Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63484
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, University of Washington
* These authors contributed equally

Summary

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכניקת הדמיה עוצמתית, לא פולשנית ונטולת תוויות. יישום מתפתח אחד הוא היסטולוגיה של ראמאן, שבה הדמיית SRS בשני צבעים במעברי החלבון והשומנים ראמאן משמשת ליצירת תמונות פסאודו-המטוקסילין ואוזין. כאן אנו מדגימים פרוטוקול להדמיית SRS בשני צבעים בזמן אמת לאבחון רקמות.

Abstract

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) התגלתה כטכניקת הדמיה אופטית רבת עוצמה לאבחון רקמות. בשנים האחרונות, הוכח כי SRS בשני צבעים מסוגל לספק תמונות שוות ערך להמטוקסילין ו-eosin (H&E) המאפשרות אבחון מהיר ואמין של סרטן המוח. יכולת כזו אפשרה יישומים מרגשים לאבחון סרטן תוך ניתוחי. הדמיית SRS בשני צבעים של רקמה יכולה להיעשות עם מקור לייזר פיקוז-שניות או פמטו-שניות. לייזרי Femtosecond נהנים מהיתרון בכך שהם מאפשרים מצבי הדמיה גמישים, כולל הדמיה היפרספקטרלית מהירה והדמיית SRS דו-צבעית בזמן אמת. גישה של מיקוד ספקטרלי עם פולסי לייזר מצייצים משמשת בדרך כלל עם לייזרים פמטו-שניות כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית גבוהה.

ניתן לממש רכישת SRS בשני צבעים באמצעות אפנון אורתוגונלי וזיהוי נעילה. המורכבות של ציוץ דופק, אפנון ואפיון היא צוואר בקבוק לאימוץ נרחב של שיטה זו. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט כדי להדגים את היישום והאופטימיזציה של SRS המתמקד בספקטרלי והדמיה בזמן אמת בשני צבעים של רקמת המוח של העכבר במצב epi-mode. פרוטוקול זה יכול לשמש למגוון רחב של יישומי הדמיית SRS הממנפים את המהירות הגבוהה ואת יכולת ההדמיה הספקטרוסקופית של SRS.

Introduction

אבחון רקמות מסורתי מסתמך על פרוטוקולי צביעה ולאחר מכן בדיקה תחת מיקרוסקופ אופטי. אחת משיטות ההכתמה הנפוצות בהן משתמשים פתולוגים היא צביעת H&E: המטוקסילין מכתים גרעיני תאים בכחול ארגמני, ואוזין מכתים את המטריצה החוץ-תאית ואת הציטופלסמה בוורוד. צביעה פשוטה זו נותרה תקן הזהב בפתולוגיה עבור משימות רבות של אבחנות רקמות, במיוחד אבחון סרטן. עם זאת, להיסטופתולוגיה של H&E, במיוחד לטכניקת החתך הקפואה המשמשת במסגרת תוך ניתוחית, עדיין יש מגבלות. הליך ההכתמה הוא תהליך מייגע הכולל הטבעת רקמות, חתך, קיבוע וכתם1. זמן ההסבה הטיפוסי הוא 20 דקות או יותר. ביצוע H&E במהלך חתך קפוא יכול לפעמים להפוך למאתגר יותר כאשר מקטעים מרובים מעובדים בבת אחת בשל הצורך להעריך תכונות תאיות או דפוסי גדילה בתלת-ממד לצורך הערכת שוליים. יתר על כן, טכניקות היסטולוגיות תוך ניתוחיות דורשות טכנאים וקלינאים מיומנים. הגבלה במספר הפתולוגים המוסמכים בבתי חולים רבים היא אילוץ להתייעצות תוך ניתוחית במקרים רבים. ניתן להקל על מגבלות כאלה עם תחומי העניין המתפתחים במהירות בפתולוגיה דיגיטלית ובאבחון מבוסס בינה מלאכותית2. עם זאת, תוצאות צביעת H&E משתנות, בהתאם לניסיון של הטכנאי, מה שמציב אתגרים נוספים לאבחון מבוסס מחשב2.

ניתן להתמודד עם אתגרים אלה באמצעות טכניקות הדמיה אופטית ללא תוויות. טכניקה אחת כזו היא מיקרוסקופיית SRS. SRS משתמש בלייזרים מסונכרנים עם פולסים – משאבה וסטוקס – כדי לעורר תנודות מולקולריות ביעילות גבוהה3. דיווחים אחרונים הראו כי הדמיית SRS של חלבונים ושומנים יכולה ליצור תמונות שוות ערך ל-H&E (הידועות גם בשם היסטולוגיה של ראמאן מגורה או SRH) עם רקמה טרייה שלמה, אשר עוקפת את הצורך בכל עיבוד רקמות, מקצרת באופן משמעותי את הזמן הדרוש לאבחון, והותאמה תוך ניתוחית4. יתר על כן, הדמיית SRS יכולה לספק תמונות תלת מימד, מה שמציע מידע נוסף לאבחון כאשר תמונות דו-ממדיות אינן מספיקות5. SRH אינו משוחד ומייצר תמונות דיגיטליות הזמינות בקלות לאבחון מבוסס מחשב. הוא מתגלה במהירות כפתרון אפשרי לאבחון סרטן תוך ניתוחי ולניתוח שולי גידול, במיוחד בסרטן המוח 6,7,8. לאחרונה, הדמיית SRS של שינויים כימיים של רקמות הוצעה גם כדי לספק מידע אבחוני שימושי שיכול לעזור עוד יותר לקלינאים לריבוד סוגי סרטן שונים או שלבים9.

למרות הפוטנציאל העצום שלה ביישומי אבחון רקמות, הדמיית SRS מוגבלת בעיקר למעבדות אקדמיות המתמחות באופטיקה בשל המורכבות הקשורה לפלטפורמת ההדמיה, הכוללת לייזרים מהירים במיוחד, מיקרוסקופ סריקת לייזר ואלקטרוניקה מתוחכמת לזיהוי. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה מפורטת להדגמת השימוש במקור לייזר femtosecond נפוץ להדמיית SRS דו-צבעית בזמן אמת וליצירת תמונות פסאודו-H&E מרקמת המוח של עכבר. הפרוטוקול יכסה את ההליכים הבאים:

יישור ואופטימיזציה של ציוץ
רוב תוכניות ההדמיה של SRS משתמשות בלייזרים פיקוז-שניות או פמטו-שניות כמקור העירור. עם לייזרים femtosecond, רוחב הפס של הלייזר הוא הרבה יותר גדול מאשר קו Raman. כדי להתגבר על מגבלה זו, נעשה שימוש בגישת מיקוד ספקטרלי כדי לצייץ את לייזרי הפמטו-שניות לציר את ציר הזמן של פיקוז-שניות כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית צרה10. רזולוציה ספקטרלית אופטימלית מושגת רק כאשר הציוץ הזמני (הידוע גם בשם פיזור השהיית הקבוצה או סתם פיזור) מותאם כראוי למשאבה וללייזרים של סטוקס. הליך היישור והצעדים הדרושים כדי לייעל את פיזור קרני הלייזר באמצעות מוטות זכוכית בעלי פיזור גבוה מודגמים כאן.

כיול תדרים
יתרון של מיקוד ספקטרלי SRS הוא שניתן לכוונן במהירות את עירור הראמן על ידי שינוי השהיית הזמן בין המשאבה ללייזרים של סטוקס. כוונון כזה מאפשר הדמיה מהירה ורכישה ספקטרלית אמינה בהשוואה לכוונון אורכי גל לייזר. עם זאת, הקשר הליניארי בין תדירות העירור לעיכוב בזמן דורש כיול חיצוני. ממיסים אורגניים עם פסגות ראמאן ידועות משמשים לכיול תדר ראמאן למיקוד ספקטרלי SRS.

הדמיה בזמן אמת, בשני צבעים
חשוב להגביר את מהירות ההדמיה ביישומי אבחון רקמות כדי לקצר את הזמן הדרוש לניתוח דגימות רקמות גדולות. הדמיית SRS דו-צבעית סימולטנית של שומנים וחלבונים מייתרת את הצורך לכוונן את הלייזר או את השהיית הזמן, מה שמגדיל את מהירות ההדמיה ביותר מפי שניים. זה מושג על ידי שימוש בטכניקת אפנון אורתוגונלית חדשנית ודמודולציה דו-ערוצית עם מגבר נעילה11. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לאפנון אורתוגונלי ולרכישת תמונה דו-ערוצית.

