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Cancer Research

स्तनधारी कोशिकाओं में इंट्रोनिक माइक्रोआरएनए परिपक्वता का विश्लेषण करने के लिए एक रिपोर्टर परख

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63498
Automatic Translation
1, 1
1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

Summary

हमने चार प्लास्मिड के साथ इन विट्रो में कोशिकाओं में उपयोग करने के लिए एक इंट्रोनिक माइक्रोआरएनए बायोजेनेसिस रिपोर्टर परख विकसित की: एक इंट्रोनिक एमआईआरएनए के साथ, एक लक्ष्य के साथ, एक नियामक प्रोटीन को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए, और एक रेनिला ल्यूसिफेरेज़ के लिए। एमआईआरएनए को संसाधित किया गया था और लक्ष्य अनुक्रम को बांधकर लूसिफेरेज़ अभिव्यक्ति को नियंत्रित कर सकता था।

Abstract

माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) छोटे आरएनए अणु हैं जो यूकेरियोट्स में व्यापक हैं। अधिकांश एमआईआरएनए को इंट्रॉन से स्थानांतरित किया जाता है, और उनकी परिपक्वता में नाभिक में विभिन्न आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन शामिल होते हैं। परिपक्व एमआईआरएनए अक्सर जीन साइलेंसिंग की मध्यस्थता करते हैं, और यह पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल घटनाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है। इसके अलावा, इसे जीन थेरेपी के लिए एक आशाजनक पद्धति के रूप में खोजा जा सकता है। हालांकि, वर्तमान में स्तनधारी सेल संस्कृतियों में एमआईआरएनए अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए प्रत्यक्ष तरीकों की कमी है। यहां, हम एक कुशल और सरल विधि का वर्णन करते हैं जो लक्ष्य अनुक्रमों के साथ इसकी बातचीत की पुष्टि के माध्यम से एमआईआरएनए बायोजेनेसिस और परिपक्वता का निर्धारण करने में सहायता करता है। इसके अलावा, यह प्रणाली उच्च दक्षता और कम लागत के साथ प्राथमिक एमआईआरएनए (प्री-एमआईआरएनए) प्रतिलेखन को नियंत्रित करने में सक्षम डॉक्सीसाइक्लिन-इंड्यूसिबल प्रमोटर का उपयोग करके अपनी अंतर्जात गतिविधि से बहिर्जात एमआईआरएनए परिपक्वता को अलग करने की अनुमति देती है। यह उपकरण एक अलग प्लास्मिड में आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन के साथ मॉडुलन की भी अनुमति देता है। विभिन्न प्रकार के एमआईआरएनए और उनके संबंधित लक्ष्यों के साथ इसके उपयोग के अलावा, इसे विभिन्न सेल लाइनों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, बशर्ते ये अभिकर्मक के लिए उत्तरदायी हों।

Introduction

यूकेरियोट्स1 में जीन अभिव्यक्ति विनियमन के लिए अग्रदूत एमआरएनए स्प्लिसिंग एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। इंट्रॉन को हटाने और परिपक्व आरएनए में एक्सॉन के संघ को स्प्लिसोसोम द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है, 100 से अधिक प्रोटीन 2,3 के साथ 5 एसएनआरएनए (यू 1, यू 2, यू 4, यू 5 और यू 6) से बना एक2 मेगाडाल्टन राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स। स्प्लिसिंग प्रतिक्रिया सह-ट्रांसक्रिप्शनल रूप से होती है, और स्प्लिसोसोम को एक्सॉन-इंट्रॉन सीमाओं पर और इंट्रॉन4 के भीतर संरक्षित स्प्लिस साइटों की मान्यता द्वारा निर्देशित प्रत्येक नए इंट्रॉन में इकट्ठा किया जाता है। स्प्लिसोसोम कॉम्प्लेक्स और इसके घटकों के उल्लेखनीय संरक्षण के बावजूद विभिन्न इंट्रॉन में अलग-अलग स्प्लिसिंग दर हो सकती है। स्प्लिस साइट संरक्षण में अंतर के अलावा, इंट्रॉन और एक्सॉन पर वितरित नियामक अनुक्रम आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) का मार्गदर्शन कर सकते हैं और 5,6 को उत्तेजित या दबा सकते हैं। एचयूआर एक सर्वव्यापी रूप से व्यक्त आरबीपी है और एमआरएनए स्थिरता को नियंत्रित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है7. हमारे समूह के पिछले परिणामों से पता चला है कि एचयूआर एमआईआरएनए युक्त इंट्रॉन से बंध सकता है, यह दर्शाता है कि यह प्रोटीन एमआईआरएनए प्रसंस्करण और परिपक्वता को सुविधाजनक बनाने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है, जिससे वैकल्पिक स्प्लिसिंग आइसोफॉर्म 6,8,9 की पीढ़ी भी हो सकती है।

कई माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) को इंट्रोनिक अनुक्रमों से कोडित किया जाता है। जबकि कुछ इंट्रॉन का हिस्सा हैं, दूसरों को "मिर्ट्रॉन" के रूप में जाना जाता है और पूरे इंट्रॉन10,11 द्वारा बनाए जाते हैं। एमआईआरएनए छोटे गैर-कोडिंग आरएनए हैं, जिनकी लंबाई 12 में 18 से 24 न्यूक्लियोटाइड तक होती है। उनका परिपक्व अनुक्रम एमआरएनए में लक्ष्य अनुक्रमों के साथ आंशिक या कुल पूरकता दिखाता है, इसलिए अनुवाद और / या एमआरएनए क्षय दर को प्रभावित करता है। एमआईआरएनए और लक्ष्यों के संयोजन सेल को विभिन्न परिणामों तक ले जाते हैं। कई एमआईआरएनए कोशिकाओं को समर्थक या विरोधी ट्यूमोरल फेनोटाइप13 में चला सकते हैं। ऑन्कोजेनिक एमआईआरएनए आमतौर पर एमआरएनए को लक्षित करते हैं जो एक दमनकारी विशेषता को ट्रिगर करते हैं, जिससे सेलुलर प्रसार, प्रवास और आक्रमण में वृद्धि होतीहै 14. दूसरी ओर, ट्यूमर-दमनकारी एमआईआरएनए बढ़े हुए सेल प्रसार से संबंधित ऑन्कोजेनिक एमआरएनए या एमआरएनए को लक्षित कर सकते हैं।

