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Bioengineering

वास्तविक समय, दो रंग ऊतक निदान के लिए माउस मस्तिष्क के रमन प्रकीर्णन इमेजिंग प्रेरित

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63484
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

उत्तेजित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली, गैर-विनाशकारी और लेबल-मुक्त इमेजिंग तकनीक है। एक उभरते हुए आवेदन को रमन हिस्टोलॉजी को उत्तेजित किया जाता है, जहां प्रोटीन और लिपिड रमन संक्रमण पर दो-रंग एसआरएस इमेजिंग का उपयोग छद्म-हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन छवियों को उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। यहां, हम ऊतक निदान के लिए वास्तविक समय, दो-रंग एसआरएस इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं।

Abstract

प्रेरित रमन प्रकीर्णन (एसआरएस) माइक्रोस्कोपी ऊतक निदान के लिए एक शक्तिशाली ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के रूप में उभरा है। हाल के वर्षों में, दो-रंग के एसआरएस को हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) -समकक्ष छवियों को प्रदान करने में सक्षम दिखाया गया है जो मस्तिष्क कैंसर के तेजी से और विश्वसनीय निदान की अनुमति देते हैं। इस तरह की क्षमता ने रोमांचक इंट्राऑपरेटिव कैंसर निदान अनुप्रयोगों को सक्षम किया है। ऊतक के दो रंग एसआरएस इमेजिंग या तो एक picosecond या femtosecond लेजर स्रोत के साथ किया जा सकता है। Femtosecond लेजर लचीला इमेजिंग मोड को सक्षम करने का लाभ है, तेजी से hyperspectral इमेजिंग और वास्तविक समय, दो रंग एसआरएस इमेजिंग सहित. चहकते लेजर दालों के साथ एक वर्णक्रमीय-फोकसिंग दृष्टिकोण आमतौर पर उच्च वर्णक्रमीय संकल्प प्राप्त करने के लिए femtosecond लेजर के साथ उपयोग किया जाता है।

दो रंग एसआरएस अधिग्रहण को ऑर्थोगोनल मॉडुलन और लॉक-इन डिटेक्शन के साथ महसूस किया जा सकता है। नाड़ी चहचहाहट, मॉडुलन, और लक्षण वर्णन की जटिलता इस विधि के व्यापक गोद लेने के लिए एक बाधा है। यह लेख एपि-मोड में माउस मस्तिष्क के ऊतकों के वर्णक्रमीय-फोकसिंग एसआरएस और वास्तविक समय, दो-रंग इमेजिंग के कार्यान्वयन और अनुकूलन को प्रदर्शित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग एसआरएस इमेजिंग अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया जा सकता है जो एसआरएस की उच्च गति और स्पेक्ट्रोस्कोपिक इमेजिंग क्षमता का लाभ उठाते हैं।

Introduction

पारंपरिक ऊतक निदान एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत परीक्षा के बाद धुंधला प्रोटोकॉल पर भरोसा करते हैं। पैथोलॉजिस्ट द्वारा उपयोग की जाने वाली एक आम धुंधला विधि एच एंड ई स्टेनिंग है: हेमेटोक्सिलिन कोशिका नाभिक को एक बैंगनी नीले रंग का दाग देता है, और ईओसिन बाहरी मैट्रिक्स और साइटोप्लाज्म गुलाबी को दागता है। यह सरल धुंधला कई ऊतक निदान कार्यों, विशेष रूप से कैंसर निदान के लिए पैथोलॉजी में सोने का मानक बना हुआ है। हालांकि, एच एंड ई हिस्टोपैथोलॉजी, विशेष रूप से एक इंट्राऑपरेटिव सेटिंग में उपयोग की जाने वाली जमे हुए सेक्शनिंग तकनीक की अभी भी सीमाएं हैं। धुंधला प्रक्रिया एक श्रमसाध्य प्रक्रिया है जिसमें ऊतक एम्बेडिंग, सेक्शनिंग, फिक्सेशन और स्टेनिंग1 शामिल है। विशिष्ट टर्नअराउंड समय 20 मिनट या उससे अधिक है। जमे हुए सेक्शनिंग के दौरान एच एंड ई का प्रदर्शन करना कभी-कभी अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब मार्जिन मूल्यांकन के लिए 3 डी में सेलुलर सुविधाओं या विकास पैटर्न का मूल्यांकन करने की आवश्यकता के कारण कई वर्गों को एक बार में संसाधित किया जाता है। इसके अलावा, इंट्राऑपरेटिव हिस्टोलॉजिकल तकनीकों को कुशल तकनीशियनों और चिकित्सकों की आवश्यकता होती है। कई अस्पतालों में बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानियों की संख्या में सीमा कई मामलों में इंट्राऑपरेटिव परामर्श के लिए एक बाधा है। इस तरह की सीमाओं को डिजिटल पैथोलॉजी और कृत्रिम बुद्धिमत्ता-आधारित निदान 2 में तेजी से विकास हितों के साथ कम किया जा सकताहै। हालांकि, एच एंड ई स्टेनिंग परिणाम परिवर्तनशील होते हैं, जो तकनीशियन के अनुभव के आधार पर होते हैं, जो कंप्यूटर-आधारित निदान 2 के लिए अतिरिक्त चुनौतियां प्रस्तुत करताहै।

इन चुनौतियों को संभावित रूप से लेबल-मुक्त ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीकों के साथ संबोधित किया जा सकता है। ऐसी ही एक तकनीक एसआरएस माइक्रोस्कोपी है। एसआरएस सिंक्रनाइज़ स्पंदित लेजर-पंप और स्टोक्स का उपयोग करता है- उच्च दक्षता3 के साथ आणविक कंपन को उत्तेजित करने के लिए। हाल की रिपोर्टों से पता चला है कि प्रोटीन और लिपिड की एसआरएस इमेजिंग एच एंड ई-समकक्ष छवियों (जिसे उत्तेजित रमन हिस्टोलॉजी या एसआरएच के रूप में भी जाना जाता है) को बरकरार ताजा ऊतक के साथ उत्पन्न कर सकती है, जो किसी भी ऊतक प्रसंस्करण की आवश्यकता को दरकिनार करती है, निदान के लिए आवश्यक समय को काफी कम कर देती है, और इसे इंट्राऑपरेटिव रूप से अनुकूलित किया गया है4। इसके अलावा, एसआरएस इमेजिंग 3 डी छवियां प्रदान कर सकती है, जो निदान के लिए अतिरिक्त जानकारी प्रदान करती है जब 2 डी छवियांअपर्याप्त होती हैं। एसआरएच निष्पक्ष है और डिजिटल छवियों को उत्पन्न करता है जो कंप्यूटर-आधारित निदान के लिए आसानी से उपलब्ध हैं। यह जल्दी से इंट्राऑपरेटिव कैंसर निदान और ट्यूमर मार्जिन विश्लेषण के लिए एक संभावित समाधान के रूप में उभरता है, खासकर मस्तिष्क कैंसर 6,7,8 में। हाल ही में, ऊतक के रासायनिक परिवर्तनों की एसआरएस इमेजिंग को उपयोगी नैदानिक जानकारी प्रदान करने का भी सुझाव दिया गया है जो चिकित्सकों को विभिन्न कैंसर प्रकारों या चरणों 9 को स्थिर करने में मदद कर सकताहै।

ऊतक निदान अनुप्रयोगों में अपनी जबरदस्त क्षमता के बावजूद, एसआरएस इमेजिंग ज्यादातर इमेजिंग प्लेटफॉर्म से जुड़ी जटिलता के कारण प्रकाशिकी में विशिष्ट अकादमिक प्रयोगशालाओं तक सीमित है, जिसमें अल्ट्राफास्ट लेजर, लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप और परिष्कृत डिटेक्शन इलेक्ट्रॉनिक्स शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय, दो-रंग एसआरएस इमेजिंग और माउस मस्तिष्क ऊतक से छद्म-एच एंड ई छवियों की पीढ़ी के लिए एक सामान्य फेम्टोसेकंड लेजर स्रोत के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए एक विस्तृत वर्कफ़्लो प्रदान करता है। प्रोटोकॉल निम्नलिखित कार्यविधियों को कवर करेगा:

संरेखण और चहचहाना अनुकूलन
अधिकांश एसआरएस इमेजिंग योजनाएं उत्तेजना स्रोत के रूप में या तो पिकोसेकंड या फेम्टोसेकंड लेजर का उपयोग करती हैं। femtosecond लेजर के साथ, लेजर की बैंडविड्थ रमन linewidth की तुलना में बहुत बड़ा है। इस सीमा को दूर करने के लिए, संकीर्ण वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन10 को प्राप्त करने के लिए एक पिकोसेकंड टाइमस्केल पर फेम्टोसेकंड लेजर को चहचहाने के लिए एक वर्णक्रमीय फोकसिंग दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है। इष्टतम वर्णक्रमीय संकल्प केवल तभी प्राप्त किया जाता है जब अस्थायी चहचहाहट (जिसे समूह देरी फैलाव या सिर्फ फैलाव के रूप में भी जाना जाता है) पंप और स्टोक्स लेजर के लिए ठीक से मेल खाता है। संरेखण प्रक्रिया और अत्यधिक फैलाव वाले कांच की छड़ का उपयोग करके लेजर बीम के फैलाव को अनुकूलित करने के लिए आवश्यक चरणों का प्रदर्शन यहां किया गया है।

आवृत्ति अंशांकन
एसआरएस पर ध्यान केंद्रित करने वाले वर्णक्रमीय का एक लाभ यह है कि रमन उत्तेजना को पंप और स्टोक्स लेजर के बीच समय की देरी को बदलकर जल्दी से ट्यून किया जा सकता है। इस तरह की ट्यूनिंग ट्यूनिंग लेजर तरंग दैर्ध्य की तुलना में तेजी से इमेजिंग और विश्वसनीय वर्णक्रमीय अधिग्रहण प्रदान करती है। हालांकि, उत्तेजना आवृत्ति और समय देरी के बीच रैखिक संबंध बाहरी अंशांकन की आवश्यकता होती है। ज्ञात रमन चोटियों के साथ कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग वर्णक्रमीय फोकसिंग एसआरएस के लिए रमन आवृत्ति को कैलिब्रेट करने के लिए किया जाता है।

