Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Двухцветная стимулированная рамановская рассеянная визуализация мозга мыши в режиме реального времени для диагностики тканей

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63484
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

Микроскопия с стимулированным комбинационным рассеянием (SRS) является мощным, неразрушающим и безвечным методом визуализации. Одним из новых применений является стимулированная гистология комбинации, где двухцветная визуализация SRS на белковых и липидных рамановских переходах используется для генерации изображений псевдогематоксилина и эозина. Здесь мы демонстрируем протокол для двухцветной визуализации SRS в режиме реального времени для диагностики тканей.

Abstract

Микроскопия стимулированного рамановского рассеяния (SRS) стала мощным оптическим методом визуализации для диагностики тканей. В последние годы было показано, что двухцветная SRS способна предоставлять гематоксилин и эозин (H & E) эквивалентные изображения, которые позволяют быстро и надежно диагностировать рак мозга. Такая возможность позволила создать захватывающие приложения для интраоперационной диагностики рака. Двухцветная SRS-визуализация ткани может быть выполнена с помощью пикосекундного или фемтосекундного лазерного источника. Преимущество фемтосекундных лазеров заключается в том, что они обеспечивают гибкие режимы визуализации, включая быструю гиперспектральную визуализацию и двухцветную визуализацию SRS в режиме реального времени. Спектрально-фокусирующий подход с чирпированными лазерными импульсами обычно используется с фемтосекундными лазерами для достижения высокого спектрального разрешения.

Двухцветное получение SRS может быть реализовано с ортогональной модуляцией и обнаружением блокировки. Сложность щебетания импульсов, модуляции и характеризации является узким местом для широкого распространения этого метода. В данной статье представлен подробный протокол для демонстрации реализации и оптимизации спектрально-фокусирующих SRS и двухцветной визуализации ткани мозга мыши в режиме реального времени в эпирежиме. Этот протокол может использоваться для широкого спектра приложений визуализации SRS, которые используют высокоскоростные и спектроскопические возможности визуализации SRS.

Introduction

Традиционная диагностика тканей опирается на протоколы окрашивания с последующим обследованием под оптическим микроскопом. Одним из распространенных методов окрашивания, используемых патологоанатомами, является окрашивание H &E: гематоксилин окрашивает ядра клеток в пурпурно-синий цвет, а эозин окрашивает внеклеточный матрикс и цитоплазму в розовый цвет. Это простое окрашивание остается золотым стандартом в патологии для многих задач диагностики тканей, особенно для диагностики рака. Тем не менее, гистопатология H&E, особенно метод замороженного сечения, используемый в интраоперационных условиях, по-прежнему имеет ограничения. Процедура окрашивания представляет собой трудоемкий процесс, включающий встраивание, срезание, фиксацию и окрашиваниетканей 1. Типичное время выполнения работ составляет 20 минут или дольше. Выполнение H &E во время замороженного секционирования иногда может стать более сложным, когда обрабатывается несколько секций одновременно из-за необходимости оценки клеточных особенностей или моделей роста в 3D для оценки маржи. Кроме того, интраоперационные гистологические методы требуют квалифицированных техников и клиницистов. Ограничение числа сертифицированных патологоанатомов во многих больницах является ограничением для интраоперационной консультации во многих случаях. Такие ограничения могут быть смягчены с помощью быстрых интересов развития цифровой патологии и диагностики на основе искусственного интеллекта2. Тем не менее, результаты окрашивания H &E варьируются в зависимости от опыта техника, что создает дополнительные проблемы для компьютерной диагностики2.

Эти проблемы потенциально могут быть решены с помощью методов оптической визуализации без этикеток. Одним из таких методов является микроскопия SRS. SRS использует синхронизированные импульсные лазеры — накачку и стокс — для возбуждения молекулярных колебаний с высокой эффективностью3. Недавние отчеты показали, что SRS-визуализация белков и липидов может генерировать H&E-эквивалентные изображения (также известные как стимулированная рамановская гистология или SRH) с неповрежденной свежей тканью, что обходит необходимость любой обработки тканей, значительно сокращает время, необходимое для диагностики, и было адаптировано интраоперационно4. Кроме того, SRS-визуализация может предоставлять 3D-изображения, которые предлагают дополнительную информацию для диагностики, когда 2D-изображений недостаточно5. SRH является непредвзятым и генерирует цифровые изображения, которые легко доступны для компьютерной диагностики. Он быстро появляется в качестве возможного решения для интраоперационной диагностики рака и анализа границ опухоли, особенно при раке головного мозга 6,7,8. Совсем недавно была также предложена визуализация SRS химических изменений ткани для предоставления полезной диагностической информации, которая может дополнительно помочь клиницистам стратифицировать различные типы рака или стадии9.

Несмотря на свой огромный потенциал в приложениях для диагностики тканей, визуализация SRS в основном ограничена академическими лабораториями, специализирующимися на оптике, из-за сложности, связанной с платформой визуализации, которая включает в себя сверхбыстрые лазеры, лазерный сканирующий микроскоп и сложную электронику обнаружения. Этот протокол обеспечивает подробный рабочий процесс для демонстрации использования общего фемтосекундного лазерного источника для двухцветной визуализации SRS в режиме реального времени и генерации псевдо-H &E изображений из ткани мозга мыши. Протокол будет охватывать следующие процедуры:

Выравнивание и оптимизация чирпа
Большинство схем визуализации SRS используют пикосекундные или фемтосекундные лазеры в качестве источника возбуждения. У фемтосекундных лазеров полоса пропускания лазера намного больше, чем ширина рамановской линии. Чтобы преодолеть это ограничение, используется спектральный фокусировочный подход для чирикания фемтосекундных лазеров до пикосекундной временной шкалы для достижения узкого спектрального разрешения10. Оптимальное спектральное разрешение достигается только тогда, когда временное щебетание (также известное как дисперсия групповой задержки или просто дисперсия) правильно подобрано для накачки и лазеров Стокса. Здесь демонстрируется процедура выравнивания и этапы, необходимые для оптимизации дисперсии лазерных лучей с использованием высокодисперсионных стеклянных стержней.

Калибровка частоты
Преимущество спектральной фокусировки SRS заключается в том, что рамановское возбуждение может быть быстро настроено путем изменения временной задержки между накачкой и лазерами Стокса. Такая настройка обеспечивает быструю визуализацию и надежное спектральное получение по сравнению с настройкой длин волн лазера. Однако линейная зависимость между частотой возбуждения и временной задержкой требует внешней калибровки. Органические растворители с известными рамановскими пиками используются для калибровки рамановской частоты для спектральной фокусировки SRS.

