Summary
Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind kurze RNA-Moleküle, die in Eukaryoten weit verbreitet sind. Die meisten miRNAs werden von Introns transkribiert, und ihre Reifung umfasst verschiedene RNA-bindende Proteine im Zellkern. Reife miRNAs vermitteln häufig Gen-Silencing, und dies ist zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um posttranskriptionelle Ereignisse zu verstehen. Darüber hinaus kann es als vielversprechende Methodik für Gentherapien erforscht werden. Derzeit fehlen jedoch direkte Methoden zur Beurteilung der miRNA-Expression in Säugetierzellkulturen. Hier beschreiben wir eine effiziente und einfache Methode, die bei der Bestimmung der miRNA-Biogenese und -Reifung durch Bestätigung ihrer Interaktion mit Zielsequenzen hilft. Dieses System ermöglicht auch die Trennung der exogenen miRNA-Reifung von ihrer endogenen Aktivität unter Verwendung eines Doxycyclin-induzierbaren Promotors, der in der Lage ist, die primäre miRNA (pri-miRNA) -Transkription mit hoher Effizienz und niedrigen Kosten zu steuern. Dieses Werkzeug ermöglicht auch die Modulation mit RNA-bindenden Proteinen in einem separaten Plasmid. Neben der Verwendung mit einer Vielzahl verschiedener miRNAs und ihren jeweiligen Targets kann es an verschiedene Zelllinien angepasst werden, sofern diese transfektionsfähig sind.
Introduction
Das Vorläufer-mRNA-Spleißen ist ein wichtiger Prozess für die Regulation der Genexpression in Eukaryoten1. Die Entfernung von Introns und die Vereinigung von Exons in reifer RNA wird durch das Spleißosom katalysiert, einen 2-Megadalton-Ribonukleoproteinkomplex, der aus 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 und U6) zusammen mit mehr als 100 Proteinen 2,3 besteht. Die Spleißreaktion erfolgt kotranskriptionell, und das Spleißosom wird an jedem neuen Intron zusammengesetzt, geleitet durch die Erkennung konservierter Spleißstellen an Exon-Intron-Grenzen und innerhalb des Introns4. Verschiedene Introns können trotz der bemerkenswerten Erhaltung des Spleißosomenkomplexes und seiner Komponenten unterschiedliche Spleißraten aufweisen. Zusätzlich zu den Unterschieden in der Konservierung von Spleißstellen können regulatorische Sequenzen, die auf Introns und Exons verteilt sind, RNA-bindende Proteine (RBP) steuern und das Spleißen stimulieren oder unterdrücken 5,6. HuR ist ein ubiquitär exprimiertes RBP und ein wichtiger Faktor zur Kontrolle der mRNA-Stabilität7. Frühere Ergebnisse unserer Gruppe zeigten, dass HuR an Introns binden kann, die miRNAs enthalten, was darauf hindeutet, dass dieses Protein ein wichtiger Faktor sein könnte, um die miRNA-Verarbeitung und -Reifung zu erleichtern, was auch zur Erzeugung alternativer Spleißisoformenführt 6,8,9.
Viele microRNAs (miRNAs) werden aus intronischen Sequenzen kodiert. Während einige Teil des Introns sind, sind andere als "Mirtrons" bekannt und werden vom gesamten Intron10,11 gebildet. miRNAs sind kurze nicht-kodierende RNAs mit 18 bis 24 Nukleotiden der Länge12. Ihre ausgereifte Sequenz zeigt eine teilweise oder vollständige Komplementarität mit Zielsequenzen in mRNAs, was sich auf die Translations- und/oder mRNA-Zerfallsraten auswirkt. Die Kombinationen von miRNAs und Targets treiben die Zelle zu unterschiedlichen Ergebnissen. Mehrere miRNAs können Zellen zu pro- oder antitumoralen Phänotypen treiben13. Onkogene miRNAs zielen in der Regel auf mRNAs ab, die eine suppressive Eigenschaft auslösen, was zu einer erhöhten Zellproliferation, Migration und Invasion führt14. Auf der anderen Seite könnten tumorsuppressive miRNAs auf onkogene mRNAs oder mRNAs abzielen, die mit einer erhöhten Zellproliferation zusammenhängen.
Auch die Verarbeitung und Reifung von miRNAs hängt von ihrer Herkunft ab. Die meisten intronischen miRNAs werden unter Beteiligung des Mikroprozessors verarbeitet, der aus der Ribonuklease Drosha und den Protein-Cofaktoren12 besteht. Mirtrons werden mit der Aktivität des Spleißosoms unabhängig von Drosha15 verarbeitet. In Anbetracht der hohen Häufigkeit von miRNAs, die in Introns gefunden werden, stellten wir die Hypothese auf, dass RNA-bindende Proteine, die am Spleißen beteiligt sind, auch die Verarbeitung und Reifung dieser miRNAs erleichtern könnten. Bemerkenswerterweise wurde das RBP hnRNP A2/B1 bereits mit dem Mikroprozessor und der miRNA-Biogeneseassoziiert 16.