דימות SRS במצב אפי
רוב הדמיית ה-SRS המוצגת עד כה מבוצעת במצב שידור. הדמיה במצב אפי מזהה פוטונים מרוסקים מרקמות12. עבור יישומים פתולוגיים, דגימות כירורגיות יכול להיות גדול למדי. עבור הדמיה במצב שידור, חתך רקמות הוא לעתים קרובות הכרחי, אשר באופן בלתי רצוי דורש זמן נוסף. לעומת זאת, הדמיה במצב אפי יכולה לעבוד עם דגימות כירורגיות שלמות. מכיוון שאותה מטרה משמשת לאיסוף אור מרוסק לאחור, אין גם צורך ביישור מעבה בעל צמצם מספרי גבוה הנדרש להדמיית שידור. מצב אפי הוא גם האפשרות היחידה כאשר חיתוך רקמות קשה, כגון עם עצם. בעבר הוכחנו כי עבור רקמת המוח, הדמיה במצב אפי מציעה איכות הדמיה מעולה לעובי הרקמה > 2 מ"מ13. פרוטוקול זה משתמש במפצל קרן מקטב (PBS) כדי לאסוף פוטונים מפוזרים שעברו דה-פולריזציה על ידי רקמה. ניתן לאסוף יותר פוטונים עם גלאי טבעתי על חשבון המורכבות של הרכבה מותאמת אישית של גלאי12. גישת PBS פשוטה יותר ליישום (בדומה לפלואורסצנציה), כאשר הפוטודיודה הסטנדרטית כבר משמשת לזיהוי מצבי שידור.

יצירת תמונות פסאודו-H&E
לאחר איסוף תמונות SRS בשני צבעים, ניתן לצבוע אותן מחדש כדי לדמות את צביעת H&E. מאמר זה מדגים את הנוהל להמרת תמונות ליפידים וחלבון SRS לתמונות פסאודו-H&E SRS עבור יישומי פתולוגיה. פרוטוקול הניסוי מפרט שלבים קריטיים הדרושים ליצירת תמונות SRS באיכות גבוהה. ההליך המוצג כאן אינו ישים רק לאבחון רקמות, אלא גם יכול להיות מותאם ליישומי הדמיית SRS היפרספקטרליים רבים אחרים כגון הדמיית תרופות והדמיה מטבולית14,15.

דרישות מערכת כלליות
מערכת הלייזר של פרוטוקול זה חייבת להיות מסוגלת להפיק 2 קרני לייזר מסונכרנות של femtosecond. מערכות כוללות באופן אידיאלי מתנד פרמטרי אופטי (OPO) לכוונון אורכי גל רחבים של אחת מקרני הלייזר. ההתקנה בפרוטוקול זה משתמשת במערכת לייזר מסחרית Insight DS+ המפיקה שני לייזרים (קרן קבועה אחת ב-1,040 ננומטר וקרן אחת מבוססת OPO הניתנת לכוונון, הנעה בין 680 ל-1,300 ננומטר) עם קצב חזרה של 80 מגה-הרץ. מיקרוסקופים לסריקת לייזר, בין אם מיצרני מיקרוסקופים גדולים או שנבנו בבית, יכולים לשמש להדמיית SRS. המיקרוסקופ המנוצל הוא מיקרוסקופ סריקת לייזר זקוף הבנוי על גבי מסגרת מיקרוסקופ זקופה מסחרית. זוג מראות גלבו 5 מ"מ משמשות לסריקת קרן הלייזר. עבור משתמשים הבוחרים לאמץ מיקרוסקופ סריקת לייזר ביתי, עיין בפרוטוקול שפורסם בעבר לבניית מיקרוסקופ סריקת לייזר16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים נערכו עם 200 מיקרומטר, מוחות עכברים קבועים ומחוטרים, בהתאם לפרוטוקול (# 4395-01) שאושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון (IACUC) של אוניברסיטת וושינגטון. עכברים מסוג בר (זן C57BL/6J) מורדמים באמצעות CO2. לאחר מכן, מתבצעת קרניוטומיה כדי לחלץ את מוחם לקיבוע ב-4% פרפורמלדהיד במי מלח עם מאגר פוספט. המוחות משובצים בתערובת של 3% אגרוז ו-0.3% ג'לטין ומחולקים לפרוסות בעובי 200 מיקרומטר על ידי ויברטום.

1. יישור ראשוני

הערה: ודא שגודל הקרן והסטייה של שתי הזרועות מותאמים לרגישות ולרזולוציה הטובות ביותר. רכזו את המשאבה ואת קרני הסטוקס והתאימו את הגדלים שלהן לפני שהן נכנסות למיקרוסקופ סריקת הלייזר. לשם כך, השתמש בזוג עדשות אכרומטיות עבור כל קרן לפני שילובן על המראה הדיכרואית. הרכיב תמיד משקפי לייזר מתאימים ליישור קרן.

  1. התנגשות קרן
    1. התקן זוג עדשות אכרומטיות עבור קרן המשאבה. כנקודת התחלה, השתמש בעדשת 100 מ"מ ובעדשת 200 מ"מ כדי להגדיל את גודל קרן הלייזר פי 2. ודאו שהמרחק של שתי העדשות הוא כ-300 מ"מ. יישרו את קרן המשאבה דרך מרכז שתי העדשות.
    2. הניחו מראה אחרי העדשה השנייה כדי לשלוח את הקורה לכיוון הקיר (במרחק של >1 מ'). היזהר בעת שליחת הקרן למרחקים ארוכים. עקבו אחר הקורה מהמראה אל הקיר באמצעות כרטיס IR ובדקו אם הקרן משתנה בגודלה. רכז את הקרן אם הקרן משתנה בגודלה כפונקציה של מרחק.
      1. אם הקרן מתכנסת (הקטנת גודלה עם התפשטות), הזיזו את שתי העדשות קרוב יותר.
      2. אם הקרן מתפצלת (מגדילה את הגודל עם ההתפשטות), הרחיקו את שתי העדשות זו מזו. התאם את המרחק עד להתנגשות הקרן.
    3. חזור על שלבים 1.1.1 ו- 1.1.2 עבור קרן סטוקס כדי לרכז את הקורה.
  2. התאמת גודל הקרן
    1. אם פרופיל קרן זמין, מדוד את גודל הקרן המתנגשת עבור כל קרן. לחלופין, הערך את גודל הקרן באמצעות כרטיס IR וסרגל כדי לקבל קוטר קרן של 4-5 מ"מ.
    2. אם גודל הקרן קטן מדי או גדול מדי, שנה את זוג העדשות שבו נעשה שימוש בשלב 1.1. התאימו את זוג העדשות עד ששתי הקורות יהיו בקוטר של 4-5 מ"מ.
      הערה: הגדלת הקרן היא היחס בין אורך המוקד של העדשה השנייה לעדשה הראשונה (f2/f1).
  3. חפיפה מרחבית
    הערה: הדמיית SRS דורשת ששתי קרני הלייזר ישולבו במרחב ובזמן כדי לעורר תנודות מולקולריות. שרטוט של הדמיית ה-SRS הממוקדת בספקטרלית מוצג באיור 1.
    1. שלבו את שתי קרני הלייזר על ידי התקנת מראה דיכרואית עם מספר מראות היגוי להתאמה. מטב את החפיפה המרחבית של המשאבה ושל סטוקס על ידי ניטור אלומות אחרי המראה הדיכרואית בשתי עמדות שונות רחוקות זו מזו (כ-1 מ'). כוונון איטרטיבי של מראת ההיגוי לפני המראה הדיכרואית והמראה הדיכרואית כדי ליישר את קרן סטוקס עם קרן המשאבה.
      הערה: אם שתי הקורות חופפות מרחבית בשני המיקומים, הן חופפות מספיק.
    2. ודא שהקורות המשולבות נשלחות למרכז מראות הסריקה של מיקרוסקופ סריקת הלייזר על ידי התאמת זוג מראות היגוי כאשר מראות הסריקה נמצאות במצב החונה. ודא ששתי הקורות עוברות דרך מרכז מטרת המיקרוסקופ והמעבה.
    3. לאחר המעבה, השתמש בזוג עדשות נוסף עם אורכי מוקד של 100 מ"מ ו -30 מ"מ, בהתאמה, כדי להעביר את הקרן המועברת אל הפוטודיודה. ודא ששתי הקורות נמצאות בתוך הפוטודיודה והתקין שני מסננים במעבר נמוך כדי לחסום את קרן סטוקס המאופננת.