Двухцветная визуализация в режиме реального времени
Важно увеличить скорость визуализации в приложениях для диагностики тканей, чтобы сократить время, необходимое для анализа крупных образцов тканей. Одновременная двухцветная SRS-визуализация липидов и белков устраняет необходимость настройки лазера или временной задержки, что увеличивает скорость визуализации более чем в два раза. Это достигается за счет использования новой техники ортогональной модуляции и двухканальной демодуляции с помощью запирающего усилителя11. В данной работе описывается протокол ортогональной модуляции и двухканального получения изображения.

Эпи-режимная визуализация SRS
Большинство изображений SRS, показанных на сегодняшний день, выполняется в режиме передачи. Эпимодальная визуализация обнаруживает обратно рассеянные фотоны из ткани12. Для аппликаций патологии хирургические образцы могут быть довольно большими. Для визуализации в режиме передачи часто необходимо срезание тканей, что нежелательно требует дополнительного времени. Напротив, эпирежимная визуализация может работать с неповрежденными хирургическими образцами. Поскольку одна и та же цель используется для сбора обратно рассеянного света, нет необходимости в выравнивании конденсатора с высокой числовой апертурой, необходимого для передачи изображения. Эпи-режим также является единственным вариантом, когда сечение тканей затруднено, например, с костью. Ранее мы продемонстрировали, что для тканей головного мозга эпирежимная визуализация обеспечивает превосходное качество визуализации для толщины ткани > 2 мм13. Этот протокол использует поляризационный делитель пучка (PBS) для сбора рассеянных фотонов, деполяризованных тканью. Можно собрать больше фотонов с помощью кольцевого детектора за счет сложности настраиваемой детекторной сборки12. Подход PBS проще в реализации (аналогично флуоресценции), при этом стандартный фотодиод уже используется для обнаружения режима передачи.

Генерация псевдо-H&E изображений
После того, как двухцветные изображения SRS собраны, они могут быть перекрашены для имитации окрашивания H &E. В данной работе демонстрируется процедура преобразования изображений липидных и белков SRS в псевдо-H&E SRS изображения для патологических применений. Экспериментальный протокол детализирует критические шаги, необходимые для создания высококачественных изображений SRS. Процедура, показанная здесь, не только применима к диагностике тканей, но также может быть адаптирована для многих других приложений гиперспектральной визуализации SRS, таких как визуализация лекарств и метаболическая визуализация14,15.

Общие системные требования
Лазерная система для этого протокола должна быть способна выводить 2 синхронизированных фемтосекундных лазерных луча. Системы идеально оснащены оптическим параметрическим генератором (OPO) для настройки одной из лазерных лучей с широкой длиной волны. Установка в этом протоколе использует коммерческую лазерную систему Insight DS+, которая выводит два лазера (один фиксированный луч на 1 040 нм и один перестраиваемый луч на основе OPO, в диапазоне от 680 до 1 300 нм) с частотой повторения 80 МГц. Лазерные сканирующие микроскопы, как от крупных производителей микроскопов, так и отечественного производства, могут использоваться для визуализации SRS. Используемый микроскоп представляет собой вертикальный лазерный сканирующий микроскоп, построенный поверх коммерческой вертикальной рамки микроскопа. Пара 5 мм зеркал galvo используется для сканирования лазерного луча. Для пользователей, решивших принять самодельный лазерный сканирующий микроскоп, обратитесь к ранее опубликованному протоколу для построения лазерного сканирующего микроскопа16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные процедуры на животных проводились с 200 мкм, фиксированным, секционным мозгом мыши, в соответствии с протоколом (No 4395-01), одобренным Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Вашингтонского университета. Мышей дикого типа (штамм C57BL/6J) усыпляют CO2. Затем выполняется трепанация черепа для извлечения их мозга для фиксации в 4% параформальдегиде в фосфатно-буферном физиологическом растворе. Мозг встроен в смесь 3% агарозы и 0,3% желатина и разделен на срезы толщиной 200 мкм вибратомом.

1. Начальное выравнивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что размер луча и расхождение обоих рычагов совпадают для наилучшей чувствительности и разрешения. Объедините насос и лучи Стокса и отрегулируйте их размеры, прежде чем они попадут в лазерный сканирующий микроскоп. Для этого используйте пару ахроматических линз для каждого луча, прежде чем комбинировать их на дихроичном зеркале. Всегда надевайте правильные лазерные очки для выравнивания луча.

  1. Коллимация пучков
    1. Установите пару ахроматических линз для пучка насоса. В качестве отправной точки используйте объектив 100 мм и объектив 200 мм, чтобы увеличить размер лазерного луча в 2 раза. Убедитесь, что расстояние между двумя объективами составляет примерно 300 мм. Выровняйте пучок насоса по центру обеих линз.
    2. Поместите зеркало после второй линзы, чтобы направить луч к стене (>1 м). Будьте осторожны при отправке луча на большие расстояния. Проследите луч от зеркала до стены с помощью ИК-карты и проверьте, изменяется ли размер луча. Коллимируйте луч, если луч изменяется в размере в зависимости от расстояния.
      1. Если луч сходится (уменьшается размер с распространением), переместите две линзы ближе.
      2. Если луч расходится (увеличивая размер с распространением), переместите две линзы дальше друг от друга. Отрегулируйте расстояние до тех пор, пока луч не будет коллимирован.
    3. Повторите шаги 1.1.1 и 1.1.2, чтобы балка Стокса коллимировала балку.
  2. Регулировка размера балки
    1. Если имеется профилировщик луча, измерьте размер коллимированного луча для каждого луча. В качестве альтернативы можно оценить размер луча с помощью ИК-карты и линейки для получения диаметра луча 4-5 мм.
    2. Если размер луча слишком мал или слишком велик, измените пару линз, используемую на шаге 1.1. Отрегулируйте пару линз до тех пор, пока оба луча не достигнут диаметра 4-5 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение луча представляет собой отношение между фокусным расстоянием второго объектива к первому объективу (f2/f1).
  3. Пространственное перекрытие
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация SRS требует, чтобы оба лазерных луча были объединены в пространстве и времени для возбуждения молекулярных колебаний. Схема спектрально-фокусирующей SRS-визуализации показана на рисунке 1.
    1. Объедините два лазерных луча, установив дихроичное зеркало с несколькими зеркалами рулевого управления для регулировки. Оптимизируйте пространственное перекрытие насоса и Stokes, контролируя лучи после дихроичного зеркала в двух разных положениях далеко друг от друга (~1 м). Итеративно отрегулируйте рулевое зеркало перед дихроичным и дихроичным зеркалом, чтобы выровнять луч Стокса с балкой насоса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если два луча пространственно перекрываются в обоих положениях, они достаточно перекрыты.
    2. Убедитесь, что комбинированные лучи направляются в центр сканирующих зеркал лазерного сканирующего микроскопа, регулируя пару зеркал рулевого управления, когда сканирующие зеркала находятся в припаркованном положении. Убедитесь, что оба луча проходят через центр объектива микроскопа и конденсатор.
    3. После конденсатора используйте другую пару линз с фокусными расстояниями 100 мм и 30 мм соответственно для передачи передаваемого луча на фотодиод. Убедитесь, что оба луча содержатся внутри фотодиода, и установите два фильтра нижних частот, чтобы блокировать модулированный луч Стокса.

