Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose

Summary

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.

Abstract

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is naar voren gekomen als een krachtige optische beeldvormingstechniek voor weefseldiagnose. In de afgelopen jaren is aangetoond dat tweekleurige SRS in staat is om hematoxyline- en eosine (H & E) -equivalente beelden te leveren die een snelle en betrouwbare diagnose van hersenkanker mogelijk maken. Een dergelijk vermogen heeft spannende intraoperatieve kankerdiagnosetoepassingen mogelijk gemaakt. Tweekleurige SRS-beeldvorming van weefsel kan worden gedaan met een picoseconde of femtoseconde laserbron. Femtoseconde lasers hebben het voordeel dat ze flexibele beeldvormingsmodi mogelijk maken, waaronder snelle hyperspectrale beeldvorming en real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming. Een spectraal-focusbenadering met getjilpte laserpulsen wordt meestal gebruikt met femtosecondelasers om een hoge spectrale resolutie te bereiken.

Tweekleurige SRS-acquisitie kan worden gerealiseerd met orthogonale modulatie en lock-in detectie. De complexiteit van pulsgefluit, modulatie en karakterisering is een knelpunt voor de wijdverspreide toepassing van deze methode. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om de implementatie en optimalisatie van spectraal-gerichte SRS en real-time, tweekleurige beeldvorming van hersenweefsel van muizen in de epi-modus te demonstreren. Dit protocol kan worden gebruikt voor een breed scala aan SRS-beeldvormingstoepassingen die gebruikmaken van de hoge snelheid en spectroscopische beeldvormingsmogelijkheden van SRS.

Introduction

Traditionele weefseldiagnostiek is gebaseerd op kleuringsprotocollen gevolgd door onderzoek onder een optische microscoop. Een veel voorkomende kleuringsmethode die door pathologen wordt gebruikt, is H & E-kleuring: hematoxyline kleurt celkernen een paarsblauw en eosine kleurt de extracellulaire matrix en cytoplasma roze. Deze eenvoudige kleuring blijft de gouden standaard in de pathologie voor veel weefseldiagnosetaken, met name kankerdiagnose. H&E-histopathologie, met name de bevroren sectietechniek die wordt gebruikt in een intraoperatieve setting, heeft echter nog steeds beperkingen. De kleuringsprocedure is een moeizaam proces waarbij weefsel wordt ingesloten, sectie, fixatie en kleuring¹. De typische doorlooptijd is 20 minuten of langer. Het uitvoeren van H & E tijdens bevroren secties kan soms een grotere uitdaging worden wanneer meerdere secties tegelijk worden verwerkt vanwege de noodzaak om cellulaire kenmerken of groeipatronen in 3D te evalueren voor margebeoordeling. Bovendien vereisen intraoperatieve histologische technieken bekwame technici en clinici. Beperking van het aantal door de raad gecertificeerde pathologen in veel ziekenhuizen is in veel gevallen een beperking voor intraoperatief overleg. Dergelijke beperkingen kunnen worden verlicht met de snelle ontwikkelingsinteresses in digitale pathologie en op kunstmatige intelligentie gebaseerde diagnose². De H&E-kleuringsresultaten zijn echter variabel, afhankelijk van de ervaring van de technicus, wat extra uitdagingen oplevert voor computergebaseerde diagnose².

Deze uitdagingen kunnen mogelijk worden aangepakt met labelvrije optische beeldvormingstechnieken. Een van die technieken is SRS-microscopie. SRS maakt gebruik van gesynchroniseerde gepulseerde lasers - pomp en Stokes - om moleculaire trillingen met een hoog rendement te prikkelen³. Recente rapporten hebben aangetoond dat SRS-beeldvorming van eiwitten en lipiden H & E-equivalente beelden kan genereren (ook bekend als gestimuleerde Raman-histologie of SRH) met intact vers weefsel, wat de noodzaak van weefselverwerking omzeilt, de tijd die nodig is voor diagnose aanzienlijk verkort en intraoperatief is aangepast⁴. Bovendien kan SRS-beeldvorming 3D-beelden leveren, wat extra informatie biedt voor diagnose wanneer 2D-beelden onvoldoende zijn⁵. SRH is onbevooroordeeld en genereert digitale beelden die direct beschikbaar zijn voor computergebaseerde diagnose. Het komt snel naar voren als een mogelijke oplossing voor intraoperatieve kankerdiagnose en tumormargeanalyse, vooral bij hersenkanker ^6,7,8. Meer recent is SRS-beeldvorming van chemische veranderingen van weefsel ook voorgesteld om nuttige diagnostische informatie te bieden die clinici verder kan helpen bij het stratificeren van verschillende soorten kanker of stadia⁹.

Ondanks het enorme potentieel in weefseldiagnosetoepassingen, is SRS-beeldvorming meestal beperkt tot academische laboratoria die gespecialiseerd zijn in optica vanwege de complexiteit die gepaard gaat met het beeldvormingsplatform, dat ultrasnelle lasers, de laserscanmicroscoop en geavanceerde detectie-elektronica omvat. Dit protocol biedt een gedetailleerde workflow om het gebruik van een gemeenschappelijke femtoseconde laserbron voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming en het genereren van pseudo-H & E-beelden van hersenweefsel van muizen te demonstreren. Het protocol heeft betrekking op de volgende procedures:

Optimalisatie van uitlijning en tjirp
De meeste SRS-beeldvormingsschema's gebruiken picoseconde- of femtosecondelasers als excitatiebron. Bij femtoseconde lasers is de bandbreedte van de laser veel groter dan de Raman lijnbreedte. Om deze beperking te overwinnen, wordt een spectrale focusbenadering gebruikt om de femtosecondelasers naar een picoseconde tijdschaal te tsjilpen om een smalle spectrale resolutie¹⁰ te bereiken. Optimale spectrale resolutie wordt alleen bereikt wanneer het temporele getjilp (ook bekend als de groepsvertragingsdispersie of gewoon dispersie) goed is afgestemd op de pomp en de Stokes-lasers. De uitlijningsprocedure en de stappen die nodig zijn om de dispersie van de laserstralen te optimaliseren met behulp van zeer dispersieve glazen staven worden hier gedemonstreerd.

Frequentie kalibratie
Een voordeel van spectraal focus SRS is dat de Raman excitatie snel kan worden afgestemd door de tijdsvertraging tussen de pomp en de Stokes lasers te veranderen. Een dergelijke afstemming biedt snelle beeldvorming en betrouwbare spectrale acquisitie in vergelijking met het afstemmen van lasergolflengten. De lineaire relatie tussen excitatiefrequentie en tijdvertraging vereist echter externe kalibratie. Organische oplosmiddelen met bekende Raman-pieken worden gebruikt om de Raman-frequentie te kalibreren voor spectraalfocusSRS.

Real-time, tweekleurenbeeldvorming
Het is belangrijk om de beeldvormingssnelheid in weefseldiagnosetoepassingen te verhogen om de tijd te verkorten die nodig is voor het analyseren van grote weefselmonsters. Gelijktijdige tweekleurige SRS-beeldvorming van lipiden en eiwitten voorkomt de noodzaak om de laser of tijdvertraging af te stemmen, waardoor de beeldvormingssnelheid meer dan twee keer toeneemt. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een nieuwe orthogonale modulatietechniek en tweekanaals demodulatie met een lock-in versterker¹¹. Dit artikel beschrijft het protocol voor orthogonale modulatie en dual-channel beeldacquisitie.