वास्तविक समय, दो रंग इमेजिंग
बड़े ऊतक नमूनों के विश्लेषण के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए ऊतक निदान अनुप्रयोगों में इमेजिंग गति को बढ़ाना महत्वपूर्ण है। लिपिड और प्रोटीन के एक साथ दो-रंग एसआरएस इमेजिंग लेजर या समय की देरी को ट्यून करने की आवश्यकता को कम करता है, जो इमेजिंग गति को दो गुना से अधिक बढ़ाता है। यह एक उपन्यास ओर्थोगोनल मॉडुलन तकनीक और एक लॉक-इन एम्पलीफायर11 के साथ दोहरे चैनल डिमॉड्यूलेशन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। यह पेपर ऑर्थोगोनल मॉडुलन और दोहरे चैनल छवि अधिग्रहण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Epi-मोड SRS इमेजिंग
आज तक दिखाए गए एसआरएस इमेजिंग का अधिकांश हिस्सा ट्रांसमिशन मोड में किया जाता है। एपि-मोड इमेजिंग ऊतक12 से बैकस्कैटर फोटॉनों का पता लगाता है। पैथोलॉजी अनुप्रयोगों के लिए, सर्जिकल नमूने काफी बड़े हो सकते हैं। ट्रांसमिशन मोड इमेजिंग के लिए, ऊतक सेक्शनिंग अक्सर आवश्यक होती है, जिसके लिए अवांछित रूप से अतिरिक्त समय की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, एपि-मोड इमेजिंग बरकरार सर्जिकल नमूनों के साथ काम कर सकती है। क्योंकि एक ही उद्देश्य का उपयोग बैकस्कैटर्ड प्रकाश को इकट्ठा करने के लिए किया जाता है, इसलिए ट्रांसमिशन इमेजिंग के लिए आवश्यक उच्च संख्यात्मक-एपर्चर कंडेनसर को संरेखित करने की भी कोई आवश्यकता नहीं है। एपि-मोड भी एकमात्र विकल्प है जब ऊतक सेक्शनिंग मुश्किल होती है, जैसे कि हड्डी के साथ। पहले हमने प्रदर्शित किया है कि मस्तिष्क के ऊतकों के लिए, एपि-मोड इमेजिंग ऊतक की मोटाई के लिए बेहतर इमेजिंग गुणवत्ता प्रदान करता है > 2 मिमी13। यह प्रोटोकॉल ऊतक द्वारा विध्रुवित बिखरे हुए फोटॉनों को इकट्ठा करने के लिए एक ध्रुवीकरण बीम विभाजक (पीबीएस) का उपयोग करता है। अनुकूलित डिटेक्टर असेंबली12 की जटिलता की कीमत पर एक कुंडलाकार डिटेक्टर के साथ अधिक फोटॉन एकत्र करना संभव है। पीबीएस दृष्टिकोण को लागू करने के लिए आसान है (प्रतिदीप्ति के समान), मानक फोटोडायोड के साथ पहले से ही संचरण मोड का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा रहा है।

छद्म एच एंड ई छवि पीढ़ी
एक बार दो रंग की एसआरएस छवियों को एकत्र करने के बाद, उन्हें एच एंड ई धुंधला अनुकरण करने के लिए फिर से रंग दिया जा सकता है। यह पेपर लिपिड और प्रोटीन एसआरएस छवियों को पैथोलॉजी अनुप्रयोगों के लिए छद्म-एच एंड ई एसआरएस छवियों में परिवर्तित करने की प्रक्रिया को दर्शाता है। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले एसआरएस छवियों को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण चरणों का विवरण देता है। यहां दिखाई गई प्रक्रिया न केवल ऊतक निदान पर लागू होती है, बल्कि कई अन्य हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस इमेजिंग अनुप्रयोगों जैसे ड्रग इमेजिंग और चयापचय इमेजिंग14,15 के लिए भी अनुकूलित की जा सकती है।

सामान्य सिस्टम आवश्यकताएँ
इस प्रोटोकॉल के लिए लेजर प्रणाली को 2 सिंक्रनाइज़ femtosecond लेजर बीम आउटपुट करने में सक्षम होना चाहिए। सिस्टम आदर्श रूप से लेजर बीम में से एक के व्यापक तरंग दैर्ध्य ट्यूनिंग के लिए एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक ऑसिलेटर (ओपीओ) की सुविधा देते हैं। इस प्रोटोकॉल में सेटअप एक वाणिज्यिक लेजर सिस्टम इनसाइट DS + का उपयोग करता है जो 80 मेगाहर्ट्ज की पुनरावृत्ति दर के साथ दो लेजर (1,040 एनएम पर एक निश्चित बीम और 680 से 1,300 एनएम तक एक OPO-आधारित ट्यूनेबल बीम) आउटपुट करता है। लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप, या तो प्रमुख माइक्रोस्कोप निर्माताओं या घर-निर्मित से, SRS इमेजिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है। उपयोग किया गया माइक्रोस्कोप एक सीधा लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप है जो एक वाणिज्यिक ईमानदार माइक्रोस्कोप फ्रेम के शीर्ष पर बनाया गया है। लेजर बीम को स्कैन करने के लिए 5 मिमी गैल्वो दर्पणों की एक जोड़ी का उपयोग किया जाता है। एक होमबिल्ट लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप को अपनाने के लिए चुनने वाले उपयोगकर्ताओं के लिए, लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप16 के निर्माण के लिए पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल का संदर्भ लें।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक पशु प्रक्रियाओं को 200 μm, निश्चित, अनुभागित माउस दिमाग के साथ आयोजित किया गया था, प्रोटोकॉल (# 4395-01) के अनुसार वाशिंगटन विश्वविद्यालय के पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के संस्थान द्वारा अनुमोदित। जंगली प्रकार के चूहों (C57BL / 6J तनाव) CO2 के साथ euthanized हैं। फिर, फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में निर्धारण के लिए उनके दिमाग को निकालने के लिए एक क्रैनियोटॉमी की जाती है। मस्तिष्क को 3% एगारोज़ और 0.3% जिलेटिन मिश्रण में एम्बेडेड किया जाता है और एक वाइब्रेटोम द्वारा 200 μm-मोटी स्लाइस में विभाजित किया जाता है।

1. प्रारंभिक संरेखण

नोट: सुनिश्चित करें कि बीम आकार और दोनों बाहों के विचलन सबसे अच्छा संवेदनशीलता और संकल्प के लिए मिलान कर रहे हैं। पंप और स्टोक्स बीम को कॉलिमेट करें और लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप में प्रवेश करने से पहले अपने आकार को समायोजित करें। ऐसा करने के लिए, डिक्रोइक दर्पण पर उन्हें संयोजित करने से पहले प्रत्येक बीम के लिए एक्रोमैटिक लेंस की एक जोड़ी का उपयोग करें। हमेशा बीम संरेखण के लिए उचित लेजर चश्मे पहनें।

  1. बीम संलयन
    1. पंप बीम के लिए एक्रोमैटिक लेंस की एक जोड़ी स्थापित करें। एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, लेजर बीम के आकार को 2 गुना तक बढ़ाने के लिए 100 मिमी लेंस और 200 मिमी लेंस का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि दोनों लेंसों की दूरी लगभग 300 मिमी है। दोनों लेंस के केंद्र के माध्यम से पंप बीम को संरेखित करें।
    2. बीम को दीवार की ओर भेजने के लिए दूसरे लेंस के बाद एक दर्पण रखें (>1 मीटर दूर)। लंबी दूरी पर बीम भेजते समय ध्यान रखें। एक आईआर कार्ड के साथ दर्पण से दीवार तक बीम का पता लगाएं और जांचें कि बीम आकार में बदलता है या नहीं। बीम को कॉलिमेट करें यदि बीम दूरी के एक समारोह के रूप में आकार में बदलता है।
      1. यदि बीम अभिसरण कर रहा है (प्रसार के साथ आकार कम हो रहा है), तो दो लेंसों को करीब ले जाएं।
      2. यदि बीम अलग हो रहा है (प्रसार के साथ आकार बढ़ा रहा है), तो दो लेंसों को आगे बढ़ाएं। दूरी को तब तक समायोजित करें जब तक कि बीम को कॉलिमेट न किया जाए।
    3. स्टोक्स बीम को बीम को कॉलिमेट करने के लिए चरण 1.1.1 और 1.1.2 को दोहराएँ।
  2. बीम आकार समायोजन
    1. यदि एक बीम प्रोफाइलर उपलब्ध है, तो प्रत्येक बीम के लिए कॉलिमेटेड बीम आकार को मापें। वैकल्पिक रूप से, 4-5 मिमी के बीम व्यास को प्राप्त करने के लिए IR कार्ड और एक शासक का उपयोग करके बीम आकार का अनुमान लगाएं।
    2. यदि बीम का आकार बहुत छोटा या बहुत बड़ा है, तो चरण 1.1 में उपयोग की गई लेंस जोड़ी बदलें। लेंस जोड़ी को तब तक समायोजित करें जब तक कि दोनों बीम का व्यास 4-5 मिमी न हो।
      नोट: बीम का आवर्धन दूसरे लेंस की फोकल लंबाई से पहले लेंस (f2/f1) के बीच का अनुपात है।
  3. स्थानिक ओवरलैप
    नोट: एसआरएस इमेजिंग को आणविक कंपन को उत्तेजित करने के लिए अंतरिक्ष और समय में संयुक्त होने के लिए दोनों लेजर बीम की आवश्यकता होती है। वर्णक्रमीय-केंद्रित एसआरएस इमेजिंग की एक योजनाबद्ध आकृति 1 में दिखाया गया है।
    1. समायोजन के लिए कई स्टीयरिंग दर्पण के साथ एक dichroic दर्पण स्थापित करके दो लेजर बीम गठबंधन. दो अलग-अलग पदों पर डाइक्रोइक दर्पण के बाद बीम की निगरानी करके पंप और स्टोक्स के स्थानिक ओवरलैप को अनुकूलित करें (~ 1 मीटर)। पुनरावर्ती रूप से dichroic और dichroic दर्पण से पहले स्टीयरिंग दर्पण समायोजित करने के लिए पंप बीम के साथ स्टोक्स बीम संरेखित करने के लिए.
      नोट: यदि दो बीम दोनों स्थितियों में स्थानिक रूप से ओवरलैपिंग हैं, तो वे पर्याप्त रूप से ओवरलैप किए गए हैं।
    2. सुनिश्चित करें कि संयुक्त बीम लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के स्कैन दर्पण के केंद्र में भेजा जाता है स्टीयरिंग दर्पण की एक जोड़ी को समायोजित करके जब स्कैन दर्पण पार्क की स्थिति में होते हैं। सुनिश्चित करें कि दोनों बीम माइक्रोस्कोप उद्देश्य और संघनित्र के केंद्र के माध्यम से यात्रा करते हैं।
    3. कंडेनसर के बाद, फोटोडायोड पर प्रेषित बीम को रिले करने के लिए क्रमशः 100 मिमी और 30 मिमी की फोकल लंबाई के साथ लेंस की एक और जोड़ी का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि दोनों बीम फोटोडायोड के भीतर निहित हैं और मॉडुलित स्टोक्स बीम को अवरुद्ध करने के लिए दो कम-पास फ़िल्टर स्थापित करें।