2. Обнаружение сигнала SRS

  1. Электрооптическая модуляция (EOM)
    ПРИМЕЧАНИЕ: EOM 20 МГц используется для модуляции амплитуды Стокса. Как обсуждалось позже, EOM получен из лазерного импульсного поезда 80 МГц, который необходим для ортогональной модуляции. Другие частоты модуляции могут быть использованы, если выполняется только одноцветная или гиперспектральная SRS. В этом случае синхронизация частоты модуляции с частотой лазера не нужна. Генератор частоты с ВЧ усилителем мощности может использоваться для привода EOM. В результате этапы 2.1.1-2.1.4 могут быть пропущены.
    1. Поместите пробоотборник луча на траекторию луча Стокса, чтобы уловить 10% луча и отправить его на быстрый фотодиод для обнаружения импульсной цепи 80 МГц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал фотодиода отправляется на делитель частоты для создания выхода TTL 20 МГц. Этот выход далее отправляется в буфер вентилятора для репликации выходных данных на четыре идентичных выхода 20 МГц. Один из выходов используется для запуска осциллографа.
    2. Возьмите один из выходов буфера вентилятора и отфильтруйте его полосовым фильтром, чтобы получить синусоидальную волну 20 МГц. Используйте радиочастотный аттенюатор для регулировки выходного напряжения от пика до пика до ~500 мВ.
    3. Отправьте полученный выход на фазовращатель, который позволяет точно регулировать радиочастотную фазу с источником напряжения. Отправьте этот выход на радиочастотный усилитель мощности и подключите выход усилителя к EOM.
    4. Разблокируйте луч Стокса и оптимизируйте глубину модуляции EOM1, разместив фотодиод на пути луча. Отрегулируйте напряжение EOM и четвертьволновую пластину до тех пор, пока глубина модуляции (отношение долины к пику) не станет удовлетворительной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При модуляции 20 МГц (1/4 частоты повторения лазера) ожидаются два импульса каждые 50 нс.
  2. Временное перекрытие
    ПРИМЕЧАНИЕ: Временное перекрытие насоса и Стокса достигается путем задержки одной из двух лазерных импульсных передач со светоотражателем, установленным на ступени задержки (на рисунке 1 показана задержка Стокса). Грубое перекрытие контролируется осциллографом, а тонкое перекрытие контролируется сигналом SRS. Тонкое временное перекрытие также может быть достигнуто с помощью автокоррелятора, если таковой имеется.
    1. Поместите фотодиод после дихроичного зеркала, чтобы обнаружить лазерный луч. Сначала заблокируйте балку Стокса. Увеличьте масштаб одного из пиков импульса насоса на осциллографе. Поместите вертикальный курсор, чтобы отметить временное положение этого пика с помощью осциллографа.
    2. Заблокируйте балку насоса и разблокируйте балку Стокса. Преобразуйте этап задержки, чтобы временно сопоставить пиковое положение на осциллографе с отмеченным положением на предыдущем шаге. На рисунке 2 показано временное перекрытие двух лучей.
      1. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Если трансляция стадии задержки недостаточна для временного соответствия двух лучей, то переместите стадию задержки в середину диапазона ее движения.
      2. Рассчитайте расстояние задержки, необходимое для соответствия двум лучам, взяв временную разницу между двумя лучами и умножив разницу на скорость света, чтобы найти количество расстояния, необходимое для временного соответствия двух лучей.
      3. Удлините траекторию луча более быстрого луча или сократите траекторию луча более медленного луча, чтобы примерно соответствовать временной задержке соответственно.
    3. Подготовьте образец слайда микроскопа с помощью DMSO и двусторонней ленты в качестве распорки для удержания образца между слайдом и крышкой.
    4. Поместите образец на микроскоп стороной крышки, обращенной к объективу микроскопа. Измените микроскоп на яркое освещение и наблюдайте за образцом из окуляра. Найдите фокус образца, сначала найдя фокус как в верхнем, так и в нижнем слое пузырьков воздуха на интерфейсе стеклянной ленты, а затем переместите фокус, чтобы он находился между двумя слоями ленты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что лазерные лучи заблокированы, прежде чем смотреть в окуляр.
    5. Установите настраиваемую выходную мощность луча на 798 нм. Исходя из оптической пропускной способности конденсатора, отрегулируйте оптическую мощность до ~40 мВт каждая для насоса и лучей Стокса в фокусе цели.
    6. Откройте ScanImage в MATLAB (или другом сканирующем программном обеспечении, которое управляет микроскопом) и нажмите кнопку с надписью FOCUS , чтобы начать сканирование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерные лучи будут растровым сканированием через образец для создания изображения. Выход низкочастотного сигнала с фотодиода (<100 кГц) передается непосредственно в канал 1 карты сбора данных (называемый каналом постоянного тока). Высокочастотный выход (>100 кГц) от фотодиода отправляется в блокирующий усилитель, а X-выход сигнала блокирующего усилителя отправляется в канал 2 карты сбора данных (называемый каналом переменного тока).
    7. Отрегулируйте рулевое зеркало перед сканером galvo, чтобы центрировать сигнал постоянного тока на дисплее канала 1. Переместите моторизованный каскад задержки и внимательно наблюдайте за выходом блокировки, отображаемым на дисплее канала 2 (т.е. канала переменного тока).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда насос и Стокс совпадают по времени, сигнал будет отображаться на канале переменного тока. Полезно настроить цветовую шкалу канала переменного тока, чтобы отобразить небольшое изменение интенсивности.
    8. Максимизируйте интенсивность сигнала переменного тока, точно отрегулировав временную задержку. Отрегулируйте дихроичное зеркало, чтобы центрировать сигнал SRS на канале переменного тока (сохраняя при этом канал постоянного тока в центре). Отрегулируйте фазу запирающего усилителя, чтобы максимизировать сигнал. Удовлетворительный сигнал см. на рисунке 3 .

3. Оптимизация спектрального разрешения

ПРИМЕЧАНИЕ: Пучки насоса и Стокса, достигающие образца, должны иметь одинаковое количество групповой дисперсии задержки (GDD) для максимизации спектрального разрешения. Дисперсия сильно зависит от экспериментальной установки. Экспериментальная установка, описанная здесь, использует фемтосекундные импульсы при 1040 нм и 800 нм в качестве Стокса и насоса соответственно. В качестве импульсно-растягивающей среды используются плотные кремневые стеклянные стержни (H-ZF52A).