Epi-mode SRS-beeldvorming
De meeste SRS-beeldvorming die tot nu toe is getoond, wordt uitgevoerd in transmissiemodus. Epi-mode beeldvorming detecteert backscattered fotonen uit weefsel¹². Voor pathologietoepassingen kunnen chirurgische monsters vrij groot zijn. Voor beeldvorming in transmissiemodus is vaak weefselsectie nodig, wat ongewenst extra tijd vereist. Epi-modus beeldvorming kan daarentegen werken met intacte chirurgische monsters. Omdat hetzelfde objectief wordt gebruikt om teruggekaatst licht te verzamelen, is het ook niet nodig om een condensor met een hoog numeriek diafragma uit te lijnen die nodig is voor transmissiebeeldvorming. Epi-modus is ook de enige optie wanneer weefselsectie moeilijk is, zoals bij bot. Eerder hebben we aangetoond dat voor hersenweefsel epi-mode beeldvorming superieure beeldvormingskwaliteit biedt voor weefseldikte > 2 mm¹³. Dit protocol maakt gebruik van een polariserende bundelsplitser (PBS) om verstrooide fotonen te verzamelen die door weefsel zijn gedepolariseerd. Het is mogelijk om meer fotonen te verzamelen met een ringvormige detector ten koste van de complexiteit van aangepaste detectorassemblage¹². De PBS-aanpak is eenvoudiger te implementeren (vergelijkbaar met fluorescentie), waarbij de standaard fotodiode al wordt gebruikt voor detectie van transmissiemodi.

Pseudo-H&E-beeldgeneratie
Zodra tweekleurige SRS-afbeeldingen zijn verzameld, kunnen ze opnieuw worden ingekleurd om H & E-kleuring te simuleren. Dit artikel demonstreert de procedure voor het converteren van lipide- en eiwit-SRS-afbeeldingen naar pseudo-H & E SRS-beelden voor pathologietoepassingen. Het experimentele protocol beschrijft kritieke stappen die nodig zijn om SRS-beelden van hoge kwaliteit te genereren. De hier getoonde procedure is niet alleen van toepassing op weefseldiagnose, maar kan ook worden aangepast voor vele andere hyperspectrale SRS-beeldvormingstoepassingen zoals beeldvorming van geneesmiddelen en metabole beeldvorming^14,15.

Algemene systeemvereisten
Het lasersysteem voor dit protocol moet 2 gesynchroniseerde femtoseconde laserstralen kunnen produceren. Systemen zijn idealiter voorzien van een Optische Parametrische Oscillator (OPO) voor brede golflengteafstemming van een van de laserstralen. De opstelling in dit protocol maakt gebruik van een commercieel lasersysteem Insight DS + dat twee lasers uitvoert (een vaste straal bij 1.040 nm en een op OPO gebaseerde afstembare straal, variërend van 680 tot 1.300 nm) met een herhalingsfrequentie van 80 MHz. Laserscanmicroscopen, hetzij van grote microscoopfabrikanten of zelfgebouwd, kunnen worden gebruikt voor SRS-beeldvorming. De gebruikte microscoop is een rechtopstaande laserscanmicroscoop gebouwd bovenop een commercieel rechtopstaand microscoopframe. Een paar 5 mm galvo spiegels worden gebruikt om de laserstraal te scannen. Voor gebruikers die ervoor kiezen om een zelfgebouwde laserscanmicroscoop te gebruiken, raadpleegt u een eerder gepubliceerd protocol voor de constructie van een laserscanmicroscoop¹⁶.

Protocol

Alle experimentele dierprocedures werden uitgevoerd met 200 μm, vaste, gesegmenteerde muizenhersenen, in overeenstemming met het protocol (# 4395-01) goedgekeurd door het Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Washington. Wild-type muizen (C57BL/6J stam) worden geëuthanaseerd met CO₂. Vervolgens wordt een craniotomie uitgevoerd om hun hersenen te extraheren voor fixatie in 4% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing. De hersenen zijn ingebed in een 3% agarose en 0,3% gelatinemengsel en door een vibratoom in 200 μm dikke plakken gesneden.

1. Initiële uitlijning

OPMERKING: Zorg ervoor dat de bundelgrootte en divergentie van beide armen op elkaar zijn afgestemd voor de beste gevoeligheid en resolutie. Collimeer de pomp en de Stokes-stralen en pas hun afmetingen aan voordat ze de laserscanmicroscoop betreden. Gebruik hiervoor een paar achromatische lenzen voor elke straal voordat u ze combineert op de dichroïsche spiegel. Draag altijd een goede laserbril voor het uitlijnen van de straal.

1. Bundelcollimatie
   1. Installeer een paar achromatische lenzen voor de pompstraal. Gebruik als uitgangspunt een 100 mm lens en 200 mm lens om de laserstraalgrootte 2-voudig te vergroten. Zorg ervoor dat de afstand van de twee lenzen ongeveer 300 mm is. Lijn de pompstraal uit door het midden van beide lenzen.
   2. Plaats een spiegel achter de tweede lens om de straal naar een muur (>1 m afstand) te sturen. Wees voorzichtig bij het verzenden van de balk over lange afstanden. Traceer de straal van de spiegel naar de muur met een IR-kaart en controleer of de straal van grootte verandert. Collimeer de bundel als de bundel in grootte verandert als functie van de afstand.
      1. Als de bundel convergeert (afnemende grootte met voortplanting), plaatst u de twee lenzen dichter bij elkaar.
      2. Als de bundel divergeert (groter wordt met de voortplanting), plaatst u de twee lenzen verder uit elkaar. Pas de afstand aan totdat de bundel is gecollimeerd.
   3. Herhaal stap 1.1.1 en 1.1.2 voor de Stokes-bundel om de bundel te collimeren.
2. Aanpassing van de bundelgrootte
   1. Als er een beam profiler beschikbaar is, meet dan de gecollimeerde bundelgrootte voor elke straal. U kunt ook de bundelgrootte schatten met behulp van de IR-kaart en een liniaal om een straaldiameter van 4-5 mm te verkrijgen.
   2. Als de bundelgrootte te klein of te groot is, wijzigt u het lenspaar dat in stap 1.1 is gebruikt. Pas het lenspaar aan totdat beide bundels een diameter van 4-5 mm hebben.
      OPMERKING: De vergroting van de bundel is de verhouding tussen de brandpuntsafstand van de tweede lens en de eerste lens (f₂/f₁).
3. Ruimtelijke overlap
   OPMERKING: SRS-beeldvorming vereist dat beide laserstralen in ruimte en tijd worden gecombineerd om moleculaire trillingen op te wekken. Een schema van de spectraal-focus SRS-beeldvorming is weergegeven in figuur 1.
   1. Combineer de twee laserstralen door een dichroïsche spiegel te installeren met verschillende stuurspiegels voor aanpassing. Optimaliseer de ruimtelijke overlap van de pomp en Stokes door de bundels na de dichroïsche spiegel op twee verschillende posities ver uit elkaar (~ 1 m) te bewaken. Pas de stuurspiegel iteratief aan voor de dichroïsche en de dichroïsche spiegel om de Stokes-straal uit te lijnen met de pompstraal.
      OPMERKING: Als de twee balken elkaar op beide posities ruimtelijk overlappen, overlappen ze elkaar voldoende.
   2. Zorg ervoor dat de gecombineerde stralen naar het midden van de scanspiegels van de laserscanmicroscoop worden gestuurd door een paar stuurspiegels aan te passen wanneer de scanspiegels zich in de geparkeerde positie bevinden. Zorg ervoor dat beide bundels door het midden van het microscoopobjectief en de condensor reizen.
   3. Gebruik na de condensor een ander paar lenzen met brandpuntsafstanden van respectievelijk 100 mm en 30 mm om de uitgezonden straal door te geven aan de fotodiode. Zorg ervoor dat beide balken zich in de fotodiode bevinden en installeer twee laagdoorlaatfilters om de gemoduleerde Stokes-straal te blokkeren.