2. एसआरएस सिग्नल का पता लगाने

  1. इलेक्ट्रोऑप्टिकल मॉडुलन (EOM)
    नोट: 20 मेगाहर्ट्ज का EOM स्टोक्स आयाम को संशोधित करने के लिए उपयोग किया जाता है। जैसा कि बाद में चर्चा की गई है, ईओएम 80 मेगाहर्ट्ज लेजर पल्स ट्रेन से लिया गया है, जो ऑर्थोगोनल मॉडुलन के लिए आवश्यक है। अन्य मॉडुलन आवृत्तियों का उपयोग किया जा सकता है यदि केवल एकल-रंग या हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस किया जाता है। उस स्थिति में, लेजर आवृत्ति के लिए मॉडुलन आवृत्ति का सिंक्रनाइज़ेशन अनावश्यक है। एक आरएफ पावर एम्पलीफायर के साथ एक आवृत्ति जनरेटर का उपयोग ईओएम को चलाने के लिए किया जा सकता है। नतीजतन, चरण 2.1.1-2.1.4 छोड़ा जा सकता है।
    1. बीम का 10% लेने के लिए स्टोक्स बीम पथ में एक बीम नमूना रखें और इसे 80 मेगाहर्ट्ज पल्स ट्रेन का पता लगाने के लिए एक तेज फोटोडायोड में भेजें।
      नोट:: फोटोडायोड संकेत एक 20 MHz TTL आउटपुट जनरेट करने के लिए एक आवृत्ति विभाजक के लिए भेजा जाता है। यह आउटपुट आगे चार समान 20 मेगाहर्ट्ज आउटपुट में आउटपुट को दोहराने के लिए एक फैनआउट बफर में भेजा जाता है। आउटपुट में से एक का उपयोग ऑसिलोस्कोप को ट्रिगर करने के लिए किया जाता है।
    2. Fanout बफर के outputs में से एक ले लो और एक 20 मेगाहर्ट्ज sinusoidal लहर पाने के लिए एक bandpass फिल्टर के साथ इसे फ़िल्टर. आउटपुट पीक-टू-पीक वोल्टेज को ~ 500 mV में समायोजित करने के लिए एक आरएफ attenuator का उपयोग करें।
    3. परिणामी आउटपुट को एक फेज शिफ्टर को भेजें, जो वोल्टेज स्रोत के साथ आरएफ चरण के ठीक समायोजन की अनुमति देता है। इस आउटपुट को एक आरएफ पावर एम्पलीफायर को भेजें और एम्पलीफायर के आउटपुट को ईओएम से कनेक्ट करें।
    4. स्टोक्स बीम को अनब्लॉक करें और बीम पथ में एक फोटोडायोड रखकर EOM1 की मॉडुलन गहराई को अनुकूलित करें। ईओएम वोल्टेज और क्वार्टर-वेव प्लेट को समायोजित करें जब तक कि मॉडुलन गहराई (घाटी से चोटी के अनुपात तक) संतोषजनक दिखाई न दे।
      नोट: 20 मेगाहर्ट्ज मॉडुलन (लेजर पुनरावृत्ति दर का 1/4) पर, हर 50 एनएस में दो दालों की उम्मीद की जाती है।
  2. अस्थायी ओवरलैप
    नोट: पंप और स्टोक्स के अस्थायी ओवरलैप एक रेट्रो-परावर्तक के साथ दो लेजर पल्स ट्रेनों में से एक में देरी करके प्राप्त किया जाता है जो देरी चरण पर घुड़सवार होता है (चित्रा 1 स्टोक्स को देरी से दिखाता है)। मोटे ओवरलैप को ऑसिलोस्कोप के साथ मॉनिटर किया जाता है, और एसआरएस सिग्नल द्वारा ठीक ओवरलैप की निगरानी की जाती है। ठीक अस्थायी ओवरलैप भी उपलब्ध होने पर एक autocorrelator के साथ प्राप्त किया जा सकता है।
    1. लेजर बीम का पता लगाने के लिए डाइक्रोइक दर्पण के बाद एक फोटोडायोड रखें। पहले स्टोक्स बीम को ब्लॉक करें। oscilloscope पर पंप पल्स चोटियों में से एक पर ज़ूम इन करें। ऑसिलोस्कोप के साथ इस चोटी की अस्थायी स्थिति को चिह्नित करने के लिए एक ऊर्ध्वाधर कर्सर रखें।
    2. पंप बीम को ब्लॉक करें और स्टोक्स बीम को अनब्लॉक करें। पिछले चरण में चिह्नित स्थिति के लिए oscilloscope पर चोटी की स्थिति से अस्थायी रूप से मेल खाने के लिए देरी चरण का अनुवाद करें। दो बीम के अस्थायी ओवरलैप के प्रदर्शन के लिए चित्र 2 देखें।
      1. (वैकल्पिक) यदि देरी चरण का अनुवाद अस्थायी रूप से दो बीम से मेल खाने के लिए अपर्याप्त है, तो देरी चरण को इसकी आंदोलन सीमा के बीच में ले जाएं।
      2. दो बीमों के बीच अस्थायी अंतर को लेकर और प्रकाश की गति से अंतर को गुणा करके दो बीमों से मेल खाने के लिए आवश्यक विलंब दूरी की गणना करें ताकि दो बीमों को अस्थायी रूप से मिलान करने के लिए आवश्यक दूरी की मात्रा का पता लगाया जा सके।
      3. तेजी से बीम के बीम पथ को लंबा करें या तदनुसार अस्थायी देरी से मोटे तौर पर मेल खाने के लिए धीमी बीम के बीम पथ को छोटा करें।
    3. DMSO के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड नमूना तैयार करें और स्लाइड और एक coverslip के बीच नमूना रखने के लिए एक स्पेसर के रूप में डबल-साइडेड टेप।
    4. माइक्रोस्कोप उद्देश्य का सामना करने वाले कवरस्लिप पक्ष के साथ माइक्रोस्कोप पर नमूने को रखें। माइक्रोस्कोप को ब्राइटफील्ड रोशनी में बदलें और आईपीस से नमूने का निरीक्षण करें। पहले ग्लास-टेप इंटरफ़ेस पर हवा के बुलबुले की शीर्ष और निचली परत दोनों पर ध्यान केंद्रित करके नमूने का ध्यान केंद्रित करें, और फिर टेप की दो परतों के बीच में फोकस को स्थानांतरित करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि लेजर बीम आईपीस में देखने से पहले अवरुद्ध हैं।
    5. 798 एनएम करने के लिए tunable बीम आउटपुट सेट करें। संघनित्र के ऑप्टिकल थ्रूपुट के आधार पर, ऑप्टिकल पावर को समायोजित करें ताकि पंप के लिए प्रत्येक ~ 40 mW हो और उद्देश्य फोकस पर स्टोक्स बीम हो।
    6. MATLAB में ScanImage खोलें (या अन्य स्कैनिंग सॉफ़्टवेयर जो माइक्रोस्कोप को नियंत्रित करता है) और स्कैनिंग शुरू करने के लिए FOCUS लेबल वाले बटन पर क्लिक करें।
      नोट: लेजर बीम raster-एक छवि उत्पन्न करने के लिए नमूने के माध्यम से स्कैन किया जाएगा। फोटोडायोड (<100 kHz) से कम आवृत्ति सिग्नल आउटपुट सीधे डेटा अधिग्रहण कार्ड (डीसी चैनल के रूप में संदर्भित) के चैनल 1 में भेजा जाता है। फोटोडायोड से उच्च-आवृत्ति आउटपुट (>100 kHz) को लॉक-इन एम्पलीफायर में भेजा जाता है, और लॉक-इन एम्पलीफायर सिग्नल का एक्स-आउटपुट डेटा अधिग्रहण कार्ड के चैनल 2 में भेजा जाता है (जिसे एसी चैनल के रूप में संदर्भित किया जाता है)।
    7. चैनल 1 प्रदर्शन पर डीसी सिग्नल को केंद्र में रखने के लिए गैल्वो स्कैनर से पहले स्टीयरिंग दर्पण को समायोजित करें। Motorized देरी चरण ले जाएँ और बारीकी से चैनल 2 (यानी, एसी चैनल) प्रदर्शन पर दिखाए गए लॉक-इन आउटपुट का निरीक्षण करें।
      नोट: जब पंप और स्टोक्स समय में मेल खाते हैं, तो एसी चैनल पर एक संकेत दिखाई देगा। यह छोटे तीव्रता परिवर्तन को प्रदर्शित करने के लिए एसी चैनल के रंग पैमाने को समायोजित करने में सहायक है।
    8. समय देरी को बारीकी से समायोजित करके एसी सिग्नल तीव्रता को अधिकतम करें। एसी चैनल पर एसआरएस सिग्नल को केंद्र में रखने के लिए डिक्रोइक दर्पण को समायोजित करें (डीसी चैनल को केंद्रित रखते हुए)। सिग्नल को अधिकतम करने के लिए लॉक-इन एम्पलीफायर के चरण को समायोजित करें। एक संतोषजनक संकेत के लिए चित्र 3 देखें।