  1. Вставьте 48 см высокодисперсионного стеклянного стержня (H-ZF52A или эквивалентное плотное кремневое стекло) в траекторию луча 800 нм. Оцените GDD с помощью Eq (1):
    Equation 1 (1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: GVD различных стеклянных материалов на разных длинах волн можно найти из ресурса базы данных показателя преломления. Например, H-ZF52A имеет полную массу 220,40 fs2/мм при 800 нм. Общий GDD составляет 105792 fs2.
  2. Рассчитайте, сколько см дисперсионного стеклянного стержня требуется для добавления к траектории луча 1040 нм, чтобы соответствовать GDD насоса. Вставьте соответствующую длину дисперсионных стеклянных стержней в траекторию луча 1040 нм, чтобы она примерно соответствовала GDD луча 800 нм. Обратите внимание, что добавление стеклянных стержней изменит временное перекрытие двух балок, и может потребоваться регулировка задержки.
  3. Калибровка спектрального разрешения
    1. Сделайте образец слайда микроскопа с ДМСО. Поместите затвор на микроскоп и проверьте мощность лучей, выходящих из конденсатора микроскопа. Отрегулируйте мощность соответствующим образом, чтобы иметь ~ 40 мВт каждый в фокусе образца.
    2. Откройте ScanImage из MATLAB. Найдите максимальный сигнал SRS, просканировав через стадию задержки, которая соответствует рамановскому пику DMSO 2,913 см-1 . Оцените положение ступени на основе положения предыдущей ступени с увеличенной длиной оптического пути за счет вставки стержней. Перестраивайте пространственное перекрытие луча из-за небольшого отклонения балки при добавлении стеклянных стержней.
    3. Сохраните гиперспектральное сканирование SRS, последовательно делая серию изображений SRS при перемещении моторизованной стадии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон задержки сканирования охватывает два рамановских пика, соответствующих 2,913 см-1 и 2,994 см-1 Рамановским пикам DMSO, соответственно. Эти два перехода наблюдаются при использовании 800 нм накачки и 1040 нм лазера Стокса.
    4. Построение спектров SRS решения DMSO с помощью ImageJ или MATLAB. Установите большой пик DMSO 2,913 см-1 к гауссовской или лоренцевой функции в MATLAB, чтобы вычислить полную ширину при половинном максимуме (FWHM) пика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты показаны на рисунке 4. Если присутствует только один широкий пик, это означает, что либо спектральное разрешение слишком плохое, чтобы различать два пика, и требуется больше стеклянных стержней, либо диапазон сканирования был слишком мал, чтобы обнаружить второй пик. Как правило, приемлемое спектральное разрешение DMSO составляет ~20-25 см-1 при использовании стеклянных стержней длиной >60 см. Более низкое разрешение часто используется для визуализации тканей для обмена на более высокие сигналы с более короткими импульсами17.
  4. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Используйте автокоррелятор или FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) для определения длительности импульса каждого рычага, чтобы точно рассчитать количество GDD и длину стержней, необходимых для соответствия GDD между насосом и Stokes.
  5. Повторите шаги 3.3.2-3.3.4 для стержней различной длины на луче Стокса, чтобы найти оптимальное спектральное разрешение, что означает, что лучшее соответствие GDD было найдено экспериментально. Используйте несколько наборов стеклянных стержней, различающихся по длине, для достижения оптимального спектрального разрешения.

4. Характеристика сигнал-шум (SNR)

  1. Убедитесь, что шаг 4.2 выполнен после полного пространственного и временного выравнивания.
  2. Получите изображение SRS, соответствующее рамановскому пику DMSO размером 2 913 см-1 . Откройте изображение в ImageJ и выделите небольшую область в центре кадра. Используйте функцию меры для вычисления среднего и стандартного отклонения значений в выбранной области.
  3. Разделите среднее значение выбранной области на стандартное отклонение, чтобы найти значение SNR, как в Eq (2).
    Equation 2 (2)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хороший SNR для системы (с константой времени блокировки 4 мкс) с использованием DMSO при 40 МВт / 40 МВт в фокусе для обоих рычагов составляет >800. Более низкие концентрации DMSO или более низкая мощность могут быть использованы для более точной оценки SNR, если карта сбора данных имеет ограниченную битовую глубину.
  4. Если SNR слишком низкий, перестройте лазерные импульсы для оптимизации пространственного перекрытия, временного перекрытия, сопоставления размера луча / коллимации и / или сопоставления дисперсии. Для цели с ошейником коррекции аберрации оптимизируйте сигнал, отрегулировав коррекционный ошейник.

5. Калибровка оси частоты

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для связи положения стадии задержки с отсканированным переходом комбинационного рассеяния. Тщательный отбор растворителей необходим для создания соответствующей «рамановской линейки». DMSO является эффективным растворителем для связей CH, поскольку он имеет два острых рамановских пика при 2,913 см-1 и 2,994 см-1.

  1. Сохраните гиперспектральное сканирование с диапазоном стадий задержки, охватывающим пики DMSO 2,913 см-1 и 2,994 см-1 . Сохраните позиции стадии, соответствующие набору гиперспектральных данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Глобальный максимальный пик спектра соответствует рамановскому сдвигу DMSO 2,913 см-1 , а второй максимальный пик соответствует сдвигу DMSO 2,994 см-1 Raman.
  2. Выполните линейную регрессию для положений сцены и рамановские сдвиги на 2,913 см-1 и 2,994 см-1. Используя уравнение линейной регрессии, связывающее положение стадии с рамановским сдвигом, преобразуйте позиции задержки в соответствующие рамановские частоты.

6. Ортогональная модуляция и двухцветная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Этап ортогональной модуляции необходим только тогда, когда требуется двухцветная визуализация в режиме реального времени. Схема этой схемы показана на рисунке 5. Ортогональная модуляция использует пару ЭОМ, приводимых в движение на четверти частоты лазера (20 МГц для лазера 80 МГц) со сдвигом фазы 90° между ними. Этот этап ортогональной модуляции можно пропустить для одноцветной визуализации SRS или гиперспектральной визуализации SRS.