2. זיהוי אותות SRS

  1. אפנון אלקטרואופטי (EOM)
    הערה: EOM של 20 MHz משמש לווסת את המשרעת של סטוקס. כפי שיפורט בהמשך, ה-EOM נגזר מרכבת פולס הלייזר של 80 מגה-הרץ, הנדרשת לאפנון אורתוגונלי. ניתן להשתמש בתדרי אפנון אחרים אם מבוצע רק SRS בצבע יחיד או היפרספקטרלי. במקרה כזה, סינכרון של תדר אפנון לתדר לייזר הוא מיותר. ניתן להשתמש בגנרטור תדרים עם מגבר כוח RF כדי להניע את ה- EOM. כתוצאה מכך, ניתן לדלג על שלבים 2.1.1-2.1.4.
    1. הניחו דוגם קרן בנתיב הקרן של סטוקס כדי לקלוט 10% מהקרן ושלחו אותה לפוטודיודה מהירה כדי לזהות את רכבת הדופק של 80 מגה-הרץ.
      הערה: אות הפוטודיודה נשלח למחיצת תדרים כדי ליצור פלט TTL של 20 MHz. פלט זה נשלח גם למאגר מאווררים כדי לשכפל את הפלט לארבע יציאות זהות של 20 מגה-הרץ. אחד הפלטים משמש להפעלת האוסצילוסקופ.
    2. קח את אחד הפלטים של מאגר המאווררים וסנן אותו באמצעות מסנן bandpass כדי לקבל גל סינוסואידלי של 20 מגה-הרץ. השתמש במנחת RF כדי להתאים את מתח השיא לשיא של היציאה ל~ 500 mV.
    3. שלח את הפלט המתקבל למשנה פאזה, המאפשר התאמה עדינה של פאזת ה- RF עם מקור מתח. שלח פלט זה למגבר כוח RF וחבר את הפלט של המגבר ל- EOM.
    4. בטל את החסימה של קרן סטוקס ובצע אופטימיזציה של עומק המודולציה של EOM1 על ידי הצבת פוטודיודה בנתיב הקרן. התאימו את מתח ה-EOM ואת לוחית רבע הגל עד שעומק המודולציה (יחס עמק לשיא) ייראה משביע רצון.
      הערה: במודולציה של 20 מגה-הרץ (1/4 מקצב חזרת הלייזר), צפויים שני פולסים כל 50 ns.
  2. חפיפה זמנית
    הערה: חפיפה טמפורלית של המשאבה וסטוקס מושגת על ידי עיכוב אחת משתי רכבות פולס הלייזר עם רפלקטור רטרו המורכב על שלב השהיה (איור 1 מראה את הסטוקס מתעכב). חפיפה גסה מנוטרת עם האוסצילוסקופ, וחפיפה עדינה מנוטרת על ידי אות SRS. ניתן להשיג חפיפה טמפורלית עדינה גם עם מתאם אוטומטי במידת האפשר.
    1. הניחו פוטודיודה אחרי המראה הדיכרואית כדי לזהות את קרן הלייזר. חסום תחילה את הקורה של סטוקס. התקרבו לאחת משיאי דופק המשאבה באוסצילוסקופ. מקם סמן אנכי כדי לסמן את המיקום הזמני של שיא זה עם האוסצילוסקופ.
    2. חסום את קרן המשאבה ובטל את החסימה של קרן סטוקס. תרגם את שלב ההשהיה כך שיתאים באופן זמני את מיקום השיא באוסצילוסקופ למיקום המסומן בשלב הקודם. ראו איור 2 לתצוגה של החפיפה הזמנית של שתי אלומות.
      1. (אופציונלי) אם התרגום של שלב ההשהיה אינו מספיק כדי להתאים באופן זמני לשתי הקורות, הזז את שלב ההשהיה לאמצע טווח התנועה שלו.
      2. חשב את מרחק ההשהיה הנדרש כדי להתאים לשתי האלומות על ידי לקיחת ההפרש הזמני בין שתי האלומות והכפלת ההפרש במהירות האור כדי למצוא את כמות המרחק הדרושה כדי להתאים לשתי האלומות באופן זמני.
      3. להאריך את נתיב הקרן של הקרן המהירה יותר או לקצר את נתיב הקרן של הקרן האיטית יותר כדי להתאים בערך את ההשהיה הזמנית בהתאם.
    3. הכינו דגימת שקופיות של מיקרוסקופ עם DMSO וסרט דו-צדדי כמרווח כדי להחזיק את הדגימה בין השקופית לכיסוי.
    4. הניחו את הדגימה על המיקרוסקופ כשצד הכיסוי פונה אל מטרת המיקרוסקופ. שנה את המיקרוסקופ להארת שדה בהיר והתבונן בדגימה מהעינית. מצא את המוקד של הדגימה על ידי מציאת המוקד הן בשכבה העליונה והן בשכבה התחתונה של בועות האוויר בממשק הזכוכית-סרט, ולאחר מכן הזז את המיקוד להיות בין שתי שכבות הסרט.
      הערה: ודא שקרני הלייזר חסומות לפני שתסתכל לתוך העינית.
    5. הגדר את פלט הקרן הניתן לכוונון ל- 798 ננומטר. בהתבסס על התפוקה האופטית של המעבה, התאם את ההספק האופטי כך שיהיה ~ 40 mW כל אחד עבור המשאבה ואלומות סטוקס במוקד המטרה.
    6. פתח את ScanImage ב- MATLAB (או בתוכנת סריקה אחרת השולטת במיקרוסקופ) ולחץ על הכפתור שכותרתו FOCUS כדי להתחיל בסריקה.
      הערה: קרני הלייזר ייסרקו באמצעות רסטר דרך הדגימה כדי ליצור תמונה. יציאת האות בתדר נמוך מהפוטודיודה (<100 קילוהרץ) נשלחת ישירות לערוץ 1 של כרטיס איסוף הנתונים (המכונה ערוץ DC). פלט התדר הגבוה (>100 קילוהרץ) מהפוטודיודה נשלח לתוך מגבר הנעילה, ויציאת ה- X של אות מגבר הנעילה נשלחת לערוץ 2 של כרטיס רכישת הנתונים (המכונה ערוץ AC).
    7. התאם את מראת ההיגוי לפני סורק ה-galvo כדי למרכז את אות ה-DC בצג ערוץ 1. הזז את שלב ההשהיה הממונע וצפה מקרוב בפלט הנעילה המוצג בתצוגת ערוץ 2 (כלומר, ערוץ AC).
      הערה: כאשר המשאבה וסטוקס חופפים בזמן, אות יופיע בערוץ AC. כדאי להתאים את סולם הצבעים של ערוץ AC כדי להציג את שינוי העוצמה הקטן.
    8. מקסם את עוצמת האות AC על-ידי כוונון עדין של השהיית הזמן. התאם את המראה הדיכרואית למרכז אות ה- SRS בערוץ AC (תוך שמירה על ערוץ DC ממורכז). התאם את הפאזה של מגבר הנעילה כדי למקסם את האות. ראו איור 3 עבור אות משביע רצון.

3. אופטימיזציה של רזולוציה ספקטרלית

הערה: המשאבה ואלומות סטוקס המגיעות לדגימה צריכות לכלול את אותה כמות של פיזור השהיה קבוצתית (GDD) כדי למקסם את הרזולוציה הספקטרלית. הפיזור תלוי במידה רבה במערך הניסוי. המערך הניסיוני המתואר כאן משתמש בפולסים של femtosecond ב-1,040 ננומטר ו-800 ננומטר כ-Stokes ו-pump, בהתאמה. מוטות זכוכית צור צפופים (H-ZF52A) משמשים כמדיום מתיחת הדופק.