3. वर्णक्रमीय संकल्प अनुकूलन

नोट: पंप और स्टोक्स नमूने तक पहुँचने बीम समूह देरी फैलाव (GDD) वर्णक्रमीय संकल्प को अधिकतम करने के लिए की एक ही राशि होनी चाहिए। फैलाव प्रयोगात्मक सेटअप पर बहुत अधिक निर्भर करता है। यहां वर्णित प्रयोगात्मक सेटअप क्रमशः स्टोक्स और पंप के रूप में 1,040 एनएम और 800 एनएम पर फेम्टोसेकंड दालों का उपयोग करता है। घने चकमक पत्थर कांच की छड़ें (H-ZF52A) नाड़ी-खींच माध्यम के रूप में उपयोग की जाती हैं।

  1. 800 एनएम बीम पथ में एक अत्यधिक फैलाव वाली कांच की छड़ (H-ZF52A या समकक्ष घने चकमक पत्थर ग्लास) के 48 सेमी डालें। Eq (1) का उपयोग करके GDD का अनुमान लगाएं:
    Equation 1 (1)
    नोट: विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर विभिन्न कांच सामग्री के जीवीडी अपवर्तक सूचकांक डेटाबेस संसाधन से पाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, H-ZF52A में 800 nm पर 220.40 fs2/mm का GVD है। कुल GDD 105792 fs2 है।
  2. गणना करें कि पंप के GDD से मेल खाने के लिए 1,040 nm बीम पथ में जोड़ने के लिए फैलाव वाले ग्लास रॉड के कितने सेमी की आवश्यकता होती है। मोटे तौर पर 800 एनएम बीम के जीडीडी से मेल खाने के लिए 1,040 एनएम बीम पथ पर फैलाव वाली कांच की छड़ों की उचित लंबाई डालें। ध्यान दें कि कांच की छड़ों के अलावा दो बीम के अस्थायी ओवरलैप को बदल देगा, और देरी का समायोजन आवश्यक हो सकता है।
  3. वर्णक्रमीय विभेदन का अंशांकन
    1. DMSO के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड नमूना बनाएँ। स्लाइड को माइक्रोस्कोप पर रखें और माइक्रोस्कोप कंडेनसर से बाहर आने वाले बीम की शक्ति की जांच करें। तदनुसार शक्ति को समायोजित करने के लिए नमूना फोकस पर ~ 40 mW प्रत्येक है.
    2. MATLAB से ScanImage खोलें. देरी चरण के माध्यम से स्कैन करके अधिकतम एसआरएस सिग्नल का पता लगाएं, जो डीएमएसओ के 2,913 सेमी -1 रमन शिखर से मेल खाता है। छड़ के सम्मिलन के कारण बढ़ी हुई ऑप्टिकल पथ लंबाई के साथ पिछले चरण की स्थिति के आधार पर चरण की स्थिति का अनुमान लगाएं। बीम स्थानिक ओवरलैप को बीम के छोटे विचलन के कारण पुन: संरेखित करें जब कांच की छड़ें जोड़ी जाती हैं।
    3. मोटरचालित चरण को स्थानांतरित करते समय अनुक्रमिक रूप से एसआरएस छवियों की एक श्रृंखला लेकर एक हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस स्कैन सहेजें।
      नोट: देरी स्कैन रेंज दो रमन चोटियों को कवर करती है, जो क्रमशः डीएमएसओ के 2,913 सेमी-1 और 2,994 सेमी-1 रमन चोटियों के अनुरूप है। इन दो संक्रमणों को 800 एनएम पंप और 1,040 एनएम स्टोक्स लेजर का उपयोग करते समय देखा जाता है।
    4. या तो ImageJ या MATLAB का उपयोग कर DMSO समाधान के SRS स्पेक्ट्रा बाहर प्लॉट. चोटी के आधे अधिकतम (FWHM) पर पूर्ण चौड़ाई की गणना करने के लिए MATLAB में एक गाऊसी या Lorentzian समारोह के लिए बड़े DMSO 2,913 सेमी-1 चोटी फिट करें।
      नोट:: प्रतिनिधि परिणाम चित्र 4 में दिखाए गए हैं। यदि केवल एक व्यापक चोटी मौजूद है, तो इसका मतलब है कि या तो वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन दो चोटियों को अलग करने के लिए बहुत खराब है और अधिक कांच की छड़ों की आवश्यकता होती है, या स्कैन की गई सीमा दूसरी चोटी का पता लगाने के लिए बहुत छोटी थी। आमतौर पर, एक स्वीकार्य वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन डीएमएसओ ~ 20-25 सेमी -1 होता है जब कांच की छड़ों की लंबाई >60 सेमी का उपयोग किया जाता है। कम रिज़ॉल्यूशन का उपयोग अक्सर ऊतक इमेजिंग के लिए किया जाता है ताकि कम दालों के साथ उच्च संकेतों के लिए व्यापारकिया जा सके।
  4. (वैकल्पिक) एक autocorrelator या एक FROG (आवृत्ति-हल ऑप्टिकल गेटिंग) का उपयोग करने के लिए प्रत्येक हाथ की नाड़ी अवधि निर्धारित करने के लिए वास्तव में GDD की मात्रा और पंप और स्टोक्स के बीच GDD मैच करने के लिए आवश्यक छड़ की लंबाई की गणना करने के लिए।
  5. इष्टतम वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन खोजने के लिए स्टोक्स बीम पर विभिन्न छड़ों की लंबाई के लिए चरण 3.3.2-3.3.4 को दोहराएं, जिसका अर्थ है कि सबसे अच्छा जीडीडी मैच प्रयोगात्मक रूप से पाया गया है। इष्टतम वर्णक्रमीय संकल्प प्राप्त करने के लिए लंबाई में भिन्न कांच की छड़ के कई सेट का उपयोग करें।

4. शोर (एसएनआर) लक्षण वर्णन के लिए संकेत

  1. सुनिश्चित करें कि चरण 4.2 पूर्ण स्थानिक और अस्थायी संरेखण के बाद किया जाता है।
  2. DMSO के 2,913 सेमी-1 रमन शिखर के अनुरूप एक SRS छवि प्राप्त करें। ImageJ में छवि खोलें और फ्रेम के केंद्र में एक छोटे से क्षेत्र का चयन करें। चयनित क्षेत्र में मानों के माध्य और मानक विचलन की गणना करने के लिए माप फ़ंक्शन का उपयोग करें.
  3. चयनित क्षेत्र के माध्य मान को मानक विचलन से विभाजित करें ताकि SNR मान ज्ञात किया जा सके, जैसा कि Eq (2) में है।
    Equation 2 (2)
    नोट: सिस्टम के लिए एक अच्छा एसएनआर (4 μs के लॉक-इन टाइम स्थिरांक के साथ) दोनों हथियारों के लिए फोकस पर 40 मेगावाट / 40 मेगावाट पर DMSO का उपयोग करके >800 है। डीएमएसओ या कम शक्ति की कम सांद्रता का उपयोग एसएनआर के अधिक सटीक अनुमान के लिए किया जा सकता है यदि डेटा अधिग्रहण कार्ड में सीमित बिट गहराई है।
  4. यदि एसएनआर बहुत कम है, तो स्थानिक ओवरलैप, अस्थायी ओवरलैप, बीम आकार / कॉलिमेशन मिलान, और / या फैलाव मिलान को अनुकूलित करने के लिए लेजर दालों को फिर से संरेखित करें। एक विपथन सुधार कॉलर के साथ एक उद्देश्य के लिए, सुधार कॉलर को समायोजित करके संकेत को अनुकूलित करें।

5. आवृत्ति अक्ष अंशांकन

नोट:: यह चरण स्कैन किए गए रमन संक्रमण के लिए विलंब चरण स्थिति से संबंधित करने के लिए किया जाता है। एक उपयुक्त "रमन शासक" उत्पन्न करने के लिए सॉल्वैंट्स के सावधानीपूर्वक चयन की आवश्यकता होती है। डीएमएसओ सीएच बांड के लिए एक प्रभावी विलायक है क्योंकि इसमें 2,913 सेमी -1 और 2,994 सेमी -1 पर दो तेज रमन चोटियां हैं।

  1. देरी-चरण सीमा के साथ एक हाइपरस्पेक्ट्रल स्कैन सहेजें जो डीएमएसओ के 2,913 सेमी-1 और 2,994 सेमी-1 रमन चोटियों को कवर करता है। हाइपरस्पेक्ट्रल डेटासेट के अनुरूप चरण स्थितियों को सहेजें।
    नोट: स्पेक्ट्रम की वैश्विक अधिकतम चोटी DMSO 2,913 सेमी-1 रमन शिफ्ट से मेल खाती है और दूसरी अधिकतम चोटी DMSO 2,994 सेमी-1 रमन शिफ्ट से मेल खाती है।
  2. चरण की स्थिति के लिए रैखिक प्रतिगमन प्रदर्शन करें और रमन 2,913 सेमी -1 और 2,994 सेमी -1 पर शिफ्ट करता है। रमन शिफ्ट के लिए चरण की स्थिति से संबंधित रैखिक प्रतिगमन समीकरण का उपयोग करते हुए, देरी की स्थिति को संबंधित रमन आवृत्तियों में परिवर्तित करें।

6. ओर्थोगोनल मॉडुलन और दो रंग इमेजिंग

नोट: ऑर्थोगोनल मॉडुलन चरण केवल तभी आवश्यक होता है जब वास्तविक समय दो-रंग इमेजिंग की आवश्यकता होती है। इस योजना की एक योजनाबद्ध आकृति 5 में दिखाई गई है। ऑर्थोगोनल मॉडुलन लेजर आवृत्ति (80 मेगाहर्ट्ज लेजर के लिए 20 मेगाहर्ट्ज) के एक चौथाई पर संचालित ईओएम की एक जोड़ी का उपयोग करता है, जिसमें दोनों के बीच 90 डिग्री चरण शिफ्ट होता है। इस ऑर्थोगोनल मॉडुलन चरण को एकल-रंग एसआरएस इमेजिंग या हाइपरस्पेक्ट्रल एसआरएस इमेजिंग के लिए छोड़ा जा सकता है।

