Imágenes de dispersión Raman estimuladas en dos colores en tiempo real del cerebro del ratón para el diagnóstico de tejidos

Summary

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) es una técnica de imagen potente, no destructiva y sin etiquetas. Una aplicación emergente es la histología Raman estimulada, donde las imágenes SRS de dos colores en las transiciones Raman de proteínas y lípidos se utilizan para generar imágenes de pseudo-hematoxilina y eosina. Aquí, demostramos un protocolo para imágenes SRS de dos colores en tiempo real para el diagnóstico de tejidos.

Abstract

La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) se ha convertido en una poderosa técnica de imagen óptica para el diagnóstico de tejidos. En los últimos años, se ha demostrado que el SRS de dos colores puede proporcionar imágenes equivalentes a hematoxilina y eosina (H&E) que permiten un diagnóstico rápido y confiable del cáncer cerebral. Tal capacidad ha permitido emocionantes aplicaciones de diagnóstico de cáncer intraoperatorio. Las imágenes SRS de dos colores del tejido se pueden realizar con una fuente láser de picosegundos o femtosegundos. Los láseres de femtosegundo tienen la ventaja de permitir modos de imagen flexibles, incluidas imágenes hiperespectrales rápidas e imágenes SRS de dos colores en tiempo real. Un enfoque de enfoque espectral con pulsos láser chirriados se usa típicamente con láseres de femtosegundo para lograr una alta resolución espectral.

La adquisición de SRS de dos colores se puede realizar con modulación ortogonal y detección de bloqueo. La complejidad del canto de pulso, la modulación y la caracterización es un cuello de botella para la adopción generalizada de este método. Este artículo proporciona un protocolo detallado para demostrar la implementación y optimización de SRS de enfoque espectral e imágenes en tiempo real de dos colores del tejido cerebral de ratón en el modo epi. Este protocolo se puede utilizar para una amplia gama de aplicaciones de imágenes SRS que aprovechan la alta velocidad y la capacidad de imágenes espectroscópicas de SRS.

Introduction

El diagnóstico tisular tradicional se basa en protocolos de tinción seguidos de un examen bajo un microscopio óptico. Un método de tinción común utilizado por los patólogos es la tinción H&E: la hematoxilina tiñe los núcleos celulares de un azul violáceo, y la eosina tiñe la matriz extracelular y el citoplasma de rosa. Esta simple tinción sigue siendo el estándar de oro en patología para muchas tareas de diagnóstico de tejidos, particularmente el diagnóstico de cáncer. Sin embargo, la histopatología de H&E, particularmente la técnica de seccionamiento congelado utilizada en un entorno intraoperatorio, todavía tiene limitaciones. El procedimiento de tinción es un proceso laborioso que implica incrustación, seccionamiento, fijación y tinción^{de tejidos 1}. El tiempo de respuesta típico es de 20 minutos o más. Realizar H&E durante la sección congelada a veces puede ser más difícil cuando se procesan varias secciones a la vez debido a la necesidad de evaluar las características celulares o los patrones de crecimiento en 3D para la evaluación de márgenes. Además, las técnicas histológicas intraoperatorias requieren técnicos y clínicos calificados. La limitación en el número de patólogos certificados por la junta en muchos hospitales es una limitación para la consulta intraoperatoria en muchos casos. Tales limitaciones pueden aliviarse con los intereses de rápido desarrollo en patología digital y diagnóstico basado en inteligencia artificial². Sin embargo, los resultados de tinción de H&E son variables, dependiendo de la experiencia del técnico, lo que presenta desafíos adicionales para el diagnóstico por computadora².

Estos desafíos pueden abordarse potencialmente con técnicas de imágenes ópticas sin etiquetas. Una de esas técnicas es la microscopía SRS. SRS utiliza láseres pulsados sincronizados (bomba y Stokes) para excitar vibraciones moleculares con alta eficiencia³. Informes recientes han demostrado que las imágenes SRS de proteínas y lípidos pueden generar imágenes equivalentes a H&E (también conocidas como histología Raman estimulada o SRH) con tejido fresco intacto, lo que evita la necesidad de cualquier procesamiento tisular, acorta significativamente el tiempo necesario para el diagnóstico y se ha adaptado intraoperatoriamente⁴. Además, las imágenes SRS pueden proporcionar imágenes 3D, lo que ofrece información adicional para el diagnóstico cuando las imágenes 2D son insuficientes⁵. La SSR es imparcial y genera imágenes digitales que están fácilmente disponibles para el diagnóstico basado en computadora. Surge rápidamente como una posible solución para el diagnóstico intraoperatorio del cáncer y el análisis del margen tumoral, especialmente en el cáncer cerebral ^6,7,8. Más recientemente, también se ha sugerido que las imágenes SRS de los cambios químicos del tejido proporcionan información diagnóstica útil que puede ayudar aún más a los médicos a estratificar diferentes tipos de cáncer o etapas⁹.

A pesar de su tremendo potencial en aplicaciones de diagnóstico de tejidos, las imágenes SRS se limitan principalmente a laboratorios académicos especializados en óptica debido a la complejidad asociada con la plataforma de imágenes, que incluye láseres ultrarrápidos, el microscopio de escaneo láser y la sofisticada electrónica de detección. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo detallado para demostrar el uso de una fuente láser de femtosegundo común para imágenes SRS de dos colores en tiempo real y la generación de imágenes pseudo-H&E a partir de tejido cerebral de ratón. El protocolo abarcará los siguientes procedimientos:

Optimización de alineación y chirrido
La mayoría de los esquemas de imágenes SRS utilizan láseres de picosegundos o femtosegundos como fuente de excitación. Con los láseres de femtosegundo, el ancho de banda del láser es mucho mayor que el ancho de línea Raman. Para superar esta limitación, se utiliza un enfoque de enfoque espectral para chirriar los láseres de femtosegundo a una escala de tiempo de picosegundos para lograr una resolución espectral estrecha¹⁰. La resolución espectral óptima solo se logra cuando el chirrido temporal (también conocido como dispersión de retardo de grupo o simplemente dispersión) se combina adecuadamente para la bomba y los láseres Stokes. El procedimiento de alineación y los pasos necesarios para optimizar la dispersión de los rayos láser utilizando varillas de vidrio altamente dispersivas se muestran aquí.

Calibración de frecuencia
Una ventaja del SRS de enfoque espectral es que la excitación Raman se puede ajustar rápidamente cambiando el retardo de tiempo entre la bomba y los láseres Stokes. Dicha sintonización ofrece imágenes rápidas y una adquisición espectral confiable en comparación con la sintonización de longitudes de onda láser. Sin embargo, la relación lineal entre la frecuencia de excitación y el retardo de tiempo requiere calibración externa. Los disolventes orgánicos con picos Raman conocidos se utilizan para calibrar la frecuencia Raman para el ENFOQUE espectral SRS.

Imágenes en tiempo real a dos colores
Es importante aumentar la velocidad de las imágenes en las aplicaciones de diagnóstico de tejidos para acortar el tiempo necesario para analizar muestras de tejido grande. Las imágenes simultáneas de SRS de dos colores de lípidos y proteínas evitan la necesidad de ajustar el láser o el retraso de tiempo, lo que aumenta la velocidad de imagen en más del doble. Esto se logra mediante el uso de una novedosa técnica de modulación ortogonal y demodulación de doble canal con un amplificador de bloqueo¹¹. Este artículo describe el protocolo para la modulación ortogonal y la adquisición de imágenes de doble canal.

Imágenes SRS en modo Epi
La mayoría de las imágenes SRS mostradas hasta la fecha se realizan en modo de transmisión. Las imágenes en modo epi detectan fotones retrodispersados del tejido¹². Para aplicaciones de patología, las muestras quirúrgicas pueden ser bastante grandes. Para las imágenes en modo de transmisión, a menudo es necesario seccionar el tejido, lo que indeseablemente requiere tiempo adicional. Por el contrario, las imágenes en modo epi pueden funcionar con muestras quirúrgicas intactas. Debido a que el mismo objetivo se utiliza para recoger la luz retrodispersada, tampoco hay necesidad de alinear un condensador de alta apertura numérica requerido para la transmisión de imágenes. El modo Epi también es la única opción cuando la sección de tejido es difícil, como con el hueso. Anteriormente hemos demostrado que para el tejido cerebral, las imágenes en modo epi ofrecen una calidad de imagen superior para el grosor del tejido > 2 mm¹³. Este protocolo utiliza un divisor de haz polarizador (PBS) para recolectar fotones dispersos despolarizados por el tejido. Es posible recolectar más fotones con un detector anular a expensas de la complejidad del conjunto de detectores^{personalizados 12}. El enfoque PBS es más simple de implementar (similar a la fluorescencia), con el fotodiodo estándar que ya se utiliza para la detección del modo de transmisión.

Generación de imágenes Pseudo-H&E
Una vez que se recopilan las imágenes SRS de dos colores, se pueden volver a colorear para simular la tinción de H&E. Este artículo demuestra el procedimiento para convertir imágenes SRS de lípidos y proteínas en imágenes SRS pseudo-H&E para aplicaciones de patología. El protocolo experimental detalla los pasos críticos necesarios para generar imágenes SRS de alta calidad. El procedimiento que se muestra aquí no solo es aplicable al diagnóstico de tejidos, sino que también se puede adaptar para muchas otras aplicaciones de imágenes srS hiperespectrales, como imágenes de medicamentos e imágenes metabólicas^14,15.

Requisitos generales del sistema
El sistema láser para este protocolo debe ser capaz de emitir 2 rayos láser de femtosegundo sincronizados. Los sistemas cuentan idealmente con un oscilador óptico paramétrico (OPO) para el ajuste de longitud de onda amplia de uno de los rayos láser. La configuración de este protocolo utiliza un sistema láser comercial Insight DS+ que emite dos láseres (un haz fijo a 1.040 nm y un haz sintonizable basado en OPO, que van desde 680 a 1.300 nm) con una tasa de repetición de 80 MHz. Los microscopios de barrido láser, ya sea de los principales fabricantes de microscopios o de fabricación casera, se pueden utilizar para imágenes SRS. El microscopio utilizado es un microscopio de barrido láser vertical construido sobre un marco de microscopio vertical comercial. Se utilizan un par de espejos galvo de 5 mm para escanear el rayo láser. Para los usuarios que elijan adoptar un microscopio de escaneo láser casero, consulte un protocolo publicado previamente para la construcción de un microscopio de escaneo láser¹⁶.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales con animales se llevaron a cabo con cerebros de ratón de 200 μm, fijos y seccionados, de acuerdo con el protocolo (# 4395-01) aprobado por el Comité del Instituto de Cuidado y Uso animal (IACUC) de la Universidad de Washington. Los ratones de tipo salvaje (cepa C57BL/6J) son sacrificados con CO₂. Luego, se realiza una craneotomía para extraer sus cerebros para la fijación en paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato. Los cerebros están incrustados en una mezcla de agarosa al 3% y gelatina al 0,3% y se seccionan en rodajas de 200 μm de espesor mediante un vibratomo.

1. Alineación inicial

NOTA: Asegúrese de que el tamaño del haz y la divergencia de ambos brazos coincidan para obtener la mejor sensibilidad y resolución. Colime la bomba y los haces de Stokes y ajuste sus tamaños antes de que entren en el microscopio de barrido láser. Para hacer esto, use un par de lentes acromáticas para cada haz antes de combinarlas en el espejo dicroico. Siempre use gafas láser adecuadas para la alineación del haz.

1. Colimación de haz
   1. Instale un par de lentes acromáticas para el haz de la bomba. Como punto de partida, use una lente de 100 mm y una lente de 200 mm para aumentar el tamaño del rayo láser en 2 veces. Asegúrese de que la distancia de las dos lentes sea de aproximadamente 300 mm. Alinee el haz de la bomba a través del centro de ambas lentes.
   2. Coloque un espejo después de la segunda lente para enviar el haz hacia una pared (a > 1 m de distancia). Tenga cuidado al enviar el haz a través de largas distancias. Traza el haz desde el espejo hasta la pared con una tarjeta IR y comprueba si el haz cambia de tamaño. Colimar el haz si el haz cambia de tamaño en función de la distancia.
      1. Si el haz está convergiendo (disminuyendo el tamaño con la propagación), acerque las dos lentes.
      2. Si el haz está divergiendo (aumentando el tamaño con la propagación), mueva las dos lentes más separadas. Ajuste la distancia hasta que el haz esté colimado.
   3. Repita los pasos 1.1.1 y 1.1.2 para que el haz de Stokes colime el haz.
2. Ajuste del tamaño del haz
   1. Si hay un perfilador de haz disponible, mida el tamaño del haz colimado para cada haz. Alternativamente, calcule el tamaño del haz utilizando la tarjeta IR y una regla para obtener un diámetro de haz de 4-5 mm.
   2. Si el tamaño del haz es demasiado pequeño o demasiado grande, cambie el par de lentes utilizado en el paso 1.1. Ajuste el par de lentes hasta que ambos haces tengan un diámetro de 4-5 mm.
      NOTA: La ampliación del haz es la relación entre la distancia focal de la segunda lente y la primera lente (f₂/f₁).
3. Superposición espacial
   NOTA: Las imágenes SRS requieren que ambos rayos láser se combinen en el espacio y el tiempo para excitar las vibraciones moleculares. En la Figura 1 se muestra un esquema de la imagen SRS de enfoque espectral.
   1. Combine los dos rayos láser instalando un espejo dicroico con varios espejos de dirección para su ajuste. Optimice la superposición espacial de la bomba y Stokes monitoreando los haces después del espejo dicroico en dos posiciones diferentes muy separadas (~ 1 m). Ajuste iterativamente el espejo de dirección antes del espejo dicroico y el espejo dicroico para alinear el haz stokes con el haz de la bomba.
      NOTA: Si las dos vigas se superponen espacialmente en ambas posiciones, están suficientemente superpuestas.
   2. Asegúrese de que los haces combinados se envíen al centro de los espejos de escaneo del microscopio de escaneo láser ajustando un par de espejos de dirección cuando los espejos de escaneo estén en la posición estacionada. Asegúrese de que ambos haces viajen a través del centro del objetivo del microscopio y el condensador.
   3. Después del condensador, utilice otro par de objetivos con distancias focales de 100 mm y 30 mm, respectivamente, para retransmitir el haz transmitido al fotodiodo. Asegúrese de que ambos haces estén contenidos dentro del fotodiodo e instale dos filtros de paso bajo para bloquear el haz Stokes modulado.

2. Detección de señal SRS

1. Modulación electroóptica (MOE)
   NOTA: La MOE de 20 MHz se utiliza para modular la amplitud de Stokes. Como se discutió más adelante, la MOE se deriva del tren de pulso láser de 80 MHz, que se requiere para la modulación ortogonal. Se pueden usar otras frecuencias de modulación si solo se realiza SRS de un solo color o hiperespectral. En ese caso, la sincronización de la frecuencia de modulación con la frecuencia láser es innecesaria. Se puede utilizar un generador de frecuencia con un amplificador de potencia de RF para impulsar la MOE. Como resultado, se pueden omitir los pasos 2.1.1-2.1.4.
   1. Coloque un muestreador de haz en la trayectoria del haz stokes para recoger el 10% del haz y enviarlo a un fotodiodo rápido para detectar el tren de pulsos de 80 MHz.
      NOTA: La señal de fotodiodo se envía a un divisor de frecuencia para generar una salida TTL de 20 MHz. Esta salida se envía además a un búfer de fanout para replicar la salida en cuatro salidas idénticas de 20 MHz. Una de las salidas se utiliza para activar el osciloscopio.
   2. Tome una de las salidas del búfer de fanout y filtre con un filtro de paso de banda para obtener una onda sinusoidal de 20 MHz. Utilice un atenuador de RF para ajustar el voltaje de pico a pico de salida a ~ 500 mV.
   3. Envíe la salida resultante a una palanca de cambios de fase, que permite un ajuste fino de la fase de RF con una fuente de voltaje. Envíe esta salida a un amplificador de potencia de RF y conecte la salida del amplificador a la MOE.
   4. Desbloquee el haz de Stokes y optimice la profundidad de modulación de EOM1 colocando un fotodiodo en la trayectoria del haz. Ajuste el voltaje de la MOE y la placa de cuarto de onda hasta que la profundidad de modulación (relación valle-pico) parezca satisfactoria.
      NOTA: A una modulación de 20 MHz (1/4 de la tasa de repetición láser), se esperan dos pulsos cada 50 ns.
2. Superposición temporal
   NOTA: La superposición temporal de la bomba y Stokes se logra retrasando uno de los dos trenes de pulsos láser con un retrorreflector montado en una etapa de retardo (la Figura 1 muestra el Stokes retrasado). La superposición gruesa se monitorea con el osciloscopio, y la superposición fina es monitoreada por la señal SRS. La superposición temporal fina también se puede lograr con un autocorrelador si está disponible.
   1. Coloque un fotodiodo después del espejo dicroico para detectar el rayo láser. Bloquea primero la viga stokes. Amplíe uno de los picos de pulso de la bomba en el osciloscopio. Coloque un cursor vertical para marcar la posición temporal de este pico con el osciloscopio.
   2. Bloquee el haz de la bomba y desbloquee el haz de Stokes. Traduzca la etapa de retardo para que coincida temporalmente con la posición máxima en el osciloscopio con la posición marcada en el paso anterior. Consulte la Figura 2 para ver una visualización de la superposición temporal de dos haces.
      1. (OPCIONAL) Si la traslación de la etapa de retardo es insuficiente para que coincida temporalmente con las dos vigas, mueva la etapa de retardo a la mitad de su rango de movimiento.
      2. Calcule la distancia de retardo requerida para que coincida con los dos haces tomando la diferencia temporal entre los dos haces y multiplicando la diferencia por la velocidad de la luz para encontrar la cantidad de distancia necesaria para que coincida con los dos haces temporalmente.
      3. Alargar la trayectoria del haz del haz más rápido o acortar la trayectoria del haz del haz más lento para que coincida aproximadamente con el retraso temporal en consecuencia.
   3. Prepare una muestra de diapositiva de microscopio con DMSO y cinta adhesiva de doble cara como espaciador para mantener la muestra entre la diapositiva y una cubierta.
   4. Coloque la muestra en el microscopio con el lado de la cubierta hacia el objetivo del microscopio. Cambie el microscopio a iluminación de campo brillante y observe la muestra desde el ocular. Encuentre el foco de la muestra encontrando primero el foco en la capa superior e inferior de burbujas de aire en la interfaz vidrio-cinta, y luego mueva el foco para que esté entre las dos capas de cinta.
      NOTA: Asegúrese de que los rayos láser estén bloqueados antes de mirar el ocular.
   5. Ajuste la salida del haz sintonizable a 798 nm. En función del rendimiento óptico del condensador, ajuste la potencia óptica para que sea de ~ 40 mW cada uno para la bomba y los haces stokes en el foco objetivo.
   6. Abra ScanImage en MATLAB (u otro software de escaneo que controle el microscopio) y haga clic en el botón FOCUS para comenzar a escanear.
      NOTA: Los rayos láser se escanearán ráster a través de la muestra para generar una imagen. La salida de señal de baja frecuencia del fotodiodo (<100 kHz) se envía directamente al canal 1 de la tarjeta de adquisición de datos (denominado canal de CC). La salida de alta frecuencia (>100 kHz) del fotodiodo se envía al amplificador de bloqueo, y la salida X de la señal del amplificador de bloqueo se envía al canal 2 de la tarjeta de adquisición de datos (denominado canal de CA).
   7. Ajuste el espejo de dirección antes del escáner galvo para centrar la señal de CC en la pantalla del canal 1. Mueva la etapa de retardo motorizado y observe de cerca la salida de bloqueo que se muestra en la pantalla del canal 2 (es decir, el canal de CA).
      NOTA: Cuando la bomba y Stokes coinciden en el tiempo, aparecerá una señal en el canal de CA. Es útil ajustar la escala de color del canal de CA para mostrar el pequeño cambio de intensidad.
   8. Maximice la intensidad de la señal de CA ajustando finamente el retardo de tiempo. Ajuste el espejo dicroico para centrar la señal SRS en el canal de CA (mientras mantiene el canal de CC centrado). Ajuste la fase del amplificador de bloqueo para maximizar la señal. Consulte la Figura 3 para obtener una señal satisfactoria.

3. Optimización de la resolución espectral

NOTA: La bomba y los haces stokes que llegan a la muestra deben tener la misma cantidad de dispersión de retardo de grupo (GDD) para maximizar la resolución espectral. La dispersión depende en gran medida de la configuración experimental. La configuración experimental descrita aquí utiliza pulsos de femtosegundos a 1.040 nm y 800 nm como Stokes y bomba, respectivamente. Las varillas de vidrio de sílex denso (H-ZF52A) se utilizan como medio de estiramiento por pulso.

1. Inserte 48 cm de una varilla de vidrio altamente dispersiva (H-ZF52A o vidrio de sílex denso equivalente) en la trayectoria del haz de 800 nm. Estimar el GDD usando Eq (1):
   (1)
   NOTA: GVD de varios materiales de vidrio en diferentes longitudes de onda se puede encontrar en el recurso de base de datos de índice de refracción. Por ejemplo, H-ZF52A tiene un GVD de 220.40 fs²/mm a 800 nm. El GDD total es 105792 fs².
2. Calcule cuántos cm de la varilla de vidrio dispersiva se requieren para agregar a la trayectoria del haz de 1.040 nm para que coincida con el GDD de la bomba. Inserte la longitud adecuada de varillas de vidrio dispersivas en la trayectoria del haz de 1.040 nm para que coincida aproximadamente con el GDD del haz de 800 nm. Tenga en cuenta que la adición de varillas de vidrio cambiará la superposición temporal de las dos vigas, y puede ser necesario ajustar el retardo.
3. Calibración de la resolución espectral
   1. Haga una muestra de diapositiva de microscopio con DMSO. Coloque el portaobjetos en el microscopio y compruebe la potencia de los haces que salen del condensador del microscopio. Ajuste la potencia en consecuencia para tener ~ 40 mW cada uno en el enfoque de la muestra.
   2. Abra ScanImage desde MATLAB. Encuentre la señal SRS máxima escaneando a través de la etapa de retardo, que corresponde al pico Raman de 2.913 ^cm-1 de DMSO. Estime la posición de la etapa en función de la posición de la etapa anterior con el aumento de la longitud de la trayectoria óptica debido a la inserción de varillas. Realinear la superposición espacial del haz debido a la pequeña desviación del haz cuando se agregan varillas de vidrio.
   3. Guarde un escaneo SRS hiperespectral tomando secuencialmente una serie de imágenes SRS mientras mueve la etapa motorizada.
      NOTA: El rango de escaneo de retardo cubre dos picos Raman, correspondientes a los picos Raman de ^{2.913 cm-1} y 2.994 ^cm-1 de DMSO, respectivamente. Estas dos transiciones se observan cuando se utiliza una bomba de 800 nm y un láser Stokes de 1.040 nm.
   4. Trazar los espectros SRS de la solución DMSO utilizando ImageJ o MATLAB. Ajuste el pico grande dmSO de 2.913 ^cm-1 a una función gaussiana o lorentziana en MATLAB para calcular el ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) del pico.
      NOTA: Los resultados representativos se muestran en la Figura 4. Si solo hay un pico ancho presente, eso significa que la resolución espectral es demasiado pobre para distinguir los dos picos y se requieren más varillas de vidrio, o que el rango escaneado era demasiado pequeño para detectar el segundo pico. Por lo general, un DMSO de resolución espectral aceptable es de ~ 20-25 ^cm-1 cuando se utilizan varillas de vidrio de >60 cm. A menudo se utiliza una resolución más baja para que las imágenes de tejidos cambien por señales más altas con pulsos más cortos¹⁷.
4. (OPCIONAL) Utilice un autocorrelador o un FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) para determinar la duración del pulso de cada brazo para calcular exactamente la cantidad de GDD y la longitud de las varillas necesarias para que coincida con el GDD entre la bomba y el Stokes.
5. Repita los pasos 3.3.2-3.3.4 para diferentes longitudes de varillas en el haz de Stokes para encontrar la resolución espectral óptima, lo que significa que se ha encontrado experimentalmente la mejor coincidencia de GDD. Utilice múltiples juegos de varillas de vidrio que difieren en longitud para lograr una resolución espectral óptima.

4. Caracterización de señal a ruido (SNR)

1. Asegúrese de que el paso 4.2 se realiza después de una alineación espacial y temporal completa.
2. Adquiera una imagen SRS correspondiente al pico Raman de ^{2.913 cm-1} de DMSO. Abra la imagen en ImageJ y seleccione un área pequeña en el centro del marco. Utilice la función de medida para calcular la media y la desviación estándar de los valores en el área seleccionada.
3. Divida el valor medio del área seleccionada por la desviación estándar para encontrar el valor SNR, como en Eq (2).
   (2)
   NOTA: Un buen SNR para el sistema (con una constante de tiempo de bloqueo de 4 μs) utilizando DMSO a 40 mw / 40 mw en el foco para ambos brazos es >800. Se pueden utilizar concentraciones más bajas de DMSO o menor potencia para una estimación más precisa del SNR si la tarjeta de adquisición de datos tiene una profundidad de bits limitada.
4. Si el SNR es demasiado bajo, realinee los pulsos láser para optimizar la superposición espacial, la superposición temporal, la coincidencia de tamaño de haz / colimación y / o la coincidencia de dispersión. Para un objetivo con un collar de corrección de aberración, optimice la señal ajustando el collar de corrección.

5. Calibración del eje de frecuencia

NOTA: Este paso se realiza para relacionar la posición de la etapa de retardo con la transición Raman escaneada. Se requiere una cuidadosa selección de solventes para generar una "Regla Raman" apropiada. DMSO es un disolvente eficaz para los enlaces CH, ya que tiene dos picos Raman agudos a 2.913 ^cm-1 y 2.994 ^cm-1.

1. Guarde una exploración hiperespectral con el rango de etapas de retardo que cubre los picos Raman de ^{2.913 cm-1} y 2.994 ^cm-1 de DMSO. Guarde las posiciones de escenario correspondientes al conjunto de datos hiperespectrales.
   NOTA: El pico máximo global del espectro corresponde al desplazamiento Raman DMSO 2,913 ^cm-1 y el segundo pico máximo corresponde al desplazamiento Raman DMSO 2,994 ^cm-1 .
2. Realizar regresión lineal para las posiciones de etapa y turnos Raman a 2.913 ^cm-1 y 2.994 ^cm-1. Usando la ecuación de regresión lineal que relaciona la posición de la etapa con el desplazamiento Raman, convierta las posiciones de retardo a las frecuencias Raman correspondientes.

6. Modulación ortogonal e imágenes de dos colores

NOTA: El paso de modulación ortogonal solo es necesario cuando se necesitan imágenes de dos colores en tiempo real. Un esquema de este esquema se muestra en la Figura 5. La modulación ortogonal utiliza un par de EOM accionados a una cuarta parte de la frecuencia del láser (20 MHz para el láser de 80 MHz) con un cambio de fase de 90 ° entre los dos. Este paso de modulación ortogonal se puede omitir para imágenes SRS de un solo color o imágenes SRS hiperespectrales.

1. Modulación EOM1
   1. Instale un PBS (PBS2), una placa de cuarto de onda (QWP2) y una segunda MOE (EOM2) en la trayectoria del haz de Stokes después de la primera MOE. Desenchufe la entrada de señal a EOM2. Conecte la entrada de señal a EOM1 y enciéndala.
   2. Modular el haz de Stokes (fijado a 1.040 nm) a 20 MHz (f₀/4) enviando el haz a través de la primera MOE. Ajuste la inclinación y la posición de EOM1 para asegurarse de que el haz está golpeando recto y centrado a través del cristal de EOM.
   3. Monitoree la profundidad de modulación observando ambas polarizaciones que salen de PBS1 con dos fotodiodos y mostrando la modulación en un osciloscopio.
   4. Ajuste el QWP1, el voltaje EOM1 y la fase de la entrada de 20 MHz (utilizando un cambiador de fase) para optimizar la profundidad de modulación del haz transmitido para que sea cercana al 100%. Consulte la Figura 2B para obtener una ilustración de una buena profundidad de modulación.
2. Modulación EOM2
   1. Desenchufe EOM1 y conecte EOM2.
   2. Envíe la salida de alto voltaje del segundo amplificador a 20 MHz a EOM2. Ajuste la inclinación y la posición de EOM2 para asegurarse de que el haz está golpeando recto y centrado a través del cristal de EOM.
   3. Una vez más, monitoree la profundidad de modulación observando ambas polarizaciones que salen de PBS2 con un osciloscopio. Ajuste el QWP2, el voltaje EOM2 y el cambio de fase según sea necesario para lograr una modulación cercana al 100% para ambas polarizaciones.
   4. Asegúrese de que la modulación del tren de impulsos tenga un cambio de fase de 90° desde la primera modulación.
      NOTA: Si los dos trenes de pulsos de la bomba no son ortogonales de 90°, la diafonía entre los dos canales será un problema.
   5. Pruebe la ortogonalidad de la modulación encendiendo y conectando tanto EOM1 como EOM2. Monitoree ambas polarizaciones divididas por PBS2 con un osciloscopio. Reoptimice EOM1 y EOM2 individualmente si el tren de pulsos después del segundo PBS no se parece a la Figura 2C.
   6. Instale un cristal de cuarzo birrefringente (BRC) de 20 mm y HWP aguas abajo de EOM2. Conecte ambos EOM a la vez y supervise el tren de pulsos de tal manera que se parezca a la Figura 2D.
      NOTA: Para el chirrido utilizado en este experimento, el BRC de 20 mm induce un retardo de tiempo que corresponde a un desplazamiento Raman de 80 ^cm-1 . Es posible que se necesite una longitud de BRC diferente si se usa un chirrido diferente.
3. Calibración
   1. Calibre el sistema utilizando DMSO detectando señales del amplificador de bloqueo X y la salida de canal E Y (enviadas a los canales 2 y 3 de la tarjeta de adquisición de datos).
   2. Compruebe si las señales generadas por el pico de 2.913 ^cm-1 de la polarización más rápida y las de la polarización más lenta están cerca de 90 ° fuera de fase en el amplificador de bloqueo. Si este no es el caso, ajuste la alineación de la MOE hasta que las dos señales estén cerca de 90 ° fuera de fase.
   3. Una vez completada la calibración, encuentre la posición de retardo que sondea la transición de la proteína a 2.930 ^cm-1 para uno de los haces ortogonales. Asegúrese de que la otra polarización sondea la transición lipídica de 2.850 ^cm-1.

7. Imágenes SRS en modo epi

NOTA: En el esquema de imágenes en modo de transmisión, el objetivo enfoca el láser en la muestra y, a continuación, una lente de condensador dirige el haz transmitido a un fotodiodo para la detección de bloqueo. En el esquema de imágenes epi-mode, la luz que es retrodispersada y despolarizada por la muestra es recogida por el objetivo de enfoque y aislada usando un divisor de haz polarizador. Los fotones aislados y retrodispersados se envían a un fotodiodo a través de un par de lentes de relé para la detección de bloqueo. La Figura 6 muestra el esquema de imágenes en modo epi.

1. Instale un HWP antes de que el haz entre en el microscopio para cambiar la polarización del haz que entra en el microscopio. Coloque un PBS sobre el objetivo para permitir que el haz retroexflexionado despolarizado llegue al detector.
2. Utilice un par de lentes que consisten en una lente acromática de 75 mm y una lente asférica de 30 mm para transmitir los fotones retrodispersados desde la apertura posterior del objetivo al fotodetector. Monte el detector para recoger la luz retrodispersada dirigida por el PBS. Instale un filtro para impedir que el haz modulado entre en el detector.
3. Coloque la muestra de tejido debajo del objetivo. Como el condensador es innecesario para las imágenes en modo epi, retírelo si se requiere más espacio.
4. Imagenológico
   1. Bloquee la viga con un obturador; hacer brillar una fuente de luz blanca sobre la muestra desde un lado; y usa brightfield para encontrar un enfoque objetivo.
   2. Desbloquee ambos haces y utilice las posiciones de retardo precalibradas para adquirir imágenes SRS de lípidos y proteínas del tejido de las dos salidas del amplificador de bloqueo.
   3. Ajuste la ganancia de bloqueo y el factor de contenedor de píxeles para adquirir imágenes de buena calidad.

8. Tinción de color falso

1. Abra la pila de imágenes con ImageJ.
2. Extraiga las dos imágenes que corresponden a las especies de lípidos (2.850 ^cm-1) y proteínas (2.930 ^cm-1) haciendo clic con el botón derecho en la imagen y haciendo clic en Duplicar.
3. Cambie el nombre de la imagen lipídica a lípidos y la imagen proteica a proteínas.
4. Ir a procesar | Calculadora de imágenes y realizar proteínas restan lípidos.
5. Combina las imágenes yendo a imagen | | de color Fusionar canales, estableciendo los lípidos en verde y las proteínas en azul. Abra la herramienta de canales de imagen (imagen | | de color Herramienta canales) y ajustar el brillo y el contraste (Imagen | Ajustar | Brillo/Contraste).
6. Ajuste el brillo y el contraste de cada canal con la herramienta canales . Para el canal lipídico, ajuste el contraste hasta que las características celulares aparezcan oscuras. Para el canal de proteína, ajuste el contraste hasta que las características celulares aparezcan azules. Convierta la imagen verde/azul del canal combinado en una imagen RGB yendo a imagen | Tipo | Color RGB. Exportar esta imagen por file | Guardar como | Tiff.
   NOTA: Para la tinción falsa de H&E, el esquema de color muestra citoplasma rosa, mientras que los núcleos son de color azul oscuro-púrpura.
7. Descargue el script HE.m MATLAB desde el recurso de script de tinción falso de H&E en la Tabla de materiales.
8. Ejecute el script HE.m en MATLAB. Seleccione la imagen RGB exportada del paso anterior para generar una imagen teñida artificialmente de H&E.
9. (OPCIONAL) Normalice la intensidad de la imagen para imágenes de campo de visión grande porque la imagen aparece más oscura en la periferia que en el centro.
   1. Para realizar la normalización de campo de las imágenes, promedie tantas imágenes como sea posible. A continuación, elimine las funciones de intensidad con ImageJ (Process | Filtros | | de desenfoque gaussiano Radio=50).
   2. Mida la intensidad máxima de la imagen borrosa (Ctrl+M). Divida la imagen borrosa por la intensidad máxima (Proceso | | matemáticas Dividir). Divida la imagen SRS sin procesar por la imagen borrosa (Proceso | Imagen | Calculadora).

Representative Results

Optimización de la resolución espectral:
La dispersión a través de un material se ve afectada por el medio dispersivo (longitud y material) y la longitud de onda. Cambiar la longitud de la varilla de dispersión afecta la resolución espectral y el tamaño de la señal. Es una relación de toma y daca que se puede sopesar de manera diferente dependiendo de la aplicación. Las varillas estiran el pulso del haz de ser ancho en frecuencia y estrecho en el tiempo a ser estrecho en frecuencia y ancho en el tiempo. La Figura 7 muestra el efecto de las diferentes longitudes de varilla en la resolución espectral. La figura 7A muestra una resolución espectral muy pobre; esta configuración no tiene varillas de chirrido de vidrio, y los dos picos Raman de DMSO no se resuelven en absoluto. En la Figura 7B, C, un aumento en el número de varillas de canto de vidrio comienza a resolver los dos picos. Por último, la Figura 7D muestra cómo el canto emparejado resuelve ambos picos y se puede usar para calibrar las posiciones de la etapa a la frecuencia.

Calibración con DMSO:
DMSO tiene dos picos Raman agudos en 2,913 y 2,994 ^cm-1 que son convenientes para la calibración en la región C-H. Una vez que se obtiene un espectro DMSO de un escaneo SRS hiperespectral, una regresión lineal simple convierte la posición de la etapa en el desplazamiento Raman. Si la resolución espectral es pobre (como se muestra en la Figura 7A) y los dos picos no son separables, entonces la calibración con regresión lineal es imposible. En este caso, es necesario un mejor emparejamiento de dispersión agregando o eliminando varillas de vidrio. Las dificultades más comunes para encontrar una señal DMSO para la calibración se deben a errores en la superposición temporal o en la superposición espacial de los dos haces. Antes de intentar la calibración DMSO, repita los pasos de alineación espacial y temporal para optimizar la señal SRS.

DMSO bicolor:
En el SRS de dos colores, se generan dos trenes de impulsos de bomba con polarización ortogonal con un retardo de tiempo fijo (debido a un cristal birrefringente). La evaluación de la profundidad de modulación y el cambio de fase de 90° se realiza con un fotodiodo seguido de una señal DMSO SRS. La Figura 8 muestra una profundidad de modulación aceptable y una separación temporal. Aunque la resolución espectral de DMSO en la Figura 8 no es ideal, a menudo se sacrifica en experimentos de imágenes de tejidos para lograr una señal más alta con pulsos más cortos. La Figura 9 muestra cambios de fase deficientes que dan lugar a picos invertidos o negativos.

SRS bicolor del tejido cerebral de ratón en modo epi:
El SRS en modo epi (detección de fotones retrodispersados) se utiliza para obtener imágenes de tejido grueso (>1 mm). La Figura 10A, B muestra imágenes SRS de dos colores en tiempo real a 2.850 ^cm-1 y 2.930 ^cm-1 de tejido cerebral de ratón ex vivo . Las imágenes en bruto de los canales de lípidos y proteínas (Figura 10A, B) fueron codificadas por colores para producir una sola imagen que representa las contribuciones de lípidos y proteínas (Figura 10C). Se realizó una tinción falsa de H&E (Figura 10D) en la Figura 10C para imitar la tinción de H&E. La mala calidad de la imagen puede ser el resultado de una gran profundidad de imagen o una calibración deficiente (eje de frecuencia o profundidad de modulación). La profundidad típica de las imágenes en el tejido cerebral es de 100-200 μm¹³.

Figura 1: Esquema de la configuración de imágenes SRS de un solo color. Construcción de un microscopio SRS de enfoque espectral en modo de transmisión. X e Y representan las salidas ortogonales. Abreviaturas: SRS = dispersión Raman estimulada; DL = línea de retardo basada en retrorreflectores; Div = divisor; FB = búfer de fanout; AT = atenuador; PS = cambiador de fase; PA = amplificador de potencia; DCM = espejo dicroico; GM = espejos galvo; EOM = modulador electroóptico; POM = espejo pick-off; PBS = divisor de haz polarizador, BRC = cristal birrefringente; QWP = placa de cuarto de onda; HWP: placa de media onda; PD = fotodiodo; GR = varilla de vidrio; BB = Bloque de haz; SPF = filtro de paso corto; CL = lente colimadora; BS = lente que cambia el tamaño del haz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Superposición temporal representativa. (A) Se observa que la bomba y los haces de Stokes se superponen temporalmente en el osciloscopio. Los cursores del osciloscopio se utilizan para marcar las posiciones temporales de la bomba y los haces de Stokes. Esta superposición es satisfactoria como punto de partida para ajustar aún más la superposición temporal con una etapa de retraso. (B) Profundidad de modulación representativa satisfactoria de una MOE a 20 MHz. (C) Modulación de pulso satisfactoria mientras se utilizan dos MOE. (D) Modulación satisfactoria del tren de impulsos después de la instalación de cristal de cuarzo birrefringente y placa de media onda en el brazo stokes doblemente modulado. Abreviatura: EOM = modulador electroóptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: SrS representativo y señales de bomba. (A) Señal de bomba desalineada detectada en el canal de CC. (B) Señal SRS desalineada detectada por fotodiodo. (C) Señal de bomba satisfactoria y centrada en el canal de CC. (D) Señal SRS satisfactoria centrada en el canal de CA. Abreviatura: SRS = dispersión Raman estimulada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Caracterización de la resolución espectral. Una función gaussiana se ajustó al pico Raman DMSO ^{de 2.913 cm-1} . El FWHM calculado dio una resolución de 15 ^cm-1 para el sistema. Abreviaturas: DMSO = dimetilsulfóxido; FWHM = Ancho completo a la mitad máximo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Esquema de la configuración de imágenes SRS de dos colores. Construcción de un microscopio SRS bicolor en modo de transmisión. X e Y representan las salidas ortogonales. Abreviaturas: DL = línea de retardo basada en retrorreflectores; Div = divisor; FB = búfer de fanout; AT = atenuador; PS = cambiador de fase; PA = amplificador de potencia; DCM = espejo dicroico; GM = espejos galvo; EOM = modulador electroóptico; PBS = divisor de haz polarizador; BRC = cristal birrefringente; QWP = placa de cuarto de onda; HWP = placa de media onda; PD = fotodiodo; GR = varilla de vidrio; BB = Bloque de haz, SPF = filtro de paso corto; CL = lente colimadora; POM = espejo pick-off; BS = lente que cambia el tamaño del haz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Esquema de la configuración en modo Epi de imágenes SRS de dos colores. Construcción de un microscopio SRS de dos colores en el modo epi. X e Y representan las salidas ortogonales. Abreviaturas: DL = línea de retardo basada en retrorreflectores; Div = divisor; FB = búfer de fanout; AT = atenuador; PS = cambiador de fase; PA = amplificador de potencia; DCM = espejo dicroico; GM = espejos galvo; EOM = modulador electroóptico; PBS = divisor de haz polarizador; BRC = cristal birrefringente; QWP = placa de cuarto de onda; HWP = placa de media onda; PD = fotodiodo; GR = varilla de vidrio; BB = Bloque de haz, BPF = filtro de paso de banda; CL = lente colimadora; POM = espejo pick-off; BS = lente que cambia el tamaño del haz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Optimización de la resolución espectral con 25% de DMSO. (A) Se utilizaron varillas de chirrido de vidrio cero para obtener el espectro DMSO. Los dos picos no están resueltos. (B) Se utilizaron varillas de canto de vidrio, 20 cm en el brazo de la bomba y 24 cm en el brazo stokes. Dos picos están empezando a resolverse hasta un punto satisfactorio. (C) Se utilizaron varillas de chirrido, bomba de 40 cm de largo y Stokes de 24 cm de largo, para obtener un espectro DMSO mejor resuelto. (D) Se utilizaron varillas de chirrido, bomba de 64 cm de largo y Stokes de 60 cm de largo, para obtener una mayor resolución espectral. Abreviatura: DMSO = dimetilsulfóxido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: SRS bicolor, polarización variable y retardo de tiempo. Se utilizan dos trenes de pulsos diferidos en el tiempo de polarización ortogonal (s&p) para obtener imágenes de espectros DMSO para mostrar el retraso de tiempo (y la diferencia de frecuencia Raman) entre las excitaciones SRS. Abreviaturas: DMSO = dimetilsulfóxido; SRS = dispersión Raman estimulada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Espectro SRS resultante de un cambio de fase SRS de dos colores deficiente. Un pico negativo de 2.994 ^cm-1 cerca de la posición de etapa 48 es indicativo de una mala diferencia de fase. Abreviatura: SRS = dispersión Raman estimulada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Generación de falsas tinciones H&E bicolores de imágenes SRS. (A) Imagen de SRS de proteína cruda de un tejido cerebral de ratón en la transición de 2.930 ^cm-1 . (B) Imagen de SRS lipídico crudo del tejido cerebral del ratón en la transición de 2.850 ^cm-1 . (C) Canales fusionados y codificados por colores de A y B con aporte lipídico en verde y aporte proteico en azul. (D) Se realizó una recoloración falsa de H&E en C para imitar la tinción de H&E para aplicaciones patológicas. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: SRS = dispersión Raman estimulada; H&E = hematoxilina y eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El esquema de imágenes SRS de dos colores presentado en este protocolo depende de la implementación adecuada de imágenes SRS de un solo color. En las imágenes SRS de un solo color, los pasos críticos son la alineación espacial, la alineación temporal, la profundidad de modulación y el cambio de fase. La combinación espacial de los dos haces se logra mediante un espejo dicroico. Se utilizan varios espejos de dirección para un ajuste fino al enviar las vigas al espejo dicroico. Una vez que los haces se combinan con el espejo dicroico, la alineación espacial se puede confirmar seleccionando la trayectoria combinada del haz con un espejo para enviar hacia una pared a > 1 m de distancia mientras se verifica el haz combinado para ver si se superpone con una tarjeta IR. Siguiendo la alineación espacial a través del microscopio, la superposición temporal se realiza ajustando la longitud de la trayectoria con una etapa de retardo basada en retrorreflectores, que tiene el beneficio de preservar la alineación espacial. El brazo de 1.040 nm es el haz retardado en este protocolo. La superposición temporal es imposible si la etapa de retardo no tiene el rango para hacer que los dos haces se superpongan temporalmente. En ese caso, puede ser necesario mover toda la etapa de retardo a una ubicación diferente para garantizar que la superposición temporal esté cerca del rango medio del escaneo de retardo. Por ejemplo, si la diferencia temporal entre los dos haces se mide como 6 ns, entonces se requieren 1,8 m de ajuste. El ajuste requerido denota la longitud de elongación de la trayectoria del haz para el haz más rápido o el acortamiento de la trayectoria del haz para el haz más lento.

Además de la alineación, la coincidencia del tamaño del haz y la modulación del haz stokes también son importantes para maximizar la señal SRS. Idealmente, ambos haces deben colimarse en el plano objetivo y coincidir con el tamaño de la apertura posterior del objetivo. Es útil comprobar la colimación y el tamaño del haz si el plano objetivo está expuesto al usuario. Si el haz está convergiendo o divergiendo, es necesario ajustar la segunda lente del par de lentes de colimación para lograr la colimación (paso de protocolo 1.1). Del mismo modo, si el tamaño del haz es demasiado pequeño en la apertura posterior del objetivo, se debe utilizar un par de lentes con gran aumento (paso de protocolo 1.2). SRS escala linealmente con la profundidad de modulación del haz de Stokes. Es importante asegurarse de que la altura del pulso en el valle sea <10% de la altura del pulso en el pico en el osciloscopio. La mala modulación del haz de Stokes se traduce directamente en un SNR deficiente.

Cuando se utilizan láseres de femtosegundo para imágenes SRS, el enfoque espectral es necesario para convertir el retardo de tiempo entre la bomba y Stokes en un cambio de frecuencia Raman. El factor de conversión depende de la cantidad de chirrido aplicado. Es fundamental que coincida con el GDD de la bomba y Stokes para lograr una resolución espectral óptima. El GDD se puede estimar en función de la longitud del material de dispersión utilizado y su GVD. Por ejemplo, la varilla de vidrio de sílex denso SF11 tiene un GVD de 123.270 fs²/mm a 1,040 nm y 187.486 fs²/mm a 800 nm. Para 240 mm de SF11 en la trayectoria del haz de 800 nm, GDD es de 240 mm × 187.486 fs²/mm = 45,000 fs². Para 240 mm de SF11 en la trayectoria del haz de 1.040 nm, el GDD es de 240 mm × 123.270 fs²/mm = 30.000 fs². Este cálculo de ejemplo significa que se deben agregar varillas de vidrio adicionales al brazo de 1.040 nm, o se deben quitar varillas de vidrio del brazo de 800 nm para que coincidan con GDD. Para lograr una mayor resolución espectral, se requiere un GDD más grande, lo que significa varillas más largas. Sin embargo, al calcular el GDD, se han descuidado las contribuciones de la MOE y el objetivo. La coincidencia real de GDD se determina experimentalmente mediante la búsqueda de la mejor resolución espectral para las longitudes de varilla dadas en la bomba o el Stokes. Los cálculos sirven como un buen paso inicial. La optimización experimental a través de la adición iterativa y la eliminación de varillas de vidrio sigue siendo necesaria para optimizar la resolución espectral.

Es importante darse cuenta de que un gran chirrido proporciona una mayor resolución espectral, pero a expensas de la intensidad de la señal. Los chirridos más pequeños y los pulsos más cortos son beneficiosos para las imágenes de tejidos en la región C-H porque los picos Raman de proteínas y lípidos son amplios. La resolución espectral más baja se puede cambiar por una señal SRS más alta (o una velocidad de imagen más rápida) sin sacrificar el contraste de tejido de dos colores¹⁷. En otras aplicaciones donde se necesita una alta resolución espectral, especialmente en la región de huellas dactilares, es necesario aplicar un chirrido más grande utilizando varillas de vidrio largas. Alternativamente, podría ser más fácil usar camillas de rejilla para obtener pulsos más largos (para una duración del pulso superior a 3 ps). Sin embargo, una limitación principal del láser comercial utilizado es su ancho de banda espectral. La cobertura espectral del SRS de enfoque espectral depende del ancho de banda de los láseres de excitación. El sistema láser utilizado tiene una cobertura espectral típicamente alrededor de 200-250 ^cm-1. Esto es apenas suficiente para cubrir la región C-H. Por lo general, se necesita una cobertura espectral más grande para resolver las especies químicas para obtener imágenes en la región de las huellas dactilares. Este problema se puede abordar con un complemento láser de fibra que amplía el ancho de banda del láser Stokes de 6 nm a 60 nm¹⁸. Otra limitación importante de la técnica de imagen SRS de dos colores es que solo se monitorean dos transiciones. Ese enfoque no sería adecuado para muestras complejas con muchos picos Raman superpuestos o múltiples especies.

El método de imágenes SRS de dos colores en tiempo real ofrece imágenes de tejidos de alta velocidad al eliminar la necesidad de láser o ajuste de retardo. Sin embargo, es difícil de configurar debido a los desafíos para lograr una profundidad de modulación casi perfecta para ambas MOE. Es mejor optimizar EOM1 y EOM2 de forma independiente. Si EOM1 está activado, entonces EOM2 debe desconectarse y viceversa. Una vez que ambas modulaciones se optimizan casi a la perfección (>95% de profundidad de modulación), ambas EOM se conectan para permitir la modulación ortogonal. La duración del retardo de tiempo entre los dos trenes de pulso ortogonales depende de la longitud del BRC y del chirrido. Este método de modulación no es inmediatamente factible para aplicaciones clínicas, ya que se necesita electrónica compleja para proporcionar dos trenes de pulsos de RF con un cambio de fase sintonizable para impulsar los dos EOM. La alineación de la MOE también debe ser casi perfecta para garantizar una alta transmisión, una buena modulación y ortogonalidad entre los dos canales. Esta técnica es generalmente aplicable a otras aplicaciones que requieren imágenes rápidas y simultáneas de dos picos Raman debido al movimiento o cambios de muestra. Los ejemplos incluyen mediciones de la temperatura del agua o seguimiento de objetos en movimiento como gotas de lípidos u orgánulos^11,19.

Se requiere un láser de fibra robusto para futuras aplicaciones clínicas⁴. El enfoque descrito por el protocolo también podría extenderse para mejorar la velocidad de adquisición hasta la velocidad de video, lo cual es importante para escanear muestras de tejido grande dentro de un tiempo razonable. Si el tiempo de imagen o los artefactos de movimiento no son una preocupación, entonces las imágenes DE SRS de proteínas y lípidos se pueden adquirir secuencialmente moviendo la etapa de retardo motorizada fotograma a fotograma. Otro método de imagen SRS de dos colores en tiempo real es un esquema de doble fase que recicla el haz de Stokes para proporcionar los mismos dos canales ortogonales²⁰. Sin embargo, la implementación del esquema de doble fase requiere una alineación adicional que involucra tres haces. También requiere la coincidencia del tamaño del haz y la divergencia de tres rayos láser. Una vía potencial para mejorar ambas técnicas para superar el límite simultáneo de dos colores es la incorporación de un láser de fibra rápidamente sintonizable para sondear regiones espectrales específicas²¹. El procesamiento de imágenes es el mismo que se describe en el protocolo para generar imágenes simuladas de H&E.

Finalmente, este protocolo muestra imágenes SRS en modo epi. Por lo general, genera imágenes de menor calidad en comparación con las imágenes en modo de transmisión para secciones de tejido delgado debido a la menor potencia de la bomba que llega al detector¹³. Para imágenes de tejido grueso (>1-2 mm) o muestras que son altamente dispersas (por ejemplo, tejido óseo), las imágenes en modo epi pueden funcionar mejor que las imágenes en modo de transmisión. Cuando se toman imágenes de tejido fresco, como el tejido cerebral, la profundidad de las imágenes SRS generalmente se limita a 200-300 μm. Para el tejido fijo, la dispersión es más fuerte y la profundidad de imagen es de 100-200 μm. Se pueden lograr imágenes más profundas con mayor potencia, corrección de aberraciones o limpieza óptica^22,23. Sin embargo, las imágenes en modo epi es un enfoque preferible para el diagnóstico de tejidos porque no requieren ninguna sección de tejido y la alineación es más simple sin el condensador de NA alto. Las futuras aplicaciones de diagnóstico de tejidos se beneficiarán de imágenes rápidas y de área grande en muestras quirúrgicas intactas, seguidas de un diagnóstico basado en aprendizaje automático / aprendizaje profundo. El protocolo presentado aquí también es adecuado para aplicaciones in vivo, como imágenes cerebrales o imágenes de la piel, donde las imágenes en modo epi es la única opción, y las imágenes de alta velocidad son importantes para evitar artefactos de movimiento.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatic Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1,050 nm, achromatic lens focal length, 200 mm
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatic Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Other dichroics with a center wavelength around 1,000 nm can be used.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Solvent for calibration of Raman shift. Other solvents with known Raman peaks can be used.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Two EOMs are needed for orthogonal modulation and dual-channel imaging. Resonant version is recommended so lower driving voltage can be used.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer and Line Driver, for generating the EOM driving frequency and the reference to the lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), for generating 20MHz from the laser output.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	High dispersion H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Laser system capable of outputting two synchronzied pulsed lasers (one fixed beam at 1, 040 nm and one tunable beam, ranging from 680-1,300 nm) with a repetition rate of 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in amplifier to extract SRS signal from the photodiode. A Zurich Instrument HF2LI or similar instrument can be used as well.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1,100 nm. Silver mirrors can also be used.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage for fine control of the temporal overlap of the pump and the Stokes lasers. Any other motorized stage should work.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. Other condensers with NA>1.2 can be used.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Any other oscilloscope with 400 MHz bandwdith or higher should work.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	For shifting the phase of the modulation frequency
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN diode with large area (10 x 10 cm2). Other diodes with large area and low capacitance can be used.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polarizing beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Other prisms or retroreflector can be used.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We used a 5mm mirror set with silver coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscope control software
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1,000 nm. For efficient suppression of the Stokes, two filters may be necessary.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Any other microscope frame can be used. If a laser scanning microscope is available, it can be used directly. Otherwise, a galvo scanner and scan lens needed to be added to the microscope.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	The multiphoton 25X Objective has a NA of 1.05. Other similar objectives can be used.