  1. הכנס 48 ס"מ של מוט זכוכית בעל פיזור גבוה (H-ZF52A או זכוכית צור צפופה שווה ערך) לנתיב הקורה של 800 ננומטר. הערך את ה- GDD באמצעות Eq (1):
    Equation 1 (1)
    הערה: GVD של חומרי זכוכית שונים באורכי גל שונים ניתן למצוא ממשאב מסד הנתונים של מקדם השבירה. לדוגמה, ל-H-ZF52A יש GVD של 220.40 fs2/mm ב-800 ננומטר. ה- GDD הכולל הוא 105792 fs2.
  2. חשב כמה ס"מ של מוט הזכוכית המפזר נדרש להוסיף לנתיב הקרן של 1,040 ננומטר כדי להתאים ל- GDD של המשאבה. הכנס את האורך המתאים של מוטות זכוכית מפוזרים לנתיב הקורה של 1,040 ננומטר כדי להתאים בערך ל- GDD של קרן 800 ננומטר. שים לב כי תוספת של מוטות זכוכית תשנה את החפיפה הטמפורלית של שתי הקורות, וייתכן שיהיה צורך בהתאמת העיכוב.
  3. כיול רזולוציה ספקטרלית
    1. הכינו דגימת שקופיות של מיקרוסקופ עם DMSO. הניחו את המגלשה על המיקרוסקופ ובדקו את עוצמת האלומות היוצאות מתוך מעבה המיקרוסקופ. התאם את ההספק בהתאם כך שיהיה ~ 40 mW כל אחד במיקוד לדוגמה.
    2. פתח את ScanImage מ- MATLAB. מצא את אות ה- SRS המרבי על ידי סריקה דרך שלב ההשהיה, המתאים לשיא 2,913 cm-1 Raman של DMSO. הערך את מיקום הבמה בהתבסס על מיקום השלב הקודם עם אורך הנתיב האופטי המוגבר עקב הכנסת מוטות. יישור מחדש את החפיפה המרחבית של הקרן בגלל הסטייה הקטנה של הקורה כאשר מוסיפים מוטות זכוכית.
    3. שמור סריקת SRS היפרספקטרלית על ידי צילום רציף של סדרה של תמונות SRS תוך כדי הזזת השלב הממונע.
      הערה: טווח סריקת ההשהיה מכסה שתי פסגות ראמאן, המקבילות לפסגות ראמאן של 2,913 ס"מ-1 ו-2,994 ס"מ-1 של DMSO, בהתאמה. שני מעברים אלה נצפים בעת שימוש במשאבה של 800 ננומטר ובלייזר סטוקס של 1,040 ננומטר.
    4. התווה את ספקטרום ה- SRS של פתרון ה- DMSO באמצעות ImageJ או MATLAB. התאם את הפסגה הגדולה של DMSO בגודל 2,913 ס"מ-1 לפונקציה גאוסית או לורנציאנית ב- MATLAB כדי לחשב את הרוחב המלא בחצי מקסימום (FWHM) של הפסגה.
      הערה: תוצאות מייצגות מוצגות באיור 4. אם קיימת רק פסגה רחבה אחת, משמעות הדבר היא שהרזולוציה הספקטרלית ירודה מכדי להבחין בין שתי הפסגות ונדרשים יותר מוטות זכוכית, או שהטווח הסרוק היה קטן מכדי לזהות את הפסגה השנייה. בדרך כלל, DMSO ברזולוציה ספקטרלית מקובלת הוא ~ 20-25 ס"מ-1 כאשר נעשה שימוש במוטות זכוכית באורך של >60 ס"מ. רזולוציה נמוכה יותר משמשת לעתים קרובות להדמיית רקמות כדי לסחור באותות גבוהים יותר עם פולסים קצרים יותר17.
  4. (אופציונלי) השתמש בקורלטור אוטומטי או ב- FROG (Gating אופטי שנפתר בתדר) כדי לקבוע את משך הפולס של כל זרוע כדי לחשב בדיוק את כמות ה- GDD ואת אורך המוטות הדרושים כדי להתאים את ה- GDD בין המשאבה לסטוקס.
  5. חזור על שלבים 3.3.2-3.3.3.4 עבור אורכי מוטות שונים בקרן סטוקס כדי למצוא את הרזולוציה הספקטרלית האופטימלית, מה שאומר שההתאמה הטובה ביותר ל- GDD נמצאה בניסוי. השתמש במספר קבוצות של מוטות זכוכית השונים באורכם כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית אופטימלית.

4. אפיון אות לרעש (SNR)

  1. ודא ששלב 4.2 מבוצע לאחר יישור מרחבי וזמני מלא.
  2. רכשו תמונת SRS המתאימה לשיא ראמאן של DMSO בגודל 2,913 ס"מ-1 . פתחו את התמונה ב-ImageJ ובחרו אזור קטן במרכז המסגרת. השתמש בפונקציית המדידה כדי לחשב את הממוצע וסטיית התקן של ערכים באזור שנבחר.
  3. חלק את הערך הממוצע של השטח שנבחר בסטיית התקן כדי למצוא את ערך ה- SNR, כמו ב- Eq (2).
    Equation 2 (2)
    הערה: SNR טוב עבור המערכת (עם קבוע זמן נעילה של 4 μs) באמצעות DMSO ב 40 mw / 40 mww במוקד עבור שתי הזרועות הוא >800. ניתן להשתמש בריכוזים נמוכים יותר של DMSO או בהספק נמוך יותר להערכה מדויקת יותר של ה- SNR אם לכרטיס רכישת הנתונים יש עומק סיביות מוגבל.
  4. אם ה-SNR נמוך מדי, התאם מחדש את פולסי הלייזר כדי למטב את החפיפה המרחבית, החפיפה הטמפורלית, התאמת גודל הקרן/ההתנגשות ו/או התאמת הפיזור. עבור מטרה עם צווארון תיקון סטייה, לייעל את האות על ידי התאמת צווארון התיקון.

5. כיול ציר התדר

הערה: שלב זה מבוצע כדי לקשר את מיקום שלב ההשהיה למעבר Raman הסרוק. בחירה זהירה של ממסים נדרשת כדי ליצור "שליט ראמאן" מתאים. DMSO הוא ממס יעיל לקשרי CH מכיוון שיש לו שתי פסגות ראמאן חדות ב-2,913 ס"מ-1 ו-2,994 ס"מ-1.

  1. שמור סריקה היפרספקטרלית עם טווח שלבי ההשהיה המכסה את פסגות ה-2,913 ס"מ-1 ו-2,994 ס"מ-1 של ה-DMSO . שמור את מיקומי הבמה המתאימים למערך הנתונים ההיפר-ספקטרלי.
    הערה: הפסגה המרבית העולמית של הספקטרום תואמת את העברת ההילוכים של DMSO 2,913 ס"מ-1 ראמאן והשיא המרבי השני מתאים להזזת DMSO 2,994 ס"מ-1 ראמאן.
  2. בצעו רגרסיה ליניארית לתנוחות הבמה והסטות ראמאן ב-2,913 ס"מ-1 ו-2,994 ס"מ-1. באמצעות משוואת הרגרסיה הליניארית הקושרת את מיקום הבמה להזזת ראמאן, המר את מיקומי ההשהיה לתדרי הראמן המתאימים.

6. אפנון אורתוגונלי והדמיה בשני צבעים

הערה: שלב המודולציה האורתוגונלית נחוץ רק כאשר יש צורך בהדמיה של שני צבעים בזמן אמת. סכמות של סכימה זו מוצגות באיור 5. המודולציה האורתוגונלית משתמשת בזוג EOMs המונעים ברבע מתדר הלייזר (20 מגה-הרץ ללייזר של 80 מגה-הרץ) עם שינוי פאזה של 90° בין השניים. ניתן לדלג על שלב אפנון אורתוגונלי זה להדמיית SRS בצבע יחיד או להדמיית SRS היפרספקטרלית.