  1. EOM1 मॉडुलन
    1. पहले EOM के बाद स्टोक्स बीम पथ में एक PBS (PBS2), एक चौथाई-तरंग प्लेट (QWP2), और एक दूसरा EOM (EOM2) स्थापित करें। EOM2 के लिए संकेत इनपुट अनप्लग करें। EOM1 के लिए संकेत इनपुट में प्लग इन करें और इसे चालू करें।
    2. पहले EOM के माध्यम से बीम भेजकर 20 मेगाहर्ट्ज (एफ 0/4) पर स्टोक्स बीम (1,040 एनएम पर तय) को संशोधित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि बीम सीधे मार रहा है और EOM क्रिस्टल के माध्यम से केंद्रित है, EOM1 के झुकाव और स्थिति को समायोजित करें।
    3. दो photodiodes के साथ PBS1 से बाहर आने वाले दोनों ध्रुवीकरणों को देखकर और एक oscilloscope पर मॉडुलन प्रदर्शित करके मॉडुलन गहराई की निगरानी करें।
    4. QWP1, EOM1 वोल्टेज, और 20 मेगाहर्ट्ज इनपुट के चरण (एक चरण शिफ्टर का उपयोग करके) को समायोजित करें ताकि प्रेषित बीम की मॉडुलन गहराई को 100% के करीब किया जा सके। अच्छी मॉडुलन गहराई के एक उदाहरण के लिए चित्रा 2B देखें।
  2. EOM2 मॉडुलन
    1. EOM1 अनप्लग करें और EOM2 में प्लग करें।
    2. EOM2 करने के लिए 20 मेगाहर्ट्ज पर दूसरे एम्पलीफायर के उच्च वोल्टेज आउटपुट में भेजें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि बीम सीधे मार रहा है और ईओएम क्रिस्टल के माध्यम से केंद्रित है, ईओएम 2 के झुकाव और स्थिति को समायोजित करें।
    3. एक बार फिर, एक oscilloscope के साथ PBS2 से बाहर आने वाले दोनों ध्रुवीकरणों को देखकर मॉडुलन गहराई की निगरानी करें। QWP2, EOM2 वोल्टेज, और चरण शिफ्टर दोनों ध्रुवीकरण के लिए 100% मॉडुलन के करीब प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में समायोजित करें।
    4. सुनिश्चित करें कि पल्स ट्रेन मॉडुलन में पहले मॉडुलन से 90 डिग्री चरण शिफ्ट है।
      नोट: यदि दो पंप पल्स ट्रेनें 90 ° ओर्थोगोनल नहीं हैं, तो दो चैनलों के बीच क्रॉसस्टॉक एक समस्या होगी।
    5. EOM1 और EOM2 दोनों में चालू और प्लगिंग करके मॉडुलन की ओर्थोगोनलिटी का परीक्षण करें। एक oscilloscope के साथ PBS2 द्वारा विभाजित किया जा रहा है दोनों ध्रुवीकरण की निगरानी। EOM1 और EOM2 को व्यक्तिगत रूप से पुन: ऑप्टिमाइज़ करें यदि दूसरे PBS के बाद पल्स ट्रेन चित्रा 2C जैसा नहीं है।
    6. एक 20 मिमी birefringent क्वार्ट्ज क्रिस्टल (BRC) और HWP EOM2 के डाउनस्ट्रीम स्थापित करें। एक बार में दोनों ईओएम में प्लग इन करें और पल्स ट्रेन की निगरानी करें जैसे कि यह चित्रा 2 डी जैसा दिखता है।
      नोट: इस प्रयोग में उपयोग की जाने वाली चहचहाहट के लिए, 20 मिमी बीआरसी एक समय देरी को प्रेरित करता है जो 80 सेमी -1 रमन शिफ्ट से मेल खाता है। एक अलग बीआरसी लंबाई की आवश्यकता हो सकती है यदि एक अलग चहचहाहट का उपयोग किया जाता है।
  3. अंशांकन
    1. लॉक-इन एम्पलीफायर एक्स और वाई चैनल आउटपुट (डेटा अधिग्रहण कार्ड के चैनल 2 और 3 को भेजे गए) से संकेतों का पता लगाकर डीएमएसओ का उपयोग करके सिस्टम को कैलिब्रेट करें।
    2. जांचें कि क्या तेजी से ध्रुवीकरण से 2,913 सेमी -1 चोटी द्वारा उत्पन्न सिग्नल और धीमी गति से ध्रुवीकरण से लॉक-इन एम्पलीफायर पर 90 डिग्री आउट-ऑफ-फेज के करीब हैं। यदि यह मामला नहीं है, तो ईओएम संरेखण को तब तक समायोजित करें जब तक कि दो सिग्नल 90 डिग्री आउट-ऑफ-फेज के करीब न हों।
    3. एक बार अंशांकन पूरा हो जाने के बाद, विलंब की स्थिति का पता लगाएं जो ऑर्थोगोनल बीम में से एक के लिए 2,930 सेमी -1 पर प्रोटीन संक्रमण की जांच करता है। सुनिश्चित करें कि अन्य ध्रुवीकरण 2,850 सेमी -1 के लिपिड संक्रमण की जांच करता है।

7. Epi-मोड SRS इमेजिंग

नोट:: संचरण मोड इमेजिंग योजना में, उद्देश्य नमूने में लेजर केंद्रित करता है, और उसके बाद एक संघनित्र लेंस लॉक-इन डिटेक्शन के लिए एक फोटोडायोड के लिए प्रेषित बीम को निर्देशित करता है। एपि-मोड इमेजिंग योजना में, प्रकाश जो नमूने द्वारा बैकस्कैटर और डिपोलराइज्ड होता है, उसे फोकसिंग उद्देश्य द्वारा याद किया जाता है और ध्रुवीकरण बीम स्प्लिटर का उपयोग करके अलग किया जाता है। अलग-थलग और बैकस्कैटर्ड फोटॉनों को लॉक-इन डिटेक्शन के लिए रिले लेंस की एक जोड़ी के माध्यम से एक फोटोडायोड में भेजा जाता है। चित्रा 6 एपि-मोड इमेजिंग योजना को दर्शाता है।

  1. माइक्रोस्कोप में जाने वाले बीम के ध्रुवीकरण को बदलने के लिए बीम माइक्रोस्कोप में प्रवेश करने से पहले एक एचडब्ल्यूपी स्थापित करें। डिटेक्टर तक पहुंचने के लिए विध्रुवीकृत बैक-परावर्तित बीम की अनुमति देने के उद्देश्य के ऊपर एक पीबीएस रखें।
  2. एक 75 मिमी achromat लेंस और एक 30 मिमी एस्फेरिक लेंस से मिलकर लेंस की एक जोड़ी का उपयोग करें उद्देश्य के पीछे एपर्चर से फोटोडिटेक्टर के लिए backscattered फोटॉन रिले करने के लिए। पीबीएस द्वारा निर्देशित backscattered प्रकाश इकट्ठा करने के लिए डिटेक्टर माउंट। डिटेक्टर में प्रवेश करने से मॉड्यूलेटेड बीम को अवरुद्ध करने के लिए एक फ़िल्टर स्थापित करें।
  3. उद्देश्य के तहत ऊतक के नमूने को रखें। जैसा कि कंडेनसर एपि-मोड इमेजिंग के लिए अनावश्यक है, यदि अधिक स्थान की आवश्यकता होती है तो इसे हटा दें।
  4. इमेजिंग
    1. एक शटर के साथ बीम को बंद करें; पक्ष से नमूने पर एक सफेद प्रकाश स्रोत चमक; और उद्देश्य फोकस खोजने के लिए brightfield का उपयोग करें।
    2. दोनों बीम को अनब्लॉक करें और लॉक-इन एम्पलीफायर के दो आउटपुट से ऊतक से लिपिड और प्रोटीन एसआरएस छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रीकैलिब्रेटेड देरी पदों का उपयोग करें।
    3. अच्छी गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए लॉक-इन लाभ और पिक्सेल बिन कारक को समायोजित करें।

8. झूठे रंग धुंधला

  1. ImageJ के साथ छवि स्टैक खोलें।
  2. छवि पर राइट-क्लिक करके और डुप्लिकेट पर क्लिक करके लिपिड (2,850 सेमी -1) और प्रोटीन (2,930 सेमी -1) प्रजातियों के अनुरूप दो छवियों को बाहर निकालें।
  3. लिपिड छवि को लिपिड में बदलें और प्रोटीन छवि को प्रोटीन में बदलें।
  4. प्रक्रिया | पर जाएँ छवि कैलकुलेटर और प्रदर्शन प्रोटीन लिपिड घटाना.
  5. इमेज | पर जाकर छवियों को संयोजित करें रंग | मर्ज चैनल, हरे रंग के लिए लिपिड और नीले करने के लिए प्रोटीन की स्थापना. छवि चैनल उपकरण खोलें (छवि | रंग | चैनल उपकरण) और चमक और इसके विपरीत समायोजित (छवि | | समायोजित करें चमक /कंट्रास्ट)।
  6. चैनल उपकरण का उपयोग करके प्रत्येक चैनल के लिए चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें। लिपिड चैनल के लिए, इसके विपरीत को समायोजित करें जब तक कि सेलुलर विशेषताएं अंधेरे दिखाई न दें। प्रोटीन चैनल के लिए, इसके विपरीत को समायोजित करें जब तक कि सेलुलर विशेषताएं नीली दिखाई न दें। मर्ज किए गए चैनल हरे/नीले रंग की छवि को छवि | पर जाकर RGB छवि में कनवर्ट करें टाइप | आरजीबी रंग. इस छवि को फ़ाइल | द्वारा निर्यात करें | के रूप में सहेजें टिफ ।
    नोट: झूठे एच एंड ई धुंधला के लिए, रंग योजना गुलाबी साइटोप्लाज्म दिखाती है, जबकि नाभिक गहरे नीले-बैंगनी होते हैं।
  7. सामग्री की तालिका में गलत H &E धुंधला स्क्रिप्ट संसाधन से HE.m MATLAB स्क्रिप्ट डाउनलोड करें।
  8. MATLAB में HE.m स्क्रिप्ट चलाएँ। कृत्रिम रूप से एच एंड ई दाग छवि उत्पन्न करने के लिए पिछले चरण से निर्यात की गई RGB छवि का चयन करें।
  9. (वैकल्पिक) बड़े फ़ील्ड-ऑफ-व्यू इमेजिंग के लिए छवि तीव्रता को सामान्य करें क्योंकि छवि केंद्र की तुलना में परिधि में गहरा दिखाई देती है।
    1. छवियों के क्षेत्र सामान्यीकरण करने के लिए, जितना संभव हो उतनी छवियों का औसत करें। उसके बाद, ImageJ के साथ तीव्रता सुविधाओं को निकालें (प्रक्रिया | फ़िल्टर | गाऊसी धुंधला | त्रिज्या = 50)।
    2. धुंधली छवि (Ctrl+M) की अधिकतम तीव्रता को मापें. धुंधली छवि को अधिकतम तीव्रता से विभाजित करें (प्रक्रिया | गणित | विभाजित करें)। कच्ची SRS छवि को धुंधली छवि से विभाजित करें (प्रक्रिया | छवि | कैलकुलेटर)।