एमआईआरएनए का प्रसंस्करण और परिपक्वता भी उनकी उत्पत्ति पर निर्भर है। अधिकांश इंट्रोनिक एमआईआरएनए को माइक्रोप्रोसेसर की भागीदारी के साथ संसाधित किया जाता है, जो राइबोन्यूक्लिज द्रोशा और प्रोटीन सह-कारकों12 द्वारा गठित होता है। मिर्ट्रॉनों को द्रोशा15 से स्वतंत्र रूप से स्प्लिसोसोम की गतिविधि के साथ संसाधित किया जाता है। इंट्रॉन के भीतर पाए जाने वाले एमआईआरएनए की उच्च आवृत्ति को ध्यान में रखते हुए, हमने परिकल्पना की कि स्प्लिसिंग में शामिल आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन इन एमआईआरएनए के प्रसंस्करण और परिपक्वता की सुविधा भी प्रदान कर सकते हैं। विशेष रूप से, आरबीपी एचएनआरएनपी ए 2 / बी 1 पहले से ही माइक्रोप्रोसेसर और एमआईआरएनए बायोजेनेसिस16 से जुड़ा हुआ है।

हमने पहले बताया है कि कई आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन, जैसे कि एचएनआरएनपी और एचयूआर, मास स्पेक्ट्रोमेट्री17 द्वारा इंट्रोनिक एमआईआरएनए से जुड़े हैं। एमआईआर -17-92 इंट्रोनिक क्लस्टर से एमआईआरएनए के साथ एचयूआर (ईएलएवीएल 1) के सहयोग की पुष्टि इम्यूनोप्रेसिपिटेशन और सिलिको विश्लेषण9 में की गई थी। एमआईआर -17-92 एक इंट्रोनिक एमआईआरएनए क्लस्टर है जो छह एमआईआरएनए से बना है जिसमें विभिन्न कैंसर18,19 में वृद्धि हुई अभिव्यक्ति है। इस क्लस्टर को "ऑनकोमिर -1" के रूप में भी जाना जाता है और यह एमआईआर -17, एमआईआर -18ए, एमआईआर -19ए, एमआईआर -20, एमआईआर -19 बी और एमआईआर -92ए से बना है। एचयूआर की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति एमआईआर -19 ए और एमआईआर -19 बी संश्लेषण 9 को उत्तेजित करतीहै। चूंकि इस क्लस्टर के इंट्रोनिक क्षेत्र एचयूआर से जुड़े हुए हैं, इसलिए हमने यह जांचने के लिए एक विधि विकसित की कि क्या यह प्रोटीन एमआईआर -19 ए और एमआईआर -19 बी अभिव्यक्ति और परिपक्वता को विनियमित कर सकता है। हमारी परिकल्पना की एक महत्वपूर्ण भविष्यवाणी यह थी कि, एक नियामक प्रोटीन के रूप में, एचयूआर एमआईआरएनए बायोजेनेसिस की सुविधा प्रदान कर सकता है, जिससे फेनोटाइपिक परिवर्तन हो सकते हैं। एक संभावना यह थी कि एमआईआरएनए को एचयूआर की उत्तेजना द्वारा संसाधित किया गया था, लेकिन परिपक्व और कार्यात्मक नहीं होगा और इसलिए, प्रोटीन के प्रभाव सीधे फेनोटाइप को प्रभावित नहीं करेंगे। इसलिए, हमने यह जांचने के लिए एक स्प्लिसिंग रिपोर्टर परख विकसित की कि क्या एचयूआर जैसे आरबीपी एक इंट्रोनिक एमआईआरएनए के बायोजेनेसिस और परिपक्वता को प्रभावित कर सकते हैं। एमआईआरएनए प्रसंस्करण और परिपक्वता की पुष्टि करके, हमारी परख लक्ष्य अनुक्रम और एक परिपक्व और कार्यात्मक एमआईआरएनए की पीढ़ी के साथ बातचीत दिखाती है। हमारे परख में, हम सुसंस्कृत कोशिकाओं में एमआईआरएनए लक्ष्य-बाध्यकारी की जांच करने के लिए एक ल्यूसिफेरेज़ प्लास्मिड के साथ एक इंट्रोनिक एमआईआरएनए क्लस्टर की अभिव्यक्ति को जोड़ते हैं।

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Protocol

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1 में दर्शाया गया है।

1. प्लास्मिड निर्माण

  1. पीसीएजीजीएस-क्रे: यह प्लास्मिड डॉ ई माकेव21 द्वारा प्रदान किया गया था।
  2. पीआरडी-एमआईआर-17-92:
    1. प्रत्येक विशिष्ट प्राइमर (सामग्री की तालिका), सीडीएनए के 150 एनजी, 1 एमएम डीएनटीपी, 1 एक्स टैक पीसीआर बफर और उच्च निष्ठा टैक डीएनए पोलीमरेज़ के 5 यू के 0.5 μM का उपयोग करके पीसीआर द्वारा पूर्व-एमआईआर -17-92 को बढ़ाएं। डीएनए संदूषण की जांच के लिए नो-टेम्पलेट कंट्रोल पीसीआर प्रतिक्रिया (सीडीएनए के बजाय पानी का उपयोग करें) करें।
    2. पीसीआर उत्पाद को पीआरडी-आरआईपीई में लिगेट करें (कृपया डॉ ई माकेव, नानयांग टेक्नोलॉजिकल यूनिवर्सिटी, सिंगापुर द्वारा प्रदान किया गया) 21 डीएनए लिगेज का उपयोग करके इकोआरआई और ईसीओआरवी प्रतिबंध साइटों के बीच इंट्रॉन के अंदर, पीआरडी-एमआईआर -17-92 बनाते हैं। सेंगर अनुक्रमण द्वारा अनुक्रम अखंडता की पुष्टि करें।
  3. पीएमआईआरजीएलओ-आरएपी-आईबी
    1. एक्सबीएआई प्रतिबंध साइटों द्वारा फ्लैंक किए गए फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरों को डिज़ाइन करें और अंदर एक नोटी प्रतिबंध साइट के साथ। आगे और रिवर्स प्राइमरों की इक्विमोलर मात्रा मिलाएं और मिश्रण को 5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, फिर 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें। नियंत्रण के रूप में, तले हुए लक्ष्य अनुक्रमों (सामग्री की तालिका) के साथ प्राइमरों का उपयोग करें।
    2. एक्सबीएआई प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करके एनील किए गए टुकड़ों को क्लीव करें और उन्हें ल्यूक 2 अनुक्रम के नीचे पीएमआईआर-जीएलओ में लिगेट करें, जिससे पीएमआईआरजीएलओ-आरएपी-आईबी -3-यूटीआर (ल्यूक-आरएपी -1 बी) और पीएमआईआरजीएलओ-तले हुए -3-यूटीआर (ल्यूक-तले हुए) रिपोर्टर निर्माण उत्पन्न होते हैं। नोटी दरार के साथ बंधाव की पुष्टि करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि प्राइमर एनीलिंग के बाद बनाए गए ओवरहैंग दरार प्रतिक्रिया के बाद वेक्टर के पूरक हैं।
  4. पीएफएलएजी-एचयूआर
    1. एचयूआर ओवर-एक्सप्रेसिंग प्लास्मिड उत्पन्न करने के लिए, विशिष्ट प्राइमरों के साथ एचयूआर अनुक्रम को बढ़ाएं। सीडीएनए के 300 एनजी, प्रत्येक विशिष्ट प्राइमर के 0.5 μM, 1 एमएम डीएनटीपी मिश्रण, 1 एक्स पीसीआर बफर, और उच्च निष्ठा टैक डीएनए पोलीमरेज़ के 5 यू मिलाएं।
    2. पीसीआर उत्पाद को पीजीईएम-टी में लिगेट करें और सेंगर अनुक्रमण द्वारा डीएनए अनुक्रम अखंडता की पुष्टि करें। पीजीईएम-टी से एचयूआर टुकड़े को निकालें और पीएफएलएजी-एचयूआर वेक्टर उत्पन्न करने के लिए इसे पीएफएलएजी-सीएमवी -3 स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर में सबक्लोन करें।

2. सेल संस्कृति

नोट: हेला-क्रे सेल लाइन डॉ ई माकेव21 से एक उपहार था, और पैपिलरी थायरॉयड कैंसर सेल (बीसीपीएपी) कृपया डॉ मासिमो सैंटोरो (विश्वविद्यालय "फेडेरिको द्वितीय", नेपल्स, इटली) द्वारा प्रदान किया गया था। हेला सेल, पैपिलरी थायराइड कैंसर सेल (बीसीपीएपी), और एचईके -293 टी का उपयोग एचयूआर को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए किया गया था।

  1. उच्च ग्लूकोज में कोशिकाओं को 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 200 एमएम एल-ग्लूटामाइन, और 1 एक्स पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक बनाए रखें, जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए। एक आर्द्र, नियंत्रित वातावरण इनक्यूबेटर (5% सीओ2) में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
  2. ईडीटीए (0.5% समाधान मिश्रण) के साथ अनुयायी कोशिकाओं को 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। उन्हें प्लेट से अलग होने दें (इनक्यूबेशन अवधि सेल प्रकार के अनुसार भिन्न हो सकती है)।
  3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए लिपिड-आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ अभिकर्मक करें। सुनिश्चित करें कि सेल संस्कृतियां लगभग 70% संगम हैं। सभी अभिकर्मक संयोजनों के लिए डीएनए की समान मात्रा का उपयोग करें, जैसा कि नीचे वर्णित है, उपयुक्त डीएनए जोड़कर। प्रतिकृतियों में अभिकर्मक प्रयोग करें।
    1. संस्कृति माध्यम के 100 μL में डीएनए के 200 एनजी और अभिकर्मक अभिकर्मक के 1.25 μL मिलाएं। कोशिकाओं के लिए अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए अभिकर्मक मिश्रण के साथ कोशिकाओं सेते हैं। फिर, 10% एफबीएस युक्त माध्यम के साथ माध्यम को बदलें, और चयन के लिए एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ने से पहले एक और 24 घंटे के लिए सेते हैं।

3. एचयूआर ओवरएक्सप्रेशन

  1. हेला में ट्रांसफेक्ट पीएफएलएजी-एचयूआर और खाली पीएफएलएजी। आनुवंशिकी (जी 418) (1 μg / एमएल) की एकाग्रता को 100 μg / एमएल से 1000 μg / एमएल तक बढ़ाकर कोशिकाओं का चयन करें, स्थिर सेल लाइनों का उत्पादन करें।
  2. चरण 7 में वर्णित एचयूआर एमआरएनए के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके मात्रात्मक पीसीआर के साथ ओवरएक्सप्रेशन की पुष्टि करें।

4. कुल आरएनए अलगाव

  1. ताजा एकत्र कोशिकाओं का उपयोग करें। ट्रिप्सिनाइज 70% संगम सेल संस्कृतियों (इस परख के लिए, हेला-क्रे कोशिकाओं का उपयोग किया गया था), जैसा कि चरण 2.2 में वर्णित है।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेल गोली ले लीजिए और इसे 1 एक्स पीबीएस (फॉस्फेट-बफर खारा) के साथ धो लें; सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं।
  3. 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और इसे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x g पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  5. शुष्क सेल गोली का वजन करें, और तदनुसार ट्यूबों की मात्रा और आकार को समायोजित करें। कोशिकाओं के 1 मिलीग्राम कुल आरएनए के लगभग 1 μg पैदावार.
  6. क्लोरोफॉर्म को सेल गोली (आदर्श रूप से 750 μL प्रति 0.25 ग्राम कोशिकाओं) में जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके और भंवर के साथ मिश्रण करके इसे होमोजेनाइज़ करें।
  7. न्यूक्लियोप्रोटीन परिसरों के पूर्ण पृथक्करण की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान (20 डिग्री सेल्सियस से 25 डिग्री सेल्सियस) पर 5 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 एक्स जी पर नमूना अपकेंद्रित्र।
  9. सतह पर तैरनेवाला को एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और उपयोग किए जाने वाले फिनोल: क्लोरोफॉर्म के प्रति 1 एमएल क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें। नमूना ट्यूबों को सुरक्षित रूप से कैप करें।
  10. 15 एस (हाथ से या संक्षेप में कम गति पर भंवर) के लिए सख्ती से मिलाएं और 2 मिनट से 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान (20 डिग्री सेल्सियस से 25 डिग्री सेल्सियस) पर सेते हैं।
  11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 एक्स जी पर नमूने अपकेंद्रित्र।
  12. एक निचले लाल फिनोल-क्लोरोफॉर्म चरण, एक मध्यस्थ चरण और एक रंगहीन ऊपरी जलीय चरण की उपस्थिति की जांच करें। आरएनए ऊपरी जलीय चरण में रहता है। एक हुड में, जलीय चरण इकट्ठा करें, मध्यस्थ चरण से संपर्क करने से बचें, और एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  13. आणविक ग्रेड आइसोप्रोपेनॉल के 400 μL (उपयोग किए गए फिनोल / क्लोरोफॉर्म के लिए 1: 1 अनुपात) और प्रत्येक ट्यूब में ग्लाइकोजन के 2 μL के साथ जलीय चरण को मिलाकर आरएनए को अवक्षेपित करें (यह गोली की उपस्थिति की कल्पना करने में मदद करेगा)।
  14. हाथ से सख्ती से मिलाएं या ~ 10 एस के लिए टिप के साथ होमोजेनाइज करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट या रात भर के लिए सेते हैं।
  15. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 12,000 एक्स जी पर नमूना अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  16. 100% इथेनॉल (लगभग 1 मिलीलीटर, डीईपीसी पानी का उपयोग करके पतला) के 3 संस्करणों को जोड़कर आरएनए गोली धो लें और गोली जारी होने तक भंवर द्वारा नमूना मिलाएं और नीचे से तैरता है।
  17. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7,500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
  18. 75% इथेनॉल के 1 एमएल जोड़कर आरएनए गोली 1 एक्स धो लें और गोली जारी होने तक भंवर द्वारा नमूना मिलाएं और नीचे से तैरता है। चरण 4.17 में वर्णित के रूप में सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं।
  19. ट्यूब की तरफ से अवशिष्ट तरल इकट्ठा करने और गोली परेशान किए बिना एक विंदुक के साथ किसी भी अवशिष्ट तरल को हटाने के लिए एक अतिरिक्त 5 एस सेंट्रीफ्यूजेशन स्पिन प्रदर्शन।
  20. संक्षेप में 3-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब की टोपी खोलकर आरएनए गोली को हवा में सुखाएं और आरएनए-मुक्त डीईपीसी-उपचारित पानी के 20-50 μL में आरएनए गोली को भंग करें। गोली के पुन: निलंबन की सुविधा के लिए 55-60 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए आरएनए सेते हैं।

5. कुल आरएनए एकाग्रता और गुणवत्ता का निर्धारण

  1. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260 एनएम और 280 एनएम पर अवशोषण को मापकर आरएनए एकाग्रता का निर्धारण करें। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में नमूनों का उपयोग करने से पहले पूर्ण-वर्णक्रमीय डेटा प्राप्त करें।
  2. 0.5 एक्स टीबीई बफर (45 एमएम ट्रिस बेस, 45 एमएम बोरिक एसिड, 1 एमएम ईडीटीए) का उपयोग करके 1.5% एगारोज़ जेल पर 800-1000 एनजी को हल करके आरएनए गुणवत्ता को नियंत्रित करें। कुल आरएनए 28 एस और 18 एस आरआरएनए का जिक्र करते हुए दो बैंड में अलग हो जाता है।
    1. सभी अभिकर्मकों को बनाएं और जेल को डीईपीसी-उपचारित पानी से चलाने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को धो लें। डीईपीसी-उपचारित पानी हुड में 1000 मिलीलीटर अल्ट्रा-शुद्ध पानी में 1 एमएल डायथिलपाइरोकार्बोनेट जोड़कर तैयार किया जाता है। कमरे के तापमान पर या 37 डिग्री सेल्सियस और आटोक्लेव पर ~ 2 घंटे के लिए सेते हैं। 10 महीने तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
      नोट: स्तनधारी कुल आरएनए का वैद्युतकणसंचलन लगभग 2: 1 के अनुपात में 28 एस और 18 एस आरआरएनए के पृथक्करण की ओर जाता है। बैंड बरकरार होना चाहिए और दो तेज बैंड के रूप में दिखाई देना चाहिए। अपमानित आरएनए के परिणामस्वरूप धुंधला बैंड होगा।

6. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

  1. कुल आरएनए के 1 μg का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया सेट करें।
  2. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइम ( सामग्री की तालिका देखें) और 50 एनजी / μL यादृच्छिक डिकैमर प्राइमरों का उपयोग करके रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) करें।
    1. 10 μL में आरएनए, यादृच्छिक प्राइमर, और 1 एमएम डीएनटीपी मिश्रण (10 एमएम) मिलाएं। निम्नलिखित अभिकर्मकों को जोड़ें: 1 एक्स आरटी बफर, 5 एमएम एमजीसीएल2, 10 एमएम डीटीटी, आरएनएएसई अवरोधक के 40 यू, और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के 200 यू।
    2. 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए और 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं (विभिन्न एंजाइमों का उपयोग किए जाने पर तापमान बदल सकता है)। 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके प्रतिक्रिया समाप्त करें सीडीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

7. मात्रात्मक पीसीआर

  1. 15 μL की अंतिम मात्रा में प्रतिक्रिया को इकट्ठा करने के लिए, सीडीएनए (100 एनजी / μL) के 3 μL, प्रत्येक प्राइमर के 3.2 पीएमओएल, डीएनटीपी और एंजाइम युक्त मास्टर मिश्रण के 6 μL और अल्ट्राप्योर पानी के 2.8 μL मिलाएं।
    नोट: एचयूआर एमआरएनए और एमआईआरएनए के अभिव्यक्ति स्तर को सामान्य करने के लिए नियंत्रण (हाउसकीपिंग जीन) के रूप में अंतर्जात संवैधानिक जीन के लिए प्राइमरों का उपयोग करें। β-एक्टिन और एसएनआरएनए यू 6 (आरएनयू 6 बी) क्रमशः एमआरएनए और एमआईआरएनए के सामान्यीकरण के लिए उपलब्ध विकल्प हैं, लेकिन मामले के आधार पर अन्य जीन भी उपयुक्त हो सकते हैं।
  2. डेल्टा-डेल्टा सीटी (2-ΔΔCt) विधि20 का उपयोग करके अभिव्यक्ति के स्तर को मापें।

8. रिपोर्टर परख

  1. परख के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं
    1. हेला-क्रे कोशिकाओं में प्लास्मिड को निम्नानुसार ट्रांसफेक्ट करें। पीटीके-रेनिला (40 एनजी) के साथ ट्रांसफेक्ट, फिर पीआरडी-एमआईआर -17-92, हेला-क्रे-एमआईआर -17-92 उत्पन्न करना, और 1 μg /
    2. ट्रांसफेक्ट हेला-क्रे-एमआईआर-17-92-पीटीके-रेनिला पीएमआईआरजीएलओ-आरएपी-आईबी-3-यूटीआर या पीएमआईआरजीएलओ-तले-3-यूटीआर के साथ अलग से। पेनिसिलिन (100 यू / एमएल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / एमएल) का उपयोग करके चुनें। ये अभिकर्मक ल्यूक-आरएपी -1-बी और ल्यूक-तले हुए उत्पन्न करते हैं।
    3. पीएफएलएजी-एचयूआर या खाली पीएफएलएजी (चरण 3) के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें।
    4. सेल संस्कृति के लिए आगे बढ़ें, जैसा कि चरण 2.2 में विस्तृत है, हेला-क्रे एमआईआर -17-92-ल्यूक, हेला-क्रे एमआईआर -17-92-तले हुए, हेला-क्रे एमआईआर -17-92-एचयूआर, और हेला-क्रे एमआईआर -17-92-एचयूआर-ल्यूक के साथ लगभग 80% संगम तक। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए डॉक्सीसाइक्लिन (1 μg / एमएल) के 1 μL के साथ प्रेरित करें। इसके अलावा, एक ही अवधि के लिए नियंत्रण के रूप में डॉक्सीसाइक्लिन के बिना सभी कोशिकाओं को रखें।
      नोट: डॉक्सीसाइक्लिन की अंतिम एकाग्रता पसंद की सेल लाइन पर निर्भर करती है। स्तनधारी कोशिकाओं के लिए डॉक्सीसाइक्लिन की अधिकता विषाक्त हो सकती है।
  2. ल्यूमिनेसेंट परख
    1. विभिन्न ल्यूमिनेसेंस तीव्रता को मापने और तुलना करने के लिए, दोहरी-लूसिफेरेज़ रिपोर्टर परख किट का उपयोग करें। लुसिफेरेज़ परख समाधान पिघलना और परख शुरू करने से पहले उन्हें कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
    2. लूसिफेरेज़ परख बफर द्वितीय के 10 एमएल में सब्सट्रेट के 200 μL मिश्रण द्वारा मिश्रण बंद करो और ग्लो (नीली टोपी ट्यूबों) तैयार करें। लूसिफेरेज़ परख सब्सट्रेट द्वितीय के एम्बर शीशी में लूसिफेरेज़ परख बफर द्वितीय के 10 मिलीलीटर मिश्रण करके मिश्रण एलएआर द्वितीय (हरी टोपी ट्यूब) तैयार करें और अच्छी तरह से हिलाएं।
    3. समाधान को पहले से पहचाने गए और प्रकाश से संरक्षित 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
      नोट: एक विकल्प के रूप में, समाधान पहले 1-2 एमएल विभाज्य में तैयार किया जा सकता है और एल्यूमीनियम पन्नी में प्रकाश से संरक्षित -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हो सकता है।
    4. सिनर्जी जैसे उपकरण का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस रीडिंग करें; माप सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (आरएलयू) के रूप में व्यक्त लूसिफेरेज़।
    5. आगे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए परिणामों को स्प्रेडशीट में निर्यात करें।
    6. रेनिला) नियंत्रण द्वारा जुगनू-लूसिफेरेज़ गतिविधि का सामान्यीकरण करें और ग्राफिक में सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (आरएलयू) के रूप में प्लॉट करें। डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण के साथ और बिना समूहों के लिए इसे दोहराएं।
    7. माध्य (एसईएम) के माध्य और मानक त्रुटि की गणना करें। समूह तुलना की अनुमति देने के लिए तुकी के पोस्ट-टेस्ट के बाद छात्र का टी-टेस्ट या दो-तरफा एनोवा करें। ये विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म जैसे पैकेज में उपलब्ध हैं। 0.05 < पी-मानों पर अंतर को महत्वपूर्ण माना जाता है।

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Representative Results

हमारी प्रारंभिक परिकल्पना यह थी कि एचयूआर अपने पूर्व-एमआईआरएनए अनुक्रम को बांधकर इंट्रोनिक एमआईआरएनए बायोजेनेसिस की सुविधा प्रदान कर सकता है। इस प्रकार, एचयूआर अभिव्यक्ति और एमआईआर -17-92 क्लस्टर बायोजेनेसिस का कनेक्शन इन एमआईआरएनए की परिपक्वता को नियंत्रित करने वाले एक नए तंत्र को इंगित कर सकता है। पीएफएलएजी-एचयूआर के अभिकर्मक पर एचयूआर के ओवरएक्सप्रेशन की पुष्टि तीन अलग-अलग सेल लाइनों में की गई थी: हेला, बीसीपीएपी और एचईके -293 टी (चित्रा 2)। नियंत्रण के रूप में, खाली पीएफएलएजी वैक्टर से संक्रमित असंक्रमित कोशिकाओं और कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, हमने देखा कि इन कोशिकाओं में एचयूआर ओवरएक्सप्रेशन एमआईआर -19 ए की अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है (पूरक तालिका 1 परिणाम गट्टी दा सिल्वा एट अल 9 में रिपोर्ट किए गए हैं)।

यह पुष्टि करने के लिए कि प्रेरित एमआईआरएनए वास्तव में कार्यात्मक थे, एक इन विट्रो रिपोर्टर सिस्टम डिजाइन किया गया था, जैसा कि यहां वर्णित है। पीआरडी-राइप में कृत्रिम इंट्रॉन ईजीएफपी के दो कोडिंग क्षेत्रों को अलग करता है। यह कैसेट टेट्रासाइक्लिन उत्तरदायी तत्व (टीआरई) के नियंत्रण में है। ईजीएफपी की अभिव्यक्ति, इस प्रकार, सेल माध्यम (चित्रा 3) में एंटीबायोटिक डॉक्सीसाइक्लिन (डॉक्स) की उपस्थिति से नियंत्रित होती है।

एमआईआरबेस और टारगेटस्कैन का उपयोग करके एक इन सिलिको खोज ने एमआईआर -19 ए और एमआईआर -19बी ( एमआईआर -17-92क्लस्टर के घटक) के लिए संभावित एमआरएनए लक्ष्यों का खुलासा किया। दोनों एमआईआरएनए के लिए एक संभावित लक्ष्य के रूप में, आरएपी-आईबी 3 'यूटीआर क्षेत्र पर पाए जाने वाले अनुक्रम 5' टीटीटीजीसीएसीए 3 'को चुना गया था (पूरक तालिका 2)। आरएपी-आईबी रास से जुड़े प्रोटीन परिवार (आरएएस) का एक जीटीपीस सदस्य है। प्रेरित एमआईआरएनए को हमारे परख में सही ढंग से संसाधित और कार्यात्मक किया गया था क्योंकि यह ल्यूसिफेरेज़ के बगल में क्लोन किए गए लक्ष्य अनुक्रम में संकरित था ( चित्रा 3, पीएमआईआर-जीएलओ लक्ष्य देखें)। इसलिए, इसने ल्यूसिफेरेज़ अनुवाद को अवरुद्ध कर दिया, जो कम लूसिफेरेज़ गतिविधि (चित्रा 3) में परिलक्षित होता था। इस परख के लिए एक नियंत्रण के रूप में, हमने लक्ष्य अनुक्रम को तले हुए, ल्यूक-तले हुए प्लास्मिड में 5 'जीजीजीटीएएए 3' के लिए इसे बदल दिया (लक्ष्य और तले हुए अनुक्रमों को सामग्री की तालिका में ओलिगोस अनुक्रमों में रेखांकित किया गया है)।

नियमित परिस्थितियों में और पीआरडी-एमआईआर -17-92 प्लास्मिड, अंतर्जात एमआईआर -19 ए और / या एमआईआर -19 बी के प्रेरण के बिना पीएमआईआर-जीएलओ पर लक्ष्य पाया गया, जिससे ल्यूसिफेरेज़ गतिविधि कम हो गई (डेटा नहीं दिखाया गया)। डॉक्स पूरकता के बाद, एक तले हुए लक्ष्य अनुक्रम के साथ कोशिकाओं में लूसिफेरेज़ गतिविधि में मामूली और सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी नहीं देखी गई थी। यह इस अनुक्रम में अन्य एमआईआरएनए के लिए लक्ष्य अनुक्रमों की उपस्थिति के कारण हो सकता है। हेला-क्रे कोशिकाओं की तुलना में पीआरडी-एमआईआर -17-92 से एमआईआर -19ए और एमआईआर -19बी अभिव्यक्ति में वृद्धि पर आरएपी-आईबी 3'यूटीआर के साथ लूसिफेरेज़ गतिविधि में एक मजबूत कमी देखी गई (चित्रा 4 देखें, नारंगी और काली सलाखों की तुलना करें)। इन कोशिकाओं में पीएफएलएजी-एचयूआर के अभिकर्मक ने लूसिफेरेज़ गतिविधि को नहीं बदला (चित्रा 4 देखें, ग्रे और ब्लैक बार की तुलना करें)। हालांकि, डॉक्सीसाइक्लिन पूरकता के साथ युग्मित एचयूआर की अधिकता, एमआईआर -17-92 क्लस्टर की अभिव्यक्ति को उत्तेजित करती है, आगे ल्यूसिफेरेज़ गतिविधि को कम करती है (चित्रा 4 देखें, ग्रे और लाल सलाखों की तुलना करें)। यह एमआईआर -19 ए और एमआईआर -19 बी पर एचयूआरके सकारात्मक विनियमन को इंगित करता है, इन एमआईआरएनए के सही प्रसंस्करण और परिपक्वता के साथ मिलकर, जो सफलतापूर्वक अपने लक्ष्यों को खोजने में सक्षम थे (हेला-क्रे एमआईआर -17-92-एचयूआर-ल्यूक) (चित्रा 4 देखें)।