2. SRS-signaal detectie

1. Elektrooptische modulatie (EOM)
   OPMERKING: EOM van 20 MHz wordt gebruikt om de Stokes-amplitude te moduleren. Zoals later besproken, is de EOM afgeleid van de 80 MHz laserpulstrein, die nodig is voor orthogonale modulatie. Andere modulatiefrequenties kunnen worden gebruikt als alleen eenkleurige of hyperspectrale SRS wordt uitgevoerd. In dat geval is synchronisatie van modulatiefrequentie naar laserfrequentie niet nodig. Een frequentiegenerator met een RF-eindversterker kan worden gebruikt om de EOM aan te drijven. Als gevolg hiervan kunnen stappen 2.1.1-2.1.4 worden overgeslagen.
   1. Plaats een beam sampler in het Stokes beam pad om 10% van de beam op te pikken en stuur deze naar een snelle fotodiode om de 80 MHz pulstrein te detecteren.
      OPMERKING: Het fotodiodesignaal wordt naar een frequentieverdeler gestuurd om een 20 MHz TTL-uitgang te genereren. Deze uitgang wordt verder in een fanoutbuffer gestuurd om de uitgang te repliceren in vier identieke 20 MHz-uitgangen. Een van de uitgangen wordt gebruikt om de oscilloscoop te activeren.
   2. Neem een van de uitgangen van de fanout buffer en filter deze met een bandpass filter om een 20 MHz sinusoïdale golf te krijgen. Gebruik een RF-verzwakker om de piek-piekspanning van de uitgang aan te passen tot ~ 500 mV.
   3. Stuur de resulterende uitgang naar een faseverschuiver, die een fijne aanpassing van de RF-fase met een spanningsbron mogelijk maakt. Stuur deze uitgang naar een RF eindversterker en sluit de uitgang van de versterker aan op de EOM.
   4. Deblokkeer de Stokes-bundel en optimaliseer de modulatiediepte van EOM1 door een fotodiode in het bundelpad te plaatsen. Pas de EOM-spanning en kwartgolfplaat aan totdat de modulatiediepte (dal-piekverhouding) bevredigend lijkt.
      OPMERKING: Bij 20 MHz modulatie (1/4 van de laserherhalingssnelheid) worden twee pulsen verwacht om de 50 ns.
2. Tijdelijke overlap
   OPMERKING: Tijdelijke overlap van de pomp en Stokes wordt bereikt door een van de twee laserpulstreinen uit te stellen met een retroflector gemonteerd op een vertragingstrap (figuur 1 laat zien dat de Stokes vertraagd zijn). Grove overlap wordt bewaakt met de oscilloscoop en fijne overlap wordt bewaakt door het SRS-signaal. Fijne temporele overlap kan ook worden bereikt met een autocorrelator indien beschikbaar.
   1. Plaats een fotodiode achter de dichroïsche spiegel om de laserstraal te detecteren. Blokkeer eerst de Stokes-balk. Zoom in op een van de pomppulspieken op de oscilloscoop. Plaats een verticale cursor om de temporele positie van deze piek met de oscilloscoop te markeren.
   2. Blokkeer de pompbalk en deblokkeer de Stokes-balk. Vertaal de vertragingsfase om de piekpositie op de oscilloscoop tijdelijk af te stemmen op de gemarkeerde positie in de vorige stap. Zie figuur 2 voor een weergave van de tijdelijke overlap van twee balken.
      1. (OPTIONEEL) Als de translatie van de vertragingsfase onvoldoende is om de twee stralen tijdelijk overeen te laten komen, verplaatst u de vertragingsfase naar het midden van het bewegingsbereik.
      2. Bereken de vertragingsafstand die nodig is om de twee bundels overeen te laten komen door het temporele verschil tussen de twee bundels te nemen en het verschil te vermenigvuldigen met de lichtsnelheid om de hoeveelheid afstand te vinden die nodig is om de twee bundels tijdelijk overeen te laten komen.
      3. Verleng het straalpad van de snellere bundel of verkort het bundelpad van de langzamere bundel om de temporele vertraging dienovereenkomstig ongeveer aan te passen.
   3. Bereid een microscoopglaasje voor met DMSO en dubbelzijdige tape als afstandhouder om het monster tussen de dia en een coverslip te houden.
   4. Plaats het monster op de microscoop met de coverslipzijde naar het microscoopobjectief gericht. Verander de microscoop in brightfield-verlichting en observeer het monster van het oculair. Zoek de focus van het monster door eerst de focus te vinden op zowel de bovenste als de onderste laag luchtbellen op de glas-tape-interface en verplaats vervolgens de focus om tussen de twee lagen tape te zijn.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de laserstralen zijn geblokkeerd voordat u in het oculair kijkt.
   5. Stel de instelbare bundeluitgang in op 798 nm. Stel op basis van de optische doorvoer van de condensor het optische vermogen in op ~ 40 mW elk voor de pomp en Stokes-stralen op de objectieve focus.
   6. Open ScanImage in MATLAB (of andere scansoftware die de microscoop bestuurt) en klik op de knop FOCUS om te beginnen met scannen.
      OPMERKING: De laserstralen worden rastergescand door het monster om een afbeelding te genereren. De laagfrequente signaaluitgang van de fotodiode (<100 kHz) wordt rechtstreeks naar kanaal 1 van de data-acquisitiekaart (het DC-kanaal genoemd) gestuurd. De hoogfrequente uitgang (>100 kHz) van de fotodiode wordt naar de lock-in versterker gestuurd en de X-uitgang van het lock-in versterkersignaal wordt naar kanaal 2 van de data-acquisitiekaart (het AC-kanaal genoemd) gestuurd.
   7. Pas de stuurspiegel voor de galvo-scanner aan om het DC-signaal op het kanaal 1-display te centreren. Verplaats de gemotoriseerde vertragingstrap en observeer nauwgezet de vergrendelingsuitgang die wordt weergegeven op het display van kanaal 2 (d.w.z. AC-kanaal).
      OPMERKING: Wanneer de pomp en Stokes in de tijd samenvallen, verschijnt er een signaal op het AC-kanaal. Het is handig om de kleurschaal van het AC-kanaal aan te passen om de kleine intensiteitsverandering weer te geven.
   8. Maximaliseer de ac-signaalintensiteit door de tijdvertraging nauwkeurig aan te passen. Pas de dichroïsche spiegel aan om het SRS-signaal op het AC-kanaal te centreren (terwijl het DC-kanaal gecentreerd blijft). Pas de fase van de lock-in versterker aan om het signaal te maximaliseren. Zie figuur 3 voor een bevredigend signaal.