  1. אפנון EOM1
    1. התקן PBS (PBS2), לוחית רבע גל (QWP2) ו- EOM שני (EOM2) לנתיב הקרן של סטוקס לאחר ה- EOM הראשון. נתק את כניסת האות ל- EOM2. חבר את קלט האות ל- EOM1 והפעל אותו.
    2. לווסת את קרן סטוקס (הקבועה ב-1,040 ננומטר) ב-20 מגה-הרץ (f0/4) על-ידי שליחת הקרן דרך ה-EOM הראשון. התאם את ההטיה והמיקום של EOM1 כדי להבטיח שהקרן פוגעת ישר ומרוכזת דרך גביש EOM.
    3. עקוב אחר עומק המודולציה על ידי התבוננות בשני הקיטובים היוצאים מ- PBS1 עם שני פוטודיודים והצגת המודולציה על אוסצילוסקופ.
    4. התאם את ה- QWP1, מתח EOM1 והפאזה של הכניסה של 20 MHz (באמצעות מעביר פאזה) כדי למטב את עומק המודולציה של הקרן המועברת כך שיהיה קרוב ל- 100%. ראו איור 2B להמחשה של עומק אפנון טוב.
  2. אפנון EOM2
    1. נתק את EOM1 וחבר את EOM2.
    2. שלח את יציאת המתח הגבוה של המגבר השני ב-20 מגה-הרץ ל-EOM2. התאם את ההטיה והמיקום של EOM2 כדי להבטיח שהקרן פוגעת ישר ומרוכזת דרך גביש EOM.
    3. שוב, עקוב אחר עומק המודולציה על ידי התבוננות בשני הקיטובים היוצאים מ- PBS2 באמצעות אוסצילוסקופ. התאם את QWP2, מתח EOM2 ומעביר הפאזה לפי הצורך כדי להשיג אפנון קרוב ל-100% עבור שני הקיטובים.
    4. ודא שלמודולציית רכבת הדופק יש שינוי פאזה של 90° מהמודולציה הראשונה.
      הערה: אם שתי רכבות הדופק של המשאבה אינן אורתוגונליות של 90°, הצלבה בין שני הערוצים תהיה בעיה.
    5. בדוק את האורתוגונליות של המודולציה על ידי הפעלה וחיבור של EOM1 ו- EOM2. עקוב אחר שני הקיטובים המתפצלים על ידי PBS2 באמצעות אוסצילוסקופ. השתמשו מחדש ב-EOM1 וב-EOM2 בנפרד אם רכבת הדופק אחרי ה-PBS השני אינה דומה לאיור 2C.
    6. התקן גביש קוורץ דו-פרצופי של 20 מ"מ (BRC) ו- HWP במורד הזרם של EOM2. חברו את שני ה-EOMs בבת אחת ועקבו אחר רכבת הדופק כך שהיא תדמה לאיור 2D.
      הערה: עבור הציוץ ששימש בניסוי זה, 20 מ"מ BRC גורם לעיכוב זמן המתאים להסטת ראמאן של 80 ס"מ-1 . ייתכן שיהיה צורך באורך BRC שונה אם נעשה שימוש בציוץ אחר.
  3. כיול
    1. כיול המערכת באמצעות DMSO על ידי זיהוי אותות מיציאת ערוץ הנעילה X ו- Y (נשלח לערוצים 2 ו-3 של כרטיס רכישת הנתונים).
    2. בדוק אם האותות הנוצרים על ידי שיא 2,913 ס"מ-1 מהקיטוב המהיר יותר וכי מהקיטוב האיטי יותר קרובים ל-90° מחוץ לפאזה במגבר הנעילה. אם זה לא המקרה, התאם את יישור ה- EOM עד ששני האותות קרובים ל- 90° מחוץ לפאזה.
    3. לאחר השלמת הכיול, מצאו את מיקום ההשהיה הבוחן את מעבר החלבון ב-2,930 ס"מ-1 עבור אחת מהקורות האורתוגונליות. ודא שהקיטוב האחר בוחן את מעבר השומנים של 2,850 ס"מ-1.

7. הדמיית SRS במצב אפי

הערה: בסכמת ההדמיה של מצב השידור, המטרה ממקדת את הלייזר לתוך הדגימה, ולאחר מכן עדשת מעבה מכוונת את הקרן המועברת לפוטודיודה לצורך זיהוי נעילה. בסכמת ההדמיה של האפי-מוד, אור שנפגע לאחור ומדה-פולריזציה על ידי הדגימה נזכר על ידי מטרת המיקוד ומבודד באמצעות מפצל קרן מקטב. הפוטונים המבודדים והמסוגננים נשלחים לפוטודיודה דרך זוג עדשות ממסר לזיהוי נעילה. איור 6 מתאר את ערכת ההדמיה של מצב האפי.

  1. התקן HWP לפני שהקרן נכנסת למיקרוסקופ כדי לשנות את הקיטוב של הקרן הנכנסת למיקרוסקופ. מקם PBS מעל המטרה כדי לאפשר לקרן המוחזרת לאחור המדה-קוטבית להגיע לגלאי.
  2. השתמש בזוג עדשות המורכבות מעדשת אכרומט 75 מ"מ ועדשה אספרית של 30 מ"מ כדי להעביר את הפוטונים האחוריים מהפתח האחורי של המטרה אל הפוטו-דטקטור. הרכיבו את הגלאי כדי לאסוף את האור האחורי המכוון על ידי ה-PBS. התקן מסנן כדי לחסום את הקרן המאופננת מלהיכנס לגלאי.
  3. מקם את דגימת הרקמה תחת המטרה. מכיוון שהמעבה אינו נחוץ להדמיה במצב אפי, הסר אותו אם נדרש מקום נוסף.
  4. דימות
    1. חסום את הקורה עם תריס; להאיר מקור אור לבן על הדגימה מהצד; ולהשתמש ב-brightfield כדי למצוא מיקוד אובייקטיבי.
    2. שחררו את החסימה משתי הקורות והשתמשו במיקומי ההשהיה המכוילים מראש כדי להשיג תמונות SRS של שומנים וחלבון מרקמה משתי היציאות של מגבר הנעילה.
    3. התאם את רווח הנעילה ואת גורם סל הפיקסלים כדי להשיג תמונות באיכות טובה.

8. צביעה בצבע כוזב

  1. פתח את ערימת התמונות באמצעות ImageJ.
  2. שלף את שתי התמונות המתאימות למיני השומנים (2,850 ס"מ-1) והחלבון (2,930 ס"מ-1) על ידי לחיצה ימנית על התמונה ולחיצה על שכפול.
  3. שנה את שם תמונת השומנים לשומנים ואת תמונת החלבון לחלבונים.
  4. עבור אל תהליך | תמונה מחשבון ולבצע חלבונים לחסר שומנים.
  5. שלב את התמונות על-ידי מעבר אל תמונה | | צבע מיזוג ערוצים, הגדרת שומנים לירוקים וחלבונים לכחולים. פתיחת הכלי לערוצי תמונות (תמונה | | צבע כלי ערוצים) והתאמת הבהירות והניגודיות (תמונה | התאמת | בהירות/ניגודיות).
  6. התאם את הבהירות והניגודיות עבור כל ערוץ באמצעות כלי הערוצים . עבור תעלת השומנים, התאם את הניגודיות עד שתכונות התאים ייראו כהות. עבור תעלת החלבון, התאם את הניגודיות עד שתכונות התאים יופיעו כחולות. המרת תמונת הערוץ הממוזגת בירוק/כחול לתמונת RGB על-ידי מעבר אל תמונה | סוג | צבע RGB. ייצא תמונה זו לפי קובץ | שמור כ| טיף.
    הערה: עבור צביעת H&E שגויה, ערכת הצבעים מציגה ציטופלסמה ורודה, בעוד שהגרעינים הם כחולים-סגולים כהים.
  7. הורד את הסקריפט HE.m MATLAB ממשאב הסקריפט הכוזב H&E מכתים את טבלת החומרים.
  8. הפעל את הסקריפט HE.m ב- MATLAB. בחר את תמונת RGB המיוצאת מהשלב הקודם כדי ליצור תמונה מוכתמת באופן מלאכותי ב- H&E.
  9. (אופציונלי) נרמל את עוצמת התמונה להדמיית שדה ראייה גדול מכיוון שהתמונה נראית כהה יותר בפריפריה מאשר במרכז.
    1. כדי לבצע נורמליזציה של השדות של התמונות, ממוצע תמונות רבות ככל האפשר. לאחר מכן, הסר את תכונות העוצמה עם ImageJ (תהליך | מסננים | טשטוש גאוסיאן | רדיוס=50).
    2. מדוד את העוצמה המרבית של התמונה המטושטשת (Ctrl+M). חלקו את התמונה המטושטשת בעוצמה המרבית (תהליך | | מתמטיקה לחלק). חלק את תמונת ה-SRS הגולמית בתמונה המטושטשת (תהליך | תמונה | מחשבון).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אופטימיזציה של רזולוציה ספקטרלית:
פיזור דרך חומר מושפע ממדיום הפיזור (אורך וחומר) ומאורך הגל. שינוי אורך מוט הפיזור משפיע על הרזולוציה הספקטרלית ועל גודל האות. זוהי מערכת יחסים של תן וקח שניתן לשקול באופן שונה בהתאם ליישום. המוטות מותחים את פולס הקרן מלהיות רחב בתדר וצר בזמן להיות צר בתדר ורחב בזמן. איור 7 מראה את ההשפעה של אורכי מוט משתנים על הרזולוציה הספקטרלית. איור 7A מדגים רזולוציה ספקטרלית ירודה מאוד; במערך זה אין מוטות ציוץ זכוכית, ושתי פסגות ראמאן מ- DMSO אינן נפתרות כלל. באיור 7B,C, עלייה במספר מוטות הציוץ מזכוכית מתחילה לפתור את שתי הפסגות. לבסוף, איור 7D מראה כיצד ציוץ תואם פותר את שתי הפסגות וניתן להשתמש בו כדי לכייל את מיקומי הבמה לתדר.

