Summary
우리는 네 개의 플라스미드를 가진 시험관 내에서 세포에서 사용되는 인트로닉 마이크로RNA 생물발생 리포터 어세이를 개발하였다: 하나는 인트로닉 miRNA를 가지고 있고, 하나는 표적을 가지고 있고, 다른 하나는 조절 단백질을 과발현하기 위해, 다른 하나는 레닐라 루시페라제이다. miRNA를 처리하고, 표적 서열에 결합함으로써 루시퍼라제 발현을 조절할 수 있었다.
Abstract
마이크로RNA(miRNAs)는 진핵생물에 널리 퍼져 있는 짧은 RNA 분자이다. 대부분의 miRNA는 인트론으로부터 전사되며, 이들의 성숙은 핵에서 상이한 RNA 결합 단백질을 포함한다. 성숙한 miRNA는 종종 유전자 침묵을 매개하며, 이것은 전사 후 사건을 이해하는 데 중요한 도구가되었습니다. 그 외에도, 그것은 유전자 치료를위한 유망한 방법론으로 탐구 될 수 있습니다. 그러나, 현재 포유동물 세포 배양물에서 miRNA 발현을 평가하기 위한 직접적인 방법이 부족하다. 여기에서는 표적 서열과의 상호작용의 확인을 통해 miRNA 생물발생 및 성숙을 결정하는 데 도움이 되는 효율적이고 간단한 방법을 설명한다. 또한, 이 시스템은 일차 miRNA(pri-miRNA) 전사를 고효율 및 저비용으로 제어할 수 있는 독시사이클린-유도성 프로모터를 사용하여 그의 내인성 활성으로부터 외인성 miRNA의 성숙을 분리할 수 있게 한다. 이 도구는 또한 별도의 플라스미드에서 RNA 결합 단백질로 조절을 허용한다. 다양한 상이한 miRNAs 및 이들의 각각의 표적과의 그의 용도 이외에도, 이들은 형질감염에 적합할 수 있는 한, 상이한 세포주에 적응될 수 있다.
Introduction
전구체 mRNA 스플라이싱은 진핵생물1에서 유전자 발현 조절을 위한 중요한 과정이다. 성숙한 RNA에서 인트론의 제거와 엑손의 연합은 100개 이상의 단백질 2,3과 함께 5개의 snRNA(U1, U2, U4, U5 및 U6)로 구성된 2메가달톤 리보뉴클레오단백질 복합체인 스플라이시오좀에 의해 촉매된다. 스플라이싱 반응은 공동-전사적으로 발생하고, 스플라이세오좀은 엑손-인트론 경계 및 인트론4 내에서 보존된 스플라이스 부위의 인식에 의해 유도되는 각각의 새로운 인트론에서 조립된다. 다른 인트론은 스플라이 케오솜 복합체와 그 구성 요소의 놀라운 보존에도 불구하고 다른 접합 속도를 가질 수 있습니다. 스플라이스 부위 보존의 차이 외에도, 인트론 및 엑손에 분포된 조절 서열은 RNA 결합 단백질(RBP)을 안내하고 스플라이싱 5,6을 자극하거나 억제할 수 있다. HuR은 유비쿼터스하게 발현된 RBP이며, mRNA 안정성을 조절하는데 중요한 인자이다7. 우리 그룹의 이전 결과는 HuR이 miRNA를 포함하는 인트론에 결합 할 수 있음을 보여 주었고,이 단백질이 miRNA 처리 및 성숙을 촉진하는 중요한 요소가 될 수 있음을 나타내며 대체 접합 이소폼 6,8,9의 생성으로 이어졌습니다.
많은 마이크로RNA(miRNAs)는 인트로닉 서열로부터 코딩된다. 일부는 인트론의 일부인 반면, 다른 일부는 "미르트론"으로 알려져 있으며 전체 인트론10,11에 의해 형성됩니다. miRNAs는 길이 12에서 18 내지 24 뉴클레오티드 범위의 짧은 비코딩 RNA이다. 이들의 성숙 서열은 mRNAs에서 표적 서열과 부분적 또는 전체 상보성을 보여주며, 따라서 번역 및/또는 mRNA 붕괴율에 영향을 미친다. miRNA와 표적의 조합은 세포를 다른 결과로 이끈다. 몇몇 miRNA는 세포를 프로- 또는 항-종양 표현형(13)으로 구동시킬 수 있다. 종양원성 miRNA는 일반적으로 억제 특성을 유발하는 mRNA를 표적으로 하여, 증가된 세포 증식, 이동 및 침윤(14)을 유도한다. 한편, 종양-억제 miRNA는 증가된 세포 증식과 관련된 종양원성 mRNA 또는 mRNA를 표적으로 할 수 있다.
miRNA의 처리 및 성숙은 또한 그들의 기원에 의존한다. 대부분의 인트로닉 miRNA는 마이크로프로세서의 참여로 처리되며, 리보뉴클레아제 드로샤 및 단백질 보조인자(12)에 의해 형성된다. Mirtrons는 Drosha15와 독립적으로 스플라이 커오좀의 활성으로 처리됩니다. 인트론 내에서 발견되는 miRNA의 높은 빈도를 고려할 때, 우리는 스플라이싱과 관련된 RNA 결합 단백질이 또한 이러한 miRNA의 처리 및 성숙을 촉진 할 수 있다고 가정했습니다. 특히, RBP hnRNP A2/B1은 이미 마이크로프로세서 및 miRNA 생물발생(16)과 연관되었다.
우리는 이전에 hnRNP 및 HuR과 같은 여러 RNA 결합 단백질이 질량 분광법17에 의해 인트로닉 miRNA와 관련이 있다고보고했습니다. miR-17-92 인트로닉 클러스터로부터의 miRNAs와의 HuR's (ELAVL1) 연관성은 면역침전 및 실리코 분석9를 사용하여 확인하였다. miR-17-92는 상이한 암18,19에서 증가된 발현을 갖는 6개의 miRNA로 구성된 인트로닉 miRNA 클러스터이다. 이 클러스터는 또한 "oncomiR-1"로 알려져 있으며, miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b 및 miR-92a로 구성된다. HuR의 증가된 발현은 miR-19a 및 miR-19b 합성 9를 자극한다. 이 클러스터를 둘러싸고 있는 인트로닉 영역이 HuR과 연관되어 있기 때문에, 우리는 이 단백질이 miR-19a 및 miR-19b 발현 및 성숙을 조절할 수 있는지 조사하는 방법을 개발했다. 우리의 가설에 대한 한 가지 중요한 예측은 조절 단백질로서 HuR이 miRNA 생물발생을 촉진하여 표현형 변화를 일으킬 수 있다는 것입니다. 한 가지 가능성은 miRNA가 HuR의 자극에 의해 처리되었지만 성숙하고 기능적이지 않으므로 단백질의 효과가 표현형에 직접적인 영향을 미치지 않는다는 것입니다. 따라서 우리는 HuR과 같은 RBP가 인트로닉 miRNA의 생물 발생 및 성숙에 영향을 줄 수 있는지 여부를 조사하기 위해 접합 리포터 분석을 개발했습니다. miRNA 처리 및 성숙을 확인함으로써, 우리의 분석은 표적 서열과의 상호작용 및 성숙하고 기능적인 miRNA의 생성을 보여준다. 우리의 분석에서, 우리는 배양 된 세포에서 miRNA 표적 결합을 확인하기 위해 인트로닉 miRNA 클러스터의 발현을 루시퍼라제 플라스미드와 결합시킵니다.
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Protocol
여기에 설명된 프로토콜의 개요는 그림 1에 설명되어 있습니다.
1. 플라스미드 구성
- pCAGGS-Cre: 이 플라스미드는 E. Makeyev박사 21에 의해 제공되었다.
- pRD-miR-17-92:
- 0.5 μM의 각 특정 프라이머 (표 물질), 150 ng의 cDNA, 1 mM dNTPs, 1x Taq PCR 버퍼 및 5 U의 고충실도 Taq DNA 중합효소를 사용하여 PCR에 의해 pre-miR-17-92를 증폭시킨다. 주형 대조군 없는 PCR 반응(cDNA 대신 물 사용)을 수행하여 DNA 오염을 확인합니다.
- PCR 산물을 pRD-RIPE(싱가포르 난양 기술 대학교 E. Makeyev 박사가 친절하게 제공함)21 DNA 리가아제를 사용하여 EcoRI와 EcoRV 제한 부위 사이의 인트론 내부에 넣어 pRD-miR-17-92를 만듭니다. Sanger 시퀀싱을 통해 시퀀스 무결성을 확인합니다.
- pmiRGLO-RAP-IB
- XhoI/XbaI 제한 부위와 내부에 하나의 NotI 제한 부위가 있는 정방향 및 역방향 프라이머를 설계합니다. 등몰량의 정방향 및 역방향 프라이머를 혼합하고, 혼합물을 90°C에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 15분 동안 37°C로 옮긴다. 대조군으로, 스크램블링된 표적 서열이 있는 프라이머를 사용하십시오 (표 재료).
- XhoI/XbaI 제한 효소를 사용하여 어닐링된 단편을 절단하고 luc2 서열의 하류에서 pmiR-GLO로 리게이트하여 pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) 및 pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled) 리포터 구축물을 생성한다. NotI 절단으로 결찰을 확인하십시오.
참고: 프라이머 어닐링 후에 생성된 오버행이 절단 반응 후 벡터에 상보적인지 확인하십시오.
- pFLAG-HuR
- HuR 과발현 플라스미드를 생성하려면, HuR 서열을 특이적 프라이머로 증폭시킨다. 300 ng의 cDNA, 0.5 μM의 각 특정 프라이머, 1 mM dNTPs 믹스, 1x PCR 버퍼 및 5 U의 고충실도 Taq DNA 중합효소를 혼합한다.
- PCR 산물을 pGEM-T로 리게이트하고 생어 시퀀싱에 의해 DNA 서열 완전성을 확인하였다. pGEM-T로부터 HuR 단편을 제거하고, 이를 pFLAG-CMV-3 포유동물 발현 벡터 내로 서브클로닝하여 pFLAG-HuR 벡터를 생성한다.
2. 세포 배양
참고 : HeLa-Cre 세포주는 E. Makeyev21 박사의 선물이었으며 유두상 갑상선 암 세포 (BCPAP)는 Massimo Santoro 박사 (University "Federico II", Naples, Italy)가 친절하게 제공했습니다. HeLa 세포, 유두상 갑상선암 세포 (BCPAP) 및 HEK-293T를 사용하여 HuR을 과발현시켰다.
- 달리 명시되지 않는 한, 100mm 페트리 접시에 10% 태아 소 혈청, 1mM 소듐 피루베이트, 200mM L-글루타민 및 1x 페니실린-스트렙토마이신(100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신)이 보충된 DMEM/고포도당에 세포를 유지한다. 세포를 가습된, 제어된 분위기 인큐베이터(5%CO2)에서 37°C에서 인큐베이션한다.
- 부착성 세포를 트립신/EDTA(0.5% 용액 혼합물)로 3-5분 동안 37°C에서 배양한다. 플레이트에서 분리하십시오 (배양 기간은 세포 유형에 따라 다를 수 있음).
- 제조업체의 지시에 따라 지질 기반 형질감염 시약으로 형질감염을 수행하십시오. 세포 배양물이 대략 70% 합류하는지 확인하십시오. 적절한 DNA를 첨가함으로써 아래에 설명된 바와 같이 모든 형질감염 조합에 대해 유사한 양의 DNA를 사용한다. 반복실험에서 형질감염 실험을 수행합니다.
- 200 ng의 DNA와 1.25 μL의 형질감염 시약을 100 μL의 배지에 혼합한다. 트랜스펙션 혼합물을 세포에 첨가한다. 세포를 형질감염 혼합물과 함께 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 배지를 10% FBS를 함유하는 배지로 교체하고, 선택을 위해 항생제를 첨가하기 전에 또 다른 24시간 동안 인큐베이션한다.
3. HuR 과발현
- pFLAG-HuR 및 빈 pFLAG를 HeLa로 트랜스펙트합니다. 제네티신 (G418) (1 μg / mL)의 농도를 100 μg / mL에서 1000 μg / mL로 증가시켜 세포를 선택하여 안정적인 세포주를 생성합니다.
- 단계 7에 기재된 바와 같이 HuR mRNA에 특이적인 프라이머를 이용한 정량적 PCR로 과발현을 확인하였다.
4. 총 RNA 분리
- 새로 수집 된 세포를 사용하십시오. 트립신화 70% 합류 세포 배양물 (이 검정을 위해, HeLa-Cre 세포를 사용함)은 단계 2.2에 기재된 바와 같다.
- 세포 펠릿을 4°C에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 수집하고, 이를 1x PBS(포스페이트-완충 식염수)로 세척하고; 원심분리를 반복한다.
- 세포 펠릿을 1 mL의 1x PBS에 재현탁시키고, 이를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.
- 4°C에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
- 건조 세포 펠릿의 무게를 측정하고, 그에 따라 튜브의 부피와 크기를 조정한다. 1mg의 세포는 약 1μg의 총 RNA를 산출한다.
- 후드에서 500-1,000 μL의 페놀 / 클로로포름을 세포 펠렛 (이상적으로는 0.25g 당 750 μL)에 첨가하고 소용돌이와 혼합하여 위아래로 피펫팅하여 균질화하십시오.
- 상기 혼합물을 실온(20°C 내지 25°C)에서 5분 동안 인큐베이션하여 핵단백질 복합체의 완전한 해리를 허용한다.
- 샘플을 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 사용된 페놀:클로로포름 1 mL당 클로로포름 200 μL를 첨가하였다. 샘플 튜브를 단단히 캡핑합니다.
- 15 s 동안 격렬하게 혼합하고(손으로 또는 더 낮은 속도로 간단히 볼텍싱하여) 실온(20°C 내지 25°C)에서 2분 내지 3분 동안 인큐베이션한다.
- 샘플을 4°C에서 15분 동안 12,000 x g 에서 원심분리한다.
- 더 낮은 적색 페놀-클로로포름 상, 중간 상 및 무색 상부 수성상의 존재 여부를 검사한다. RNA는 상부 수성상에 남아있다. 후드에서 수성상을 모으고 중간 단계와 접촉하지 말고 신선한 튜브로 옮깁니다.
- 수성상을 400 μL의 분자 등급 이소프로판올 (페놀 / 클로로포름에 대한 1 : 1 비율) 및 2 μL의 글리코겐과 각 튜브에 혼합하여 RNA를 침전시킵니다 (펠렛의 존재를 시각화하는 데 도움이 될 것입니다).
- 손으로 격렬하게 섞거나 팁과 균질화하여 ~ 10 초 동안 유지하십시오. -20°C에서 15분 또는 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
- 샘플을 4°C에서 20분 동안 12,000 x g 에서 원심분리하고 상청액을 버린다.
- 3 부피의 100% 에탄올 (약 1 mL, DEPC 물을 사용하여 희석)을 첨가하여 RNA 펠릿을 세척하고, 펠릿이 방출되고 바닥에서 부유할 때까지 볼텍싱하여 샘플을 혼합한다.