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Representative Results

वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन का अनुकूलन:
एक सामग्री के माध्यम से फैलाव फैलाव माध्यम (लंबाई और सामग्री) और तरंग दैर्ध्य से प्रभावित होता है। फैलाव रॉड लंबाई बदलने वर्णक्रमीय संकल्प और संकेत आकार को प्रभावित करता है। यह एक देने और लेने का संबंध है जिसे आवेदन के आधार पर अलग-अलग तौला जा सकता है। छड़ें बीम पल्स को आवृत्ति में व्यापक होने और समय में संकीर्ण होने से आवृत्ति में संकीर्ण और समय में व्यापक होने तक फैलाती हैं। चित्रा 7 वर्णक्रमीय संकल्प पर अलग-अलग छड़ लंबाई के प्रभाव को दर्शाता है। चित्रा 7A बहुत खराब वर्णक्रमीय संकल्प को दर्शाता है; इस सेटअप में कोई ग्लास चहचहाहट की छड़ नहीं है, और डीएमएसओ से दो रमन चोटियों को बिल्कुल हल नहीं किया गया है। चित्रा 7B, C में, कांच की चहचहाहट की छड़ों की संख्या में वृद्धि दो चोटियों को हल करने के लिए शुरू होती है। अंत में, चित्रा 7 डी से पता चलता है कि कैसे मिलान की गई चहचहाहट दोनों चोटियों को हल करती है और इसका उपयोग आवृत्ति के लिए चरण स्थितियों को कैलिब्रेट करने के लिए किया जा सकता है।

DMSO के साथ अंशांकन:
डीएमएसओ में 2,913 और 2,994 सेमी - 1 पर दो तेज रमन चोटियां हैं जो सी-एच क्षेत्र में अंशांकन के लिए सुविधाजनक हैं। एक बार एक DMSO स्पेक्ट्रम एक hyperspectral SRS स्कैन से प्राप्त किया जाता है, एक साधारण रैखिक प्रतिगमन रमन शिफ्ट करने के लिए मंच की स्थिति परिवर्तित करता है। यदि वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन खराब है (जैसा कि चित्रा 7 ए में दिखाया गया है) और दो चोटियां वियोज्य नहीं हैं, तो रैखिक प्रतिगमन के साथ अंशांकन असंभव है। इस मामले में, कांच की छड़ों को जोड़ने या हटाने से बेहतर फैलाव मिलान आवश्यक है। अंशांकन के लिए एक डीएमएसओ सिग्नल खोजने में सबसे आम कठिनाइयां या तो अस्थायी ओवरलैप या दो बीम के स्थानिक ओवरलैप में त्रुटियों के कारण होती हैं। DMSO अंशांकन का प्रयास करने से पहले, SRS संकेत को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए स्थानिक और अस्थायी संरेखण चरणों को दोहराएँ।

दो रंग DMSO:
दो रंग एसआरएस में, दो पंप पल्स ट्रेनों को एक निश्चित समय की देरी के साथ ओर्थोगोनल ध्रुवीकरण के साथ उत्पन्न किया जाता है (एक birefringent क्रिस्टल के कारण)। मॉडुलन गहराई और 90 डिग्री चरण शिफ्ट का मूल्यांकन एक फोटोडायोड के साथ किया जाता है, जिसके बाद एक डीएमएसओ एसआरएस सिग्नल होता है। चित्रा 8 स्वीकार्य मॉडुलन गहराई और अस्थायी अलगाव को दर्शाता है। यद्यपि चित्रा 8 में डीएमएसओ का वर्णक्रमीय संकल्प आदर्श नहीं है, यह अक्सर छोटी दालों के साथ एक उच्च संकेत प्राप्त करने के लिए ऊतक इमेजिंग प्रयोगों में बलिदान किया जाता है। चित्रा 9 खराब चरण बदलावों को दर्शाता है जो उल्टे या नकारात्मक चोटियों को जन्म देते हैं।

एपि-मोड में माउस मस्तिष्क के ऊतकों के दो-रंग एसआरएस:
एपि-मोड (बैकस्कैटर्ड फोटॉनों का पता लगाना) एसआरएस का उपयोग मोटे ऊतक (>1 मिमी) की इमेजिंग के लिए किया जाता है। चित्रा 10ए, बी वास्तविक समय, दो-रंग एसआरएस इमेजिंग को 2,850 सेमी-1 और पूर्व विवो माउस मस्तिष्क ऊतक के 2,930 सेमी -1 पर प्रदर्शित करता है। लिपिड और प्रोटीन चैनलों (चित्रा 10ए, बी) से कच्ची छवियों को लिपिड और प्रोटीन योगदान (चित्रा 10 सी) को दर्शाने वाली एक एकल छवि का उत्पादन करने के लिए रंग-कोडित किया गया था। एच एंड ई स्टेनिंग की नकल करने के लिए चित्रा 10 सी पर गलत एच एंड ई स्टेनिंग (चित्रा 10 डी) किया गया था। खराब इमेजिंग गुणवत्ता बड़ी इमेजिंग गहराई या खराब अंशांकन (आवृत्ति अक्ष या मॉडुलन गहराई) का परिणाम हो सकती है। मस्तिष्क के ऊतकों में विशिष्ट इमेजिंग गहराई 100-200 μm13 है।