כיול עם DMSO:
ל-DMSO יש שתי פסגות ראמאן חדות ב-2,913 ו-2,994 ס"מ-1 הנוחות לכיול באזור C-H. ברגע שספקטרום DMSO מתקבל מסריקת SRS היפרספקטרלית, רגרסיה ליניארית פשוטה ממירה את מיקום הבמה להזזת ראמאן. אם הרזולוציה הספקטרלית גרועה (כפי שמוצג באיור 7A) ושתי הפסגות אינן ניתנות להפרדה, אז כיול עם רגרסיה ליניארית הוא בלתי אפשרי. במקרה זה, יש צורך בהתאמת פיזור טובה יותר על ידי הוספה או הסרה של מוטות זכוכית. הקשיים הנפוצים ביותר במציאת אות DMSO לכיול נובעים משגיאות בחפיפה טמפורלית או בחפיפה מרחבית של שתי האלומות. לפני שתנסה כיול DMSO, חזור על שלבי היישור המרחביים והזמניים כדי למטב את אות ה- SRS.

DMSO בשני צבעים:
ב- SRS בשני צבעים, שתי רכבות פולס משאבה נוצרות עם קיטוב אורתוגונלי עם עיכוב זמן קבוע (עקב גביש דו-מפרפר). הערכה של עומק אפנון והסטת פאזה של 90° נעשית עם פוטודיודה ואחריה אות DMSO SRS. איור 8 מדגים עומק אפנון מקובל והפרדה זמנית. אף על פי שהרזולוציה הספקטרלית של DMSO באיור 8 אינה אידיאלית, לעתים קרובות היא מוקרבת בניסויי הדמיית רקמות כדי להשיג אות גבוה יותר עם פולסים קצרים יותר. איור 9 מדגים שינויי פאזה גרועים שמעוררים פסגות הפוכות או שליליות.

SRS דו-צבעי של רקמת המוח של העכבר במצב אפי:
מצב אפי (זיהוי פוטונים אחוריים) SRS משמש להדמיית רקמה עבה (>1 מ"מ). איור 10A,B מדגים הדמיית SRS דו-צבעית בזמן אמת ב-2,850 ס"מ-1 ו-2,930 ס"מ-1 של רקמת המוח של עכבר ex vivo. התמונות הגולמיות מתעלות השומנים והחלבון (איור 10A,B) היו מקודדות בצבע כדי לייצר תמונה אחת המתארת את תרומת השומנים והחלבונים (איור 10C). צביעת H&E מזויפת בוצעה (איור 10D) באיור 10C כדי לחקות את צביעת H&E. איכות הדמיה ירודה יכולה להיות תוצאה של עומק הדמיה גדול או כיול לקוי (ציר תדרים או עומק אפנון). עומק ההדמיה הטיפוסי ברקמת המוח הוא 100-200 מיקרומטר13.