3. Spectrale resolutie optimalisatie

OPMERKING: De pomp en Stokes-bundels die het monster bereiken, moeten dezelfde hoeveelheid groepsvertragingsdispersie (GDD) hebben om de spectrale resolutie te maximaliseren. De dispersie is sterk afhankelijk van de experimentele opstelling. De hier beschreven experimentele opstelling maakt gebruik van femtosecondepulsen bij 1.040 nm en 800 nm als respectievelijk Stokes en pomp. Dichte vuursteenglasstaven (H-ZF52A) worden gebruikt als het puls-stretching medium.

1. Steek 48 cm van een zeer dispersieve glazen staaf (H-ZF52A of gelijkwaardig dicht vuursteenglas) in het 800 nm bundelpad. Schat de GDD met Eq (1):
   (1)
   OPMERKING: van verschillende glasmaterialen op verschillende golflengten kan worden gevonden in de brekingsindexdatabasebron. Zo heeft de H-ZF52A een van 220,40 fs²/mm bij 800 nm. De totale GDD is 105792 fs².
2. Bereken hoeveel cm van de dispersieve glazen staaf nodig is om toe te voegen aan het 1.040 nm bundelpad om overeen te komen met de GDD van de pomp. Plaats de juiste lengte van dispersieve glazen staven in het bundelpad van 1.040 nm om ongeveer overeen te komen met de GDD van de 800 nm-bundel. Merk op dat de toevoeging van glazen staven de tijdelijke overlap van de twee balken zal veranderen en dat aanpassing van de vertraging nodig kan zijn.
3. Kalibratie van spectrale resolutie
   1. Maak een microscoopglaasje met DMSO. Plaats de dia op de microscoop en controleer de kracht van de bundels die uit de microscoopcondensor komen. Pas het vermogen dienovereenkomstig aan om ~ 40 mW elk bij monsterfocus te hebben.
   2. Open ScanImage van MATLAB. Vind het maximale SRS-signaal door door de vertragingsfase te scannen, die overeenkomt met de 2.913 ^{cm-1 Raman-piek} van DMSO. Schat de fasepositie op basis van de vorige fasepositie met de toegenomen optische padlengte als gevolg van het inbrengen van staafjes. Richt de ruimtelijke overlap van de balk opnieuw uit vanwege de kleine afwijking van de balk wanneer glazen staven worden toegevoegd.
   3. Sla een hyperspectrale SRS-scan op door achtereenvolgens een reeks SRS-beelden te maken terwijl u het gemotoriseerde podium verplaatst.
      OPMERKING: Het bereik van de vertragingsscan omvat twee Raman-pieken, overeenkomend met respectievelijk de ^{Raman-pieken van 2.913 cm-1} en 2.994 ^cm-1 van DMSO. Deze twee overgangen worden waargenomen bij gebruik van een 800 nm pomp en 1.040 nm Stokes laser.
   4. Zet de SRS-spectra van de DMSO-oplossing uit met behulp van ImageJ of MATLAB. Monteer de grote DMSO 2.913 ^cm-1 piek op een Gaussische of Lorentziaanse functie in MATLAB om de volledige breedte bij half maximum (FWHM) van de piek te berekenen.
      OPMERKING: Representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 4. Als er slechts één brede piek aanwezig is, betekent dit dat ofwel de spectrale resolutie te slecht is om de twee pieken te onderscheiden en er meer glazen staven nodig zijn, ofwel dat het gescande bereik te klein was om de tweede piek te detecteren. Typisch is een acceptabele spectrale resolutie DMSO ~ 20-25 ^cm-1 wanneer glazen stavenlengte van >60 cm worden gebruikt. Een lagere resolutie wordt vaak gebruikt voor weefselbeeldvorming om te ruilen voor hogere signalen met kortere pulsen¹⁷.
4. (OPTIONEEL) Gebruik een autocorrelator of een FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) om de pulsduur van elke arm te bepalen om precies de hoeveelheid GDD en de lengte van de staven te berekenen die nodig zijn om overeen te komen met de GDD tussen de pomp en de Stokes.
5. Herhaal stap 3.3.2-3.3.4 voor verschillende staaflengtes op de Stokes-bundel om de optimale spectrale resolutie te vinden, wat betekent dat de beste GDD-match experimenteel is gevonden. Gebruik meerdere sets glazen staven van verschillende lengte om een optimale spectrale resolutie te bereiken.

4. Signaal-ruis (SNR) karakterisering

1. Zorg ervoor dat stap 4.2 wordt uitgevoerd na volledige ruimtelijke en temporele uitlijning.
2. Verkrijg een SRS-afbeelding die overeenkomt met de 2.913 ^{cm-1 Raman-piek} van DMSO. Open de afbeelding in ImageJ en selecteer een klein gebied in het midden van het frame. Gebruik de meetfunctie om het gemiddelde en de standaarddeviatie van waarden in het geselecteerde gebied te berekenen.
3. Deel de gemiddelde waarde van het geselecteerde gebied door de standaarddeviatie om de SNR-waarde te vinden, zoals in Eq (2).
   (2)
   OPMERKING: Een goede SNR voor het systeem (met een lock-in tijdconstante van 4 μs) met DMSO bij 40 mw/40 mw bij focus voor beide armen is >800. Lagere concentraties DMSO of een lager vermogen kunnen worden gebruikt voor een nauwkeurigere schatting van de SNR als de data-acquisitiekaart een beperkte bitdiepte heeft.
4. Als de SNR te laag is, richt u de laserpulsen opnieuw uit om ruimtelijke overlap, temporele overlap, afstemming van bundelgrootte/collimatie en/of dispersie te optimaliseren. Voor een objectief met een aberratiecorrectiekraag optimaliseert u het signaal door de correctiehalsband aan te passen.

5. Kalibratie van de frequentieas

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om de positie van de vertragingsfase te relateren aan de gescande Raman-overgang. Zorgvuldige selectie van oplosmiddelen is vereist om een geschikte "Raman-liniaal" te genereren. DMSO is een effectief oplosmiddel voor CH-bindingen omdat het twee scherpe Raman-pieken heeft bij 2.913 ^cm-1 en 2.994 ^cm-1.

1. Sla een hyperspectrale scan op met het delay-stage bereik dat de 2.913 ^cm-1 en 2.994 ^cm-1 Raman-pieken van DMSO bestrijkt. Sla de faseposities op die overeenkomen met de hyperspectrale gegevensset.
   OPMERKING: De globale maximale piek van het spectrum komt overeen met de DMSO 2.913 ^{cm-1 Raman-verschuiving} en de tweede maximale piek komt overeen met de DMSO 2.994 ^{cm-1 Raman-verschuiving} .
2. Voer lineaire regressie uit voor de podiumposities en Raman verschuift op 2.913 ^cm-1 en 2.994 ^cm-1. Gebruik de lineaire regressievergelijking die de fasepositie relateert aan de Raman-verschuiving en converteer de vertragingsposities naar de overeenkomstige Raman-frequenties.

6. Orthogonale modulatie en tweekleurenbeeldvorming

OPMERKING: De orthogonale modulatiestap is alleen nodig wanneer real-time tweekleurenbeeldvorming nodig is. Een schema van dit schema is weergegeven in figuur 5. De orthogonale modulatie maakt gebruik van een paar EOM's aangedreven op een kwart van de laserfrequentie (20 MHz voor 80 MHz laser) met een 90 ° faseverschuiving tussen de twee. Deze orthogonale modulatiestap kan worden overgeslagen voor single-color SRS-beeldvorming of hyperspectrale SRS-beeldvorming.