  1. Модуляция EOM1
    1. Установите PBS (PBS2), четвертьволновую пластину (QWP2) и вторую EOM (EOM2) в траекторию луча Стокса после первой EOM. Отключите входной сигнал к EOM2. Подключите сигнальный вход к EOM1 и включите его.
    2. Модулируйте луч Стокса (фиксированный на 1040 нм) на частоте 20 МГц (f0/4), посылая луч через первый EOM. Отрегулируйте наклон и положение EOM1, чтобы убедиться, что луч попадает прямо и центрируется через кристалл EOM.
    3. Контролируйте глубину модуляции, наблюдая обе поляризации, выходящие из PBS1 с двумя фотодиодами и отображая модуляцию на осциллографе.
    4. Отрегулируйте напряжение QWP1, EOM1 и фазу входного сигнала 20 МГц (с помощью фазовращателя), чтобы оптимизировать глубину модуляции передаваемого луча, чтобы она была близка к 100%. Смотрите рисунок 2B для иллюстрации хорошей глубины модуляции.
  2. Модуляция EOM2
    1. Отключите EOM1 и подключите EOM2.
    2. Отправьте выход высокого напряжения второго усилителя на частоте 20 МГц в EOM2. Отрегулируйте наклон и положение EOM2, чтобы убедиться, что луч попадает прямо и центрируется через кристалл EOM.
    3. Еще раз контролируйте глубину модуляции, глядя на обе поляризации, выходящие из PBS2 с помощью осциллографа. Отрегулируйте напряжение QWP2, EOM2 и фазовращатель по мере необходимости для достижения почти 100% модуляции для обеих поляризаций.
    4. Убедитесь, что импульсная модуляция имеет сдвиг фазы на 90° от первой модуляции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если две импульсные цепи насоса не являются ортогональными на 90°, перекрестные помехи между двумя каналами будут проблемой.
    5. Проверьте ортогональность модуляции, включив и подключив EOM1 и EOM2. Мониторинг обеих поляризаций, разделенных PBS2 с помощью осциллографа. Реоптимизируйте EOM1 и EOM2 по отдельности, если пульсовая тренировка после второго PBS не похожа на рисунок 2C.
    6. Установите 20 мм двулучепреломляющий кристалл кварца (BRC) и HWP после EOM2. Подключите оба EEM одновременно и контролируйте импульсную передачу так, чтобы она напоминала рисунок 2D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для чирпа, используемого в этом эксперименте, 20 мм BRC вызывает временную задержку, которая соответствует сдвигу 80 см-1 Раман. Другая длина BRC может потребоваться, если используется другое чирпирование.
  3. Калибровка
    1. Откалибруйте систему с помощью DMSO, обнаружив сигналы от выхода X- и Y-каналов усилителя (отправляемые на каналы 2 и 3 карты сбора данных).
    2. Проверьте, близки ли сигналы, генерируемые пиком 2,913 см-1 от более быстрой поляризации и от более медленной поляризации, к 90° вне фазы на блокируемом усилителе. Если это не так, отрегулируйте выравнивание EOM до тех пор, пока два сигнала не будут близки к 90° вне фазы.
    3. После завершения калибровки найдите положение задержки, которое зондирует переход белка при 2 930 см-1 для одного из ортогональных пучков. Убедитесь, что другая поляризация зондирует липидный переход 2 850 см-1.

7. Эпи-режимная визуализация SRS

ПРИМЕЧАНИЕ: В схеме визуализации режима передачи объектив фокусирует лазер в образце, а затем конденсаторная линза направляет передаваемый луч на фотодиод для обнаружения блокировки. В эпимодальной схеме визуализации свет, который обратно рассеивается и деполяризуется образцом, вспоминается фокусирующим объективом и изолируется с помощью поляризационного делителя пучка. Изолированные и обратно рассеянные фотоны отправляются на фотодиод через пару релейных линз для обнаружения блокировки. На рисунке 6 показана схема эпимодальной визуализации.

  1. Установите HWP до того, как луч войдет в микроскоп, чтобы изменить поляризацию луча, идущего в микроскоп. Поместите PBS над объективом, чтобы деполяризованный обратно отраженный луч достиг детектора.
  2. Используйте пару линз, состоящих из 75-миллиметрового ахроматного объектива и 30-мм асферического объектива, для передачи обратно рассеянных фотонов от задней диафрагмы объектива к фотоприемнику. Установите детектор для сбора обратно рассеянного света, направленного PBS. Установите фильтр, чтобы заблокировать попадание модулированного луча в детектор.
  3. Поместите образец ткани под объектив. Поскольку конденсатор не нужен для эпирежимной визуализации, удалите его, если требуется больше места.
  4. Отображение
    1. Перекрыть балку затвором; светить белым источником света на образец сбоку; и используйте brightfield для поиска объективной направленности.
    2. Разблокируйте оба пучка и используйте предварительно откалиброванные положения задержки для получения изображений липидов и белков SRS из ткани с двух выходов блокирующего усилителя.
    3. Отрегулируйте коэффициент усиления блокировки и коэффициент блокировки пикселей для получения изображений хорошего качества.

8. Окрашивание ложным цветом

  1. Откройте стек изображений с помощью ImageJ.
  2. Вытащите два изображения, которые соответствуют липидным (2 850 см-1) и белковым (2 930 см-1) видам, щелкнув правой кнопкой мыши на изображении и щелкнув Дубликат.
  3. Переименуйте липидное изображение в липиды , а изображение белка в белки.
  4. Перейти к процессуальной | Калькулятор изображений и выполнение белков вычитания липидов.
  5. Объедините изображения, перейдя в image | Цвет | Объединяйте каналы, устанавливая липиды в зеленый и белки в синий. Откройте инструмент «Каналы изображений» (Image | Цвет | Инструмент «Каналы») и отрегулируйте яркость и контрастность (Image | Отрегулируйте | Яркость/Контрастность).
  6. Отрегулируйте яркость и контрастность для каждого канала с помощью инструмента «Каналы ». Для липидного канала отрегулируйте контраст до тех пор, пока клеточные объекты не станут темными. Для белкового канала отрегулируйте контраст до тех пор, пока клеточные особенности не станут синими. Преобразуйте объединенное зелено-синее изображение канала в RGB-изображение, перейдя в раздел Image | Тип | Цвет RGB. Экспортируйте это изображение с помощью | файлов Сохранить как | Тифф.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для ложного окрашивания H &E цветовая схема показывает розовую цитоплазму, в то время как ядра темно-сине-фиолетовые.
  7. Загрузите скрипт HE.m MATLAB из ресурса ложного сценария окрашивания H&E в таблице материалов.
  8. Запустите сценарий HE.m в MATLAB. Выберите экспортированное RGB-изображение из предыдущего шага, чтобы создать искусственно окрашенное изображение H&E.
  9. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Нормализуйте интенсивность изображения для изображений с большим полем зрения, поскольку изображение выглядит темнее на периферии, чем в центре.
    1. Чтобы выполнить полевую нормализацию изображений, усредните как можно больше изображений. Затем удалите элементы интенсивности с помощью ImageJ (Process | фильтры | Гауссовское размытие | Радиус=50).
    2. Измерьте максимальную интенсивность размытого изображения (Ctrl+M). Разделите размытое изображение на максимальную интенсивность (Process | Математические | Разделить). Разделите необработанное изображение SRS на размытое изображение (Process | Изображение | Калькулятор).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оптимизация спектрального разрешения:
Дисперсия через материал зависит от дисперсионной среды (длины и материала) и длины волны. Изменение длины дисперсионного стержня влияет на спектральное разрешение и размер сигнала. Это отношения взаимных уступок, которые могут быть взвешены по-разному в зависимости от применения. Стержни растягивают импульс луча от широкого по частоте и узкого во времени до узкого по частоте и широкого по времени. На рисунке 7 показано влияние различной длины стержней на спектральное разрешение. На рисунке 7A показано очень плохое спектральное разрешение; эта установка не имеет стеклянных щебечущих стержней, а два рамановских пика от DMSO вообще не разрешены. На рисунке 7B,C увеличение числа стеклянных щебечущих стержней начинает разрешать два пика. Наконец, на рисунке 7D показано, как согласованное щебетание разрешает оба пика и может быть использовано для калибровки положений ступеней по частоте.