Figure 1
איור 1: שרטוט של הגדרת הדמיית SRS בצבע אחד. בניית מיקרוסקופ SRS ממוקד ספקטרלי במצב שידור. X ו- Y מייצגים את הפלטים האורתוגונליים. קיצורים: SRS = פיזור ראמאן מגורה; DL = קו השהיה מבוסס רטרו-רפלקטור; Div = מחיצה; FB = מאגר מניפות; AT = מנחת; PS = מעביר פאזה; PA = מגבר כוח; DCM = מראה דיכרואית; GM = מראות גלבו; EOM = אפנן אלקטרואופטי; POM = מראה פיק-אוף; PBS = מפצל קרן מקטב, BRC = גביש דו-פרצופי; QWP = צלחת רבע גל; HWP: צלחת חצי גל; PD = פוטודיודה; GR = מוט זכוכית; BB = בלוק קרן; SPF = מסנן פסים קצרים; CL = עדשת התנגשות; BS = עדשת שינוי גודל קרן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: חפיפה טמפורלית מייצגת. (A) המשאבה ואלומות סטוקס נראות חופפות באופן זמני על האוסצילוסקופ. סמני אוסצילוסקופ משמשים לסימון המיקומים הזמניים של המשאבה וקורות סטוקס. חפיפה זו משביעת רצון כנקודת התחלה לשינוי נוסף של החפיפה הזמנית עם שלב ההשהיה. (B) עומק אפנון מייצג משביע רצון של EOM אחד ב- 20 MHz. (C) אפנון פולסים משביע רצון בזמן ששני EOMs נמצאים בשימוש. (D) אפנון משביע רצון של רכבת פולסים לאחר גביש קוורץ דו-פרצופי והתקנת צלחת חצי גל על זרוע סטוקס המאופננת כפליים. קיצור: EOM = אפנן אלקטרואופטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: SRS מייצג ואותות משאבה. (A) אות משאבה לא מיושר שזוהה בערוץ DC. (B) אות SRS לא מיושר שזוהה על ידי פוטודיודה. (C) אות משאבה משביע רצון ומרוכז בתעלת DC. (D) אות SRS משביע רצון שבמרכזו ערוץ AC. קיצור: SRS = פיזור ראמאן מגורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: אפיון רזולוציה ספקטרלית. פונקציה של גאוס הייתה מתאימה לשיא 2,913 ס"מ-1 ראמאן DMSO. ה- FWHM המחושב נתן רזולוציה של 15 ס"מ-1 עבור המערכת. קיצורים: DMSO = דימתיל סולפוקסיד; FWHM = רוחב מלא בחצי מקסימום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: שרטוט של מערך הדמיית SRS בשני צבעים. בניית מיקרוסקופ SRS בשני צבעים במצב שידור. X ו- Y מייצגים את הפלטים האורתוגונליים. קיצורים: DL = קו השהיה מבוסס retroreflector; Div = מחיצה; FB = מאגר מניפות; AT = מנחת; PS = מעביר פאזה; PA = מגבר כוח; DCM = מראה דיכרואית; GM = מראות גלבו; EOM = אפנן אלקטרואופטי; PBS = מפצל קרן מקטב; BRC = גביש דו-פרצופי; QWP = צלחת רבע גל; HWP = צלחת חצי גל; PD = פוטודיודה; GR = מוט זכוכית; BB = בלוק קרן, SPF = מסנן פס קצר; CL = עדשת התנגשות; POM = מראה פיק-אוף; BS = עדשת שינוי גודל קרן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: שרטוט של הגדרת מצב אפי של הדמיית SRS בשני צבעים. בניית מיקרוסקופ SRS בשני צבעים במצב אפי. X ו- Y מייצגים את הפלטים האורתוגונליים. קיצורים: DL = קו השהיה מבוסס retroreflector; Div = מחיצה; FB = מאגר מניפות; AT = מנחת; PS = מעביר פאזה; PA = מגבר כוח; DCM = מראה דיכרואית; GM = מראות גלבו; EOM = אפנן אלקטרואופטי; PBS = מפצל קרן מקטב; BRC = גביש דו-פרצופי; QWP = צלחת רבע גל; HWP = צלחת חצי גל; PD = פוטודיודה; GR = מוט זכוכית; BB = בלוק קרן, BPF = מסנן פס פס; CL = עדשת התנגשות; POM = מראה פיק-אוף; BS = עדשת שינוי גודל קרן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: אופטימיזציה של הרזולוציה הספקטרלית עם 25% DMSO. (A) מוטות ציוץ זכוכית אפסיים שימשו להשגת ספקטרום ה-DMSO. שתי הפסגות אינן נפתרות. (B) נעשה שימוש במוטות ציוץ מזכוכית, 20 ס"מ על זרוע המשאבה ו-24 ס"מ על זרוע סטוקס. שתי פסגות מתחילות להיפתר עד לנקודה משביעת רצון. (C) נעשה שימוש במוטות ציוץ, משאבה באורך 40 ס"מ וסטוקס באורך 24 ס"מ, כדי להשיג ספקטרום DMSO פתור טוב יותר. (D) נעשה שימוש במוטות ציוץ, משאבה באורך 64 ס"מ וסטוקס באורך 60 ס"מ, כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית גבוהה יותר. קיצור: DMSO = דימתיל סולפוקסיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 8
איור 8: SRS בשני צבעים, קיטוב משתנה ועיכוב בזמן. שתי רכבות פולסים מושהות בזמן של קיטוב אורתוגונלי (s&p) משמשות לצילום ספקטרום DMSO כדי להראות את השהיית הזמן (ואת הפרש התדרים של ראמאן) בין עירורי ה-SRS. קיצורים: DMSO = דימתיל סולפוקסיד; SRS = פיזור ראמאן מגורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 9
איור 9: ספקטרום SRS הנובע מהסטת פאזה גרועה של SRS בשני צבעים. שיא שלילי של 2,994 ס"מ-1 בסמוך למיקום שלב 48 מעיד על הפרש פאזות נמוך. קיצור: SRS = פיזור ראמאן מגורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 10
איור 10: יצירת צביעת H&E מזויפת בשני צבעים של תמונות SRS. (A) תמונת SRS של חלבון גולמי מרקמת מוח של עכבר במעבר של 2,930 ס"מ-1 . (B) תמונת SRS שומנית גולמית מרקמת המוח של העכבר במעבר של 2,850 ס"מ-1 . (C) ערוצים ממוזגים ומקודדים בצבעים מ-A ו-B עם תרומת שומנים ליפידים בירוק ובתרומת חלבונים בכחול. (D) צביעה מחדש של H&E שגויה בוצעה ב-C כדי לחקות את צביעת H&E עבור יישומים פתולוגיים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: SRS = פיזור ראמאן מגורה; H&E = המטוקסילין ואוזין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ערכת ההדמיה של SRS בשני צבעים המוצגת בפרוטוקול זה תלויה ביישום נכון של הדמיית SRS בצבע אחד. בהדמיית SRS בצבע אחד, השלבים הקריטיים הם יישור מרחבי, יישור זמני, עומק אפנון והסטת פאזה. שילוב מרחבי של שתי הקורות נעשה על ידי מראה דיכרואית. מספר מראות היגוי משמשות להתאמה עדינה בעת שליחת הקורות למראה הדיכרואית. לאחר שילוב הקורות עם המראה הדיכרואית, ניתן לאשר יישור מרחבי על ידי בחירת נתיב הקרן המשולב עם מראה כדי לשלוח לעבר קיר במרחק של >1 מ 'תוך בדיקת הקרן המשולבת כדי לראות אם היא חופפת לכרטיס IR. לאחר יישור מרחבי באמצעות המיקרוסקופ, החפיפה הטמפורלית מתבצעת על ידי התאמת אורך הנתיב לשלב השהיה מבוסס רטרו-רפלקטור, שיש לו את היתרון של שמירה על יישור מרחבי. זרוע ה-1,040 ננומטר היא הקרן המושהית בפרוטוקול זה. חפיפה טמפורלית אינה אפשרית אם לשלב ההשהיה אין את הטווח לגרום לשתי הקורות לחפוף באופן זמני. במקרה כזה, ייתכן שיהיה צורך להעביר את כל שלב ההשהיה למיקום אחר כדי להבטיח שהחפיפה הזמנית קרובה לטווח הסריקה של אמצע ההשהיה. לדוגמה, אם ההפרש הזמני בין שתי הקורות נמדד כ-6 ננו-נס, נדרש 1.8 מ' של התאמה. ההתאמה הנדרשת מציינת את אורך התארכות נתיב הקרן עבור הקרן המהירה יותר או את קיצור נתיב הקרן עבור הקרן האיטית יותר.

מלבד היישור, התאמת גודל הקרן והמודולציה של קרן סטוקס חשובים גם כדי למקסם את אות ה- SRS. באופן אידיאלי, שתי הקורות צריכות להתקבץ במישור האובייקטיבי ולהתאים לגודל הצמצם האחורי האובייקטיבי. כדאי לבדוק את האיסוף ואת גודל הקרן אם המישור האובייקטיבי חשוף למשתמש. אם הקרן מתכנסת או מתפצלת, יש צורך להתאים את העדשה השנייה של זוג עדשות הקולימציה כדי להשיג קולימציה (שלב פרוטוקול 1.1). באופן דומה, אם גודל הקרן קטן מדי בצמצם האחורי האובייקטיבי, יש להשתמש בזוג עדשות עם הגדלה גבוהה (שלב פרוטוקול 1.2). SRS משתנה באופן ליניארי עם עומק המודולציה של קרן סטוקס. חשוב לוודא שגובה הדופק בעמק <10% מגובה הדופק בשיאו באוסצילוסקופ. אפנון לקוי של קרן סטוקס מתורגם ישירות ל- SNR גרוע.

בעת שימוש בלייזרים femtosecond להדמיית SRS, יש צורך במיקוד ספקטרלי כדי להמיר את השהיית הזמן בין המשאבה לסטוקס לשינוי תדר ראמאן. גורם ההמרה תלוי בכמות הציוץ שהוחלה. זה קריטי להתאים את ה- GDD של המשאבה ואת סטוקס כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית אופטימלית. ניתן להעריך את ה- GDD בהתבסס על אורך חומר הפיזור שבו נעשה שימוש וה- GVD שלו. לדוגמה, למוט זכוכית הצור הצפוף SF11 יש GVD של 123.270 fs2/מ"מ ב-1,040 ננומטר ו-187.486 fs2/מ"מ ב-800 ננומטר. עבור 240 מ"מ של SF11 בנתיב הקרן של 800 ננומטר, GDD הוא 240 מ"מ × 187.486 fs2/mm = 45,000 fs2. עבור 240 מ"מ של SF11 בנתיב הקרן של 1,040 ננומטר, ה- GDD הוא 240 מ"מ × 123.270 fs2/mm = 30,000 fs2. חישוב לדוגמה זה אומר שיש להוסיף מוטות זכוכית נוספים לזרוע של 1,040 ננומטר, או להסיר מוטות זכוכית מזרוע 800 ננומטר כדי להתאים ל- GDD. כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית גבוהה יותר, נדרש GDD גדול יותר, כלומר מוטות ארוכים יותר. עם זאת, בחישוב ה- GDD, התרומות של ה- EOM והמטרה הוזנחו. ההתאמה בפועל של GDD נקבעת באופן ניסיוני על ידי מציאת הרזולוציה הספקטרלית הטובה ביותר עבור אורכי המוט הנתון במשאבה או בסטוקס. החישובים משמשים כשלב התחלה טוב. אופטימיזציה ניסיונית באמצעות הוספה איטרטיבית והסרה של מוטות זכוכית עדיין נחוצה כדי לייעל את הרזולוציה הספקטרלית.

