⁰. Tuttavia, l'implementazione dello schema a doppia fase richiede un allineamento aggiuntivo che coinvolge tre fasci. Richiede inoltre la corrispondenza delle dimensioni del fascio e della divergenza di tre raggi laser. Una potenziale strada per migliorare entrambe le tecniche per superare il limite simultaneo di due colori è l'incorporazione di un laser a fibra rapidamente sintonizzabile per sondare specifiche regioni spettrali²¹. L'elaborazione delle immagini è la stessa descritta nel protocollo per generare immagini H&E simulate.

Infine, questo protocollo dimostra l'imaging SRS in modalità epi. In genere genera immagini di qualità inferiore rispetto all'imaging in modalità di trasmissione per sezioni di tessuto sottile a causa della minore potenza della pompa che raggiunge il rilevatore¹³. Per l'imaging di tessuti spessi (>1-2 mm) o campioni ad alta dispersione (ad esempio, tessuto osseo), l'imaging in modalità epi può funzionare meglio dell'imaging in modalità di trasmissione. Quando si esegue l'imaging di tessuto fresco come il tessuto cerebrale, la profondità di imaging SRS è in genere limitata a 200-300 μm. Per il tessuto fisso, la dispersione è più forte e la profondità di imaging è di 100-200 μm. L'imaging più profondo può essere ottenuto con una maggiore potenza, correzione dell'aberrazione o cancellazione ottica^22,23. Tuttavia, l'imaging in modalità epi è un approccio preferibile per la diagnosi tissutale perché non richiede alcuna sezione tissutale e l'allineamento è più semplice senza il condensatore NA elevato. Le future applicazioni di diagnosi tissutale trarranno vantaggio da un'imaging rapido e di ampia area su campioni chirurgici intatti, seguito da una diagnosi basata sull'apprendimento automatico / deep learning. Il protocollo qui presentato è adatto anche per applicazioni in vivo, come l'imaging cerebrale o l'imaging cutaneo, in cui l'imaging in modalità epi è l'unica opzione e l'imaging ad alta velocità è importante per evitare artefatti di movimento.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.