Калибровка с помощью DMSO:
DMSO имеет два резких рамановских пика при 2,913 и 2,994 см-1 , которые удобны для калибровки в области C-H. Как только спектр DMSO получен из гиперспектрального SRS-сканирования, простая линейная регрессия преобразует положение стадии в рамановский сдвиг. Если спектральное разрешение плохое (как показано на рисунке 7А) и два пика неразделимы, то калибровка с линейной регрессией невозможна. В этом случае необходимо лучшее согласование дисперсии путем добавления или удаления стеклянных стержней. Наиболее распространенные трудности в поиске сигнала DMSO для калибровки обусловлены ошибками либо во временном перекрытии, либо в пространственном перекрытии двух лучей. Перед попыткой калибровки DMSO повторите шаги пространственного и временного выравнивания, чтобы оптимизировать сигнал SRS.

Двухцветный DMSO:
В двухцветных SRS генерируются две импульсные цепи насоса с ортогональной поляризацией с фиксированной временной задержкой (за счет двулучепреломляющего кристалла). Оценка глубины модуляции и сдвига фазы на 90° производится с помощью фотодиода, за которым следует сигнал DMSO SRS. На рисунке 8 показана приемлемая глубина модуляции и временное разделение. Хотя спектральное разрешение DMSO на рисунке 8 не является идеальным, оно часто приносится в жертву в экспериментах по визуализации тканей для достижения более высокого сигнала с более короткими импульсами. На рисунке 9 показаны плохие фазовые сдвиги, которые приводят к перевернутым или отрицательным пикам.

Двухцветная SRS ткани мозга мыши в эпи-режиме:
Эпимод (обнаружение обратно рассеянных фотонов) SRS используется для визуализации толстой ткани (>1 мм). Рисунок 10A,B демонстрирует двухцветную визуализацию SRS в режиме реального времени при 2 850 см-1 и 2 930 см-1 ткани мозга мыши ex vivo. Необработанные изображения из липидных и белковых каналов (рисунок 10A, B) были окрашены в цвет для получения одного изображения, изображающего липидный и белковый вклад (рисунок 10C). Ложное окрашивание H&E было выполнено (рисунок 10D) на рисунке 10C для имитации окрашивания H&E. Низкое качество изображения может быть результатом большой глубины изображения или плохой калибровки (ось частоты или глубина модуляции). Типичная глубина визуализации в ткани мозга составляет 100-200 мкм13.