Figure 1
चित्रा 1: एक-रंग एसआरएस इमेजिंग सेटअप की योजनाबद्ध। संचरण मोड में एक वर्णक्रमीय-फोकसिंग एसआरएस माइक्रोस्कोप का निर्माण। X और Y ओर्थोगोनल आउटपुट का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षेप: SRS = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन; डीएल = retroreflector-आधारित देरी लाइन; Div = विभाजक; एफबी = fanout बफर; AT = attenuator; पीएस = चरण शिफ्टर; पीए = शक्ति एम्पलीफायर; DCM = dichroic दर्पण; जीएम = गैल्वो दर्पण; EOM = electrooptic modulator; POM = पिक-ऑफ दर्पण; PBS = polarizing बीम विभाजक, BRC = birefringent क्रिस्टल; QWP = तिमाही लहर प्लेट; HWP: आधा लहर प्लेट; पीडी = फोटोडायोड; जीआर = कांच की छड़ी; BB = बीम ब्लॉक; SPF = शॉर्टपास फ़िल्टर; CL = collimating लेंस; बीएस = बीम आकार बदलने लेंस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्रतिनिधि अस्थायी ओवरलैप। (A) पंप और स्टोक्स बीम को ऑसिलोस्कोप पर अस्थायी रूप से ओवरलैप किया गया देखा जाता है। Oscilloscope कर्सर पंप और स्टोक्स बीम के अस्थायी पदों को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह ओवरलैप एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में संतोषजनक है ताकि देरी चरण के साथ अस्थायी ओवरलैप को आगे बढ़ाया जा सके। (बी) 20 मेगाहर्ट्ज पर एक ईओएम की संतोषजनक प्रतिनिधि मॉडुलन गहराई (सी) संतोषजनक पल्स मॉडुलन जबकि दो ईओएम उपयोग में हैं। (घ) दोगुना मॉडुलित स्टोक्स हाथ पर birefringent क्वार्ट्ज क्रिस्टल और आधा तरंग प्लेट स्थापना के बाद संतोषजनक पल्स ट्रेन मॉडुलन। संक्षिप्त नाम: EOM = electrooptic modulator. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि एसआरएस और पंप संकेतों. (ए) डीसी चैनल में गलत संरेखित पंप सिग्नल का पता चला। (बी) फोटोडायोड द्वारा पता लगाया गया गलत संरेखित एसआरएस सिग्नल। (सी) डीसी चैनल में संतोषजनक, केंद्रित पंप सिग्नल। (d) संतोषजनक एसआरएस सिग्नल एसी चैनल पर केंद्रित है। संक्षिप्त नाम: SRS = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: वर्णक्रमीय संकल्प लक्षण वर्णन. एक गाऊसी समारोह 2,913 सेमी -1 रमन डीएमएसओ चोटी के लिए फिट था। FWHM की गणना प्रणाली के लिए 15 सेमी -1 का एक संकल्प दिया। संक्षिप्त रूप: DMSO = dimethyl sulfoxide; FWHM = आधा अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: दो रंग एसआरएस इमेजिंग सेटअप की योजनाबद्ध। संचरण मोड में दो रंग एसआरएस माइक्रोस्कोप का निर्माण। X और Y ओर्थोगोनल आउटपुट का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षेप: डीएल = रेट्रोरिफ्लेक्टर आधारित देरी लाइन; Div = विभाजक; एफबी = fanout बफर; AT = attenuator; पीएस = चरण शिफ्टर; पीए = शक्ति एम्पलीफायर; DCM = dichroic दर्पण; जीएम = गैल्वो दर्पण; EOM = electrooptic modulator; PBS = polarizing बीम विभाजक; BRC = birefringent क्रिस्टल; QWP = तिमाही लहर प्लेट; HWP = आधा लहर प्लेट; पीडी = फोटोडायोड; जीआर = कांच की छड़ी; BB = बीम ब्लॉक, SPF = शॉर्टपास फ़िल्टर; CL = collimating लेंस; POM = पिक-ऑफ दर्पण; बीएस = बीम आकार बदलने लेंस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: दो रंग एसआरएस इमेजिंग एपि-मोड सेट-अप की योजनाबद्ध। एपि-मोड में दो-रंग के एसआरएस माइक्रोस्कोप का निर्माण। X और Y ओर्थोगोनल आउटपुट का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षेप: डीएल = रेट्रोरिफ्लेक्टर आधारित देरी लाइन; Div = विभाजक; एफबी = fanout बफर; AT = attenuator; पीएस = चरण शिफ्टर; पीए = शक्ति एम्पलीफायर; DCM = dichroic दर्पण; जीएम = गैल्वो दर्पण; EOM = electrooptic modulator; PBS = polarizing बीम विभाजक; BRC = birefringent क्रिस्टल; QWP = तिमाही लहर प्लेट; HWP = आधा लहर प्लेट; पीडी = फोटोडायोड; जीआर = कांच की छड़ी; BB = बीम ब्लॉक, BPF = bandpass फिल्टर; CL = collimating लेंस; POM = पिक-ऑफ दर्पण; बीएस = बीम आकार बदलने लेंस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: 25% DMSO के साथ वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन को अनुकूलित करना( A) DMSO स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए शून्य ग्लास चहचहाहट छड़ का उपयोग किया गया था। दोनों चोटियों का समाधान नहीं किया गया है। (बी) ग्लास चहचहाहट की छड़ों का उपयोग किया गया था, पंप बांह पर 20 सेमी और स्टोक्स हाथ पर 24 सेमी। दो चोटियों को एक संतोषजनक बिंदु पर हल किया जाना शुरू हो रहा है। (सी) चहकने वाली छड़ों का उपयोग किया गया था, 40 सेमी लंबा पंप और 24 सेमी लंबा स्टोक्स, एक बेहतर हल किए गए डीएमएसओ स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए। (डी) उच्च वर्णक्रमीय संकल्प प्राप्त करने के लिए चहचहाहट की छड़ों का उपयोग किया गया था, 64 सेमी लंबा पंप और 60 सेमी लंबा स्टोक्स। संक्षिप्त नाम: DMSO = dimethyl sulfoxide. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: दो रंग एसआरएस, ध्रुवीकरण और समय देरी को अलग-अलग करता है। ऑर्थोगोनल ध्रुवीकरण (एस एंड पी) की दो समय-विलंबित पल्स ट्रेनों का उपयोग एसआरएस उत्तेजनाओं के बीच समय में देरी (और रमन आवृत्ति अंतर) दिखाने के लिए डीएमएसओ स्पेक्ट्रा की छवि के लिए किया जाता है। संक्षिप्त रूप: DMSO = dimethyl sulfoxide; एसआरएस = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: एक गरीब दो रंग एसआरएस चरण बदलाव के परिणामस्वरूप एसआरएस स्पेक्ट्रम। चरण स्थिति 48 के पास एक नकारात्मक 2,994 सेमी -1 शिखर खराब चरण अंतर का संकेत है। संक्षिप्त नाम: SRS = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्रा 10: एसआरएस छवियों के झूठे दो-रंग एच एंड ई धुंधला की पीढ़ी। (ए) 2,930 सेमी -1 संक्रमण पर एक माउस मस्तिष्क ऊतक से कच्चे प्रोटीन एसआरएस छवि। (बी) 2,850 सेमी -1 संक्रमण पर माउस मस्तिष्क ऊतक से कच्ची लिपिड एसआरएस छवि। (सी) हरे रंग में लिपिड योगदान और नीले रंग में प्रोटीन योगदान के साथ ए और बी से विलय और रंग-कोडित चैनल। (डी) पैथोलॉजिकल अनुप्रयोगों के लिए एच एंड ई स्टेनिंग की नकल करने के लिए सी पर गलत एच एंड ई रीकलरिंग किया गया था। स्केल बार = 50 μm. संक्षेप: SRS = उत्तेजित रमन प्रकीर्णन; H&E = hematoxylin और eosin कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत दो-रंग एसआरएस इमेजिंग योजना एक-रंग एसआरएस इमेजिंग के उचित कार्यान्वयन पर निर्भर करती है। एक-रंग एसआरएस इमेजिंग में, महत्वपूर्ण कदम स्थानिक संरेखण, अस्थायी संरेखण, मॉडुलन गहराई और चरण शिफ्ट हैं। स्थानिक रूप से दो बीम के संयोजन को एक डाइक्रोइक दर्पण द्वारा पूरा किया जाता है। बीम को डाइक्रोइक दर्पण में भेजते समय ठीक समायोजन के लिए कई स्टीयरिंग दर्पणों का उपयोग किया जाता है। एक बार जब बीम को डाइक्रोइक दर्पण के साथ जोड़ा जाता है, तो स्थानिक संरेखण की पुष्टि दर्पण के साथ संयुक्त बीम पथ को चुनकर की जा सकती है ताकि एक दीवार की ओर भेजा जा सके >1 मीटर दूर संयुक्त बीम की ओर भेजा जा सके, जबकि यह देखने के लिए कि क्या यह आईआर कार्ड के साथ ओवरलैप करता है। माइक्रोस्कोप के माध्यम से स्थानिक संरेखण के बाद, अस्थायी ओवरलैप को एक रेट्रोरिफ्लेक्टर-आधारित देरी चरण के साथ पथ की लंबाई को समायोजित करके किया जाता है, जिसमें स्थानिक संरेखण को संरक्षित करने का लाभ होता है। 1,040 एनएम हाथ इस प्रोटोकॉल में विलंबित बीम है। अस्थायी ओवरलैप असंभव है यदि देरी चरण में दो बीम को अस्थायी रूप से ओवरलैप करने का कारण बनने की सीमा नहीं है। उस स्थिति में, यह सुनिश्चित करने के लिए कि अस्थायी ओवरलैप मध्य-के-देरी-स्कैन रेंज के करीब है, पूरे देरी चरण को एक अलग स्थान पर ले जाना आवश्यक हो सकता है। उदाहरण के लिए, यदि दो बीमों के बीच अस्थायी अंतर को 6 एनएस के रूप में मापा जाता है, तो 1.8 मीटर समायोजन की आवश्यकता होती है। आवश्यक समायोजन तेजी से बीम के लिए बीम पथ के बढ़ाव की लंबाई या धीमी बीम के लिए बीम पथ के छोटे होने को दर्शाता है।

संरेखण के अलावा, बीम आकार मिलान और स्टोक्स बीम के मॉडुलन भी एसआरएस संकेत को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। आदर्श रूप से, दोनों बीम को उद्देश्य विमान पर कॉलिमेट किया जाना चाहिए और उद्देश्य बैक एपर्चर के आकार से मेल खाना चाहिए। यह collimation और बीम आकार की जांच करने के लिए उपयोगी है यदि उद्देश्य विमान उपयोगकर्ता के संपर्क में है। यदि बीम अभिसरण या विचलन कर रहा है, तो कॉलिमेशन (प्रोटोकॉल चरण 1.1) प्राप्त करने के लिए कोलिमेशन लेंस जोड़ी के दूसरे लेंस को समायोजित करना आवश्यक है। इसी तरह, यदि बीम का आकार उद्देश्य बैक एपर्चर पर बहुत छोटा है, तो उच्च आवर्धन के साथ एक लेंस जोड़ी का उपयोग करने की आवश्यकता है (प्रोटोकॉल चरण 1.2)। एसआरएस स्टोक्स बीम की मॉडुलन गहराई के साथ रैखिक रूप से तराजू। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि घाटी में नाड़ी की ऊंचाई ऑसिलोस्कोप पर चोटी पर नाड़ी की ऊंचाई का <10% है। स्टोक्स बीम का खराब मॉडुलन सीधे खराब एसएनआर का अनुवाद करता है।

एसआरएस इमेजिंग के लिए फेम्टोसेकंड लेजर का उपयोग करते समय, पंप और स्टोक्स के बीच समय की देरी को रमन आवृत्ति शिफ्ट में बदलने के लिए वर्णक्रमीय फोकसिंग आवश्यक है। रूपांतरण कारक लागू चहचहाना की मात्रा पर निर्भर करता है। इष्टतम वर्णक्रमीय संकल्प प्राप्त करने के लिए पंप और स्टोक्स के जीडीडी से मेल खाना महत्वपूर्ण है। जीडीडी का अनुमान उपयोग की जाने वाली फैलाव सामग्री की लंबाई और इसके जीवीडी के आधार पर लगाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, SF11 घने चकमक पत्थर कांच की छड़ में 1,040 एनएम पर 123.270 fs2 / mm का जीवीडी और 800 एनएम पर 187.486 fs2 / मिमी है। 800 nm बीम पथ में SF11 के 240 मिमी के लिए, GDD 240 मिमी × 187.486 fs2 / mm = 45,000 fs2 है। 1,040 एनएम बीम पथ में SF11 के 240 मिमी के लिए, GDD 240 मिमी × 123.270 fs2 / mm = 30,000 fs2 है। इस उदाहरण की गणना का मतलब है कि अतिरिक्त ग्लास रॉड को 1,040 एनएम आर्म में जोड़ा जाना चाहिए, या जीडीडी से मेल खाने के लिए 800 एनएम आर्म से ग्लास रॉड को हटा दिया जाना चाहिए। उच्च वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, एक बड़े जीडीडी की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है कि लंबी छड़ें। हालांकि, जीडीडी की गणना में, ईओएम और उद्देश्य से योगदान की उपेक्षा की गई है। जीडीडी का वास्तविक मिलान प्रयोगात्मक रूप से पंप या स्टोक्स पर दिए गए रॉड की लंबाई के लिए सबसे अच्छा वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन खोजकर निर्धारित किया जाता है। गणना एक अच्छी शुरुआती कदम के रूप में काम करती है। पुनरावर्ती अतिरिक्त और कांच की छड़ को हटाने के माध्यम से प्रयोगात्मक अनुकूलन अभी भी वर्णक्रमीय संकल्प का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है।