חשוב להבין כי ציוץ גדול מספק רזולוציה ספקטרלית גבוהה יותר אך על חשבון עוצמת האות. ציוצים קטנים יותר ופולסים קצרים יותר מועילים להדמיית רקמות באזור C-H מכיוון שפסגות החלבון והשומנים ראמאן רחבות. ניתן לסחור ברזולוציה ספקטרלית נמוכה יותר עבור אות SRS גבוה יותר (או מהירות הדמיה גבוהה יותר) מבלי לוותר על ניגודיות רקמה בשני צבעים17. ביישומים אחרים שבהם יש צורך ברזולוציה ספקטרלית גבוהה, במיוחד באזור טביעת האצבע, יש צורך להחיל ציוץ גדול יותר באמצעות מוטות זכוכית ארוכים. לחלופין, ייתכן שיהיה קל יותר להשתמש באלונקות סורגים כדי להשיג פולסים ארוכים יותר (עבור משך הדופק הארוך מ-3 ps). עם זאת, מגבלה עיקרית אחת של הלייזר המסחרי המנוצל היא רוחב הפס הספקטרלי שלו. הכיסוי הספקטרלי של SRS המתמקד בספקטרלי תלוי ברוחב הפס של לייזרי העירור. למערכת הלייזר המשומשת יש כיסוי ספקטרלי בדרך כלל סביב 200-250 ס"מ-1. זה בקושי מספיק כדי לכסות את אזור C-H. בדרך כלל יש צורך בכיסוי ספקטרלי גדול יותר כדי לפתור מינים כימיים להדמיה באזור טביעת האצבע. ניתן לטפל בבעיה זו באמצעות תוסף לייזר סיבים המרחיב את רוחב הפס של לייזר סטוקס מ-6 ננומטר ל-60 ננומטר18. מגבלה חשובה נוספת לטכניקת ההדמיה של SRS בשני צבעים היא שרק שני מעברים מנוטרים. גישה זו לא תתאים לדגימות מורכבות עם פסגות ראמאן חופפות רבות או מינים מרובים.

שיטת ההדמיה של SRS בשני צבעים בזמן אמת מאפשרת הדמיית רקמות במהירות גבוהה על ידי הסרת הצורך בלייזר או בכוונון השהיה. עם זאת, קשה להגדיר אותו בשל האתגרים בהשגת עומק אפנון כמעט מושלם עבור שני ה- EOMs. עדיף לייעל את EOM1 ו- EOM2 באופן עצמאי. אם EOM1 מופעל, אז EOM2 חייב להיות מנותק ולהיפך. לאחר ששני המודולציות ממוטבות לכמעט שלמות (עומק אפנון >95%), שני ה-EOMs מחוברים כדי לאפשר אפנון אורתוגונלי. משך השהיית הזמן בין שתי רכבות הדופק האורתוגונליות תלוי באורך ה-BRC ובציוץ. שיטת אפנון זו אינה אפשרית באופן מיידי עבור יישומים קליניים מכיוון שנדרשות אלקטרוניקה מורכבת כדי לספק שתי רכבות פולס RF עם שינוי פאזה הניתן לכוונון כדי להניע את שני ה- EOMs. היישור של ה-EOM צריך גם להיות כמעט מושלם כדי להבטיח שידור גבוה, אפנון טוב ואורתוגונליות בין שני הערוצים. טכניקה זו ישימה בדרך כלל ליישומים אחרים הדורשים הדמיה מהירה ובו זמנית של שתי פסגות ראמאן עקב שינויים בתנועה או בדגימה. דוגמאות לכך כוללות מדידות טמפרטורת מים או מעקב אחר עצמים נעים כגון טיפות שומנים או אברונים11,19.

לייזר סיבים חזק נדרש ליישומים קליניים עתידיים4. ניתן להרחיב את הגישה המתוארת על ידי הפרוטוקול גם כדי לשפר את מהירות הרכישה עד לקצב הווידאו, שחשוב לסרוק דגימות רקמות גדולות תוך זמן סביר. אם זמן ההדמיה או תוצרי התנועה אינם מהווים דאגה, ניתן לרכוש תמונות SRS של חלבונים ושומנים ברצף על ידי הזזת שלב ההשהיה הממונע פריים אחר מסגרת. שיטת הדמיה נוספת של SRS בשני צבעים בזמן אמת היא סכימה דו-פאזית הממחזרת את קרן סטוקס כדי לספק את אותם שני ערוצים אורתוגונליים20. עם זאת, יישום התוכנית הדו-פאזית דורש יישור נוסף הכולל שלוש אלומות. זה גם דורש התאמה של גודל הקרן והסטייה של שלוש קרני לייזר. דרך פוטנציאלית לשיפור שתי הטכניקות כדי להתגבר על מגבלת שני הצבעים בו-זמנית היא שילוב של לייזר סיבים הניתן לכוונון מהיר כדי לחקור אזורים ספקטרליים ספציפיים21. עיבוד התמונות זהה לתיאור בפרוטוקול כדי ליצור תמונות H&E מדומות.

לבסוף, פרוטוקול זה מדגים הדמיית SRS במצב אפי. בדרך כלל הוא מייצר תמונות באיכות נמוכה יותר בהשוואה להדמיית מצב שידור עבור מקטעי רקמה דקים בגלל הספק המשאבה הנמוך יותר שמגיע לגלאי13. עבור הדמיית רקמות עבות (>1-2 מ"מ) או דגימות בעלות פיזור גבוה (למשל, רקמת עצם), הדמיה במצב אפי יכולה לתפקד טוב יותר מהדמיה במצב העברה. בעת הדמיה של רקמות טריות כגון רקמת מוח, עומק ההדמיה של SRS מוגבל בדרך כלל ל-200-300 מיקרומטר. עבור רקמות קבועות, הפיזור חזק יותר, ועומק ההדמיה הוא 100-200 מיקרומטר. הדמיה עמוקה יותר יכולה להיות מושגת עם הספק גבוה יותר, תיקון סטייה או ניקוי אופטי22,23. עם זאת, הדמיה במצב אפי היא גישה עדיפה לאבחון רקמות מכיוון שהיא אינה דורשת כל חיתוך רקמה, והיישור פשוט יותר ללא מעבה NA גבוה. יישומים עתידיים לאבחון רקמות ייהנו מהדמיה מהירה בשטח גדול על דגימות כירורגיות שלמות ולאחר מכן מאבחנה מבוססת למידת מכונה/למידה עמוקה. הפרוטוקול המוצג כאן מתאים גם ליישומי in vivo, כגון הדמיית מוח או הדמיית עור, שבה הדמיה במצב אפי היא האפשרות היחידה, והדמיה במהירות גבוהה חשובה כדי למנוע תוצרי תנועה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי NIH R35 GM133435 עד D.F.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Achromatic Lens THORLABS AC254-100-B Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter Minicircuits BBP-21.4+ Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens THORLABS AC254-200-B Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate Union Optic WPA2210-650-1100-M25.4 Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate Union Optic WPA4210-650-1100-M25.4 Broadband quarter waveplate
Beam Sampler THORLABS BSN11 10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror THORLABS DMSP1000 Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich 472301 Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator THORLABS EO-AM-NR-C1 Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script Matlab https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer PRL-414B Pulse Research Lab 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode THORLABS DET10A2 Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider PRL-220A Pulse Research Lab TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods Union Optic CYLROD01 High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+ Newport Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz. 
Lock-in Amplifier Liquid Instruments Moku Lab Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors THORLABS BB05-E03-10 Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage Zaber X-DMQ12P-DE52 Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor Nikon CSC1003 1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope Tektronix TDS7054 Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter SigaTek SF50A2 For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode Hamamatsu Corp S3994-01 Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter Union Optic PBS9025-620-1000 Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database refractiveindex.info
Retro-reflector Edmund Optics 34-408 BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier Minicircuits ZHL-1-2W+ Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors Cambridge Technologies 6215H We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage Vidrio ScanImage Basic Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter THORLABS FESH1000 25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope Nikon Eclipse FN1 Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective Olympus XLPLN25XWMP2 The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  2. Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
  3. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  4. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027 (2017).
  5. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  6. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  7. Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392 (2019).
  8. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  9. Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
  10. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  11. Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  14. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  15. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  16. Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).
  17. Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750 (2017).
  18. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  19. Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
  20. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  21. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  22. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  23. Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 180
בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Espinoza, R., Wong, B., Fu, D.… More

Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis. J. Vis. Exp. (180), e63484, doi:10.3791/63484 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter