Raman estimulado em tempo real, duas cores, espalhando imagens do cérebro do rato para diagnóstico de tecido

Summary

A microscopia de dispersão raman estimulada (SRS) é uma técnica de imagem poderosa, não destrutiva e livre de rótulos. Uma aplicação emergente é a histologia raman estimulada, onde imagens de SRS de duas cores nas transições de proteína e lipídio de Raman são usadas para gerar imagens pseudo-hematoxilina e eosina. Aqui, demonstramos um protocolo para imagens de SRS em tempo real e duas cores para diagnóstico de tecido.

Abstract

A microscopia estimulada de dispersão de Raman (SRS) surgiu como uma poderosa técnica de imagem óptica para diagnóstico de tecidos. Nos últimos anos, o SRS de duas cores mostrou-se capaz de fornecer imagens equivalentes à hematoxilina e eosina (H&E) que permitem um diagnóstico rápido e confiável do câncer cerebral. Tal capacidade permitiu aplicações emocionantes de diagnóstico de câncer intraoperatório. A imagem de tecido srs de duas cores pode ser feita com uma fonte de laser picosegundo ou femtosegundo. Os lasers Femtosegundos têm a vantagem de permitir modos de imagem flexíveis, incluindo imagens hiperespectrais rápidas e imagens srs em tempo real de duas cores. Uma abordagem espectral com pulsos laser chirped é tipicamente usado com lasers femtosegundos para alcançar alta resolução espectral.

A aquisição de SRS de duas cores pode ser realizada com modulação ortogonal e detecção de lock-in. A complexidade do pulso, modulação e caracterização é um gargalo para a adoção generalizada desse método. Este artigo fornece um protocolo detalhado para demonstrar a implementação e otimização do SRS focado no espectral e imagens em tempo real de duas cores do tecido cerebral do camundongo no modo epi. Este protocolo pode ser usado para uma ampla gama de aplicações de imagem SRS que aproveitam a alta velocidade e capacidade de imagem espectroscópica do SRS.

Introduction

Os diagnósticos tradicionais de tecido dependem de protocolos de coloração seguidos de exame sob um microscópio óptico. Um método comum de coloração usado pelos patologistas é a coloração de H&E: manchas de hematoxilina nos núcleos celulares um azul arroxeado, e eosina mancha a matriz extracelular e citoplasma rosa. Essa simples coloração continua sendo o padrão ouro na patologia para muitas tarefas de diagnóstico de tecido, particularmente o diagnóstico de câncer. No entanto, a histopatologia H&E, particularmente a técnica de secção congelada usada em um ambiente intraoperatório, ainda tem limitações. O procedimento de coloração é um processo trabalhoso que envolve incorporação de tecidos, secção, fixação e coloração¹. O tempo típico de retorno é de 20 minutos ou mais. O desempenho do H&E durante a seção congelada às vezes pode se tornar mais desafiador quando várias seções são processadas ao mesmo tempo devido à necessidade de avaliar características celulares ou padrões de crescimento em 3D para avaliação de margem. Além disso, técnicas histológicas intraoperatórias exigem técnicos e clínicos qualificados. A limitação no número de patologistas certificados pelo conselho em muitos hospitais é uma restrição para consulta intraoperatória em muitos casos. Tais limitações podem ser aliviadas com os interesses de desenvolvimento rápido na patologia digital e no diagnóstico baseado em inteligência artificial². No entanto, os resultados de coloração do H&E são variáveis, dependendo da experiência do técnico, que apresenta desafios adicionais para o diagnóstico baseado em computador².

Esses desafios podem ser potencialmente enfrentados com técnicas de imagem óptica sem rótulos. Uma dessas técnicas é a microscopia SRS. O SRS usa lasers pulsados sincronizados — bomba e Stokes — para excitar vibrações moleculares com alta eficiência³. Relatórios recentes demonstraram que a imagem de proteínas e lipídios da SRS pode gerar imagens equivalentes a H&E (também conhecida como histologia raman estimulada ou SRH) com tecido fresco intacto, o que contorna a necessidade de qualquer processamento de tecido, encurta significativamente o tempo necessário para o diagnóstico, e foi adaptado intraoperatóriamente⁴. Além disso, a imagem SRS pode fornecer imagens 3D, que oferecem informações adicionais para diagnóstico quando as imagens 2D são insuficientes⁵. O SRH é imparcial e gera imagens digitais prontamente disponíveis para diagnóstico baseado em computador. Ele surge rapidamente como uma possível solução para o diagnóstico de câncer intraoperatório e análise da margem do tumor, especialmente no câncer cerebral ^6,7,8. Mais recentemente, a imagem srs de alterações químicas do tecido também foi sugerida para fornecer informações diagnósticas úteis que podem ajudar ainda mais os médicos a estratificar diferentes tipos de câncer ou^{estágios 9}.

Apesar de seu tremendo potencial em aplicações de diagnóstico de tecidos, a imagem SRS é limitada principalmente a laboratórios acadêmicos especializados em óptica devido à complexidade associada à plataforma de imagem, que inclui lasers ultrarrápidos, microscópio de varredura a laser e sofisticados eletrônicos de detecção. Este protocolo fornece um fluxo de trabalho detalhado para demonstrar o uso de uma fonte de laser femtosegundo comum para imagens srs em tempo real e duas cores e a geração de imagens pseudo-H&E a partir do tecido cerebral do mouse. O protocolo abrangerá os seguintes procedimentos:

Alinhamento e otimização de chirp
A maioria dos esquemas de imagem SRS usam picosegundos ou lasers femtosegundos como fonte de excitação. Com lasers femtosegundos, a largura de banda do laser é muito maior que a largura de linha raman. Para superar essa limitação, uma abordagem focalizante espectral é usada para chirp os lasers femtosegundos para uma escala de tempo picosegundo para alcançar a resolução espectral estreita¹⁰. A resolução espectral ideal só é alcançada quando o chirp temporal (também conhecido como dispersão de atraso de grupo ou apenas dispersão) é devidamente combinado para a bomba e os lasers stokes. O procedimento de alinhamento e as etapas necessárias para otimizar a dispersão dos raios laser usando hastes de vidro altamente dispersivas são demonstradas aqui.

Calibração de frequência
Uma vantagem do srs focalizado espectral é que a excitação de Raman pode ser rapidamente ajustada alterando o atraso de tempo entre a bomba e os lasers Stokes. Tal ajuste oferece imagens rápidas e aquisição espectral confiável em comparação com comprimentos de onda a laser de ajuste. No entanto, a relação linear entre a frequência de excitação e o atraso de tempo requer calibração externa. Solventes orgânicos com picos raman conhecidos são usados para calibrar a frequência raman para srs focalizando espectral.

Imagem em tempo real, de duas cores
É importante aumentar a velocidade de imagem nas aplicações de diagnóstico tecidual para encurtar o tempo necessário para analisar grandes amostras de tecido. A imagem simultânea de SRS de duas cores de lipídios e proteínas evita a necessidade de ajustar o laser ou o atraso de tempo, o que aumenta a velocidade de imagem em mais de duas vezes. Isso é conseguido usando uma nova técnica de modulação ortogonal e demodulação de dois canais com um amplificador lock-in¹¹. Este artigo descreve o protocolo de modulação ortogonal e aquisição de imagens de dois canais.

Imagem SRS do modo epi
A maioria das imagens SRS mostradas até o momento é realizada no modo de transmissão. A imagem do modo epi detecta fótons recattered do tecido¹². Para aplicações patológicas, as amostras cirúrgicas podem ser bastante grandes. Para a imagem do modo de transmissão, a secção tecidual é muitas vezes necessária, o que indesejavelmente requer tempo extra. Em contraste, a imagem do modo epi pode funcionar com amostras cirúrgicas intactas. Como o mesmo objetivo é usado para coletar luz retorcido, também não há necessidade de alinhar um condensador de abertura numérica elevada necessário para a imagem de transmissão. O modo epi também é a única opção quando a seção tecidual é difícil, como com osso. Anteriormente, demonstramos que, para o tecido cerebral, a imagem do modo epi oferece qualidade de imagem superior para a espessura do tecido > 2 mm¹³. Este protocolo usa um divisor de feixe polarizador (PBS) para coletar fótons dispersos despolarizados pelo tecido. É possível coletar mais fótons com um detector anular em detrimento da complexidade do conjunto de detector personalizado¹². A abordagem PBS é mais simples de implementar (semelhante à fluorescência), com o fotodiodo padrão já sendo usado para detecção do modo de transmissão.

Geração de imagens Pseudo-H&E
Uma vez coletadas imagens srs de duas cores, elas podem ser recoloridas para simular a coloração de H&E. Este artigo demonstra o procedimento para converter imagens de SRS lipídicos e proteicos em imagens pseudo-H&E SRS para aplicações patológicas. O protocolo experimental detalha as etapas críticas necessárias para gerar imagens srs de alta qualidade. O procedimento aqui mostrado não é apenas aplicável ao diagnóstico tecidual, mas também pode ser adaptado para muitas outras aplicações de imagem hiperespectral srs, como imagem de drogas e imagem metabólica^14,15.

Requisitos gerais do sistema
O sistema laser para este protocolo deve ser capaz de produzir 2 raios laser femtosegundos sincronizados. Os sistemas possuem idealmente um Oscilador Paramétrico Óptico (OPO) para afinação de comprimento de onda amplo de um dos raios laser. A configuração deste protocolo usa um sistema de laser comercial Insight DS+ que produz dois lasers (um feixe fixo a 1.040 nm e um feixe tunable baseado em OPO, variando de 680 a 1.300 nm) com uma taxa de repetição de 80 MHz. Microscópios de varredura a laser, seja de grandes fabricantes de microscópios ou caseiros, podem ser usados para imagens SRS. O microscópio utilizado é um microscópio de varredura a laser vertical construído em cima de um quadro comercial de microscópio vertical. Um par de espelhos galvo de 5 mm são usados para escanear o raio laser. Para os usuários que optarem por adotar um microscópio de varredura a laser construído em casa, consulte um protocolo publicado anteriormente para a construção de um microscópio de varredura a laser¹⁶.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais de animais foram realizados com cérebros de camundongos fixos e seccionados de 200 μm, de acordo com o protocolo (nº 4395-01) aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Washington. Os camundongos do tipo selvagem (cepa C57BL/6J) são eutanizados com CO₂. Em seguida, uma craniotomia é realizada para extrair seus cérebros para fixação em 4% de paraformaldeído em soro fisco tamponado. Os cérebros são embutidos em uma mistura de 3% de agarose e 0,3% de gelatina e seccionados em fatias de 200 μm de espessura por um vibratome.

1. Alinhamento inicial

NOTA: Certifique-se de que o tamanho do feixe e a divergência de ambos os braços são combinados para melhor sensibilidade e resolução. Cotoma a bomba e os feixes stokes e ajusta seus tamanhos antes de entrar no microscópio de varredura a laser. Para isso, use um par de lentes acráticas para cada feixe antes de combiná-las no espelho dicrómico. Use sempre óculos laser adequados para alinhamento de feixe.

1. Colagem de feixe
   1. Instale um par de lentes acráticas para o feixe da bomba. Como ponto de partida, use uma lente de 100 mm e uma lente de 200 mm para ampliar o tamanho do raio laser em 2 vezes. Certifique-se de que a distância das duas lentes é de aproximadamente 300 mm. Alinhe o feixe da bomba através do centro de ambas as lentes.
   2. Coloque um espelho após a segunda lente para enviar o feixe em direção a uma parede (>1 m de distância). Tome cuidado ao enviar o feixe por longas distâncias. Rastreie o feixe do espelho até a parede com um cartão IR e verifique se o feixe muda de tamanho. Cobrem o feixe se o feixe mudar de tamanho em função da distância.
      1. Se o feixe estiver convergindo (tamanho decrescente com propagação), mova as duas lentes mais para perto.
      2. Se o feixe estiver divergindo (aumentando o tamanho com a propagação), mova as duas lentes mais distantes. Ajuste a distância até que o feixe seja colidido.
   3. Repita os passos 1.1.1 e 1.1.2 para que o feixe de Stokes entre em collimate a viga.
2. Ajuste do tamanho do feixe
   1. Se um profiler de feixe estiver disponível, meça o tamanho do feixe colidido para cada feixe. Alternativamente, estime o tamanho do feixe usando a placa IR e uma régua para obter um diâmetro de feixe de 4-5 mm.
   2. Se o tamanho do feixe for muito pequeno ou muito grande, mude o par de lentes usado na etapa 1.1. Ajuste o par da lente até que ambos os feixes tenham um diâmetro de 4-5 mm.
      NOTA: A ampliação do feixe é a razão entre a distância focal da segunda lente para a primeira lente (f₂/f₁).
3. Sobreposição espacial
   NOTA: A imagem srs requer que ambos os raios laser sejam combinados no espaço e no tempo para excitar vibrações moleculares. Um esquema da imagem SRS com foco espectral é mostrado na Figura 1.
   1. Combine os dois raios laser instalando um espelho dicroico com vários espelhos de direção para ajuste. Otimize a sobreposição espacial da bomba e dos Stokes monitorando feixes após o espelhodicróico em duas posições diferentes distantes (~1 m). Ajuste iterativamente o espelho de direção antes dodicróico e do espelho dicroico para alinhar o feixe de Stokes com o feixe da bomba.
      NOTA: Se os dois feixes estiverem se sobrepondo espacialmente em ambas as posições, elas serão suficientemente sobrepostas.
   2. Certifique-se de que os feixes combinados sejam enviados para o centro dos espelhos de varredura do microscópio de varredura a laser, ajustando um par de espelhos de direção quando os espelhos de varredura estiverem na posição estacionada. Certifique-se de que ambos os feixes viajem pelo centro do objetivo do microscópio e do condensador.
   3. Após o condensador, use outro par de lentes com distâncias focais de 100 mm e 30 mm, respectivamente, para retransmitir o feixe transmitido para o fotodiodo. Certifique-se de que ambos os feixes estão contidos dentro do fotodiodo e instale dois filtros de baixa passagem para bloquear o feixe de Stokes modulado.