यह महसूस करना महत्वपूर्ण है कि एक बड़ी चहचहाहट उच्च वर्णक्रमीय संकल्प प्रदान करती है लेकिन सिग्नल तीव्रता की कीमत पर। सी-एच क्षेत्र में ऊतक इमेजिंग के लिए छोटे चहचहाहट और छोटी दालें फायदेमंद हैं क्योंकि प्रोटीन और लिपिड रमन चोटियां व्यापक हैं। कम वर्णक्रमीय संकल्प को दो-रंग ऊतक कंट्रास्ट17 का त्याग किए बिना एक उच्च एसआरएस सिग्नल (या तेज इमेजिंग गति) के लिए कारोबार किया जा सकता है। अन्य अनुप्रयोगों में जहां उच्च वर्णक्रमीय रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से फिंगरप्रिंट क्षेत्र में, लंबे कांच की छड़ों का उपयोग करके एक बड़ी चहचहाहट लागू करना आवश्यक है। वैकल्पिक रूप से, लंबे समय तक दालों को प्राप्त करने के लिए झंझरी स्ट्रेचर का उपयोग करना आसान हो सकता है (पल्स अवधि के लिए 3 पीएस से अधिक)। हालांकि, उपयोग किए गए वाणिज्यिक लेजर की एक मुख्य सीमा इसकी वर्णक्रमीय बैंडविड्थ है। वर्णक्रमीय-केंद्रित एसआरएस का वर्णक्रमीय कवरेज उत्तेजना लेजर की बैंडविड्थ पर निर्भर करता है। उपयोग की गई लेजर प्रणाली में आमतौर पर 200-250 सेमी -1 के आसपास एक वर्णक्रमीय कवरेज होता है। यह मुश्किल से सी-एच क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त है। फिंगरप्रिंट क्षेत्र में इमेजिंग के लिए रासायनिक प्रजातियों को हल करने के लिए आमतौर पर एक बड़े वर्णक्रमीय कवरेज की आवश्यकता होती है। इस समस्या को एक फाइबर लेजर ऐड-ऑन के साथ संबोधित किया जा सकता है जो स्टोक्स लेजर की बैंडविड्थ को 6 एनएम से 60 एनएम18 तक बढ़ाता है। दो-रंग एसआरएस इमेजिंग तकनीक के लिए एक और महत्वपूर्ण सीमा यह है कि केवल दो संक्रमणों की निगरानी की जाती है। यह दृष्टिकोण कई अतिव्यापी रमन चोटियों या कई प्रजातियों के साथ जटिल नमूनों के लिए अनुपयुक्त होगा।

वास्तविक समय दो रंग एसआरएस इमेजिंग विधि लेजर या देरी ट्यूनिंग की आवश्यकता को दूर करके उच्च गति ऊतक इमेजिंग affords. हालांकि, दोनों ईओएम के लिए निकट-पूर्ण मॉडुलन गहराई प्राप्त करने में चुनौतियों के कारण स्थापित करना मुश्किल है। EOM1 और EOM2 को स्वतंत्र रूप से अनुकूलित करना सबसे अच्छा है। यदि EOM1 चालू है, तो EOM2 को अनप्लग किया जाना चाहिए और इसके विपरीत। एक बार जब दोनों मॉडुलन को निकट-पूर्णता (>95% मॉडुलन गहराई) के लिए अनुकूलित किया जाता है, तो दोनों ईओएम ऑर्थोगोनल मॉडुलन को सक्षम करने के लिए जुड़े होते हैं। दो ऑर्थोगोनल पल्स ट्रेनों के बीच समय की देरी की लंबाई बीआरसी और चहचहाहट की लंबाई पर निर्भर करती है। यह मॉडुलन विधि नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए तुरंत संभव नहीं है क्योंकि जटिल इलेक्ट्रॉनिक्स को दो ईओएम को चलाने के लिए एक ट्यूनेबल फेज शिफ्ट के साथ दो आरएफ पल्स ट्रेनों को प्रदान करने की आवश्यकता होती है। ईओएम के संरेखण को भी दो चैनलों के बीच उच्च संचरण, अच्छा मॉडुलन और ओर्थोगोनेलिटी सुनिश्चित करने के लिए निकट-पूर्ण होने की आवश्यकता है। यह तकनीक आम तौर पर अन्य अनुप्रयोगों पर लागू होती है जिनके लिए गति या नमूना परिवर्तन के कारण दो रमन चोटियों की तेज, एक साथ इमेजिंग की आवश्यकता होती है। उदाहरणों में पानी के तापमान के माप या चलती वस्तुओं जैसे लिपिड बूंदों या ऑर्गेनेल11,19 की ट्रैकिंग शामिल है।

भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक मजबूत फाइबर लेजर की आवश्यकता होती है4। प्रोटोकॉल द्वारा वर्णित दृष्टिकोण को वीडियो दर तक अधिग्रहण की गति में सुधार करने के लिए भी बढ़ाया जा सकता है, जो उचित समय के भीतर बड़े ऊतक नमूनों को स्कैन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि इमेजिंग समय या गति कलाकृतियां चिंता का विषय नहीं हैं, तो प्रोटीन और लिपिड एसआरएस छवियों को मोटरचालित देरी चरण फ्रेम-दर-फ्रेम को स्थानांतरित करके क्रमिक रूप से प्राप्त किया जा सकता है। एक और वास्तविक समय, दो-रंग एसआरएस इमेजिंग विधि एक दोहरी-चरण योजना है जो स्टोक्स बीम को एक ही दो ओर्थोगोनल चैनल20 प्रदान करने के लिए रीसायकल करती है। हालांकि, दोहरे चरण की योजना के कार्यान्वयन के लिए अतिरिक्त संरेखण की आवश्यकता होती है जिसमें तीन बीम शामिल होते हैं। इसके लिए बीम आकार के मिलान और तीन लेजर बीम के विचलन की भी आवश्यकता होती है। एक साथ दो रंग सीमा को दूर करने के लिए दोनों तकनीकों में सुधार करने के लिए एक संभावित एवेन्यू विशिष्ट वर्णक्रमीय क्षेत्रोंकी जांच करने के लिए एक तेजी से ट्यूनेबल फाइबर लेजर का समावेश है। छवियों का प्रसंस्करण नकली एच एंड ई छवियों को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल में उल्लिखित के समान है।

अंत में, यह प्रोटोकॉल एपि-मोड एसआरएस इमेजिंग को प्रदर्शित करता है। यह आमतौर पर डिटेक्टर13 तक पहुंचने वाली कम पंप शक्ति के कारण पतले ऊतक वर्गों के लिए ट्रांसमिशन मोड इमेजिंग की तुलना में कम गुणवत्ता वाली छवियों को उत्पन्न करता है। मोटी ऊतक इमेजिंग (>1-2 मिमी) या नमूनों के लिए जो अत्यधिक बिखरने वाले हैं (उदाहरण के लिए, हड्डी के ऊतक), एपि-मोड इमेजिंग ट्रांसमिशन मोड इमेजिंग से बेहतर प्रदर्शन कर सकते हैं। मस्तिष्क के ऊतकों जैसे ताजा ऊतकों की इमेजिंग करते समय, एसआरएस इमेजिंग गहराई आमतौर पर 200-300 μm तक सीमित होती है। निश्चित ऊतक के लिए, प्रकीर्णन मजबूत है, और इमेजिंग गहराई 100-200 μm है। गहरी इमेजिंग को उच्च शक्ति, विपथन सुधार, या ऑप्टिकल समाशोधन22,23 के साथ प्राप्त किया जा सकता है। फिर भी, एपि-मोड इमेजिंग ऊतक निदान के लिए एक बेहतर दृष्टिकोण है क्योंकि इसे किसी भी ऊतक सेक्शनिंग की आवश्यकता नहीं होती है, और संरेखण उच्च एनए कंडेनसर के बिना सरल है। भविष्य के ऊतक निदान अनुप्रयोगों को मशीन लर्निंग / डीप लर्निंग-आधारित निदान के बाद बरकरार सर्जिकल नमूनों पर तेजी से, बड़े क्षेत्र इमेजिंग से लाभ होगा। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल विवो अनुप्रयोगों के लिए भी उपयुक्त है, जैसे कि मस्तिष्क इमेजिंग या त्वचा इमेजिंग, जहां एपि-मोड इमेजिंग एकमात्र विकल्प है, और गति कलाकृतियों से बचने के लिए उच्च गति इमेजिंग महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को एनआईएच R35 GM133435 द्वारा D.F. द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Achromatic Lens THORLABS AC254-100-B Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter Minicircuits BBP-21.4+ Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens THORLABS AC254-200-B Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate Union Optic WPA2210-650-1100-M25.4 Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate Union Optic WPA4210-650-1100-M25.4 Broadband quarter waveplate
Beam Sampler THORLABS BSN11 10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror THORLABS DMSP1000 Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 472301 Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator THORLABS EO-AM-NR-C1 Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script Matlab https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer PRL-414B Pulse Research Lab 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode THORLABS DET10A2 Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider PRL-220A Pulse Research Lab TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods Union Optic CYLROD01 High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+ Newport Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. 
Lock-in Amplifier Liquid Instruments Moku Lab Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors THORLABS BB05-E03-10 Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage Zaber X-DMQ12P-DE52 Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor Nikon CSC1003 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope Tektronix TDS7054 Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter SigaTek SF50A2 For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode Hamamatsu Corp S3994-01 Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter Union Optic PBS9025-620-1000 Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database refractiveindex.info
Retro-reflector Edmund Optics 34-408 BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier Minicircuits ZHL-1-2W+ Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors Cambridge Technologies 6215H We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage Vidrio ScanImage Basic Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter THORLABS FESH1000 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope Nikon Eclipse FN1 Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective Olympus XLPLN25XWMP2 The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.

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References

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वास्तविक समय, दो रंग ऊतक निदान के लिए माउस मस्तिष्क के रमन प्रकीर्णन इमेजिंग प्रेरित
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Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis. J. Vis. Exp. (180), e63484, doi:10.3791/63484 (2022).

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