Wir haben bereits berichtet, dass mehrere RNA-bindende Proteine, wie hnRNPs und HuR, durch Massenspektrometrie mit intronischen miRNAs assoziiert sind17. Die Assoziation von HuR (ELAVL1) mit miRNAs aus dem intronischen Cluster miR-17-92 wurde mittels Immunpräzipitation und In-silico-Analyse bestätigt9. miR-17-92 ist ein intronischer miRNA-Cluster, der aus sechs miRNAs mit erhöhter Expression bei verschiedenen Krebsarten besteht18,19. Dieser Cluster wird auch als "oncomiR-1" bezeichnet und besteht aus miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b und miR-92 a. miR-19 a und miR-19b gehören zu den onkogensten miRNAs dieses Clusters 19. Die erhöhte Expression von HuR stimuliert die miR-19a- und miR-19b-Synthese 9. Da intronische Regionen, die diesen Cluster flankieren, mit HuR assoziiert sind, haben wir eine Methode entwickelt, um zu untersuchen, ob dieses Protein die Expression und Reifung von miR-19a und miR-19b regulieren kann. Eine wichtige Vorhersage unserer Hypothese war, dass HuR als regulatorisches Protein die miRNA-Biogenese erleichtern könnte, was zu phänotypischen Veränderungen führt. Eine Möglichkeit war, dass miRNAs durch die Stimulation von HuR verarbeitet wurden, aber nicht ausgereift und funktionsfähig wären und daher die Auswirkungen des Proteins den Phänotyp nicht direkt beeinflussen würden. Daher haben wir einen Spleißreporter-Assay entwickelt, um zu untersuchen, ob ein RBP wie HuR die Biogenese und Reifung einer intronischen miRNA beeinflussen könnte. Durch die Bestätigung der miRNA-Prozessierung und -Reifung zeigt unser Assay die Interaktion mit der Zielsequenz und die Erzeugung einer reifen und funktionellen miRNA. In unserem Assay koppeln wir die Expression eines intronischen miRNA-Clusters mit einem Luciferase-Plasmid, um die miRNA-Target-Bindung in kultivierten Zellen zu überprüfen.
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Protocol
Eine Übersicht über das hier beschriebene Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Plasmidaufbau
- pCAGGS-Cre: Dieses Plasmid wurde von Dr. E. Makeyev21 zur Verfügung gestellt.
- pRD-miR-17-92:
- Amplifizieren Sie pre-miR-17-92 durch PCR unter Verwendung von 0,5 μM jedes spezifischen Primers (Table of Materials), 150 ng cDNA, 1 mM dNTPs, 1x Taq PCR-Puffer und 5 U High-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase. Führen Sie eine PCR-Reaktion ohne Schablonenkontrolle durch (verwenden Sie Wasser anstelle von cDNA), um nach DNA-Verunreinigungen zu suchen.
- Ligate das PCR-Produkt in pRD-RIPE (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. E. Makeyev, Nanyang Technological University, Singapore)21 innerhalb des Introns zwischen den EcoRI- und EcoRV-Restriktionsstellen unter Verwendung von DNA-Ligase, wodurch pRD-miR-17-92 entsteht. Bestätigen Sie die Sequenzintegrität durch Sanger-Sequenzierung.
- pmiRGLO-RAP-IB
- Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärtsprimer, flankiert von XhoI/XbaI-Restriktionsstellen und mit einer NotI-Restriktionsstelle im Inneren. Mischen Sie äquimolare Mengen von Vorwärts- und Rückwärtsprimern und inkubieren Sie die Mischung bei 90 °C für 5 min, dann auf 37 °C für 15 min. Verwenden Sie als Steuerelemente Primer mit verschlüsselten Zielsequenzen (Table of Materials).
- Spaltet die geglühten Fragmente mit XhoI/XbaI-Restriktionsenzymen und ligiert sie stromabwärts der luc2-Sequenz in pmiR-GLO, wodurch pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) und pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled) Reporterkonstrukte erzeugt werden. Bestätigen Sie die Ligatur mit NotI-Spaltung.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Überhänge, die nach dem Primerglühen entstehen, komplementär zum Vektor nach der Spaltungsreaktion sind.
- pFLAG-HuR
- Um ein HuR-überexprimierendes Plasmid zu erzeugen, amplifizieren Sie die HuR-Sequenz mit spezifischen Primern. Mischen Sie 300 ng cDNA, 0,5 μM jedes spezifischen Primers, 1 mM dNTPs-Mix, 1x PCR-Puffer und 5 U High-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase.
- Ligate das PCR-Produkt in pGEM-T und Bestätigung der DNA-Sequenzintegrität durch Sanger-Sequenzierung. Entfernen Sie das HuR-Fragment aus pGEM-T und subklonen Sie es in den pFLAG-CMV-3-Säugetierexpressionsvektor, um den pFLAG-HuR-Vektor zu erzeugen.
2. Zellkultur
HINWEIS: Die HeLa-Cre-Zelllinie war ein Geschenk von Dr. E. Makeyev21, und die papilläre Schilddrüsenkrebszelle (BCPAP) wurde freundlicherweise von Dr. Massimo Santoro (Universität "Federico II", Neapel, Italien) zur Verfügung gestellt. HeLa-Zelle, papilläre Schilddrüsenkrebszelle (BCPAP) und HEK-293T wurden verwendet, um HuR zu überexprimieren.
- Halten Sie die Zellen in DMEM / hoher Glukose, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 1 mM Natriumpyruvat, 200 mM L-Glutamin und 1x Penicillin-Streptomycin (100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin) in 100 mm Petrischale, sofern nicht anders angegeben. Die Zellen werden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit kontrollierter Atmosphäre (5% CO2) inkubiert.
- Adhärente Zellen mit Trypsin/EDTA (0,5%ige Lösungsmischung) bei 37 °C für 3-5 min inkubieren. Lassen Sie sie sich von der Platte lösen (die Inkubationszeit kann je nach Zelltyp variieren).
- Führen Sie Transfektionen mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Stellen Sie sicher, dass die Zellkulturen zu ca. 70% konfluent sind. Verwenden Sie ähnliche DNA-Mengen für alle Transfektionskombinationen, wie unten beschrieben, indem Sie die entsprechenden DNAs hinzufügen. Durchführung von Transfektionsexperimenten in Replikaten.
- Mischen Sie 200 ng DNA und 1,25 μL Transfektionsreagenz in 100 μL des Kulturmediums. Fügen Sie die Transfektionsmischung zu den Zellen hinzu. Die Zellen mit den Transfektionsmischungen 4 h bei 37 °C inkubieren. Dann ersetzen Sie das Medium durch ein Medium, das 10% FBS enthält, und inkubieren Sie für weitere 24 Stunden, bevor Sie die Antibiotika zur Auswahl hinzufügen.
3. HuR-Überexpression
- Transfizieren Sie pFLAG-HuR und leeren Sie pFLAG in HeLa. Selektieren Sie Zellen, indem Sie die Konzentration von Geneticin (G418) (1 μg / ml) von 100 μg / ml auf 1000 μg / ml erhöhen, wodurch stabile Zelllinien erzeugt werden.
- Bestätigen Sie die Überexpression mit quantitativer PCR unter Verwendung spezifischer Primer für HuR-mRNA, wie in Schritt 7 beschrieben.
4. Gesamt-RNA-Isolierung
- Verwenden Sie frisch gesammelte Zellen. Trypsinisieren von 70% konfluenten Zellkulturen (für diesen Assay wurden HeLa-Cre-Zellen verwendet), wie in Schritt 2.2 beschrieben.
- Das Zellpellet wird 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugiert und mit 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gewaschen; Wiederholen Sie die Zentrifugation.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml 1x PBS und geben Sie es in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren.
- Wiegen Sie das Trockenzellenpellet und passen Sie das Volumen und die Größe der Röhrchen entsprechend an. 1 mg Zellen ergeben etwa 1 μg Gesamt-RNA.
- In einer Haube 500-1.000 μL Phenol / Chloroform in das Zellpellet geben (idealerweise 750 μL pro 0,25 g Zellen) und homogenisieren Sie es, indem Sie auf und ab pipettieren und mit dem Wirbel mischen.
- Inkubieren Sie die Mischung für 5 min bei Raumtemperatur (20 °C bis 25 °C), um die vollständige Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe zu ermöglichen.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
- Den Überstand in ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 200 μL Chloroform pro 1 mL verwendetem Phenol:Chloroform hinzufügen. Verschließen Sie die Probenröhrchen sicher.
- 15 s kräftig mischen (von Hand oder kurz bei geringerer Geschwindigkeit wirbeln) und bei Raumtemperatur (20 °C bis 25 °C) 2 min bis 3 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.
- Überprüfen Sie, ob eine untere rote Phenol-Chloroform-Phase, eine Zwischenphase und eine farblose obere wässrige Phase vorhanden sind. RNA verbleibt in der oberen wässrigen Phase. Sammeln Sie in einer Haube die wässrige Phase, vermeiden Sie den Kontakt mit der Zwischenphase und übertragen Sie sie in ein frisches Röhrchen.
- Fällen Sie RNA aus, indem Sie die wässrige Phase mit 400 μL Isopropanol in molekularer Qualität (1: 1-Verhältnis zu Phenol / Chloroform verwendet) und 2 μL Glykogen in jedem Röhrchen mischen (es hilft, das Vorhandensein des Pellets sichtbar zu machen).
- Von Hand kräftig mischen oder mit der Spitze für ~10 s homogenisieren. 15 min oder über Nacht bei −20 °C inkubieren.
- Die Probe wird bei 12.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Waschen Sie das RNA-Pellet durch Zugabe von 3 Volumina 100% Ethanol (ca. 1 ml, verdünnt mit DEPC-Wasser) und mischen Sie die Probe durch Wirbeln, bis das Pellet freigesetzt ist und vom Boden schwimmt.
- Zentrifugieren bei 7.500 x g für 5 min bei 4 °C.
- Waschen Sie das RNA-Pellet 1x durch Zugabe von 1 ml 75% Ethanol und mischen Sie die Probe durch Wirbeln, bis das Pellet freigesetzt ist und vom Boden schwimmt. Wiederholen Sie die Zentrifugation wie in Schritt 4.17 beschrieben.
- Führen Sie einen zusätzlichen Zentrifugationsschleuder von 5 s durch, um Restflüssigkeit von der Seite des Röhrchens zu sammeln und Restflüssigkeit mit einer Pipette zu entfernen, ohne das Pellet zu stören.
- Trocknen Sie das RNA-Pellet kurz an der Luft, indem Sie die Kappe des Röhrchens bei Raumtemperatur für 3-5 min öffnen und lösen Sie das RNA-Pellet in 20-50 μL RNase-freiem DEPC-behandeltem Wasser auf. Inkubieren Sie die RNA für 10 min bei 55-60 °C, um die Resuspension des Pellets zu erleichtern.
5. Bestimmung der Gesamt-RNA-Konzentration und -Qualität
- Bestimmen Sie die RNA-Konzentration, indem Sie die Absorption bei 260 nm und 280 nm mit einem Spektralphotometer messen. Erhalten Sie vollständige spektrale Daten, bevor Sie die Proben in nachgelagerten Anwendungen verwenden.
- Kontrollieren Sie die RNA-Qualität, indem Sie 800-1000 ng auf einem 1,5% igen Agarosegel unter Verwendung eines 0,5-fachen FSME-Puffers (45 mM Tris-Base, 45 mM Borsäure, 1 mM EDTA) auflösen. Die Gesamt-RNA trennt sich in zwei Banden, die sich auf 28S- und 18S-rRNAs beziehen.
- Stellen Sie alle Reagenzien her und waschen Sie alle Geräte, die für den Betrieb des Gels verwendet werden, mit DEPC-behandeltem Wasser. DEPC-behandeltes Wasser wird in der Haube durch Zugabe von 1 ml Diethylpyrocarbonat zu 1000 ml Reinstwasser hergestellt. Inkubieren für ~2 h bei Raumtemperatur oder bei 37 °C und Autoklav. Bei Raumtemperatur bis zu 10 Monate lagern.
HINWEIS: Die Elektrophorese von Säugetier-Gesamt-RNAs führt zur Trennung von 28S- und 18S-rRNAs in einem Verhältnis von etwa 2:1. Die Bänder sollten intakt und als zwei scharfe Bänder sichtbar sein. Degradierte RNA führt zu verschwommenen Banden.
- Stellen Sie alle Reagenzien her und waschen Sie alle Geräte, die für den Betrieb des Gels verwendet werden, mit DEPC-behandeltem Wasser. DEPC-behandeltes Wasser wird in der Haube durch Zugabe von 1 ml Diethylpyrocarbonat zu 1000 ml Reinstwasser hergestellt. Inkubieren für ~2 h bei Raumtemperatur oder bei 37 °C und Autoklav. Bei Raumtemperatur bis zu 10 Monate lagern.
6. Reverse Transkription
- Stellen Sie die umgekehrte Transkriptionsreaktion mit 1 μg Gesamt-RNA ein.
- Führen Sie eine umgekehrte Transkription (RT) unter Verwendung des Enzyms der reversen Transkriptase (siehe Materialtabelle) und 50 ng/μL zufälliger Decamer-Primer durch.
- Mischen Sie RNA, zufällige Primer und 1 mM dNTP-Mischung (10 mM) in 10 μL. Inkubieren Sie bei 65 °C für 5 min und auf Eis für 1 min. Fügen Sie die folgenden Reagenzien hinzu: 1x RT-Puffer, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U RNase-Inhibitor und 200 U Reverse Transkriptase.
- Inkubieren Sie für 10 min bei 25 °C und für 1 h bei 50 °C (die Temperaturen können sich ändern, wenn verschiedene Enzyme verwendet werden). Beenden Sie die Reaktion durch Inkubation bei 85 °C für 5 min. cDNAs können bei −20 °C gelagert werden.
7. Quantitative PCR
- Um die Reaktion in einem Endvolumen von 15 μL zusammenzusetzen, mischen Sie 3 μL cDNA (100 ng / μL), 3,2 pmol jedes Primers, 6 μL Master-Mix, die die dNTPs und das Enzym enthält, und 2,8 μL Reinstwasser.
HINWEIS: Verwenden Sie Primer für endogene konstitutive Gene als Kontrollen (Housekeeping-Gene), um die Expressionsniveaus von HuR-mRNA und miRNAs zu normalisieren. β-Actin und snRNA U6 (RNU6B) sind verfügbare Optionen für die Normalisierung von mRNAs bzw. miRNAs, aber je nach Fall können auch andere Gene geeignet sein. - Quantifizieren Sie die Expressionsniveaus mit der Delta-Delta-Ct-Methode (2-ΔΔCt)20.
8. Der Reporter-Assay
- Für den Assay verwendete Zellen
- Transfizieren Sie die Plasmide in HeLa-Cre-Zellen wie folgt. Transfekt mit pTK-Renilla (40 ng), dann pRD-miR-17-92, Erzeugung von HeLa-Cre-miR-17-92 und Selektion mit 1 μg/ml Puromycin.
- Transfect HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla mit pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR oder pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, separat. Wählen Sie mit Penicillin (100 U / ml) und Streptomycin (100 μg / ml). Diese Transfektionen erzeugen Luc-RAP-1-B und Luc-scrambled.
- Transfizieren Sie die Zellen mit pFLAG-HuR oder leerem pFLAG (Schritt 3).
- Fahren Sie mit der Zellkultur fort, wie in Schritt 2.2. beschrieben, mit HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR und HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc bis etwa 80% des Zusammenflusses. Mit 1 μL Doxycyclin (1 μg/ml) für 30 min bei 37 °C induzieren. Halten Sie auch alle Zellen ohne Doxycyclin als Kontrollen für den gleichen Zeitraum.
HINWEIS: Die endgültige Konzentration von Doxycyclin hängt von der Zelllinie der Wahl ab. Ein Überschuss an Doxycyclin kann für Säugetierzellen toxisch sein.
- Lumineszenz-Assay
- Um verschiedene Lumineszenzintensitäten zu quantifizieren und zu vergleichen, verwenden Sie das Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit. Luciferase-Assay-Lösungen auftauen und bei Raumtemperatur belassen, bevor Sie mit dem Assay beginnen.
- Bereiten Sie die Mischung Stop und Glo (blaue Kappenröhrchen) vor, indem Sie 200 μL des Substrats in 10 mL Luciferase Assay Buffer II mischen. Bereiten Sie die Mischung LAR II (Green Cap Tubes) vor, indem Sie 10 ml Luciferase Assay Buffer II in die bernsteinfarbene Durchstechflasche von Luciferase Assay Substrat II mischen und gut schütteln.
- Übertragen Sie die Lösungen in 15-ml-Zentrifugenröhrchen, die zuvor identifiziert und vor Licht geschützt wurden.
HINWEIS: Alternativ können die Lösungen zuvor in 1-2 mL Aliquots hergestellt und bei −80 °C lichtgeschützt in Aluminiumfolie eingefroren werden. - Führen Sie die Lumineszenzmessungen mit einem Gerät wie Synergy durch. Maß ausgedrückt Luciferase als relative Lichteinheiten (RLU).
- Exportieren Sie die Ergebnisse zur weiteren statistischen Analyse in eine Tabelle.
- Führen Sie eine Normalisierung der Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität durch die Steuerung Renilla (Luciferase / Renilla) durch und zeichnen Sie diese als relative Lichteinheiten (RLU) in einer Grafik auf. Wiederholen Sie dies für Gruppen mit und ohne Doxycyclin-Induktion.
- Berechnen Sie den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts (SEM). Führen Sie einen studentischen t-Test oder eine Zwei-Wege-ANOVA durch, gefolgt von Tukeys Post-Test, um einen Gruppenvergleich zu ermöglichen. Diese Analysen sind in einem Paket wie GraphPad Prism verfügbar. Unterschiede bei p-Werten < 0,05 gelten als signifikant.
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Representative Results
Unsere ursprüngliche Hypothese war, dass HuR die intronische miRNA-Biogenese erleichtern könnte, indem es an seine Prä-miRNA-Sequenz bindet. So könnte der Zusammenhang von HuR-Expression und miR-17-92-Clusterbiogenese auf einen neuen Mechanismus hinweisen, der die Reifung dieser miRNAs steuert. Die Überexpression von HuR bei Transfektion von pFLAG-HuR wurde in drei verschiedenen Zelllinien bestätigt: HeLa, BCPAP und HEK-293T (Abbildung 2). Als Kontrollen wurden untransfizierte Zellen und Zellen verwendet, die mit leeren pFLAG-Vektoren transfiziert wurden. Wichtig ist, dass wir beobachteten, dass die HuR-Überexpression in diesen Zellen die Expression von miR-19a stimuliert (ergänzende Tabelle 1 Ergebnisse berichtet in Gatti da Silva et al.9).
Um zu bestätigen, dass die induzierten miRNAs wirklich funktionsfähig sind, wurde ein In-vitro-Reportersystem entwickelt, wie hier beschrieben. Das künstliche Intron in pRD-RIPE trennt zwei kodierende Regionen von eGFP. Diese Kassette wird von einem Tetracyclin-responsiven Element (TRE) gesteuert. Die Expression von eGFP wird somit durch die Anwesenheit des Antibiotikums Doxycyclin (DOX) im Zellmedium gesteuert (Abbildung 3).
Eine In-silico-Suche mit miRbase und TargetScan ergab mögliche mRNA-Targets für miR-19 a und miR-19 b (Komponenten des miR-17-92-Clusters). Als potenzielles Ziel für beide miRNAs wurde die Sequenz 5' TTTGCACA 3' gewählt, die in der RAP-IB 3' UTR-Region gefunden wurde (Zusatztabelle 2). RAP-IB ist ein GTPase-Mitglied der Ras-assoziierten Proteinfamilie (RAS). Die induzierten miRNAs waren in unserem Assay korrekt verarbeitet und funktionsfähig, als sie mit der Zielsequenz hybridisierten, die neben Luciferase kloniert wurde (siehe Abbildung 3, pmiR-UGLO Target). Daher blockierte es die Luciferase-Translation, was sich in einer reduzierten Luciferase-Aktivität widerspiegelte (Abbildung 3). Als Kontrolle für diesen Assay haben wir die Zielsequenz verschlüsselt und durch 5' GGGTAAA 3' in Luc-verschlüsseltem Plasmid ersetzt (Ziel- und verschlüsselte Sequenzen sind in den Oligosequenzen in der Materialtabelle unterstrichen).
Unter normalen Bedingungen und ohne Induktion des pRD-miR-17-92-Plasmids fanden endogenes miR-19a und/oder miR-19b das Ziel auf pmiR-GLO, was zu einer reduzierten Luciferase-Aktivität führte (Daten nicht gezeigt). Nach DOX-Supplementierung wurde eine leichte und nicht statistisch signifikante Verringerung der Luciferase-Aktivität in Zellen mit einer verschlüsselten Zielsequenz beobachtet. Dies könnte auf das Vorhandensein von Zielsequenzen für andere miRNAs in dieser Sequenz zurückzuführen sein. Eine starke Reduktion der Luciferase-Aktivität wurde mit RAP-IB 3'UTR bei erhöhter miR-19 a und miR-19b-Expression von pRD-miR-17-92 im Vergleich zu HeLa-Cre-Zellenbeobachtet (siehe Abbildung 4, vergleiche orange und schwarze Balken). Die Transfektion von pFLAG-HuR in diesen Zellen allein veränderte die Luciferase-Aktivität nicht (siehe Abbildung 4, vergleiche graue und schwarze Balken). Die Überexpression von HuR in Verbindung mit einer Doxycyclin-Supplementierung, die die Expression des miR-17-92-Clusters stimulierte, reduzierte jedoch die Luciferase-Aktivität weiter (siehe Abbildung 4, vergleiche graue und rote Balken). Dies deutet auf eine positive Regulation von HuR über miR-19 a und miR-19 b hin, gekoppelt mit korrekter Verarbeitung und Reifung dieser miRNAs, die erfolgreich ihre Ziele finden konnten (HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc) (siehe Abbildung 4).
Die Verwendung dieses Reportersystems bestätigte, dass HuR die Expression und korrekte Reifung von miR-19 a und miR-19b in HeLa-Zelleninduziert.
Abbildung 1: Eine konzeptionelle Übersicht über das hier beschriebene Protokoll. Plasmide, die miRNA, Zielsequenz, regulatorisches Protein und pTK-Renilla enthielten, wurden in kultivierten Zellen transfiziert. Nach der Antibiotikaselektion wurden diese Zellen zur Induktion der miRNA-Expression (mit Doxycyclin), mit anschließender Quantifizierung der Luciferase-Aktivität und für die RNA-Analyse zur Bestätigung der HuR-Überexpression verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bestätigung der FLAG-HuR-Überexpression in (A) HeLa-, (B) BCPAP- und (C) HEK293T-Zellen durch qPCR. Als Kontrolle wurde die Transfektion mit leerem pFLAG verwendet (weiße Balken). β-Aktin wurde verwendet, um Ct-Werte zu normalisieren. Die y-Achse stellt die nach der Normalisierung berechnete Faltenänderung des Ausdrucks dar. Die Fehlerbalken stellen Standardfehler dar, die aus drei unabhängigen Messungen berechnet werden. **P <0,005, ****P < 0,0005 (Abbildung nach Gatti da Silva et al.9). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Intronisches miRNA-Reportersystem. (A) Schematische Darstellung des pRD-RIPE-Plasmids, das pRD-miR-17-92 erzeugte. pre-miR-17-92 wurde in das Intron eingeführt und stand unter der Kontrolle eines Dox-induzierbaren Promotors; rechts das pmiR-GLO Plasmid mit RAP-IB 3'UTR Zielsequenz (pmiRGLO-RAP-IB); die Steuerung hatte die verschlüsselte Zielsequenz (pmiRGLO-scrambled). (B) Einzelheiten zur Sequenz von pmiRGLO-RAP-IB mit Schwerpunkt auf der Zielsequenz komplementär zu miR-19 a und miR-19b. Die Luciferase-Aktivität wird durch die Interaktion von miRNA und dem Target reduziert (Abbildung adaptiert von Gatti da Silva et al.9). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: HeLa-Cre-Zellen wurden zusammen mit den Reporterplasmiden pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-scrambled, pRD-miR-17-92 und pFLAG-HuR transfiziert. Luciferase-Aktivität auf nicht transfizierten HeLa-Cre-Zellen (schwarz), HeLa-Cre miR-17-92-verschlüsselt (weiß), HeLa-Cre-HuR (grau), HeLa-Cre miR-17-92-luc (orange) und HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (rot). Die Luciferase-Aktivität wurde wie im Protokoll beschrieben als relative Aktivität von Glühwürmchen-Luciferase zu Renilla luciferase (beobachtet mit pTK-Renilla) quantifiziert und nach Doxycyclin-Zugabe normalisiert. Sie wird als "relative Light Units" (RLU) auf der y-Achse dargestellt. **P < 0,005; P < 0,0005 (Abbildung nach Gatti da Silva et al.9). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Tabelle 1: Rohe Ct-Werte, die für qPCR zur Analyse der miR-19-Expression beobachtet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: RAP-IB 3'UTR-Sequenz und miR-19-Zielsequenz. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Das Pre-mRNA-Spleißen ist ein wichtiger Prozess für die Regulation der Genexpression, und seine Kontrolle kann starke Auswirkungen auf die phänotypischen Modifikationen der Zellen auslösen22,23. Mehr als 70% der miRNAs werden von Introns beim Menschen transkribiert, und wir stellten die Hypothese auf, dass ihre Verarbeitung und Reifung durch Spleißen regulatorischer Proteine erleichtert werden könnte24,25. Wir haben eine Methode entwickelt, um die intronische miRNA-Prozessierung und -Funktion in kultivierten Zellen zu analysieren. Unser Assay verwendet vier verschiedene Plasmide und ermöglicht es uns, die Reifung von endogenen und exogenen oder induzierten miRNAs zu testen. Die hier beschriebene Methode kann in 2-3 Tagen durchgeführt werden und erfordert keine teuren Reagenzien.
In Anbetracht der Tatsache, dass HuR ein RNA-bindendes Protein ist, das für die mRNA-Stabilität wichtig ist und mit miR-18 und miR-19a miRNAs 17 immun gefällt wird, testete dieser Assay, ob es die intronische miRNA-Biogenese und -Reifung vorantreiben kann. HuR wird nicht im Kern von Spleißosomen gefunden, sondern interagiert mit Proteinen, die an der mRNA-Stabilisierung beteiligt sind26. Konsequenterweise wurde die Überexpression von HuR mit der Entwicklung von Eierstock- und Blasenkrebs in Verbindung gebracht27,28. In papillären Schilddrüsenkrebszellen beobachteten wir, dass HuR die Zellproliferation, Migration und Invasion erhöht9. HuR beeinflusst auch die mRNA-Stabilität von Zellzyklusregulatoren wie PTEN, Cyclin A2 und Cyclin D2, erhöht die Zellproliferation und -migration und führt zu tumorigenen Eigenschaften29,30. Ein signifikanter Teil dieser mRNAs hat jedoch auch Zielsequenzen für miR-19 a und miR-19b. Insbesondere kann HuR an die intronische Region binden, in der diese miRNAs transkribiert werden, was zu der Vorstellung führt, dass es das Spleißen und die Reifung dieser miRNAskontrollieren und folglich die tumorigenen Eigenschaften verbessern kann.
Um das zu testen, wurde dieser Assay mit vier verschiedenen Plasmiden entwickelt. Die erste enthält den miRNA-Cluster miR-17-92 , der in ein Intron eingefügt wird, und seine Expression wird durch Doxycyclin-Addition gesteuert. Das zweite Plasmid ist das kommerzielle pmiR-GLO mit der Zielsequenz neben den 3' des luc2-Gens. Die Bindung der miRNA an diese Zielsequenz beeinflusst die luc2-Expression, die mit einem Lumineszenztest gemessen werden kann. Das dritte Plasmid ist pFLAG-HuR, das die Überexpression dieses regulatorischen Proteins induziert. Schließlich wird pTK-Renilla auch verwendet, um die Renilla-Luciferase-Fluoreszenz einzubeziehen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass HuR die miR-17-92-Expression stimuliert und die Assoziation seiner Komponenten mit den Zielsequenzen erhöht, was zu reifen und funktionellen miRNA-Molekülen führt. Wir beschreiben die Assoziation von HuR mit miRNA in einem anderen Paper9. Die in dieser Studie verwendeten Zielsequenzen waren spezifisch für miR-19 a und miR-19b miRNAs. Diese Methode kann jedoch auch an die Verwendung kürzerer oder längerer Zielsequenzen angepasst werden, einschließlich mehrerer Zielorte. In diesem Fall muss eine unspezifische Bindung endogener miRNAs an die Zielsequenz oder nahegelegene Sequenzen bei der Analyse berücksichtigt werden. Die verwendeten Sequenzen können andere mögliche Zielstellen haben, die die Luciferase-Aktivität beeinflussen könnten. Die hier beschriebene Methode könnte auch verwendet werden, um verschiedene Ziele einer miRNA oder einer Gruppe von miRNAs zu validieren, die zusammen transkribiert wurden, was funktionelle Studien von miRNAs und ihren spezifischen phänotypischen Veränderungen ermöglicht. Es sollte auch beachtet werden, dass es ermöglicht, die Ergebnisse zwischen verschiedenen Zelllinien und genetischen Hintergründen zu vergleichen.
Die kritischsten Schritte für die breitere Anwendung dieses Protokolls in Säugetierzellen sind die Effizienz der Transfektions- und Induktionsschritte. Da verschiedene Plasmide in die Zellen transfiziert werden, sind auch adäquate Kontrollen von entscheidender Bedeutung. Diese Parameter ändern sich mit der Größe der Plasmide und werden durch die lange Zeit in der Zellkultur beeinflusst. Daher ist ein wichtiger Punkt, der vor Beginn des Assays zu berücksichtigen ist, die Leichtigkeit der Transfektion der ausgewählten Zellen. Darüber hinaus kann der umfangreiche Einsatz verschiedener Antibiotika zur Selektion der verschiedenen Plasmide (Gentamicin, Puromycin und Doxycyclin) und zur Aktivierung der Expression für die Zellen schädlich sein und die Effizienz der folgenden Experimente verringern. Es ist wichtig, dass dieser Assay zunächst mit Zellen mit bekannter Transfektionseffizienz optimiert wird.
Der Reporter zeigte erfolgreich, dass eine erhöhte HuR-Expression die miRNA-Biogenese induzieren könnte und bestätigte ihre funktionelle Reifung. Wichtig ist, dass die Überexpression von HuR die Menge des produzierten Introns nicht beeinflusste, da wir in diesem Zustand keine reduzierte Luciferaseaktivität beobachteten (Abbildung 4). Weitere Experimente können durchgeführt werden, um RBPs und miRNAs mit diesem Reportersystem zu charakterisieren. Zum Beispiel wäre es wichtig, einzelne Mutationen in miRNA-Sequenzen oder in ihren flankierenden Regionen zu erzeugen und den Einfluss regulatorischer Proteine auf die miRNA-Biogenese zu analysieren. Dies würde die spezifische Charakterisierung der Biogenese einzelner miRNAs ermöglichen und könnte auch das Wissen über konservierte Sequenzen für die miRNA-Prozessierung und -Reifung verbessern.
Wir betrachten dies als einen wichtigen methodischen Beitrag zur Untersuchung der miRNA-Biogenese und -Reifung und der Rolle des Spleißens regulatorischer Proteine in diesen Prozessen. Es könnte auch auf Studien zur Regulation und Kontrolle von mRNAs und miRNAs in verschiedenen Zelltypen angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapur) für die HeLa-Cre-Zellen und pRD-RIPE- und pCAGGS-Cre-Plasmide. Wir danken Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes und Anselmo Moriscot für ihre Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
|
| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
|
| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
|
| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
|
| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
|
| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
|
| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
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