1. EOM1 modulatie
   1. Installeer een PBS (PBS2), een kwartgolfplaat (QWP2) en een tweede EOM (EOM2) in het Stokes-bundelpad na de eerste EOM. Koppel de signaalingang los van EOM2. Sluit de signaalingang aan op EOM1 en schakel deze in.
   2. Moduleer de Stokes-bundel (gefixeerd op 1.040 nm) op 20 MHz (f₀/4) door de bundel door de eerste EOM te sturen. Pas de kanteling en positie van EOM1 aan om ervoor te zorgen dat de straal recht en gecentreerd door het EOM-kristal slaat.
   3. Bewaak de modulatiediepte door beide polarisaties uit PBS1 met twee fotodiodes te observeren en de modulatie op een oscilloscoop weer te geven.
   4. Pas de QWP1-, EOM1-spanning en fase van de 20 MHz-ingang aan (met behulp van een fasedraaier) om de modulatiediepte van de verzonden bundel te optimaliseren om dicht bij 100% te liggen. Zie figuur 2B voor een illustratie van een goede modulatiediepte.
2. EOM2 modulatie
   1. Koppel EOM1 los en sluit EOM2 aan.
   2. Stuur de hoogspanningsuitgang van de tweede versterker op 20 MHz naar EOM2. Pas de kanteling en positie van EOM2 aan om ervoor te zorgen dat de straal recht en gecentreerd door het EOM-kristal slaat.
   3. Controleer nogmaals de modulatiediepte door te kijken naar beide polarisaties die uit PBS2 komen met een oscilloscoop. Pas de QWP2-, EOM2-spanning en de fasedraaier indien nodig aan om bijna 100% modulatie voor beide polarisaties te bereiken.
   4. Zorg ervoor dat de pulstreinmodulatie een faseverschuiving van 90° heeft ten opzichte van de eerste modulatie.
      OPMERKING: Als de twee pomppulstreinen niet 90° orthogonaal zijn, zal overspraak tussen de twee kanalen een probleem zijn.
   5. Test de orthogonaliteit van de modulatie door zowel EOM1 als EOM2 in te schakelen en aan te sluiten. Controleer beide polarisaties die door PBS2 worden gesplitst met een oscilloscoop. Optimaliseer EOM1 en EOM2 afzonderlijk opnieuw als de pulstrein na de tweede PBS niet lijkt op figuur 2C.
   6. Installeer een 20 mm birefringent kwartskristal (BRC) en HWP stroomafwaarts van EOM2. Sluit beide EOM's tegelijk aan en bewaak de pulstrein zodanig dat deze lijkt op Figuur 2D.
      OPMERKING: Voor het getjilp dat in dit experiment wordt gebruikt, induceert 20 mm BRC een tijdsvertraging die overeenkomt met een 80 ^{cm-1 Raman-verschuiving} . Een andere BRC-lengte kan nodig zijn als een ander getjilp wordt gebruikt.
3. Calibratie
   1. Kalibreer het systeem met DMSO door signalen van de lock-in versterker X- en Y-kanaaluitgang te detecteren (verzonden naar kanalen 2 en 3 van de data-acquisitiekaart).
   2. Controleer of de signalen die worden gegenereerd door de 2.913 ^cm-1 piek van de snellere polarisatie en die van de langzamere polarisatie bijna 90° uitfase zijn op de lock-in versterker. Als dit niet het geval is, past u de EOM-uitlijning aan totdat de twee signalen bijna 90° uit-fase zijn.
   3. Zodra de kalibratie is voltooid, zoekt u de vertragingspositie die de eiwitovergang op 2.930 ^cm-1 voor een van de orthogonale stralen onderzoekt. Zorg ervoor dat de andere polarisatie de lipideovergang van 2.850 ^{cm-1 aftast}.

7. Epi-mode SRS-beeldvorming

OPMERKING: In het beeldvormingsschema van de transmissiemodus richt het objectief de laser op het monster en vervolgens stuurt een condensorlens de verzonden straal naar een fotodiode voor lock-in detectie. In het epi-modus beeldvormingsschema wordt licht dat door het monster wordt teruggekaatst en gedepolariseerd, door het scherpstelobjectief opgevangen en geïsoleerd met behulp van een polariserende bundelsplitser. De geïsoleerde en teruggekaatste fotonen worden via een paar relaislenzen naar een fotodiode gestuurd voor lock-in detectie. Figuur 6 toont het epi-mode beeldvormingsschema.

1. Installeer een HWP voordat de straal de microscoop binnenkomt om de polarisatie van de bundel die in de microscoop gaat te veranderen. Plaats een PBS boven het objectief om de gedepolariseerde teruggekaatste straal de detector te laten bereiken.
2. Gebruik een paar lenzen bestaande uit een 75 mm achromatlens en een 30 mm asferische lens om de backscattered fotonen van het achterste diafragma van het objectief door te geven aan de fotodetector. Monteer de detector om het teruggekaatste licht te verzamelen dat door de PBS wordt aangestuurd. Installeer een filter om te voorkomen dat de gemoduleerde straal de detector binnenkomt.
3. Plaats het weefselmonster onder het doel. Omdat de condensor niet nodig is voor epi-modus beeldvorming, verwijdert u deze als er meer ruimte nodig is.
4. Beeldvorming
   1. Blokkeer de balk met een rolluik; schijn een witte lichtbron vanaf de zijkant op het monster; en gebruik brightfield om objectieve focus te vinden.
   2. Deblokkeer beide bundels en gebruik de vooraf gekalibreerde vertragingsposities om lipide- en eiwit-SRS-beelden te verkrijgen van weefsel uit de twee uitgangen van de lock-in versterker.
   3. Pas de vergrendelingsversterking en pixel bin-factor aan om afbeeldingen van goede kwaliteit te verkrijgen.

8. Valse kleuring

1. Open de afbeeldingsstapel met ImageJ.
2. Haal de twee afbeeldingen die overeenkomen met de lipide (2.850 ^cm-1) en eiwit (2.930 ^cm-1) soorten eruit door met de rechtermuisknop op de afbeelding te klikken en op Dupliceren te klikken.
3. Hernoem het lipidenbeeld naar lipiden en het eiwitbeeld naar eiwitten.
4. Ga naar proces- | Image Calculator en voer eiwitten af om lipiden af te trekken.
5. Combineer de afbeeldingen door naar Afbeelding | te gaan Kleur | Kanalen samenvoegen, lipiden op groen zetten en eiwitten op blauw. Open het gereedschap Afbeeldingskanalen (Afbeelding | Kleur | Channels Tool) en pas de helderheid en het contrast aan (Image | | aanpassen Helderheid/contrast).
6. Pas de helderheid en het contrast voor elk kanaal aan met het gereedschap Kanalen . Pas voor het lipidekanaal het contrast aan totdat de cellulaire kenmerken donker lijken. Pas voor het eiwitkanaal het contrast aan totdat de cellulaire kenmerken blauw lijken. Converteer de samengevoegde kanaal groen/blauwe afbeelding naar een RGB-afbeelding door naar Afbeelding | Soort | RGB-kleur. Exporteer deze afbeelding op Bestand | Opslaan als | Tiff.
   OPMERKING: Voor valse H & E-kleuring toont het kleurenschema roze cytoplasma, terwijl de kernen donkerblauw-paars zijn.
7. Download het HE.m MATLAB-script van de valse H&E-vlekscriptbron in de Materiaaltabel.
8. Voer het HE.m-script uit in MATLAB. Selecteer de geëxporteerde RGB-afbeelding uit de vorige stap om een kunstmatig H&E-gekleurde afbeelding te genereren.
9. (OPTIONEEL) Normaliseer de beeldintensiteit voor grote beeldhoeken omdat het beeld donkerder lijkt in de periferie dan in het midden.
   1. Om veldnormalisatie van de afbeeldingen uit te voeren, moet u zoveel mogelijk afbeeldingen gemiddeld nemen. Verwijder vervolgens de intensiteitsfuncties met ImageJ (Process | Filters | Gaussische | Straal=50).
   2. Meet de maximale intensiteit van de wazige afbeelding (Ctrl+M). Deel de wazige afbeelding door de maximale intensiteit (Process | Wiskunde | Verdeel). Deel de onbewerkte SRS-afbeelding door de onscherpe afbeelding (proces| Afbeelding | Rekenmachine).

Representative Results

Spectrale resolutie optimaliseren:
Dispersie door een materiaal wordt beïnvloed door het dispersieve medium (lengte en materiaal) en golflengte. Het veranderen van de lengte van de dispersiestaaf heeft invloed op de spectrale resolutie en de signaalgrootte. Het is een geven-en-nemen relatie die afhankelijk van de toepassing anders kan worden gewogen. De staven rekken de bundelpuls uit van breed in frequentie en smal in de tijd tot smal in frequentie en breed in de tijd. Figuur 7 toont het effect van variërende staaflengtes op de spectrale resolutie. Figuur 7A toont een zeer slechte spectrale resolutie; deze opstelling heeft geen glazen tjilpende staven en de twee Raman-pieken van DMSO zijn helemaal niet opgelost. In figuur 7B,C begint een toename van het aantal glazen tjilpende staven de twee pieken op te lossen. Ten slotte laat figuur 7D zien hoe afgestemd getjilp beide pieken oplost en kan worden gebruikt om podiumposities op frequentie te kalibreren.

Kalibratie met DMSO:
DMSO heeft twee scherpe Raman-pieken bij 2.913 en 2.994 ^cm-1 die geschikt zijn voor kalibratie in het C-H-gebied. Zodra een DMSO-spectrum is verkregen uit een hyperspectrale SRS-scan, converteert een eenvoudige lineaire regressie de podiumpositie naar de Raman-verschuiving. Als de spectrale resolutie slecht is (zoals weergegeven in figuur 7A) en de twee pieken niet scheidbaar zijn, dan is kalibratie met lineaire regressie onmogelijk. In dit geval is een betere dispersieafstemming noodzakelijk door glazen staven toe te voegen of te verwijderen. De meest voorkomende problemen bij het vinden van een DMSO-signaal voor kalibratie zijn te wijten aan fouten in temporele overlap of ruimtelijke overlap van de twee bundels. Voordat u DMSO-kalibratie uitvoert, herhaalt u de ruimtelijke en temporele uitlijningsstappen om het SRS-signaal te optimaliseren.

Tweekleurige DMSO:
In tweekleurige SRS worden twee pomppulstreinen gegenereerd met orthogonale polarisatie met een vaste tijdsvertraging (door een birefringent kristal). Evaluatie van modulatiediepte en 90° faseverschuiving gebeurt met een fotodiode gevolgd door een DMSO SRS-signaal. Figuur 8 toont een aanvaardbare modulatiediepte en temporele scheiding. Hoewel de spectrale resolutie van DMSO in figuur 8 niet ideaal is, wordt deze vaak opgeofferd in weefselbeeldvormingsexperimenten om een hoger signaal te bereiken met kortere pulsen. Figuur 9 toont slechte faseverschuivingen die aanleiding geven tot omgekeerde of negatieve pieken.

Tweekleurige SRS van muizenhersenweefsel in epi-modus:
Epi-modus (detectie van backscattered fotonen) SRS wordt gebruikt voor het afbeelden van dik weefsel (>1 mm). Figuur 10A,B toont real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming bij 2.850 ^cm-1 en 2.930 ^cm-1 ex vivo muishersenweefsel. De ruwe afbeeldingen van de lipide- en eiwitkanalen (figuur 10A,B) werden kleurgecodeerd om een enkele afbeelding te produceren met lipide- en eiwitbijdragen (figuur 10C). Valse H&E-kleuring werd uitgevoerd (figuur 10D) op figuur 10C om H&E-kleuring na te bootsen. Slechte beeldkwaliteit kan het gevolg zijn van een grote beelddiepte of een slechte kalibratie (frequentieas of modulatiediepte). De typische beelddiepte in hersenweefsel is 100-200 μm¹³.