- 4°C에서 5분 동안 7,500 x g 에서 원심분리한다.
- 75% 에탄올 1 mL를 가하여 RNA 펠릿 1x를 세척하고, 펠렛이 방출되고 바닥으로부터 부유할 때까지 볼텍싱하여 샘플을 혼합한다. 단계 4.17에 설명된 대로 원심분리를 반복한다.
- 추가 5 s 원심분리 스핀을 수행하여 튜브 측면에서 잔류 액체를 수집하고 펠렛을 방해하지 않고 피펫으로 잔류 액체를 제거하십시오.
- 튜브의 캡을 실온에서 3-5분 동안 개방하여 RNA 펠릿을 간단히 공기-건조시키고, RNA 펠릿을 RNase-free DEPC 처리수의 20-50 μL에 용해시킨다. 펠렛의 재현탁을 용이하게 하기 위해 RNA를 55-60°C에서 10분 동안 인큐베이션한다.
5. 총 RNA 농도 및 품질 결정
- 분광광도계를 이용하여 260 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 결정한다. 다운스트림 애플리케이션에서 샘플을 사용하기 전에 전체 스펙트럼 데이터를 가져옵니다.
- 0.5X TBE 완충액 (45 mM 트리스 염기, 45 mM 붕산, 1 mM EDTA)을 사용하여 1.5% 아가로스 겔 상에서 800-1000 ng을 분해함으로써 RNA 품질을 조절하였다. 총 RNA는 28S 및 18S rRNA를 참조하는 두 개의 밴드로 분리됩니다.
- 모든 시약을 만들고 DEPC 처리 된 물로 젤을 실행하는 데 사용되는 모든 장비를 씻으십시오. DEPC 처리된 물은 1000 mL의 초순수에 디에틸피로카보네이트 1 mL를 첨가하여 후드에서 제조된다. 실온에서 또는 37°C에서 ∼2시간 동안 인큐베이션하고 오토클레이브한다. 실온에서 최대 10개월 동안 보관하십시오.
참고: 포유동물 총 RNA의 전기영동은 대략 2:1의 비율로 28S 및 18S rRNAs의 분리로 이어진다. 밴드는 손상되지 않고 두 개의 날카로운 밴드로 표시되어야합니다. 분해된 RNA는 흐릿한 밴드를 초래할 것이다.
- 모든 시약을 만들고 DEPC 처리 된 물로 젤을 실행하는 데 사용되는 모든 장비를 씻으십시오. DEPC 처리된 물은 1000 mL의 초순수에 디에틸피로카보네이트 1 mL를 첨가하여 후드에서 제조된다. 실온에서 또는 37°C에서 ∼2시간 동안 인큐베이션하고 오토클레이브한다. 실온에서 최대 10개월 동안 보관하십시오.
6. 역전사
- 총 RNA 1 μg을 사용하여 역전사 반응을 설정한다.
- 역전사효소 효소( 표 참조)와 50ng/μL 랜덤 디카머 프라이머를 사용하여 역전사(RT)를 수행합니다.
- 10 μL의 RNA, 랜덤 프라이머 및 1 mM dNTP 믹스 (10 mM)를 혼합하고, 65°C에서 5분 동안 그리고 1분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 다음 시약을 첨가한다: 1x RT 완충액, 5 mMMgCl2, 10 mM DTT, RNase 억제제 40 U, 및 역전사효소 200 U.
- 25°C에서 10분 동안 그리고 50°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다(상이한 효소가 사용될 경우 온도가 변할 수 있음). 85°C에서 5분 동안 인큐베이션함으로써 반응을 종결시킨다. cDNAs는 -20°C에서 저장될 수 있다.
7. 정량적 PCR
- 반응물을 15 μL의 최종 부피로 조립하려면, 3 μL의 cDNA (100 ng/μL), 각 프라이머의 3.2 pmol, dNTP 및 효소를 함유하는 마스터 믹스 6 μL, 및 2.8 μL의 초순수를 혼합한다.
참고: 내인성 구성 유전자에 대한 프라이머를 대조군(하우스 키핑 유전자)으로 사용하여 HuR mRNA 및 miRNA의 발현 수준을 정상화하십시오. β-Actin 및 snRNA U6 (RNU6B)는 각각 mRNA 및 miRNA의 정상화에 사용할 수있는 옵션이지만 경우에 따라 다른 유전자도 적합 할 수 있습니다. - 델타-델타 Ct(2-ΔΔCt) 방법20을 사용하여 발현 수준을 정량화한다.
8. 리포터 분석
- 분석에 사용된 세포
- 플라스미드를 HeLa-Cre 세포에 형질감염시키면 다음과 같다. pTK-레닐라 (40 ng)로 형질감염시킨 다음 pRD-miR-17-92로 형질감염시켜 HeLa-Cre-miR-17-92를 생성하고 1 μg/mL 퓨로마이신으로 선택한다.
- HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla를 pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR 또는 pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR로 별도로 트랜스펙트합니다. 페니실린 (100 U / mL)과 스트렙토 마이신 (100 μg / mL)을 사용하여 선택하십시오. 이러한 트랜스펙션은 Luc-RAP-1-B 및 Luc-scrambled를 생성합니다.
- 세포를 pFLAG-HuR 또는 빈 pFLAG로 형질감염시킨다(단계 3).
- 단계 2.2.에 상술된 바와 같이, 대략 80%가 합류할 때까지 HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-스크램블링, HeLa-Cre miR-17-92-HuR, 및 HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc과 함께 세포 배양을 진행한다. 1 μL의 독시사이클린(1 μg/mL)으로 37°C에서 30분 동안 유도하였다. 또한, 같은 기간 동안 대조군으로 독시사이클린없이 모든 세포를 유지하십시오.
참고: 독시사이클린의 최종 농도는 선택한 세포주에 따라 다릅니다. 과량의 독시사이클린은 포유동물 세포에 독성을 가질 수 있다.
- 발광 분석
- 다양한 발광 강도를 정량화하고 비교하려면 이중 루시퍼라아제 리포터 분석 키트를 사용하십시오. 루시퍼라아제 분석 용액을 해동하고 분석을 시작하기 전에 실온에서 방치하십시오.
- 10 mL의 루시퍼라제 어세이 버퍼 II에 200 μL의 기질을 혼합함으로써 Stop 및 Glo (블루 캡 튜브) 믹스를 제조하였다. 혼합 LAR II (녹색 캡 튜브) 10 mL의 루시퍼라아제 어세이 버퍼 II를 루시퍼라제 어세이 기질 II의 호박색 바이알에 혼합하고 잘 진탕하여 준비한다.
- 용액을 이전에 확인되고 빛으로부터 보호된 15 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
참고: 대안으로, 용액은 1-2 mL 분취량으로 미리 제조되고 알루미늄 호일에서 빛으로부터 보호되는 -80°C에서 동결될 수 있다. - Synergy와 같은 장비를 사용하여 발광 판독을 수행하는 단계; 루시퍼라아제를 상대적 광 단위(RLU)로 표현한 측정치.
- 추가 통계 분석을 위해 결과를 스프레드시트로 내보냅니다.
- 제어 레닐라 (루시페라제 / 레닐라)에 의해 반딧불이 루시퍼라제 활성의 정상화를 수행하고 그래픽에서 상대 광 단위 (RLU)로 플롯하십시오. 독시사이클린 유도가 있거나없는 그룹에 대해이 작업을 반복하십시오.
- 평균(SEM)의 평균 및 표준 오차를 계산합니다. 스튜던트 t-테스트 또는 양방향 ANOVA를 수행한 후 Tukey의 사후 테스트를 수행하여 그룹 비교를 허용합니다. 이러한 분석은 GraphPad Prism과 같은 패키지로 제공됩니다. p-값에서 0.05<의 차이는 유의한 것으로 간주됩니다.
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Representative Results
우리의 초기 가설은 HuR이 그것의 pre-miRNA 서열에 결합함으로써 인트로닉 miRNA 생물발생을 촉진할 수 있다는 것이었다. 따라서, HuR 발현 및 miR-17-92 클러스터 생물발생의 연결은 이들 miRNAs의 성숙을 지배하는 새로운 메카니즘을 가리킬 수 있다. pFLAG-HuR의 형질감염시 HuR의 과발현은 세 개의 상이한 세포주, 즉 HeLa, BCPAP, 및 HEK-293T에서 확인되었다(도 2). 대조군으로서, 형질감염되지 않은 세포 및 빈 pFLAG 벡터로 형질감염된 세포가 사용되었다. 중요하게는, 이들 세포에서의 HuR 과발현이 miR-19a의 발현을 자극한다는 것을 관찰하였다 (보충 표 1 결과는 Gatti da Silva et al.9에 보고되었다).
유도된 miRNA가 진정으로 기능적임을 확인하기 위해, 여기에 기술된 바와 같이 시험관내 리포터 시스템이 설계되었다. pRD-RIPE의 인공 인트론은 eGFP의 두 코딩 영역을 분리한다. 이 카세트는 테트라 사이클린 반응 요소 (TRE)의 통제하에 있습니다. eGFP의 발현은, 따라서, 세포 배지 내의 항생제 독시사이클린(DOX)의 존재에 의해 조절된다(도 3).
miRbase 및 TargetScan을 사용한 실리코 검색에서 miR-19 a 및 miR-19 b (miR-17-92클러스터의 구성 요소)에 대한 가능한 mRNA 표적이 밝혀졌습니다. miRNA 둘 다에 대한 잠재적 표적으로서, RAP-IB3' UTR 영역 상에서 발견되는 서열 5' TTTGCACA 3'를 선택하였다(보충 표 2). RAP-IB는 Ras-관련 단백질 패밀리 (RAS)의 GTPase 멤버이다. 유도된 miRNA는 루시퍼라제 옆에 클로닝된 표적 서열에 혼성화됨에 따라 우리의 분석에서 정확하게 처리되고 기능적이었다(도 3 참조, pmiR-GLO 표적). 따라서, 루시퍼라아제 번역을 차단하였고, 이는 감소된 루시퍼라제 활성에 반영되었다(도 3). 이 검정에 대한 대조군으로서, 우리는 표적 서열을 스크램블링하고, Luc-스크램블링된 플라스미드에서 5' GGGTAAA 3'에 대해 대체하였다(표적 및 스크램블된 서열은 표 물질의 올리고 서열에 밑줄이 그어져 있다).