2. Detecção de sinal SRS

1. Modulação eletroóptica (EOM)
   NOTA: O EOM de 20 MHz é usado para modular a amplitude de Stokes. Como discutido posteriormente, o EOM é derivado do trem de pulso laser de 80 MHz, que é necessário para modulação ortogonal. Outras frequências de modulação podem ser usadas se apenas o SRS de cor única ou hiperespectral for realizado. Nesse caso, a sincronização da frequência de modulação à frequência laser é desnecessária. Um gerador de frequência com um amplificador de energia RF pode ser usado para conduzir o EOM. Como resultado, as etapas 2.1.1-2.1.4 podem ser ignoradas.
   1. Coloque um sampler de feixe no caminho do feixe de Stokes para pegar 10% do feixe e enviá-lo para um fotodiodo rápido para detectar o trem de pulso de 80 MHz.
      NOTA: O sinal de fotodiodo é enviado a um divisor de frequências para gerar uma saída TTL de 20 MHz. Esta saída é ainda enviada para um buffer de fanout para replicar a saída em quatro saídas idênticas de 20 MHz. Uma das saídas é usada para acionar o osciloscópio.
   2. Pegue uma das saídas do buffer de fanout e filtre-o com um filtro bandpass para obter uma onda sinusoidal de 20 MHz. Use um atenuante RF para ajustar a tensão de pico de saída para ~500 mV.
   3. Envie a saída resultante para um câmbio de fase, o que permite um ajuste fino da fase RF com uma fonte de tensão. Envie esta saída para um amplificador de energia RF e conecte a saída do amplificador ao EOM.
   4. Desbloqueie o feixe de Stokes e otimize a profundidade de modulação do EOM1 colocando um fotodiodo no caminho do feixe. Ajuste a tensão EOM e a placa de quarta-de-onda até que a profundidade de modulação (relação vale a pico) pareça satisfatória.
      NOTA: Na modulação de 20 MHz (1/4 da taxa de repetição do laser), são esperados dois pulsos a cada 50 ns.
2. Sobreposição temporal
   NOTA: A sobreposição temporal da bomba e Stokes é alcançada atrasando um dos dois trens de pulso laser com um retro-refletor montado em um estágio de atraso (a Figura 1 mostra que os Stokes estão atrasados). A sobreposição grosseira é monitorada com o osciloscópio, e a sobreposição fina é monitorada pelo sinal SRS. A sobreposição temporal fina também pode ser alcançada com um autocorrelador se disponível.
   1. Coloque um fotodiodo após o espelhodicróico para detectar o raio laser. Bloqueie o feixe de Stokes primeiro. Amplie em um dos picos de pulso da bomba no osciloscópio. Coloque um cursor vertical para marcar a posição temporal deste pico com o osciloscópio.
   2. Bloqueie o feixe da bomba e desbloqueie o feixe de Stokes. Traduza o estágio de atraso para corresponder temporalmente à posição de pico do osciloscópio com a posição marcada na etapa anterior. Consulte a Figura 2 para exibir a sobreposição temporal de dois feixes.
      1. (OPCIONAL) Se a tradução da etapa de atraso for insuficiente para corresponder temporalmente às duas vigas, mova o estágio de atraso para o meio de sua faixa de movimento.
      2. Calcule a distância de atraso necessária para combinar com os dois feixes, tomando a diferença temporal entre os dois feixes e multiplicando a diferença pela velocidade da luz para encontrar a quantidade de distância necessária para corresponder às duas vigas temporalmente.
      3. Alongue o caminho do feixe mais rápido ou encurte o caminho do feixe do feixe mais lento para aproximadamente corresponder ao atraso temporal de acordo.
   3. Prepare uma amostra de slides de microscópio com DMSO e fita dupla face como espaçador para segurar a amostra entre o slide e um deslizamento de tampa.
   4. Coloque a amostra no microscópio com o lado de deslizamento de cobertura voltado para o objetivo do microscópio. Altere o microscópio para iluminação de campo brilhante e observe a amostra da ocular. Encontre o foco da amostra primeiro encontrando o foco na camada superior e inferior das bolhas de ar na interface da fita de vidro e, em seguida, mova o foco para estar entre as duas camadas de fita.
      NOTA: Certifique-se de que os raios laser estão bloqueados antes de olhar para a ocular.
   5. Defina a saída do feixe tunable para 798 nm. Com base no rendimento óptico do condensador, ajuste a potência óptica para ser ~40 mW cada para a bomba e os feixes de Stokes no foco objetivo.
   6. Abra o ScanImage no MATLAB (ou em outro software de digitalização que controla o microscópio) e clique no botão rotulado FOCUS para iniciar a digitalização.
      NOTA: Os raios laser serão escaneados através da amostra para gerar uma imagem. A saída de sinal de baixa frequência do fotodiodo (<100 kHz) é enviada diretamente para o canal 1 da placa de aquisição de dados (conhecida como canal DC). A saída de alta frequência (>100 kHz) do fotodiodo é enviada para o amplificador lock-in, e a saída X do sinal do amplificador de travamento é enviada para o canal 2 da placa de aquisição de dados (referida como canal CA).
   7. Ajuste o espelho de direção antes que o scanner galvo centralize o sinal DC no visor do canal 1. Mova o estágio de atraso motorizado e observe de perto a saída de bloqueio mostrada no visor do canal 2 (ou seja, canal CA).
      NOTA: Quando a bomba e Stokes coincidirem com o tempo, um sinal aparecerá no canal CA. É útil ajustar a escala de cores do canal CA para exibir a pequena mudança de intensidade.
   8. Maximize a intensidade do sinal CA ajustando bem o atraso de tempo. Ajuste o espelho dicroico para centralizar o sinal SRS no canal CA (mantendo o canal DC centrado). Ajuste a fase do amplificador de travamento para maximizar o sinal. Consulte a Figura 3 para obter um sinal satisfatório.