Figuur 1: Schema van eenkleurige SRS-beeldvormingsopstelling. Constructie van een spectraal-focus SRS microscoop in transmissiemodus. X en Y vertegenwoordigen de orthogonale uitgangen. Afkortingen: SRS = gestimuleerde Raman-verstrooiing; DL = op retroreflector gebaseerde vertragingslijn; Div = verdeler; FB = uitwaaierende buffer; AT = verzwakker; PS = fasedraaier; PA = eindversterker; DCM = dichroïsche spiegel; GM = galvo spiegels; EOM = elektrooptische modulator; POM = pick-off spiegel; PBS = polariserende bundelsplitser, BRC = birefringent kristal; QWP = kwartgolfplaat; HWP: halve golfplaat; PD = fotodiode; GR = glazen staaf; BB = Balkblok; SPF = shortpass filter; CL = collimaterende lens; BS = bundelgrootte veranderende lens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve temporele overlap. (A) De pomp- en Stokes-balken blijken tijdelijk overlapt te zijn op de oscilloscoop. Oscilloscoopcursors worden gebruikt om de temporele posities van de pomp en Stokes-balken te markeren. Deze overlap is bevredigend als uitgangspunt om de tijdelijke overlap met een vertragingsfase verder aan te passen. (B) Bevredigende representatieve modulatiediepte van één EOM bij 20 MHz. (C) Bevredigende pulsmodulatie terwijl twee EOM's in gebruik zijn. (D) Bevredigende pulstreinmodulatie na birefringente kwartskristal en halfgolfplaatinstallatie op de dubbel gemoduleerde Stokes-arm. Afkorting: EOM = electrooptic modulator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve SRS en pompsignalen. (A) Verkeerd uitgelijnd pompsignaal gedetecteerd in DC-kanaal. (B) Verkeerd uitgelijnd SRS-signaal gedetecteerd door fotodiode. (C) Bevredigend, gecentreerd pompsignaal in het DC-kanaal. (D) Bevredigend SRS-signaal gecentreerd op het AC-kanaal. Afkorting: SRS = stimuleerde Raman-verstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Spectrale resolutie karakterisering. Een gaussische functie paste op de 2.913 ^cm-1 Raman DMSO-piek. De berekende FWHM gaf een resolutie van 15 ^cm-1 voor het systeem. Afkortingen: DMSO = dimethylsulfoxide; FWHM = Volledige breedte bij half maximum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Schema van tweekleurige SRS-beeldvormingsopstelling. Constructie van een tweekleurige SRS-microscoop in de transmissiemodus. X en Y vertegenwoordigen de orthogonale uitgangen. Afkortingen: DL = retroreflector based delay line; Div = verdeler; FB = uitwaaierende buffer; AT = verzwakker; PS = fasedraaier; PA = eindversterker; DCM = dichroïsche spiegel; GM = galvo spiegels; EOM = elektrooptische modulator; PBS = polariserende bundelsplitser; BRC = birefringent kristal; QWP = kwartgolfplaat; HWP = halve golfplaat; PD = fotodiode; GR = glazen staaf; BB = Beam Block, SPF = shortpass filter; CL = collimaterende lens; POM = pick-off spiegel; BS = bundelgrootte veranderende lens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Schema van tweekleurige SRS imaging Epi-mode set-up. Constructie van een tweekleurige SRS-microscoop in de epi-modus. X en Y vertegenwoordigen de orthogonale uitgangen. Afkortingen: DL = retroreflector based delay line; Div = verdeler; FB = uitwaaierende buffer; AT = verzwakker; PS = fasedraaier; PA = eindversterker; DCM = dichroïsche spiegel; GM = galvo spiegels; EOM = elektrooptische modulator; PBS = polariserende bundelsplitser; BRC = birefringent kristal; QWP = kwartgolfplaat; HWP = halve golfplaat; PD = fotodiode; GR = glazen staaf; BB = Beam Block, BPF = bandpass filter; CL = collimaterende lens; POM = pick-off spiegel; BS = bundelgrootte veranderende lens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Optimalisatie van de spectrale resolutie met 25% DMSO. (A) Er werden nul glazen tjilpstaven gebruikt om het DMSO-spectrum te verkrijgen. De twee pieken zijn niet opgelost. (B) Er werden glazen tjilpstangen gebruikt, 20 cm op de pomparm en 24 cm op de Stokes-arm. Twee pieken beginnen tot een bevredigend punt te worden opgelost. (C) Er werden chirping rods gebruikt, 40 cm lange pomp en 24 cm lange Stokes, om een beter opgelost DMSO-spectrum te verkrijgen. (D) Chirping rods werden gebruikt, 64 cm lange pomp en 60 cm lange Stokes, om een hogere spectrale resolutie te verkrijgen. Afkorting: DMSO = dimethylsulfoxide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Tweekleurige SRS, variërende polarisatie en tijdsvertraging. Twee tijd-vertraagde pulstreinen van orthogonale polarisatie (s & p) worden gebruikt om DMSO-spectra in beeld te brengen om de tijdvertraging (en raman-frequentieverschil) tussen de SRS-excitaties te tonen. Afkortingen: DMSO = dimethylsulfoxide; SRS = stimuleerde Raman-verstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: SRS-spectrum als gevolg van een slechte tweekleurige SRS-faseverschuiving. Een negatieve piek van 2.994 ^cm-1 in de buurt van podiumpositie 48 is indicatief voor een slecht faseverschil. Afkorting: SRS = stimuleerde Raman-verstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Generatie van valse tweekleurige H&E-kleuring van SRS-afbeeldingen. (A) Ruw eiwit SRS-beeld van een muizenhersenweefsel bij de overgang 2.930 ^cm-1 . (B) Ruw lipide SRS-beeld van hersenweefsel van muizen bij de overgang van 2.850 ^cm-1 . (C) Samengevoegde en kleurgecodeerde kanalen van A en B met lipidebijdrage in groen en eiwitbijdrage in blauw. (D) Valse H&E-herkleuring werd uitgevoerd op C om H&E-kleuring na te bootsen voor pathologische toepassingen. Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: SRS = gestimuleerde Raman-verstrooiing; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het tweekleurige SRS-beeldvormingsschema dat in dit protocol wordt gepresenteerd, hangt af van de juiste implementatie van SRS-beeldvorming met één kleur. In SRS-beeldvorming met één kleur zijn de kritieke stappen ruimtelijke uitlijning, temporele uitlijning, modulatiediepte en faseverschuiving. Ruimtelijk combineren van de twee balken wordt bereikt door een dichroïsche spiegel. Verschillende stuurspiegels worden gebruikt voor fijnafstelling bij het verzenden van de balken naar de dichroïsche spiegel. Zodra de balken zijn gecombineerd met de dichroïsche spiegel, kan de ruimtelijke uitlijning worden bevestigd door het gecombineerde straalpad met een spiegel af te kiezen om naar een muur >1 m afstand te sturen terwijl de gecombineerde straal wordt gecontroleerd om te zien of deze overlapt met een IR-kaart. Na ruimtelijke uitlijning door de microscoop wordt de temporele overlap uitgevoerd door de padlengte aan te passen met een op retroreflector gebaseerde vertragingsfase, wat het voordeel heeft van het behoud van ruimtelijke uitlijning. De 1.040 nm arm is de vertraagde bundel in dit protocol. Temporele overlap is onmogelijk als de vertragingsfase niet het bereik heeft om ervoor te zorgen dat de twee bundels elkaar tijdelijk overlappen. In dat geval kan het nodig zijn om de hele vertragingsfase naar een andere locatie te verplaatsen om ervoor te zorgen dat de tijdelijke overlap dicht bij het midden van het vertragingsscanbereik ligt. Als het temporele verschil tussen de twee balken bijvoorbeeld wordt gemeten als 6 ns, dan is 1,8 m aanpassing vereist. De vereiste aanpassing geeft de lengte van de rek van het bundelpad voor de snellere bundel of de verkorting van het bundelpad voor de langzamere bundel aan.

Naast uitlijning zijn ook het matchen van de bundelgrootte en modulatie van de Stokes-bundel belangrijk om het SRS-signaal te maximaliseren. Idealiter zouden beide stralen op het objectiefvlak moeten worden gecollimeerd en overeenkomen met de grootte van de achteropening van het objectief. Het is handig om de collimatie en bundelgrootte te controleren als het objectiefvlak wordt blootgesteld aan de gebruiker. Als de bundel convergeert of divergeert, moet de tweede lens van het collimatielenspaar worden aangepast om collimatie te bereiken (protocolstap 1.1). Evenzo, als de bundelgrootte te klein is bij het diafragma van de objectieve achterkant, moet een lenspaar met een hoge vergroting worden gebruikt (protocolstap 1.2). SRS schaalt lineair met de modulatiediepte van de Stokes-bundel. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de pulshoogte in het dal <10% is van de pulshoogte op de piek op de oscilloscoop. Slechte modulatie van de Stokes-bundel vertaalt zich direct in slechte SNR.

Bij het gebruik van femtosecondelasers voor SRS-beeldvorming is spectraal scherpstellen nodig om de tijdsvertraging tussen pomp en Stokes om te zetten in Raman-frequentieverschuiving. De conversiefactor is afhankelijk van de hoeveelheid getjilp die wordt toegepast. Het is van cruciaal belang om de GDD van de pomp en Stokes te matchen om een optimale spectrale resolutie te bereiken. De GDD kan worden geschat op basis van de lengte van het gebruikte dispersiemateriaal en de ervan. Zo heeft de SF11 dichte vuursteen glazen staaf een van 123.270 fs²/mm bij 1.040 nm en 187.486 fs²/mm bij 800 nm. Voor 240 mm SF11 in het 800 nm bundelpad is GDD 240 mm × 187.486 fs²/mm = 45.000 fs². Voor 240 mm SF11 in het 1.040 nm bundelpad is de GDD 240 mm × 123.270 fs²/mm = 30.000 fs². Deze voorbeeldberekening houdt in dat er extra glazen staven aan de 1.040 nm-arm moeten worden toegevoegd of dat glazen staven uit de 800 nm-arm moeten worden verwijderd om overeen te komen met GDD. Om een hogere spectrale resolutie te bereiken is een grotere GDD nodig, wat langere staven betekent. Bij de berekening van de GDD zijn de bijdragen van de EOM en de doelstelling echter verwaarloosd. De werkelijke matching van GDD wordt experimenteel bepaald door de beste spectrale resolutie te vinden voor de gegeven staaflengtes op de pomp of de Stokes. De berekeningen dienen als een goede beginstap. Experimentele optimalisatie door iteratieve toevoeging en verwijdering van glazen staven is nog steeds nodig om de spectrale resolutie te optimaliseren.

Het is belangrijk om te beseffen dat een groot getjilp een hogere spectrale resolutie biedt, maar ten koste gaat van de signaalintensiteit. Kleinere tjirps en kortere pulsen zijn gunstig voor weefselbeeldvorming in het C-H-gebied omdat eiwit- en lipide Raman-pieken breed zijn. Lagere spectrale resolutie kan worden ingeruild voor een hoger SRS-signaal (of snellere beeldvormingssnelheid) zonder in te boeten aan tweekleurig weefselcontrast¹⁷. In andere toepassingen waar een hoge spectrale resolutie nodig is, vooral in het vingerafdrukgebied, is het noodzakelijk om een grotere tjilp toe te passen met behulp van lange glazen staven. Als alternatief kan het gemakkelijker zijn om roosterrekbare brancards te gebruiken om langere pulsen te verkrijgen (voor een pulsduur langer dan 3 ps). Een belangrijke beperking van de gebruikte commerciële laser is echter de spectrale bandbreedte. De spectrale dekking van spectraal-focussende SRS is afhankelijk van de bandbreedte van de excitatielasers. Het gebruikte lasersysteem heeft een spectrale dekking die meestal rond de 200-250 ^{cm-1 ligt}. Dit is nauwelijks voldoende om de C-H-regio te bestrijken. Een grotere spectrale dekking is meestal nodig om chemische soorten op te lossen voor beeldvorming in het vingerafdrukgebied. Dit probleem kan worden aangepakt met een fiberlaser add-on die de bandbreedte van de Stokes laser verbreedt van 6 nm naar 60 nm¹⁸. Een andere belangrijke beperking van de tweekleurige SRS-beeldvormingstechniek is dat slechts twee overgangen worden bewaakt. Die aanpak zou ongeschikt zijn voor complexe monsters met veel overlappende Raman-pieken of meerdere soorten.

De real-time tweekleurige SRS-beeldvormingsmethode biedt snelle weefselbeeldvorming door de noodzaak van laser- of vertragingsafstemming te elimineren. Het is echter moeilijk in te stellen vanwege de uitdagingen bij het bereiken van bijna perfecte modulatiediepte voor beide EOM's. Het is het beste om EOM1 en EOM2 onafhankelijk van elkaar te optimaliseren. Als EOM1 is ingeschakeld, moet EOM2 worden losgekoppeld en vice versa. Zodra beide modulaties zijn geoptimaliseerd tot bijna perfectie (>95% modulatiediepte), worden beide EOM's verbonden om orthogonale modulatie mogelijk te maken. De lengte van de tijdsvertraging tussen de twee orthogonale pulstreinen is afhankelijk van de lengte van de BRC en het getjilp. Deze modulatiemethode is niet onmiddellijk haalbaar voor klinische toepassingen, omdat complexe elektronica nodig is om twee RF-pulstreinen te voorzien van een instelbare faseverschuiving om de twee EOM's aan te drijven. De uitlijning van de EOM moet ook bijna perfect zijn om een hoge transmissie, goede modulatie en orthogonaliteit tussen de twee kanalen te garanderen. Deze techniek is algemeen toepasbaar op andere toepassingen die snelle, gelijktijdige beeldvorming van twee Raman-pieken vereisen als gevolg van beweging of monsterveranderingen. Voorbeelden hiervan zijn watertemperatuurmetingen of het volgen van bewegende objecten zoals lipidedruppeltjes of organellen^11,19.

Een robuuste fiberlaser is vereist voor toekomstige klinische toepassingen⁴. De aanpak die in het protocol wordt beschreven, kan ook worden uitgebreid om de acquisitiesnelheid te verbeteren tot de videosnelheid, wat belangrijk is om grote weefselmonsters binnen een redelijke tijd te scannen. Als beeldvormingstijd of bewegingsartefacten geen probleem zijn, kunnen eiwit- en lipide SRS-beelden sequentieel worden verkregen door het gemotoriseerde vertragingsstadium frame voor frame te verplaatsen. Een andere real-time, tweekleurige SRS-beeldvormingsmethode is een tweefasig schema dat de Stokes-bundel recyclet om dezelfde twee orthogonale kanalen²⁰ te bieden. De implementatie van het tweefasenschema vereist echter extra uitlijning waarbij drie balken betrokken zijn. Het vereist ook afstemming van de straalgrootte en divergentie van drie laserstralen. Een mogelijke manier om beide technieken te verbeteren om de gelijktijdige tweekleurenlimiet te overwinnen, is de integratie van een snel instelbare fiberlaser om specifieke spectrale gebieden^{te onderzoeken 21}. De verwerking van afbeeldingen is hetzelfde als beschreven in het protocol om gesimuleerde H & E-afbeeldingen te genereren.

Ten slotte demonstreert dit protocol epi-mode SRS-beeldvorming. Het genereert meestal beelden van lagere kwaliteit in vergelijking met beeldvorming in transmissiemodus voor dunne weefselsecties vanwege het lagere pompvermogen dat de detector^{bereikt 13}. Voor beeldvorming van dik weefsel (>1-2 mm) of monsters die sterk verstrooiend zijn (bijv. Botweefsel), kan beeldvorming in epimodus beter presteren dan beeldvorming in transmissiemodus. Bij het afbeelden van vers weefsel zoals hersenweefsel is de SRS-beeldvormingsdiepte meestal beperkt tot 200-300 μm. Voor vast weefsel is de verstrooiing sterker en is de beelddiepte 100-200 μm. Diepere beeldvorming kan worden bereikt met een hoger vermogen, aberratiecorrectie of optische clearing^22,23. Niettemin is epi-modus beeldvorming een voorkeursbenadering voor weefseldiagnose omdat het geen weefselsectie vereist en de uitlijning eenvoudiger is zonder de hoge NA-condensor. Toekomstige weefseldiagnosetoepassingen zullen profiteren van snelle beeldvorming met een groot gebied op intacte chirurgische monsters, gevolgd door op machine learning / deep learning gebaseerde diagnose. Het hier gepresenteerde protocol is ook geschikt voor in vivo toepassingen, zoals beeldvorming van de hersenen of beeldvorming van de huid, waarbij epi-modus beeldvorming de enige optie is en beeldvorming met hoge snelheid belangrijk is om bewegingsartefacten te voorkomen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.