규칙적인 조건 및 pRD-miR-17-92 플라스미드의 유도 없이, 내인성 miR-19a 및/또는 miR-19b는 pmiR-GLO 상에서 표적을 발견하였고, 이는 감소된 루시퍼라제 활성을 유도하였다(데이터는 나타내지 않음). DOX 보충 후, 스크램블링된 표적 서열을 갖는 세포에서 루시퍼라제 활성의 약간의, 그리고 통계적으로 유의하지 않은 감소가 관찰되었다. 이는 이 서열에서 다른 miRNA에 대한 표적 서열의 존재 때문일 수 있다. HeLa-Cre 세포와 비교하여 pRD-miR-17-92로부터의 miR-19a 및 miR-19b 발현 증가시 RAP-IB 3'UTR로 루시퍼라제 활성의 강한 감소가 관찰되었다 (도 4 참조, 오렌지색 및 검정색 막대 비교). 이들 세포에서 pFLAG-HuR의 형질감염은 그 자체로 루시퍼라제 활성을 변화시키지 않았다(도 4 참조, 회색 및 검정색 막대 비교). 그러나, 독시사이클린 보충과 결합된 HuR의 과발현은, miR-17-92 클러스터의 발현을 자극하여, 루시퍼라제 활성을 더욱 감소시켰다(도 4 참조, 회색 및 적색 막대 비교). 이는 miR-19a 및 miR-19 b에 대한 HuR의 양성 조절을 나타내며, 이들 miRNA의 정확한 처리 및 성숙과 결합하여, 이들의 표적을 성공적으로 찾을 수 있었다(HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc)(도 4 참조).
이 리포터 시스템의 사용은 HuR이 HeLa 세포에서 miR-19a 및 miR-19 b의발현 및 적절한 성숙을 유도한다는 것을 확인하였다.
그림 1: 여기에 설명된 프로토콜의 개념적 개요. miRNA, 표적 서열, 조절 단백질, 및 pTK-레닐라를 함유하는 플라스미드를 배양된 세포에 형질감염시켰다. 항생제 선택 후, 이들 세포를 miRNA 발현 유도(독시사이클린 사용), 루시퍼라제 활성의 후속 정량화 및 HuR 과발현을 확인하기 위한 RNA 분석에 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: qPCR에 의한 (A) HeLa, (B) BCPAP, 및 (C) HEK293T 세포에서의 FLAG-HuR 과발현의 확인. 빈 pFLAG로 형질감염시키고 대조군(백색 막대)으로 사용하였다. β-액틴을 사용하여 Ct 값을 정규화하였다. y축은 정규화 후 계산된 발현의 폴드 변화를 나타낸다. 오류 막대는 세 개의 독립적인 측정에서 계산된 표준 오류를 나타냅니다. **P <0.005, ****P < 0.0005 (Gatti da Silva et al.9에서 적응된 수치). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 인트로닉 miRNA 리포터 시스템. (A) pRD-miR-17-92를 생성한 pRD-RIPE 플라스미드의 개략적인 표현. pre-miR-17-92는 인트론 내부에 삽입되었고, 독스-유도성 프로모터의 제어 하에 있었다; 우측에, RAP-IB 3'UTR 표적 서열 (pmiRGLO-RAP-IB)을 갖는 pmiR-GLO 플라스미드; 대조군은 스크램블링된 표적 서열(pmiRGLO-scrambled)을 가졌다. (b) miR-19a 및 miR-19b에 상보적인 표적 서열에 초점을 맞춘 pmiRGLO-RAP-IB서열에 대한 상세함. 루시퍼라제 활성은 miRNA와 표적의 상호작용시 감소된다(Gatti da Silva et al.9로부터 적응된 그림). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: HeLa-Cre 세포를 리포터 플라스미드 pTK-레닐라, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-스크램블드, pRD-miR-17-92, 및 pFLAG-HuR로 공동-형질감염시켰다. 형질감염되지 않은 HeLa-Cre 세포 (검정), HeLa-Cre miR-17-92-스크램블 (흰색), HeLa-Cre-HuR (회색), HeLa-Cre miR-17-92-luc (주황색) 및 HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (빨간색)에 대한 루시퍼라아제 활성. 루시퍼라아제 활성은 레닐라 루시퍼라아제(pTK-Renilla로 관찰됨)에 대한 반딧불이 루시퍼라아제의 상대적 활성으로서 프로토콜에 기재된 바와 같이 정량화하고, 독시사이클린 첨가 후에 정상화하였다. y축에 "상대 광 단위"(RLU)로 표시됩니다. **P < 0.005; P < 0.0005 (Gatti da Silva et al.9에서 적응된 그림). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: miR-19 발현을 분석하기 위해 qPCR에 대해 관찰된 원시 Ct 값. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: RAP-IB 3'UTR 서열 및 miR-19 표적 서열. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Pre-mRNA 스플라이싱은 유전자 발현 조절을 위한 중요한 과정이며, 그의 조절은 세포 표현형 변형(22,23)에 강한 효과를 촉발시킬 수 있다. miRNA의 70 % 이상이 인간의 인트론에서 전사되며, 우리는 조절 단백질24,25를 접합함으로써 처리 및 성숙이 촉진 될 수 있다고 가정했습니다. 우리는 배양된 세포에서 인트로닉 miRNA 처리 및 기능을 분석하는 방법을 개발했습니다. 우리의 분석은 네 가지 플라스미드를 사용하며 내인성 및 외인성 또는 유도 된 miRNA의 성숙을 테스트 할 수있게합니다. 여기에 설명 된 방법은 2-3 일 내에 수행 할 수 있으며 값 비싼 시약을 필요로하지 않습니다.
HuR이 mRNA 안정성에 중요한 RNA 결합 단백질이고 miR-18 및 miR-19a miRNAs 17로 면역침전되는 것을 고려하면, 이 분석은 인트론 miRNA 생물발생 및 성숙을 유도할 수 있는지 시험하였다. HuR은 스플라이케오좀의 코어에서는 발견되지 않지만 mRNA 안정화(26)와 관련된 단백질과 상호작용한다. 일관되게, HuR의 과발현은 난소 및 방광암의 발달과 관련되었다27,28. 유두상 갑상선암 세포에서, 우리는 HuR이 세포 증식, 이동 및 침윤을 증가시킨다는 것을 관찰했다9. HuR은 또한 PTEN, 사이클린 A2 및 사이클린 D2와 같은 세포 주기 조절제의 mRNA 안정성에 영향을 미쳐 세포 증식 및 이동을 증가시키고 종양원성 특성29,30을 유도한다. 그러나, 이들 mRNA의 상당 부분은 또한 miR-19a 및 miR-19b에 대한 표적 서열을 갖는다. 특히, HuR은 이들 miRNA가 전사되는 인트로닉 영역에 결합할 수 있고, 이는 이들 miRNA의 접합 및 성숙을 조절할 수 있고, 결과적으로 종양원성 특징을 강화할 수 있다는 개념으로 이어진다.
이를 시험하기 위해, 이 검정은 네 개의 상이한 플라스미드로 개발되었다. 첫 번째는 인트론 내부에 삽입된 miR-17-92 miRNA 클러스터를 함유하고, 그의 발현은 독시사이클린 첨가시 조절된다. 두 번째 플라스미드는 luc2 유전자의 3' 옆에 표적 서열을 운반하는 상업적 pmiR-GLO이다. 이러한 표적 서열에 대한 miRNA의 결합은 luc2 발현에 영향을 미치며, 이는 발광 분석시 측정될 수 있다. 세 번째 플라스미드는 pFLAG-HuR이며, 이는 이러한 조절 단백질의 과발현을 유도한다. 마지막으로, pTK-Renilla는 또한 레닐라 루시퍼라제 형광을 포함하는데 사용된다. 우리의 결과는 HuR이 miR-17-92 발현을 자극하고 그 성분과 표적 서열의 연관성을 증가시켜 성숙하고 기능적인 miRNA 분자를 초래한다는 것을 나타냈다. 우리는 HuR과 miRNA의 연관성을 다른 논문9에서 설명한다. 본 연구에 사용된 표적 서열은 miR-19a 및 miR-19b miRNAs에 특이적이었다. 그러나, 이러한 방법은 또한 다수의 표적 부위를 포함하는 더 짧거나 더 긴 표적 서열의 사용에 적응될 수 있다. 이 경우, 표적 서열 또는 근처의 서열에 대한 내인성 miRNA의 비특이적 결합이 분석에서 고려되어야 한다. 사용된 서열은 루시퍼라아제 활성에 영향을 미칠 수 있는 다른 가능한 표적 부위를 가질 수 있다. 여기에 설명된 방법은 또한 miRNA 또는 함께 전사된 miRNA 그룹의 상이한 표적을 검증하는데 사용될 수 있고, miRNAs 및 이들의 특정 표현형 변경에 대한 기능적 연구를 가능하게 한다. 또한 결과가 다른 세포주 및 유전 적 배경 사이에서 비교 될 수 있음을 주목해야한다.
포유동물 세포에서 이 프로토콜의 보다 광범위한 사용을 위한 가장 중요한 단계는 형질감염 및 유도 단계의 효율이다. 상이한 플라스미드가 세포 내로 형질감염되기 때문에, 적절한 조절이 또한 중요하다. 이들 파라미터는 플라스미드의 크기에 따라 변화하고 세포 배양에서의 광범위한 시간에 의해 영향을 받는다. 따라서, 분석을 시작하기 전에 고려해야 할 중요한 점은 선택된 세포의 형질감염의 용이성이다. 추가적으로, 상이한 플라스미드 (겐타마이신, 퓨로마이신, 및 독시사이클린)를 선택하고 발현을 활성화시키기 위해 상이한 항생제의 광범위한 사용은 세포에 유해할 수 있고 하기 실험의 효율을 감소시킬 수 있다. 이 분석이 먼저 알려진 형질감염 효율을 갖는 세포로 최적화되는 것이 중요하다.
리포터는 HuR 발현 증가가 miRNA 생물발생을 유도할 수 있다는 것을 성공적으로 보여주었고 이의 기능적 성숙을 확인하였다. 중요하게도, HuR의 과발현은 이 조건에서 감소된 루시퍼라제 활성을 관찰하지 않았기 때문에 생성된 인트론의 양에 영향을 미치지 않았다(도 4). 이 리포터 시스템을 사용하여 RBP 및 miRNA를 특성화하기 위해 추가 실험을 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, miRNA 서열 또는 그 플랭킹 영역에서 단일 돌연변이를 생성하고 miRNA 생물발생에서 조절 단백질의 영향을 분석하는 것이 중요할 것이다. 이것은 개별 miRNA의 생물발생의 특정 특성화를 허용하고 또한 miRNA 처리 및 성숙을 위한 보존된 서열에 대한 지식을 향상시킬 수 있다.
우리는 이것이 miRNA 생물발생 및 성숙에 대한 연구와 이러한 과정에서 조절 단백질을 접합시키는 역할에 대한 중요한 방법론적 기여라고 생각합니다. 또한 다양한 유형의 세포에서 mRNA 및 miRNA의 조절 및 조절에 관한 연구에 적용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 HeLa-Cre 세포와 pRD-RIPE 및 pCAGGS-Cre 플라스미드에 대한 E. Makeyev (싱가포르 난양 기술 대학)에게 감사하고 있습니다. Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes 및 Anselmo Moriscot의 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant DNA | |||
| pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pFLAG-HuR | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-RAP-IB | Generated during this work | ||
| pmiRGLO-scrambled | Generated during this work | ||
| pRD-miR-17-92 | Generated during this work | ||
| pRD-RIPE-donor | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| pTK-Renilla | Promega | E2241 | |
| Antibodies | |||
| anti-B-actin | Sigma Aldrich | A5316 | |
| anti-HuR | Cell Signaling | mAb 12582 | |
| IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG | Li-Cor Biosciences | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG | Li-Cor Biosciences | 929-70020 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HeLa-Cre | A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011 | ||
| HeLa-Cre miR17-92 | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-luc | Generated during this work | ||
| HeLa-Cre miR17-92-scrambled | Generated during this work | ||
| Chemicals and Peptides | |||
| DMEM/high-glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800-017 | |
| Doxycycline | BioBasic | MB719150 | |
| Dual-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2940 | |
| EcoRI | Thermo Fisher Scientific | ER0271 | |
| EcoRV | Thermo Fisher Scientific | ER0301 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific | E859-EG | |
| L-glutamine | Life Technologies | ||
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| pFLAG-CMV™-3 Expression Vector | Sigma Aldrich | E6783 | |
| pGEM-T | Promega | A3600 | |
| Platinum Taq DNA polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10966-030 | |
| pmiR-GLO | Promega | E1330 | |
| Puromycin | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNAse OUT | Thermo Fisher Scientific | 752899 | |
| SuperScript IV kit | Thermo Fisher Scientific | 18091050 | |
| Trizol-LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | |
| trypsin/EDTA 10X | Life Technologies | 15400-054 | |
| XbaI | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | |
| XhoI | Promega | R616A | |
| Oligonucleotides | |||
| forward RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG CTACTATATCAGTTTGCACAT |
|
| reverse RAP-1B pmiRGLO | Exxtend | CTAGATGTGCAAACTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward scrambled pmiRGLO | Exxtend | TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA GCTACTATATCAGGGGTAAAAT |
|
| reverse scrambled pmiRGLO | Exxtend | CTAGATTTTACCCCTGATATAGT AGCTTACTAGCGGCCGCTAC |
|
| forward HuR pFLAG | Exxtend | GCCGCGAATTCAATGTCTAAT GGTTATGAAGAC |
|
| reverse HuR pFLAG | Exxtend | GCGCTGATATCGTTATTTGTG GGACTTGTTGG |
|
| forward pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ATCCTCGAGAATTCCCATTAG GGATTATGCTGAG |
|
| reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE | Exxtend | ACTAAGCTTGATATCATCTTG TACATTTAACAGTG |
|
| forward snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | CTCGCTTCGGCAGCACATATAC | |
| reverse snRNA U6 (RNU6B) | Exxtend | GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG | |
| forward B-Actin qPCR | Exxtend | ACCTTCTACAATGAGCTGCG | |
| reverse B-Actin qPCR | Exxtend | CCTGGATAGCAACGTACATGG | |
| forward HuR qPCR | Exxtend | ATCCTCTGGCAGATGTTTGG | |
| reverse HuR qPCR | Exxtend | CATCGCGGCTTCTTCATAGT | |
| forward pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | GTGCTCGAGACGAATTCGTCA GAATAATGTCAAAGTG |
|
| reverse pre-miR-1792 qPCR | Exxtend | TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC TCAACAGGCCG |
|
| Software and Algorithms | |||
| Prism 8 for Mac OS X | Graphpad | https://www.graphpad.com | |
| ImageJ | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij |
References
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