3. Otimização da resolução espectral

NOTA: Os feixes de bomba e Stokes que atingem a amostra devem ter a mesma quantidade de dispersão de atraso de grupo (GDD) para maximizar a resolução espectral. A dispersão depende muito da configuração experimental. A configuração experimental descrita aqui utiliza pulsos femtosegundos a 1.040 nm e 800 nm como Stokes e bomba, respectivamente. As barras de vidro de pedra densas (H-ZF52A) são usadas como meio de alongamento de pulso.

1. Insira 48 cm de uma haste de vidro altamente dispersiva (H-ZF52A ou vidro de pedra denso equivalente) no caminho do feixe de 800 nm. Estimar o GDD usando Eq (1):
   (1)
   NOTA: O GVD de vários materiais de vidro em diferentes comprimentos de onda pode ser encontrado a partir do recurso de banco de dados de índices refrativos. Por exemplo, H-ZF52A tem um GVD de 220,40 fs²/mm a 800 nm. O GDD total é 105792 fs².
2. Calcule quantos cm da haste de vidro dispersiva é necessária para adicionar ao caminho do feixe de 1.040 nm para combinar com o GDD da bomba. Insira o comprimento apropriado das hastes de vidro dispersivas no caminho do feixe de 1.040 nm para aproximadamente corresponder ao GDD do feixe de 800 nm. Observe que a adição de hastes de vidro mudará a sobreposição temporal das duas vigas, podendo ser necessário ajuste de atraso.
3. Calibração da resolução espectral
   1. Faça uma amostra de slides de microscópio com DMSO. Coloque o slide sobre o microscópio e verifique a potência dos feixes que saem do condensador do microscópio. Ajuste a potência de acordo para ter ~40 mW cada um em foco de amostra.
   2. Abra o ScanImage do MATLAB. Encontre o sinal máximo srs através da fase de atraso, que corresponde ao pico raman de 2.913 ^cm-1 do DMSO. Estime a posição do estágio com base na posição do estágio anterior com o aumento do comprimento do caminho óptico devido à inserção de hastes. Realinhar a sobreposição espacial do feixe devido ao pequeno desvio do feixe quando as hastes de vidro forem adicionadas.
   3. Salve uma varredura srs hiperespectral, tirando sequencialmente uma série de imagens SRS enquanto move o estágio motorizado.
      NOTA: A faixa de varredura de atraso abrange dois picos de Raman, correspondentes aos picos de 2.913 ^cm-1 e 2.994 ^cm-1 Raman de DMSO, respectivamente. Estas duas transições são observadas ao utilizar uma bomba de 800 nm e 1.040 nm de laser Stokes.
   4. Plote os espectros SRS da solução DMSO usando ImageJ ou MATLAB. Encaixe o grande pico DMSO de 2.913 ^cm-1 a uma função gaussiana ou lorentziana no MATLAB para calcular a Largura Total na Metade Máxima (FWHM) do pico.
      NOTA: Os resultados representativos são mostrados na Figura 4. Se apenas um pico amplo estiver presente, isso significa que ou a resolução espectral é muito pobre para distinguir os dois picos e mais barras de vidro são necessárias, ou a faixa digitalizada era muito pequena para detectar o segundo pico. Normalmente, uma resolução espectral aceitável DMSO é ~20-25 ^cm-1 quando são usadas hastes de vidro de >60 cm. Uma resolução mais baixa é frequentemente usada para imagens de tecido para trocar por sinais mais altos com pulsos mais curtos¹⁷.
4. (OPCIONAL) Use um autocorrelador ou um FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) para determinar a duração do pulso de cada braço para calcular exatamente a quantidade de GDD e o comprimento das hastes necessárias para combinar com o GDD entre a bomba e os Stokes.
5. Repetir passos 3.3.2-3.3.4 para diferentes comprimentos de hastes no feixe stokes para encontrar a resolução espectral ideal, o que significa que a melhor correspondência GDD foi encontrada experimentalmente. Use vários conjuntos de hastes de vidro que diferem em comprimento para obter uma resolução espectral ideal.

4. Caracterização do sinal para ruído (SNR)

1. Certifique-se de que a etapa 4.2 seja realizada após o alinhamento espacial e temporal completo.
2. Adquira uma imagem SRS correspondente ao pico raman de 2.913 ^cm-1 do DMSO. Abra a imagem no ImageJ e selecione uma pequena área no centro do quadro. Use a função de medida para calcular a média e o desvio padrão dos valores na área selecionada.
3. Divida o valor médio da área selecionada pelo desvio padrão para encontrar o valor SNR, como no Eq (2).
   (2)
   NOTA: Um bom SNR para o sistema (com uma constante de tempo de bloqueio de 4 μs) utilizando DMSO a 40 mw/40 mw em foco para ambos os braços é >800. Concentrações mais baixas de DMSO ou menor potência podem ser usadas para uma estimativa mais precisa do SNR se o cartão de aquisição de dados tiver uma profundidade de bits limitada.
4. Se o SNR estiver muito baixo, realinhar os pulsos de laser para otimizar a sobreposição espacial, sobreposição temporal, correspondência de tamanho/colisão do feixe e/ou correspondência de dispersão. Para um objetivo com uma coleira de correção de aberração, otimize o sinal ajustando a coleira de correção.

5. Calibração do eixo de frequência

NOTA: Esta etapa é realizada para relacionar a posição do estágio de atraso com a transição de Raman digitalizada. Uma seleção cuidadosa de solventes é necessária para gerar um "Raman Ruler" apropriado. O DMSO é um solvente eficaz para ligações CH, pois tem dois picos de Raman afiados a 2.913 ^cm-1 e 2.994 ^cm-1.

1. Salve uma varredura hiperespectral com o intervalo de estágio de atraso cobrindo os picos de 2.913 ^cm-1 e 2.994 ^cm-1 Raman de DMSO. Salve as posições de estágio correspondentes ao conjunto de dados hiperespectral.
   NOTA: O pico máximo global do espectro corresponde ao câmbio DMSO 2.913 ^cm-1 Raman e o segundo pico máximo corresponde ao câmbio DMSO 2.994 ^cm-1 Raman.
2. Realizar regressão linear para as posições do palco e Raman muda a 2.913 ^cm-1 e 2.994 ^cm-1. Usando a equação de regressão linear relacionando a posição do palco à mudança de Raman, converta as posições de atraso para as frequências raman correspondentes.

6. Modulação ortogonal e imagem de duas cores

NOTA: A etapa de modulação ortogonal só é necessária quando é necessária uma imagem de duas cores em tempo real. Um esquema deste esquema é mostrado na Figura 5. A modulação ortogonal utiliza um par de EOMs conduzidos a um quarto da frequência laser (20 MHz para laser de 80 MHz) com uma mudança de fase de 90°entre os dois. Esta etapa de modulação ortogonal pode ser ignorada para imagens srs de cor única ou imagens de SRS hiperespectrais.

1. Modulação EOM1
   1. Instale um PBS (PBS2), uma placa de quarto de onda (QWP2) e um segundo EOM (EOM2) no caminho do feixe de Stokes após o primeiro EOM. Desligue a entrada do sinal para EOM2. Ligue a entrada do sinal para EOM1 e ligue-a.
   2. Modular o feixe stokes (fixado em 1.040 nm) a 20 MHz (f₀/4) enviando o feixe através do primeiro EOM. Ajuste a inclinação e a posição do EOM1 para garantir que o feixe esteja em linha reta e centralizou através do cristal EOM.
   3. Monitore a profundidade de modulação observando ambas as polarizações que saem do PBS1 com duas fotodiodes e exibindo a modulação em um osciloscópio.
   4. Ajuste a tensão QWP1, EOM1 e a fase da entrada de 20 MHz (usando um shifter de fase) para otimizar a profundidade de modulação do feixe transmitido para estar perto de 100%. Consulte a Figura 2B para obter uma ilustração de uma boa profundidade de modulação.
2. Modulação EOM2
   1. Desligue o EOM1 e conecte o EOM2.
   2. Envie a saída de alta tensão do segundo amplificador a 20 MHz para EOM2. Ajuste a inclinação e a posição do EOM2 para garantir que o feixe esteja em linha reta e centralizou através do cristal EOM.
   3. Mais uma vez, monitore a profundidade da modulação olhando para ambas as polarizações que saem do PBS2 com um osciloscópio. Ajuste a tensão QWP2, EOM2 e o câmbio de fase conforme necessário para alcançar quase 100% de modulação para ambas as polarizações.
   4. Certifique-se de que a modulação do trem de pulso tenha uma mudança de fase de 90° a partir da primeira modulação.
      NOTA: Se os dois trens de pulso da bomba não estiverem 90° ortogonais, o crosstalk entre os dois canais será um problema.
   5. Teste a ortogonalidade da modulação ligando e conectando tanto o EOM1 quanto o EOM2. Monitore ambas as polarizações sendo divididas pelo PBS2 com um osciloscópio. Reotimize EOM1 e EOM2 individualmente se o trem de pulso após o segundo PBS não se assemelhar à Figura 2C.
   6. Instale um cristal de quartzo birefringent de 20 mm (BRC) e HWP a jusante de EOM2. Conecte os dois EOMs de uma só vez e monitore o trem de pulso de tal forma que se assemelhe à Figura 2D.
      NOTA: Para o chirp usado neste experimento, 20 mm BRC induz um atraso de tempo que corresponde a uma mudança raman de 80 ^cm-1 . Um comprimento BRC diferente pode ser necessário se um chirp diferente for usado.
3. Calibração
   1. Calibrar o sistema usando OMSO detectando sinais do amplificador de bloqueio X e saída de canal Y (enviado aos canais 2 e 3 do cartão de aquisição de dados).
   2. Verifique se os sinais gerados pelo pico de 2.913 ^cm-1 a partir da polarização mais rápida e que a partir da polarização mais lenta estão perto de 90° fora de fase no amplificador lock-in. Se este não for o caso, ajuste o alinhamento EOM até que os dois sinais estejam perto de 90° fora de fase.
   3. Uma vez que a calibração esteja completa, encontre a posição de atraso que sonda a transição proteica em 2.930 ^cm-1 para um dos feixes ortogonais. Certifique-se de que a outra polarização sonda a transição lipídica de 2.850 ^cm-1.

7. Imagem SRS do modo epi

NOTA: No esquema de imagem do modo de transmissão, o objetivo concentra o laser na amostra e, em seguida, uma lente condensadora direciona o feixe transmitido para um fotodiodo para detecção de bloqueio. No esquema de imagem do modo epi, a luz que é retroacionada e despolarizada pela amostra é recolhida pelo objetivo de foco e isolada usando um divisor de feixe polarizador. Os fótons isolados e recattered são enviados para um fotodiodo através de um par de lentes de relé para detecção de lock-in. A figura 6 retrata o esquema de imagem do modo epi.

1. Instale um HWP antes que o feixe entre no microscópio para alterar a polarização do feixe que vai para o microscópio. Coloque um PBS acima do objetivo de permitir que o feixe despolarizado refletido para chegar ao detector.
2. Use um par de lentes compostas por uma lente de acromat de 75 mm e uma lente asférica de 30 mm para retransmitir os fótons backscattered da abertura traseira do objetivo para o fotodetetor. Monte o detector para coletar a luz resqueada dirigida pela PBS. Instale um filtro para impedir que o feixe modulado entre no detector.
3. Coloque a amostra de tecido sob o objetivo. Como o condensador é desnecessário para imagens de modo epi, remova-o se for necessário mais espaço.
4. Imagiologia
   1. Bloqueie o feixe com um obturador; brilhar uma fonte de luz branca sobre a amostra do lado; e usar brightfield para encontrar foco objetivo.
   2. Desbloqueie ambos os feixes e use as posições de atraso pré-calibradas para adquirir imagens de SRS lipídicos e proteicos a partir do tecido das duas saídas do amplificador lock-in.
   3. Ajuste o fator de ganho de bloqueio e caixa de pixels para adquirir imagens de boa qualidade.

8. Coloração de cor falsa

1. Abra a pilha de imagens com ImageJ.
2. Retire as duas imagens que correspondem às espécies lipídica (2.850 ^cm-1) e proteína (2.930 ^cm-1) clicando com o botão direito do mouse na imagem e clicando em Duplicata.
3. Renomeie a imagem lipídica para lipídios e a imagem proteica para proteínas.
4. Vá para processá-| Calculadora de imagens e realizar proteínas subtraem lipídios.
5. Combine as imagens indo para Image | | de cor Mesclar canais, colocando lipídios em verde e proteínas em azul. Abra a ferramenta canais de imagem (| de imagem | de cor Ferramenta de canais) e ajuste o brilho e o contraste (| de imagem Ajuste | Brilho/Contraste).
6. Ajuste o brilho e o contraste para cada canal usando a ferramenta de canais . Para o canal lipíduo, ajuste o contraste até que as características celulares pareçam escuras. Para o canal de proteínas, ajuste o contraste até que as características celulares pareçam azuis. Converta a imagem verde/azul do canal mesclado em uma imagem RGB indo para Image | Tipo | Cor RGB. Exporte esta imagem por | de arquivos Salve como | Tiff, o que está tendo?
   NOTA: Para a falsa coloração de H&E, o esquema de cores mostra citoplasma rosa, enquanto os núcleos são azul-roxo escuro.
7. Baixe o script HE.m MATLAB do falso recurso de script de coloração H&E na Tabela de Materiais.
8. Execute o script HE.m no MATLAB. Selecione a imagem RGB exportada da etapa anterior para gerar uma imagem artificialmente manchada de H&E.
9. (OPCIONAL) Normalize a intensidade da imagem para imagens de grande campo de visão porque a imagem aparece mais escura na periferia do que no centro.
   1. Para realizar a normalização de campo das imagens, média do maior número possível de imagens. Em seguida, remova os recursos de intensidade com ImageJ (Processe | Filtros | | de Borrão Gaussiano Raio=50).
   2. Meça a intensidade máxima da imagem borrada (Ctrl+M). Divida a imagem desfocada pela intensidade máxima (Processar | | de matemática Divida). Divida a imagem SRS bruta pela imagem borrada (Processe | | de imagem Calculadora).

Representative Results

Otimização da resolução espectral:
A dispersão através de um material é afetada pelo meio dispersivo (comprimento e material) e comprimento de onda. A alteração do comprimento da haste de dispersão afeta a resolução espectral e o tamanho do sinal. É uma relação de dar e receber que pode ser ponderada de forma diferente dependendo da aplicação. As hastes esticam o pulso do feixe de ser larga em frequência e estreita no tempo para ser estreita em frequência e larga no tempo. A Figura 7 mostra o efeito de comprimentos variados da haste na resolução espectral. Figura 7A demonstra resolução espectral muito ruim; esta configuração não tem hastes de vidro, e os dois picos Raman do DMSO não são resolvidos. Na Figura 7B,C, um aumento no número de hastes de vidro começa a resolver os dois picos. Por fim, a Figura 7D mostra como o chirping combinado resolve ambos os picos e pode ser usado para calibrar posições de estágio para frequência.

Calibração com DMSO:
O DMSO tem dois picos de Raman afiados em 2.913 e 2.994 ^cm-1 que são convenientes para a calibração na região C-H. Uma vez que um espectro DMSO é obtido a partir de uma varredura de SRS hiperespectral, uma simples regressão linear converte a posição do palco para a mudança de Raman. Se a resolução espectral é ruim (como mostrado na Figura 7A) e os dois picos não são separáveis, então a calibração com regressão linear é impossível. Neste caso, é necessário uma melhor correspondência de dispersão, adicionando ou removendo hastes de vidro. As dificuldades mais comuns em encontrar um sinal DMSO para calibração são devido a erros na sobreposição temporal ou sobreposição espacial dos dois feixes. Antes de tentar a calibração do DMSO, repita as etapas de alinhamento espacial e temporal para otimizar o sinal SRS.

DMSO de duas cores:
Em SRS de duas cores, dois trens de pulso de bomba são gerados com polarização ortogonal com um atraso de tempo fixo (devido a um cristal birefringent). A avaliação da profundidade de modulação e do turno de fase de 90° é feita com um fotodiodo seguido de um sinal DMSO SRS. A Figura 8 demonstra profundidade de modulação aceitável e separação temporal. Embora a resolução espectral do DMSO na Figura 8 não seja ideal, muitas vezes é sacrificada em experimentos de imagem tecidual para obter um sinal mais alto com pulsos mais curtos. A Figura 9 demonstra mudanças de fase ruins que dão origem a picos invertidos ou negativos.

SRS de duas cores do tecido cerebral do rato em modo epi:
Modo epi (detecção de fótons backscattered) SRS é usado para imagem de tecido grosso (>1 mm). Figura 10A,B demonstra imagem srs em tempo real, de duas cores, a 2.850 ^cm-1 e 2.930 ^cm-1 de tecido cerebral ex vivo. As imagens brutas dos canais lipídico e proteico (Figura 10A,B) foram codificadas por cores para produzir uma única imagem representando contribuições lipídicas e proteicas (Figura 10C). Foi realizada coloração falsa de H&E (Figura 10D) na Figura 10C para imitar a coloração de H&E. A má qualidade da imagem pode ser resultado de grande profundidade de imagem ou má calibração (eixo de frequência ou profundidade de modulação). A profundidade típica de imagem no tecido cerebral é de 100-200 μm¹³.

Figura 1: Esquema de configuração de imagem SRS de uma cor. Construção de um microscópio SRS com foco espectral no modo de transmissão. X e Y representam as saídas ortogonais. Abreviaturas: SRS = dispersão estimulada de Raman; DL = linha de atraso baseada em retrorefletores; Div = divisor; FB = tampão de ventilador; AT = atenuador; PS = shifter de fase; PA = amplificador de energia; DCM = espelho dicrómico; GM = espelhos galvo; EOM = modulador eletroóptico; POM = espelho de retirada; PBS = divisor de feixe polarizador, BRC = cristal birefringente; QWP = placa de quarta-onda; HWP: placa de meia onda; PD = fotodiodo; GR = haste de vidro; BB = Bloco de vigas; FPS = filtro de passagem curta; CL = lente de colisão; BS = lente de mudança de tamanho do feixe. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Sobreposição temporal representativa. (A) As vigas da bomba e de Stokes são vistas como temporalmente sobrepostas no osciloscópio. Os cursores de osciloscópios são usados para marcar as posições temporais da bomba e dos feixes de Stokes. Essa sobreposição é satisfatória como ponto de partida para ajustar ainda mais a sobreposição temporal com um estágio de atraso. (B) Profundidade de modulação representativa satisfatória de um EOM a 20 MHz. (C) Modulação de pulso satisfatória enquanto dois EOMs estão em uso. (D) Modulação satisfatória do trem de pulso após a instalação de cristal de quartzo e placa de meia onda no braço de Stokes duplamente modulado. Abreviação: EOM = modulador eletroóptico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: SrS representativo e sinais de bomba. (A) Sinal de bomba desalinhado detectado no canal DC. (B) Sinal SRS desalinhado detectado por fotodiodo. (C) Sinal de bomba satisfatório e centrado no canal DC. (D) Sinal DE SRS satisfatório centrado no canal CA. Abreviação: SRS = dispersão estimulada de Raman. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Caracterização da resolução espectral. Uma função gaussiana foi adequada ao pico raman DMSO de 2.913 ^cm-1 . O cálculo da FWHM deu uma resolução de 15 ^cm-1 para o sistema. Abreviaturas: DMSO = sulfóxido de dimetil; FWHM = Largura Total a Meio Máximo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Esquema de configuração de imagem SRS de duas cores. Construção de um microscópio SRS de duas cores no modo de transmissão. X e Y representam as saídas ortogonais. Abreviaturas: DL = linha de atraso baseada em retrorefletor; Div = divisor; FB = tampão de ventilador; AT = atenuador; PS = shifter de fase; PA = amplificador de energia; DCM = espelho dicrómico; GM = espelhos galvo; EOM = modulador eletroóptico; PBS = divisor de feixe polarizador; BRC = cristal birefringente; QWP = placa de quarta-onda; HWP = placa de meia onda; PD = fotodiodo; GR = haste de vidro; BB = Bloco de feixe, FPS = filtro de curto-tempo; CL = lente de colisão; POM = espelho de retirada; BS = lente de mudança de tamanho do feixe. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Esquema de configuração de modo epi de imagem SRS de duas cores. Construção de um microscópio SRS de duas cores no modo epi. X e Y representam as saídas ortogonais. Abreviaturas: DL = linha de atraso baseada em retrorefletor; Div = divisor; FB = tampão de ventilador; AT = atenuador; PS = shifter de fase; PA = amplificador de energia; DCM = espelho dicrómico; GM = espelhos galvo; EOM = modulador eletroóptico; PBS = divisor de feixe polarizador; BRC = cristal birefringente; QWP = placa de quarta-onda; HWP = placa de meia onda; PD = fotodiodo; GR = haste de vidro; BB = Bloco de feixe, BPF = filtro de bandpass; CL = lente de colisão; POM = espelho de retirada; BS = lente de mudança de tamanho do feixe. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Otimizando a resolução espectral com 25% de DMSO. (A) Foram utilizadas hastes de vidro zero para obter o espectro DMSO. Os dois picos não estão resolvidos. (B) Foram utilizadas hastes de vidro, 20 cm no braço da bomba e 24 cm no braço de Stokes. Dois picos estão começando a ser resolvidos a um ponto satisfatório. (C) Foram utilizadas hastes de chirping, bomba de 40 cm de comprimento e Stokes de 24 cm de comprimento, para obter um espectro DMSO melhor resolvido. (D) Foram utilizadas hastes de chirping, bomba de 64 cm de comprimento e Stokes de 60 cm de comprimento, para obter maior resolução espectral. Abreviação: DMSO = sulfóxido de dimetila. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: SRS de duas cores, polarização variada e atraso de tempo. Dois trens de pulso atrasados de tempo de polarização ortogonal (s&p) são usados para imagem de espectro dMSO para mostrar o atraso de tempo (e diferença de frequência de Raman) entre as excitações do SRS. Abreviaturas: DMSO = sulfóxido de dimetil; SRS = dispersão estimulada de Raman. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Espectro SRS resultante de uma fraca mudança de fase srs de duas cores. Um pico negativo de 2.994 ^cm-1 perto da posição do estágio 48 é um indicativo de baixa diferença de fase. Abreviação: SRS = dispersão estimulada de Raman. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Geração de falsa coloração de H&E de duas cores de imagens SRS. (A) Imagem de SRS de proteína bruta de um tecido cerebral de camundongos na transição de 2.930 ^cm-1 . (B) Imagem de SRS lipídica bruta do tecido cerebral do camundongo na transição de 2.850 ^cm-1 . (C) Canais mesclados e codificados por cores a partir de A e B com contribuição lipídica na contribuição verde e proteica em azul. (D) A recoloração falsa de H&E foi realizada em C para imitar a coloração de H&E para aplicações patológicas. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: SRS = dispersão estimulada de Raman; H&E = hematoxilina e eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O esquema de imagem SRS de duas cores apresentado neste protocolo depende da implementação adequada de imagens SRS de uma cor. Em imagens de SRS de uma cor, as etapas críticas são alinhamento espacial, alinhamento temporal, profundidade de modulação e mudança de fase. A combinação espacial dos dois feixes é realizada por um espelhodicróico. Vários espelhos de direção são usados para ajuste fino ao enviar as vigas para o espelho dicroico. Uma vez que os feixes são combinados com o espelho dicroico, o alinhamento espacial pode ser confirmado pegando o caminho combinado do feixe com um espelho para enviar em direção a uma parede > 1 m de distância enquanto verifica o feixe combinado para ver se ele se sobrepõe com um cartão IR. Seguindo o alinhamento espacial através do microscópio, a sobreposição temporal é realizada ajustando o comprimento do caminho com um estágio de atraso baseado em retrorefletor, que tem o benefício de preservar o alinhamento espacial. O braço de 1.040 nm é o feixe atrasado neste protocolo. A sobreposição temporal é impossível se o estágio de atraso não tiver o alcance para fazer com que os dois feixes se sobreponham temporalmente. Nesse caso, pode ser necessário mover todo o estágio de atraso para um local diferente para garantir que a sobreposição temporal esteja próxima do intervalo do meio do intervalo de varredura de atraso. Por exemplo, se a diferença temporal entre as duas vigas for medida como 6 ns, então 1,8 m de ajuste é necessária. O ajuste necessário denota o comprimento do alongamento do caminho do feixe para o feixe mais rápido ou o encurtamento do caminho do feixe para o feixe mais lento.

Além do alinhamento, a correspondência do tamanho do feixe de feixe e a modulação do feixe stokes também são importantes para maximizar o sinal SRS. Idealmente, ambas as vigas devem ser colididas no plano objetivo e corresponder ao tamanho da abertura traseira objetiva. É útil verificar o tamanho da collimação e do feixe se o plano objetivo for exposto ao usuário. Se o feixe estiver convergindo ou divergindo, é necessário ajustar a segunda lente do par de lentes de colisão para alcançar a colisão (passo do protocolo 1.1). Da mesma forma, se o tamanho do feixe for muito pequeno na abertura traseira objetiva, um par de lentes com alta ampliação precisa ser usado (protocolo passo 1.2). SrS escala linearmente com a profundidade de modulação do feixe stokes. É importante garantir que a altura do pulso no vale seja <10% da altura do pulso no pico do osciloscópio. A má modulação do feixe de Stokes traduz diretamente para o pobre SNR.

Ao usar lasers femtosegundos para imagens SRS, o foco espectral é necessário para converter o atraso de tempo entre a bomba e Stokes para a mudança de frequência de Raman. O fator de conversão depende da quantidade de chirp aplicado. É fundamental combinar o GDD da bomba e Stokes para obter uma resolução espectral ideal. O GDD pode ser estimado com base no comprimento do material de dispersão utilizado e seu GVD. Por exemplo, a vara de vidro de pedra densa SF11 tem um GVD de 123.270 fs²/mm a 1.040 nm e 187.486 fs²/mm a 800 nm. Para 240 mm de SF11 no caminho do feixe de 800 nm, GDD é de 240 mm × 187.486 fs²/mm = 45.000 fs². Para 240 mm de SF11 no caminho do feixe de 1.040 nm, o GDD é de 240 mm × 123.270 fs²/mm = 30.000 fs². Este cálculo de exemplo significa que as hastes de vidro adicionais devem ser adicionadas ao braço de 1.040 nm, ou as hastes de vidro devem ser removidas do braço de 800 nm para corresponder ao GDD. Para obter uma resolução espectral maior, é necessário um GDD maior, o que significa hastes mais longas. No entanto, no cálculo da GDD, as contribuições do EOM e do objetivo foram negligenciadas. A correspondência real do GDD é determinada experimentalmente, encontrando a melhor resolução espectral para os comprimentos da haste dada na bomba ou nos Stokes. Os cálculos servem como um bom passo inicial. A otimização experimental através da adição iterativa e remoção de barras de vidro ainda é necessária para otimizar a resolução espectral.

É importante perceber que um grande chirp fornece maior resolução espectral, mas em detrimento da intensidade do sinal. Chirps menores e pulsos mais curtos são benéficos para a imagem tecidual na região C-H porque os picos de proteína e lipídio de Raman são amplos. A resolução espectral mais baixa pode ser trocada por um sinal SRS mais alto (ou velocidade de imagem mais rápida) sem sacrificar o contraste do tecido de duas cores¹⁷. Em outras aplicações onde é necessária alta resolução espectral, especialmente na região da impressão digital, é necessário aplicar um chirp maior usando hastes de vidro longas. Alternativamente, pode ser mais fácil usar macas de grade para obter pulsos mais longos (para duração do pulso maior que 3 ps). No entanto, uma das principais limitações do laser comercial utilizado é sua largura de banda espectral. A cobertura espectral do SRS focado no espectral depende da largura de banda dos lasers de excitação. O sistema laser utilizado tem uma cobertura espectral tipicamente em torno de 200-250 ^cm-1. Isso é pouco suficiente para cobrir a região C-H. Uma cobertura espectral maior é tipicamente necessária para resolver espécies químicas para imagens na região das impressões digitais. Este problema pode ser resolvido com um complemento de laser de fibra que amplia a largura de banda do laser Stokes de 6 nm para 60 nm¹⁸. Outra limitação importante para a técnica de imagem SRS de duas cores é que apenas duas transições são monitoradas. Essa abordagem seria inadequada para amostras complexas com muitos picos de Raman sobrepostos ou várias espécies.

O método de imagem SRS em tempo real oferece imagens de tecido de alta velocidade, removendo a necessidade de afinação a laser ou atraso. No entanto, é difícil configurar devido aos desafios em alcançar uma profundidade de modulação quase perfeita para ambos os EOMs. É melhor otimizar o EOM1 e o EOM2 de forma independente. Se o EOM1 estiver ligado, então o EOM2 deve ser desligado e vice-versa. Uma vez que ambas as modulações são otimizadas para quase perfeição (>95% de profundidade de modulação), ambos os EOMs são conectados para permitir a modulação ortogonal. O tempo de atraso entre os dois trens de pulso ortogonal depende do comprimento do BRC e do chirp. Este método de modulação não é imediatamente viável para aplicações clínicas, pois eletrônicos complexos são necessários para fornecer dois trens de pulso RF com uma mudança de fase incapaz para conduzir os dois EOMs. O alinhamento do EOM também precisa ser quase perfeito para garantir alta transmissão, boa modulação e ortogonalidade entre os dois canais. Esta técnica é geralmente aplicável a outras aplicações que requerem imagens rápidas e simultâneas de dois picos raman devido a alterações de movimento ou amostra. Exemplos incluem medições da temperatura da água ou rastreamento de objetos em movimento, como gotículas lipídicas ou organelas^11,19.

Um laser de fibra robusto é necessário para futuras aplicações clínicas⁴. A abordagem descrita pelo protocolo também poderia ser estendida para melhorar a velocidade de aquisição até a taxa de vídeo, o que é importante para escanear grandes amostras de tecido dentro de um tempo razoável. Se o tempo de imagem ou artefatos de movimento não forem uma preocupação, então as imagens de SRS proteicas e lipídicas podem ser adquiridas sequencialmente movendo o estágio de atraso motorizado quadro por quadro. Outro método de imagem SRS em tempo real, de duas cores, é um esquema de duas fases que recicla o feixe stokes para fornecer os mesmos dois canais ortogonais²⁰. No entanto, a implementação do esquema de duas fases requer um alinhamento extra que envolve três feixes. Também requer correspondência do tamanho do feixe e divergência de três raios laser. Um caminho potencial para melhorar ambas as técnicas para superar o limite simultâneo de duas cores é a incorporação de um laser de fibra rapidamente incapaz para sondar regiões espectrais específicas²¹. O processamento de imagens é o mesmo descrito no protocolo para gerar imagens simuladas de H&E.

Finalmente, este protocolo demonstra imagens SRS do modo epi. Normalmente gera imagens de baixa qualidade em comparação com a imagem do modo de transmissão para seções de tecido fino devido à menor potência da bomba que atinge o detector¹³. Para imagens de tecido grosso (>1-2 mm) ou amostras altamente dispersas (por exemplo, tecido ósseo), a imagem do modo epi pode ter um desempenho melhor do que a imagem do modo de transmissão. Ao fotografar tecidos frescos, como tecido cerebral, a profundidade de imagem srs é tipicamente limitada a 200-300 μm. Para tecido fixo, a dispersão é mais forte, e a profundidade de imagem é de 100-200 μm. Imagens mais profundas podem ser obtidas com maior potência, correção de aberração ou compensação óptica^22,23. No entanto, a imagem do modo epi é uma abordagem preferível para o diagnóstico tecidual porque não requer nenhuma seção tecidual, e o alinhamento é mais simples sem o condensador de NA alto. Futuras aplicações de diagnóstico tecidual se beneficiarão de imagens rápidas e de grande área em amostras cirúrgicas intactas, seguidas de aprendizado de máquina/diagnóstico baseado em aprendizagem profunda. O protocolo aqui apresentado também é adequado para aplicações in vivo, como imagens cerebrais ou imagens de pele, onde a imagem do modo epi é a única opção, e imagens de alta velocidade são importantes para evitar artefatos de movimento.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.