इस रिपोर्टर प्रणाली के उपयोग ने पुष्टि की कि एचयूआर हेला कोशिकाओं में एमआईआर -19ए और एमआईआर -19बी की अभिव्यक्ति और उचित परिपक्वता को प्रेरित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: यहां वर्णित प्रोटोकॉल का एक वैचारिक अवलोकन। एमआईआरएनए, लक्ष्य अनुक्रम, नियामक प्रोटीन और पीटीके-रेनिला युक्त प्लास्मिड सुसंस्कृत कोशिकाओं में ट्रांसफेक्ट किए गए थे। एंटीबायोटिक चयन के बाद, इन कोशिकाओं का उपयोग एमआईआरएनए अभिव्यक्ति (डॉक्सीसाइक्लिन के साथ) को प्रेरित करने के लिए किया गया था, लूसिफेरेज़ गतिविधि के बाद के परिमाणीकरण के साथ, और एचयूआर ओवरएक्सप्रेशन की पुष्टि करने के लिए आरएनए विश्लेषण के लिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: क्यूपीसीआर द्वारा (ए) हेला, (बी) बीसीपीएपी, और (सी) एचईके 293 टी कोशिकाओं में फ्लैग-एचयूआर ओवर-एक्सप्रेशन की पुष्टि। खाली पीएफएलएजी के साथ अभिकर्मक का उपयोग नियंत्रण (सफेद सलाखों) के रूप में किया गया था। सीटी मानों को सामान्य करने के लिए β-एक्टिन का उपयोग किया गया था। वाई-अक्ष सामान्यीकरण के बाद गणना की गई अभिव्यक्ति के गुना परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टियाँ तीन स्वतंत्र मापों से गणना की गई मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करती हैं। ** पी <0.005, **** पी < 0.0005 (गट्टी दा सिल्वा एट अल .9 से अनुकूलित आंकड़ा)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: इंट्रोनिक एमआईआरएनए रिपोर्टर सिस्टम ( ए ) पीआरडी-आरआईपीई प्लास्मिड का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जो पीआरडी-एमआईआर -17-92 उत्पन्न करता है। प्री-एमआईआर -17-92 को इंट्रॉन के अंदर डाला गया था और एक डॉक्स-इंड्यूसिबल प्रमोटर के नियंत्रण में था; दाईं ओर, आरएपी-आईबी 3'यूटीआर लक्ष्य अनुक्रम (पीएमआईआरजीएलओ-आरएपी-आईबी) के साथ पीएमआईआर-जीएलओ प्लास्मिड; नियंत्रण में तले हुए लक्ष्य अनुक्रम (पीएमआईआरजीएलओ-तले हुए) थे। (बी) एमआईआर -19 ए और एमआईआर -19 बी के पूरक लक्ष्य अनुक्रम पर ध्यान केंद्रित करते हुए पीएमआईआरजीएलओ-आरएपी-आईबी के अनुक्रम पर विस्तार। एमआईआरएनए और लक्ष्य की बातचीत पर लूसिफेरेज़ गतिविधि कम हो जाती है (गट्टी दा सिल्वा एट अल 9 से अनुकूलित आंकड़ा)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: हेला-क्रे कोशिकाओं को रिपोर्टर प्लास्मिड पीटीके-रेनिला, पीएमआईआरजीएलओ-आरएपी-आईबी, पीएमआईआरजीएलओ-तले हुए, पीआरडी-एमआईआर-17-92 और पीएफएलएजी-एचयूआर के साथ सह-ट्रांसफेक्ट किया गया था। "अपरिवर्तित हेला-क्रे कोशिकाओं (काला), हेला-क्रे एमआईआर-17-92-तले हुए (सफेद), हेला-क्रे-एचयूआर (ग्रे), हेला-क्रे एमआईआर-17-92-ल्यूक (नारंगी), और हेला-क्रे एमआईआर-17-92-एचयूआर-ल्यूक (लाल) पर लूसिफेरेज़ गतिविधि"। ल्यूसिफेरेज़ गतिविधि को प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में रेनिला ल्यूसिफेरेज़ (पीटीके-रेनिला के साथ मनाया गया) के लिए जुगनू लूसिफेरेज़ की सापेक्ष गतिविधि के रूप में निर्धारित किया गया था और डॉक्सीसाइक्लिन जोड़ के बाद सामान्यीकृत किया गया था। इसे वाई-अक्ष पर "सापेक्ष प्रकाश इकाइयों" (आरएलयू) के रूप में दिखाया गया है। ** पी < 0.005; पी < 0.0005 (गट्टी दा सिल्वा एट अल .9 से अनुकूलित आंकड़ा)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 1: एमआईआर -19 अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए क्यूपीसीआर के लिए मनाया गया कच्चा सीटी मान। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 2: आरएपी-आईबी 3'यूटीआर अनुक्रम और एमआईआर -19 लक्ष्य अनुक्रम। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्री-एमआरएनए स्प्लिसिंग जीन अभिव्यक्ति विनियमन के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, और इसका नियंत्रण सेल फेनोटाइपिकसंशोधनों 22,23 पर मजबूत प्रभाव को ट्रिगर कर सकता है। 70% से अधिक एमआईआरएनए मनुष्यों में इंट्रॉन से प्रतिलेखित होते हैं, और हमने परिकल्पना की है कि नियामक प्रोटीन24,25 को विभाजित करके उनके प्रसंस्करण और परिपक्वता को सुविधाजनक बनाया जा सकता है। हमने सुसंस्कृत कोशिकाओं में इंट्रोनिक एमआईआरएनए प्रसंस्करण और कार्य का विश्लेषण करने के लिए एक विधि विकसित की। हमारी परख चार अलग-अलग प्लास्मिड का उपयोग करती है और हमें अंतर्जात और बहिर्जात या प्रेरित एमआईआरएनए की परिपक्वता का परीक्षण करने की अनुमति देती है। यहां वर्णित विधि 2-3 दिनों में की जा सकती है और महंगे अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं होती है।

एचयूआर को ध्यान में रखते हुए एमआरएनए स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण एक आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन है और एमआईआर -18 और एमआईआर -19 ए एमआईआरएनए17 के साथ प्रतिरक्षा-अवक्षेपित है, इस परख का परीक्षण किया गया कि क्या यह इंट्रोनिक एमआईआरएनए बायोजेनेसिस और परिपक्वता को चला सकता है। एचयूआर स्प्लिसोसोम के मूल में नहीं पाया जाता है, लेकिन एमआरएनए स्थिरीकरण26 के साथ शामिल प्रोटीन के साथ बातचीत करता है। लगातार, एचयूआर की अधिकता अंडाशय और मूत्राशय के कैंसर27,28 के विकास से जुड़ी हुई है। पैपिलरी थायरॉयड कैंसर कोशिकाओं में, हमने देखा कि एचयूआर सेल प्रसार, प्रवास और आक्रमण9 को बढ़ाता है। एचयूआर पीटीईएन, साइक्लिन ए 2 और साइक्लिन डी 2 जैसे सेल चक्र नियामकों की एमआरएनए स्थिरता को भी प्रभावित करता है, सेल प्रसार और प्रवास को बढ़ाता है और ट्यूमरजेनिक विशेषताओं29,30 की ओर जाता है। हालांकि, इन एमआरएनए के एक महत्वपूर्ण हिस्से में एमआईआर -19 ए और एमआईआर -19बी के लिए लक्ष्य अनुक्रम भी हैंविशेष रूप से, एचयूआर इंट्रोनिक क्षेत्र से बंध सकता है जहां इन एमआईआरएनए को स्थानांतरित किया जाता है, जिससे यह धारणा बनती है कि यह इन एमआईआरएनए के स्प्लिसिंग और परिपक्वता को नियंत्रित कर सकता है और परिणामस्वरूप, ट्यूमरजेनिक विशेषताओं को बढ़ा सकता है।

इसका परीक्षण करने के लिए, इस परख को चार अलग-अलग प्लास्मिड के साथ विकसित किया गया था। पहले में एक इंट्रॉन के अंदर डाला गया एमआईआरएनए क्लस्टर एमआईआर -17-92 होता है, और इसकी अभिव्यक्ति को डॉक्सीसाइक्लिन जोड़ पर नियंत्रित किया जाता है। दूसरा प्लास्मिड वाणिज्यिक पीएमआईआर-जीएलओ है जो ल्यूक 2 जीन के 3 'के बगल में लक्ष्य अनुक्रम ले जाता है। इस लक्ष्य अनुक्रम के लिए एमआईआरएनए का बंधन ल्यूक 2 अभिव्यक्ति को प्रभावित करता है, जिसे ल्यूमिनेसेंस परख पर मापा जा सकता है। तीसरा प्लास्मिड पीएफएलएजी-एचयूआर है, जो इस नियामक प्रोटीन के अतिरेक को प्रेरित करता है। अंत में, पीटीके-रेनिला का उपयोग रेनिला ल्यूसिफेरेज़ प्रतिदीप्ति को शामिल करने के लिए भी किया जाता है। हमारे परिणामों ने संकेत दिया कि एचयूआर एमआईआर -17-92 अभिव्यक्ति को उत्तेजित करता है और लक्ष्य अनुक्रमों के साथ अपने घटकों के सहयोग को बढ़ाता है, जिसके परिणामस्वरूप परिपक्व और कार्यात्मक एमआईआरएनए अणु होते हैं। हम एक अन्य पेपर 9 में एमआईआरएनए के साथ एचयूआर के सहयोग का वर्णन करतेहैं। इस अध्ययन में उपयोग किए गए लक्ष्य अनुक्रम एमआईआर -19 एऔर एमआईआर -19बी एमआईआरएनए के लिए विशिष्ट थे। हालाँकि, इस पद्धति को कई लक्ष्य साइटों सहित छोटे या लंबे लक्ष्य अनुक्रमों के उपयोग के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। इस मामले में, लक्ष्य अनुक्रम या आस-पास के अनुक्रमों के लिए अंतर्जात एमआईआरएनए के अविशिष्ट बंधन को विश्लेषण में माना जाना चाहिए। उपयोग किए गए अनुक्रमों में अन्य संभावित लक्ष्य साइटें हो सकती हैं, जो लूसिफेरेज़ गतिविधि को प्रभावित कर सकती हैं। यहां वर्णित विधि का उपयोग एमआईआरएनए के विभिन्न लक्ष्यों या एमआईआरएनए के एक समूह को एक साथ स्थानांतरित करने के लिए भी किया जा सकता है, जिससे एमआईआरएनए के कार्यात्मक अध्ययन और उनके विशिष्ट फेनोटाइपिक परिवर्तन सक्षम हो सकते हैं। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह परिणामों को विभिन्न सेल लाइनों और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बीच तुलना करने की अनुमति देता है।

स्तनधारी कोशिकाओं में इस प्रोटोकॉल के व्यापक उपयोग के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम अभिकर्मक और प्रेरण चरणों की दक्षता हैं। चूंकि विभिन्न प्लास्मिड कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट होते हैं, इसलिए पर्याप्त नियंत्रण भी महत्वपूर्ण होते हैं। ये पैरामीटर प्लास्मिड के आकार के साथ बदलते हैं और सेल संस्कृति में व्यापक समय से प्रभावित होते हैं। इसलिए, परख शुरू करने से पहले विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु चुने हुए कोशिकाओं के अभिकर्मक की आसानी है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न प्लास्मिड (जेंटामाइसिन, प्यूरोमाइसिन और डॉक्सीसाइक्लिन) के लिए चयन करने और अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए विभिन्न एंटीबायोटिक दवाओं का व्यापक उपयोग कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकता है और निम्नलिखित प्रयोगों की दक्षता को कम कर सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि इस परख पहले ज्ञात अभिकर्मक दक्षता के साथ कोशिकाओं के साथ अनुकूलित है.

रिपोर्टर ने सफलतापूर्वक दिखाया कि बढ़ी हुई एचयूआर अभिव्यक्ति एमआईआरएनए बायोजेनेसिस को प्रेरित कर सकती है और इसकी कार्यात्मक परिपक्वता की पुष्टि कर सकती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि एचयूआर के ओवरएक्सप्रेशन ने उत्पादित इंट्रॉन की मात्रा को प्रभावित नहीं किया क्योंकि हमने इस स्थिति (चित्रा 4) में कम ल्यूसिफेरेज़ गतिविधि का निरीक्षण नहीं किया था। इस रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके आरबीपी और एमआईआरएनए को चिह्नित करने के लिए आगे के प्रयोग किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, एमआईआरएनए अनुक्रमों में या उनके फ्लैंकिंग क्षेत्रों में एकल उत्परिवर्तन बनाना और एमआईआरएनए बायोजेनेसिस में नियामक प्रोटीन के प्रभाव का विश्लेषण करना महत्वपूर्ण होगा। यह व्यक्तिगत एमआईआरएनए के बायोजेनेसिस के विशिष्ट लक्षण वर्णन की अनुमति देगा और एमआईआरएनए प्रसंस्करण और परिपक्वता के लिए संरक्षित अनुक्रमों पर ज्ञान में भी सुधार कर सकता है।

हम मानते हैं कि यह एमआईआरएनए बायोजेनेसिस और परिपक्वता के अध्ययन और इन प्रक्रियाओं में नियामक प्रोटीन को अलग करने की भूमिका की दिशा में एक महत्वपूर्ण पद्धतिगत योगदान है। इसे विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में एमआरएनए और एमआईआरएनए के विनियमन और नियंत्रण पर अध्ययन के लिए भी लागू किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक हेला-क्रे कोशिकाओं और पीआरडी-आरआईपीई और पीसीएजीजीएस-क्रे प्लास्मिड के लिए ई माकेयेव (नानयांग टेक्नोलॉजिकल यूनिवर्सिटी, सिंगापुर) के आभारी हैं। हम एडना किमुरा, कैरोलिना परसेल गोज़, गिसेला रामोस, लूसिया रोसेटी लोप्स और एंसेल्मो मोरिस्कॉट को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 184
स्तनधारी कोशिकाओं में इंट्रोनिक माइक्रोआरएनए परिपक्वता का विश्लेषण करने के लिए एक रिपोर्टर परख
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Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. … More

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

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