Figure 1
Рисунок 1: Схема настройки одноцветной SRS-визуализации. Построение спектрально-фокусирующего SRS-микроскопа в режиме передачи. X и Y представляют ортогональные выходы. Сокращения: SRS = стимулированное рамановское рассеяние; DL = линия задержки на основе ретрорефлектора; Div = делитель; FB = буфер раздувания; AT = аттенюатор; PS = фазовращатель; PA = усилитель мощности; DCM = дихроичное зеркало; GM = зеркала гальво; EOM = электрооптический модулятор; POM = зеркало для подбора; PBS = поляризационный делитель пучка, BRC = двулучепреломляющий кристалл; QWP = четвертьволновая пластина; HWP: полуволновая пластина; PD = фотодиод; GR = стеклянный стержень; BB = лучевой блок; SPF = фильтр коротких частот; CL = коллимирующая линза; BS = объектив, изменяющий размер луча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативное временное перекрытие. (A) На осциллографе видно, что пучки насоса и Стокса временно перекрываются. Курсоры осциллографа используются для обозначения временных положений пучков насоса и Стокса. Это перекрытие является удовлетворительным в качестве отправной точки для дальнейшей настройки временного перекрытия с задержкой стадии. (B) Удовлетворительная глубина репрезентативной модуляции одной ЭОМ на частоте 20 МГц. (C) Удовлетворительная импульсная модуляция при использовании двух ЭОМ. (D) Удовлетворительная импульсная модуляция поезда после установки двулучепреломляющего кристалла кварца и полуволновой пластины на дважды модулированном рычаге Стокса. Аббревиатура: EOM = электрооптический модулятор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные сигналы SRS и насоса. (A) Смещенный сигнал насоса, обнаруженный в канале постоянного тока. (B) Смещенный сигнал SRS, обнаруженный фотодиодом. (C) Удовлетворительный, центрированный сигнал насоса в канале постоянного тока. (D) Удовлетворительный сигнал SRS, сосредоточенный на канале переменного тока. Аббревиатура: SRS = стимулированное рамановское рассеяние. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Характеристика спектрального разрешения. Гауссова функция соответствовала пику DMSO 2,913 см-1 . Расчет FWHM дал разрешение 15 см-1 для системы. Сокращения: ДМСО = диметилсульфоксид; FWHM = полная ширина при половинном максимуме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Схема настройки двухцветной визуализации SRS. Построение двухцветного SRS-микроскопа в режиме передачи. X и Y представляют ортогональные выходы. Сокращения: DL = линия задержки на основе ретрорефлектора; Div = делитель; FB = буфер раздувания; AT = аттенюатор; PS = фазовращатель; PA = усилитель мощности; DCM = дихроичное зеркало; GM = зеркала гальво; EOM = электрооптический модулятор; PBS = поляризационный светоделитель; BRC = двулучепреломляющий кристалл; QWP = четвертьволновая пластина; HWP = полуволновая пластина; PD = фотодиод; GR = стеклянный стержень; BB = блок балок, SPF = фильтр коротких частот; CL = коллимирующая линза; POM = зеркало для подбора; BS = объектив, изменяющий размер луча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Схема настройки двухцветной визуализации SRS в эпи-режиме. Построение двухцветного SRS-микроскопа в эпи-режиме. X и Y представляют ортогональные выходы. Сокращения: DL = линия задержки на основе ретрорефлектора; Div = делитель; FB = буфер раздувания; AT = аттенюатор; PS = фазовращатель; PA = усилитель мощности; DCM = дихроичное зеркало; GM = зеркала гальво; EOM = электрооптический модулятор; PBS = поляризационный светоделитель; BRC = двулучепреломляющий кристалл; QWP = четвертьволновая пластина; HWP = полуволновая пластина; PD = фотодиод; GR = стеклянный стержень; BB = лучевой блок, BPF = полосовой фильтр; CL = коллимирующая линза; POM = зеркало для подбора; BS = объектив, изменяющий размер луча. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Оптимизация спектрального разрешения с 25% DMSO. (A) Для получения спектра DMSO использовались стержни нулевого щебетания стекла. Два пика не разрешены. (B) Использовались стеклянные щебечущие стержни, 20 см на рычаге насоса и 24 см на рычаге Стокса. Два пика начинают разрешаться до удовлетворительной точки. (C) Для получения лучшего спектра DMSO использовались чирпирующие стержни, насос длиной 40 см и Stokes длиной 24 см. (D) Для получения более высокого спектрального разрешения использовались чирпирующие стержни, насос длиной 64 см и стокс длиной 60 см. Аббревиатура: ДМСО = диметилсульфоксид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Двухцветные SRS, изменяющаяся поляризация и временная задержка. Два импульсных поезда с задержкой по времени ортогональной поляризации (s & p) используются для изображения спектров DMSO, чтобы показать временную задержку (и разность частот комбинационного рассеяния) между возбуждениями SRS. Сокращения: ДМСО = диметилсульфоксид; SRS = стимулированное рамановское рассеяние. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Спектр SRS в результате плохого двухцветного фазового сдвига SRS. Отрицательный пик 2,994 см-1 вблизи позиции стадии 48 свидетельствует о плохой разнице фаз. Аббревиатура: SRS = стимулированное рамановское рассеяние. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Генерация ложного двухцветного окрашивания изображений SRS. (A) Изображение сырого белка SRS из ткани мозга мыши при переходе 2,930 см-1. (B) Необработанное изображение липидной SRS из ткани мозга мыши при переходе 2 850 см-1. (C) Объединенные и обозначенные цветом каналы от А и В с липидным вкладом в зеленом и вкладом белка в синем. (D) Ложное перекрашивание H&E было выполнено на C, чтобы имитировать окрашивание H&E для патологических применений. Шкала бара = 50 мкм. Сокращения: SRS = стимулированное рамановское рассеяние; H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Двухцветная схема визуализации SRS, представленная в этом протоколе, зависит от правильной реализации одноцветной визуализации SRS. В одноцветной визуализации SRS критическими шагами являются пространственное выравнивание, временное выравнивание, глубина модуляции и сдвиг фазы. Пространственное объединение двух лучей осуществляется дихроичным зеркалом. Несколько рулевых зеркал используются для тонкой регулировки при отправке лучей на дихроичное зеркало. После того, как лучи объединены с дихроичным зеркалом, пространственное выравнивание может быть подтверждено путем выбора комбинированного пути луча с зеркалом для отправки к стене >1 м, проверяя комбинированный луч, чтобы увидеть, перекрывается ли он с ИК-картой. После пространственного выравнивания через микроскоп временное перекрытие выполняется путем регулировки длины пути с помощью стадии задержки на основе ретрорефлектора, которая имеет преимущество сохранения пространственного выравнивания. Рычаг 1040 нм является отложенным лучом в этом протоколе. Временное перекрытие невозможно, если стадия задержки не имеет диапазона, заставляющего два луча перекрываться во времени. В этом случае может потребоваться переместить всю стадию задержки в другое место, чтобы обеспечить временное перекрытие близко к середине диапазона задержки сканирования. Например, если временная разница между двумя лучами измеряется как 6 нс, то требуется 1,8 м регулировки. Требуемая регулировка обозначает длину удлинения траектории луча для более быстрого луча или укорочение траектории луча для более медленного луча.

Помимо выравнивания, согласование размера луча и модуляция луча Стокса также важны для максимизации сигнала SRS. В идеале оба луча должны быть коллимированы в плоскости цели и соответствовать размеру задней апертуры объектива. Полезно проверить коллимацию и размер луча, если объективная плоскость подвергается воздействию пользователя. Если луч сходится или расходится, необходимо отрегулировать вторую линзу пары коллимационных линз для достижения коллимации (этап протокола 1.1). Аналогичным образом, если размер луча слишком мал при задней диафрагме объектива, необходимо использовать пару объективов с большим увеличением (шаг протокола 1.2). SRS линейно масштабируется с глубиной модуляции луча Стокса. Важно следить за тем, чтобы высота импульса в долине составляла <10% от высоты импульса на пике на осциллографе. Плохая модуляция луча Стокса напрямую приводит к плохому SNR.

При использовании фемтосекундных лазеров для визуализации SRS спектральная фокусировка необходима для преобразования временной задержки между насосом и Стоксом в рамановский сдвиг частоты. Коэффициент пересчета зависит от количества примененного чирпа. Крайне важно соответствовать GDD насоса и Stokes для достижения оптимального спектрального разрешения. GDD может быть оценен на основе длины используемого дисперсионного материала и его GVD. Например, плотный кремневый стеклянный стержень SF11 имеет GVD 123.270 fs2/mm при 1,040 нм и 187.486 fs2/mm при 800 нм. Для 240 мм SF11 в лучевой траектории 800 нм GDD составляет 240 мм × 187,486 fs2/mm = 45 000 fs2. Для 240 мм SF11 в лучевом тракте 1040 нм GDD составляет 240 мм × 123,270 fs2/мм = 30 000 fs2. Этот пример расчета означает, что к рычагу 1040 нм должны быть добавлены дополнительные стеклянные стержни, или стеклянные стержни должны быть удалены из рычага 800 нм, чтобы соответствовать GDD. Для достижения более высокого спектрального разрешения требуется больший GDD, что означает более длинные стержни. Однако при расчете ВВП вклад ЕОМ и цель были проигнорированы. Фактическое соответствие GDD определяется экспериментально путем нахождения наилучшего спектрального разрешения для заданных длин стержней на насосе или Стоксе. Расчеты служат хорошим начальным шагом. Экспериментальная оптимизация путем итеративного добавления и удаления стеклянных стержней по-прежнему необходима для оптимизации спектрального разрешения.

Важно понимать, что большое щебетание обеспечивает более высокое спектральное разрешение, но за счет интенсивности сигнала. Меньшее щебетание и более короткие импульсы полезны для визуализации тканей в области C-H, потому что пики белка и липидов Рамана широки. Более низкое спектральное разрешение может быть обменено на более высокий сигнал SRS (или более высокую скорость визуализации) без ущерба для двухцветного контрастатканей 17. В других приложениях, где требуется высокое спектральное разрешение, особенно в области отпечатков пальцев, необходимо применять более крупное щебетание с помощью длинных стеклянных стержней. В качестве альтернативы может быть проще использовать решетчатые носилки для получения более длинных импульсов (для продолжительности импульса более 3 пс). Однако одним из основных ограничений используемого коммерческого лазера является его спектральная полоса пропускания. Спектральное покрытие спектрально-фокусирующих SRS зависит от полосы пропускания лазеров возбуждения. Используемая лазерная система имеет спектральное покрытие, обычно около 200-250 см-1. Этого едва ли достаточно, чтобы охватить область C-H. Больший спектральный охват обычно необходим для разрешения химических веществ для визуализации в области отпечатков пальцев. Эта проблема может быть решена с помощью дополнения к волоконному лазеру, которое расширяет полосу пропускания лазера Стокса с 6 нм до 60 нм18. Другим важным ограничением метода двухцветной визуализации SRS является то, что контролируются только два перехода. Такой подход был бы неподходящим для сложных образцов со многими перекрывающимися рамановскими пиками или несколькими видами.

Двухцветный метод визуализации SRS в режиме реального времени обеспечивает высокоскоростную визуализацию тканей, устраняя необходимость в лазерной или задержке настройки. Тем не менее, его трудно настроить из-за проблем в достижении почти идеальной глубины модуляции для обоих EOM. Лучше всего оптимизировать EOM1 и EOM2 независимо друг от друга. Если EOM1 включен, то EOM2 должен быть отключен и наоборот. После того, как обе модуляции оптимизированы почти до совершенства (глубина модуляции >95%), оба EOM подключаются для обеспечения ортогональной модуляции. Длина временной задержки между двумя ортогональными импульсными поездами зависит от длины BRC и чирикания. Этот метод модуляции не сразу осуществим для клинических применений, поскольку сложная электроника необходима для обеспечения двух РЧ-импульсных поездов с настраиваемым фазовым сдвигом для привода двух ЭОМ. Выравнивание EOM также должно быть почти идеальным, чтобы обеспечить высокую передачу, хорошую модуляцию и ортогональность между двумя каналами. Этот метод, как правило, применим к другим приложениям, которые требуют быстрой, одновременной визуализации двух рамановских пиков из-за движения или изменения образца. Примеры включают измерение температуры воды или отслеживание движущихся объектов, таких как капли липидов или органеллы11,19.

Для будущих клинических применений требуется надежный волоконный лазер4. Подход, описанный протоколом, также может быть расширен для повышения скорости сбора до скорости видео, что важно для сканирования больших образцов тканей в течение разумного времени. Если время визуализации или артефакты движения не являются проблемой, то изображения белка и липида SRS могут быть получены последовательно путем перемещения моторизованной стадии задержки кадр за кадром. Другой двухцветный метод визуализации SRS в режиме реального времени представляет собой двухфазную схему, которая перерабатывает луч Стокса для обеспечения тех же двух ортогональных каналов20. Однако реализация двухфазной схемы требует дополнительного выравнивания, которое включает в себя три балки. Это также требует сопоставления размера луча и расхождения трех лазерных лучей. Потенциальным способом улучшения обоих методов для преодоления одновременного двухцветного предела является включение быстро перестраиваемого волоконного лазера для исследования конкретных спектральныхобластей 21. Обработка изображений такая же, как описано в протоколе для создания смоделированных изображений H&E.

Наконец, этот протокол демонстрирует эпи-режимную визуализацию SRS. Он обычно генерирует изображения более низкого качества по сравнению с визуализацией режима передачи для тонких участков тканей из-за более низкой мощности насоса, достигающейдетектора 13. Для визуализации толстых тканей (>1-2 мм) или образцов, которые сильно рассеиваются (например, костная ткань), эпимодальная визуализация может работать лучше, чем визуализация в режиме передачи. При визуализации свежих тканей, таких как ткань мозга, глубина визуализации SRS обычно ограничивается 200-300 мкм. Для фиксированной ткани рассеяние сильнее, а глубина визуализации составляет 100-200 мкм. Более глубокая визуализация может быть достигнута с помощью более высокой мощности, коррекции аберрации илиоптической очистки 22,23. Тем не менее, эпимодальная визуализация является предпочтительным подходом для диагностики тканей, поскольку она не требует разрезания тканей, а выравнивание проще без конденсатора с высоким NA. Будущие приложения для диагностики тканей выиграют от быстрой визуализации большой площади на неповрежденных хирургических образцах с последующим машинным обучением / диагностикой на основе глубокого обучения. Протокол, представленный здесь, также подходит для приложений in vivo, таких как визуализация мозга или визуализация кожи, где эпимодальная визуализация является единственным вариантом, а высокоскоростная визуализация важна для предотвращения артефактов движения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано NIH R35 GM133435 до D.F.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Achromatic Lens THORLABS AC254-100-B Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter Minicircuits BBP-21.4+ Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens THORLABS AC254-200-B Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate Union Optic WPA2210-650-1100-M25.4 Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate Union Optic WPA4210-650-1100-M25.4 Broadband quarter waveplate
Beam Sampler THORLABS BSN11 10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror THORLABS DMSP1000 Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 472301 Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator THORLABS EO-AM-NR-C1 Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script Matlab https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer PRL-414B Pulse Research Lab 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode THORLABS DET10A2 Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider PRL-220A Pulse Research Lab TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods Union Optic CYLROD01 High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+ Newport Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. 
Lock-in Amplifier Liquid Instruments Moku Lab Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors THORLABS BB05-E03-10 Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage Zaber X-DMQ12P-DE52 Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor Nikon CSC1003 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope Tektronix TDS7054 Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter SigaTek SF50A2 For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode Hamamatsu Corp S3994-01 Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter Union Optic PBS9025-620-1000 Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database refractiveindex.info
Retro-reflector Edmund Optics 34-408 BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier Minicircuits ZHL-1-2W+ Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors Cambridge Technologies 6215H We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage Vidrio ScanImage Basic Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter THORLABS FESH1000 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope Nikon Eclipse FN1 Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective Olympus XLPLN25XWMP2 The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  2. Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
  3. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  4. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).
  5. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  6. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  7. Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).
  8. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  9. Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
  10. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  11. Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  14. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  15. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  16. Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).
  17. Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).
  18. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  19. Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
  20. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  21. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  22. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  23. Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).

Tags

Биоинженерия выпуск 180
Двухцветная стимулированная рамановская рассеянная визуализация мозга мыши в режиме реального времени для диагностики тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espinoza, R., Wong, B., Fu, D.… More

Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis. J. Vis. Exp. (180), e63484, doi:10.3791/63484 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter