Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En reporteranalyse for å analysere intronisk mikroRNA-modning i pattedyrceller

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63498
Automatic Translation
1, 1
1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

Summary

Vi utviklet en intronisk mikroRNA biogenese reporteranalyse som skal brukes i celler in vitro med fire plasmider: en med intronisk miRNA, en med målet, en for å overuttrykke et regulatorisk protein og en for Renilla luciferase. MiRNA ble behandlet og kunne kontrollere luciferaseuttrykk ved å binde seg til målsekvensen.

Abstract

MikroRNA (miRNA) er korte RNA-molekyler som er utbredt i eukaryoter. De fleste miRNA transkriberes fra introner, og deres modning involverer forskjellige RNA-bindende proteiner i kjernen. Modne miRNA formidler ofte geninaktivering, og dette har blitt et viktig verktøy for å forstå posttranskripsjonelle hendelser. Dessuten kan det utforskes som en lovende metodikk for genterapier. Imidlertid mangler det for tiden direkte metoder for å vurdere miRNA-uttrykk i pattedyrcellekulturer. Her beskriver vi en effektiv og enkel metode som hjelper til med å bestemme miRNA-biogenese og modning gjennom bekreftelse av samspillet med målsekvenser. Dette systemet tillater også separasjon av eksogen miRNA-modning fra sin endogene aktivitet ved bruk av en doxycyklinininduserbar promotor som er i stand til å kontrollere primær miRNA (pri-miRNA) transkripsjon med høy effektivitet og lave kostnader. Dette verktøyet tillater også modulering med RNA-bindende proteiner i et eget plasmid. I tillegg til bruken med en rekke forskjellige miRNA og deres respektive mål, kan den tilpasses forskjellige cellelinjer, forutsatt at disse er egnet til transfeksjon.

Introduction

Forløper mRNA-spleising er en viktig prosess for regulering av genuttrykk i eukaryoter1. Fjerning av introner og forening av eksoner i modent RNA katalyseres av spliceosomet, et 2 megadalton ribonukleoproteinkompleks sammensatt av 5 snRNA (U1, U2, U4, U5 og U6) sammen med mer enn 100 proteiner 2,3. Skjøtereaksjonen skjer kotranskripsjonelt, og spliceosomet settes sammen ved hvert nytt intron styrt av gjenkjennelsen av konserverte spleisesteder ved ekson-introngrenser og innenfor intron4. Ulike introner kan ha forskjellige spleisingshastigheter til tross for den bemerkelsesverdige bevaringen av spliceosomkomplekset og dets komponenter. I tillegg til forskjellene i bevaring av spleisested, kan regulatoriske sekvenser fordelt på introner og eksoner veilede RNA-bindende proteiner (RBP) og stimulere eller undertrykke spleising 5,6. HuR er en allestedsnærværende uttrykt RBP og er en viktig faktor for å kontrollere mRNA-stabilitet7. Tidligere resultater fra vår gruppe viste at HuR kan binde seg til introner som inneholder miRNA, noe som indikerer at dette proteinet kan være en viktig faktor for å lette miRNA-prosessering og modning, noe som også fører til generering av alternative spleisingsisoformer 6,8,9.

Mange mikroRNA (miRNA) er kodet fra introniske sekvenser. Mens noen er en del av intronen, er andre kjent som "mirtrons" og dannes av hele intron10,11. miRNA er korte ikke-kodende RNA, alt fra 18 til 24 nukleotider i lengde12. Deres modne sekvens viser delvis eller total komplementaritet med målsekvenser i mRNA, og påvirker derfor oversettelses- og / eller mRNA-forfallshastigheter. Kombinasjonene av miRNA og mål driver cellen til forskjellige utfall. Flere miRNA kan drive celler til pro- eller antitumorfenotyper13. Onkogene miRNA retter seg vanligvis mot mRNA som utløser en undertrykkende egenskap, noe som fører til økt cellulær spredning, migrasjon og invasjon14. På den annen side kan tumorundertrykkende miRNA målrette onkogene mRNA eller mRNA relatert til økt celleproliferasjon.

Behandlingen og modningen av miRNA er også avhengig av opprinnelsen. De fleste introniske miRNA behandles med deltakelse av mikroprosessoren, dannet av ribonuklease Drosha og proteinkofaktorer12. Mirtrons behandles med aktiviteten til spliceosomet uavhengig av Drosha15. Med tanke på den høye frekvensen av miRNA som finnes i introner, antydet vi at RNA-bindende proteiner involvert i spleising også kunne lette behandlingen og modningen av disse miRNA-ene. Spesielt har RBP hnRNP A2 / B1 allerede vært assosiert med mikroprosessoren og miRNA-biogenesen16.

Vi har tidligere rapportert at flere RNA-bindende proteiner, som hnRNPs og HuR, er assosiert med introniske miRNA ved massespektrometri17. HuRs (ELAVL1) assosiasjon med miRNA fra miR-17-92 intronic-klyngen ble bekreftet ved hjelp av immunprecipitasjon og i silicoanalyse 9. miR-17-92 er en intronisk miRNA-klynge sammensatt av seks miRNA med økt uttrykk i forskjellige kreftformer18,19. Denne klyngen er også kjent som "oncomiR-1" og består av miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b og miR-92 a. miR-19 a og miR-19b er blant de mest onkogene miRNAene i denne klyngen 19. Det økte uttrykket av HuR stimulerer miR-19a og miR-19b syntese9. Siden introniske regioner som flankerer denne klyngen er assosiert med HuR, utviklet vi en metode for å undersøke om dette proteinet kunne regulere miR-19a og miR-19b uttrykk og modning. En viktig prediksjon av hypotesen vår var at HuR som et regulatorisk protein kunne lette miRNA-biogenese, noe som førte til fenotypiske endringer. En mulighet var at miRNA ble behandlet ved stimulering av HuR, men ville ikke være moden og funksjonell, og derfor ville effekten av proteinet ikke direkte påvirke fenotypen. Derfor utviklet vi en spleisingsreporteranalyse for å undersøke om en RBP som HuR kunne påvirke biogenesen og modningen av et intronisk miRNA. Ved å bekrefte miRNA-prosessering og modning viser vår analyse samspillet med målsekvensen og genereringen av et modent og funksjonelt miRNA. I vår analyse kobler vi uttrykket av en intronisk miRNA-klynge med et luciferase-plasmid for å se etter miRNA-målbinding i dyrkede celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En oversikt over protokollen beskrevet her er avbildet i figur 1.

1. Plasmid konstruksjon

  1. pCAGGS-Cre: Dette plasmidet ble levert av Dr. E. Makeyev21.
  2. pRD-mir-17-92:
    1. Forsterk pre-miR-17-92 ved PCR ved å bruke 0,5 μM av hver spesifikk primer (materialtabell), 150 ng cDNA, 1 mM dNTPs, 1x Taq PCR-buffer og 5 U high-fidelity Taq DNA-polymerase. Utfør en ikke-mal kontroll PCR-reaksjon (bruk vann i stedet for cDNA) for å se etter DNA-forurensning.
    2. Ligate PCR-produktet i pRD-RIPE (vennlig levert av Dr. E. Makeyev, Nanyang Technological University, Singapore)21 inne i intron mellom EcoRI og EcoRV restriksjonssteder ved hjelp av DNA-ligase, og skaper pRD-miR-17-92. Bekreft sekvensintegritet ved Sanger-sekvensering.
  3. pmiRGLO-RAP-IB
    1. Design fremover og bakover primere flankert av XhoI / XbaI restriksjonssteder og med ett NotI-begrensningssted inne. Bland tilsvarende mengder forover- og reversprimere og inkuber blandingen ved 90 °C i 5 minutter, og overfør deretter til 37 °C i 15 minutter. Som kontroller bruker du primere med krypterte målsekvenser (materialtabell).
    2. Spalt de glødede fragmentene ved hjelp av XhoI/XbaI-restriksjonsenzymer og liggjør dem nedstrøms for luc2-sekvensen i pmiR-GLO, og generer pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) og pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled) reporterkonstruksjoner. Bekreft ligering med NotI-spalting.
      MERK: Forsikre deg om at overhengene som er opprettet etter grunningglødning, er komplementære til vektoren etter spaltningsreaksjon.
  4. pFLAG-HuR
    1. For å generere et HuR-overuttrykkende plasmid, forsterk HuR-sekvensen med spesifikke primere. Bland 300 ng cDNA, 0,5 μM av hver spesifikk primer, 1 mM dNTPs blanding, 1x PCR-buffer og 5 U high-fidelity Taq DNA-polymerase.
    2. Ligate PCR-produktet i pGEM-T og bekreft DNA-sekvensintegriteten ved Sanger-sekvensering. Fjern HuR-fragmentet fra pGEM-T og subklon det til pFLAG-CMV-3 pattedyruttrykksvektor for å generere pFLAG-HuR-vektoren.

2. Cellekultur

MERK: HeLa-Cre-cellelinjen var en gave fra Dr. E. Makeyev21, og papillær skjoldbruskkreftcelle (BCPAP) ble vennlig levert av Dr. Massimo Santoro (Universitetet "Federico II", Napoli, Italia). HeLa-celle, papillær skjoldbruskkreftcelle (BCPAP) og HEK-293T ble brukt til å overuttrykke HuR.

  1. Oppretthold cellene i DMEM/høyglukose supplert med 10 % føtalt bovint serum, 1 mM natriumpyruvat, 200 mM L-glutamin og 1x penicillin-streptomycin (100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin) i 100 mm petriskåler, med mindre annet er angitt. Inkuber cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator i kontrollert atmosfære (5 % CO2).
  2. Inkuber adherente celler med trypsin/EDTA (0,5% oppløsningsblanding) ved 37 °C i 3-5 min. La dem løsne fra platen (inkubasjonsperioden kan variere i henhold til celletypen).
  3. Utfør transfeksjoner med et lipidbasert transfeksjonsreagens etter produsentens instruksjoner. Sørg for at cellekulturene er omtrent 70% sammenflytende. Bruk lignende mengder DNA for alle transfeksjonskombinasjoner, som beskrevet nedenfor, ved å legge til passende DNA-er. Utfør transfeksjonseksperimenter i replikasjoner.
    1. Bland 200 ng DNA og 1,25 μL transfeksjonsreagens i 100 μL av kulturmediet. Tilsett transfeksjonsblandingen til cellene. Inkuber cellene med transfeksjonsblandingene i 4 timer ved 37 °C. Erstatt deretter mediet med medium som inneholder 10% FBS, og inkuber i ytterligere 24 timer før du legger til antibiotika for valg.

3. HuR overuttrykk

  1. Transfekt pFLAG-HuR og tom pFLAG til HeLa. Velg celler ved å øke konsentrasjonen av genein (G418) (1 μg / ml) fra 100 μg / ml til 1000 μg / ml, og generere stabile cellelinjer.
  2. Bekreft overekspresjon med kvantitativ PCR ved hjelp av spesifikke primere for HuR mRNA, som beskrevet i trinn 7.

4. Total RNA-isolasjon

  1. Bruk nyoppsamlede celler. Trypsinisere 70% konfluente cellekulturer (for denne analysen ble HeLa-Cre-celler brukt), som beskrevet i trinn 2.2.
  2. Samle cellepelleten ved sentrifugering i 5 minutter ved 500 x g ved 4 ° C og vask den med 1x PBS (fosfatbufret saltvann); gjenta sentrifugeringen.
  3. Resuspend cellepelleten i 1 ml 1x PBS og overfør den til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  4. Sentrifuge i 5 minutter ved 500 x g ved 4 °C.
  5. Vei tørrcellepelleten, og juster volumene og størrelsen på rørene deretter. 1 mg celler gir ca. 1 μg totalt RNA.
  6. I en hette, tilsett 500-1000 μL fenol / kloroform til cellepelleten (ideelt 750 μL per 0,25 g celler) og homogeniser den ved pipettering opp og ned og blanding med virvelen.
  7. Inkuber blandingen i 5 minutter ved romtemperatur (20 °C til 25 °C) for å muliggjøre fullstendig dissosiasjon av nukleoproteinkomplekser.
  8. Sentrifuge prøven ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  9. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør og tilsett 200 μL kloroform per 1 ml fenol: kloroform som brukes. Sett lokk prøverørene forsvarlig.
  10. Bland kraftig i 15 s (for hånd eller kortvarig vortexing ved lavere hastighet) og inkuber ved romtemperatur (20 °C til 25 °C) i 2 minutter til 3 minutter.
  11. Sentrifuge prøvene ved 12 000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
  12. Kontroller tilstedeværelsen av en nedre rød fenol-kloroformfase, en mellomfase og en fargeløs øvre vandig fase. RNA forblir i den øvre vandige fasen. I en hette, samle den vandige fasen, unngå å kontakte mellomfasen, og overfør til et friskt rør.
  13. Utfell RNA ved å blande den vandige fasen med 400 μL molekylær klasse isopropanol (1: 1-forhold til fenol / kloroform brukt) og 2 μL glykogen i hvert rør (det vil bidra til å visualisere tilstedeværelsen av pelleten).
  14. Bland kraftig for hånd eller homogeniser med spissen i ~10 s. Inkuber i 15 minutter eller over natten ved -20 °C.
  15. Sentrifuge prøven ved 12 000 x g i 20 minutter ved 4 °C og kast supernatanten.
  16. Vask RNA-pelleten ved å tilsette 3 volumer 100% etanol (ca. 1 ml, fortynnet med DEPC-vann) og bland prøven ved vortexing til pelleten frigjøres og flyter fra bunnen.
  17. Sentrifuge ved 7 500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  18. Vask RNA-pelleten 1x ved å tilsette 1 ml 75% etanol og bland prøven ved å virvle til pelleten frigjøres og flyter fra bunnen. Gjenta sentrifugeringen som beskrevet i trinn 4.17.
  19. Utfør ytterligere 5 s sentrifugeringsspinn for å samle gjenværende væske fra siden av røret og fjern eventuell gjenværende væske med en pipette uten å forstyrre pelleten.
  20. Lufttørk RNA-pelleten kort ved å åpne lokket på røret ved romtemperatur i 3-5 minutter og oppløs RNA-pelleten i 20-50 μL RNase-fritt DEPC-behandlet vann. Inkuber RNA i 10 minutter ved 55-60 °C for å lette resuspendering av pelleten.

5. Bestemmelse av total RNA-konsentrasjon og kvalitet

  1. Bestem RNA-konsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 260 nm og 280 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Hent fullstendige spektrale data før du bruker prøvene i nedstrømsapplikasjoner.
  2. Kontroller RNA-kvaliteten ved å løse 800-1000 ng på en 1,5% agarosegel ved bruk av 0,5X TBE-buffer (45 mM Tris-base, 45 mM borsyre, 1 mM EDTA). Totalt RNA skiller seg i to bånd som refererer til 28S og 18S rRNA.
    1. Lag alle reagenser og vask alt utstyr som brukes til å kjøre gelen med DEPC-behandlet vann. DEPC-behandlet vann fremstilles i hetten ved å tilsette 1 ml dietylpyrokarbonat til 1000 ml ultrarent vann. Inkuber i ~2 timer ved romtemperatur eller ved 37 °C og autoklav. Oppbevares ved romtemperatur i opptil 10 måneder.
      MERK: Elektroforese av pattedyrs totale RNA fører til separasjon av 28S og 18S rRNA i forholdet ca. 2: 1. Båndene skal være intakte og synlige som to skarpe bånd. Degradert RNA vil resultere i uskarpe bånd.

6. Omvendt transkripsjon

  1. Still inn omvendt transkripsjonsreaksjon ved bruk av 1 μg totalt RNA.
  2. Utfør revers transkripsjon (RT) ved bruk av revers transkriptaseenzym (se Materialtabell) og 50 ng / μL tilfeldige dekamerprimere.
    1. Bland RNA, tilfeldige primere og 1 mM dNTP-blanding (10 mM) i 10 μL. Inkuber ved 65 °C i 5 minutter og på is i 1 min. Legg til følgende reagenser: 1x RT-buffer, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U RNase-hemmer og 200 U reverstranskriptase.
    2. Inkuber i 10 minutter ved 25 °C og i 1 time ved 50 °C (temperaturen kan endres hvis forskjellige enzymer brukes). Avslutt reaksjonen ved å inkubere ved 85 °C i 5 min.

7. Kvantitativ PCR

  1. For å sette sammen reaksjonen i et endelig volum på 15 μL, bland 3 μL cDNA (100 ng / μL), 3,2 pmol av hver primer, 6 μL masterblanding som inneholder dNTP og enzym, og 2,8 μL ultrarent vann.
    MERK: Bruk primere for endogene konstitutive gener som kontroller (housekeeping gener) for å normalisere uttrykksnivåene av HuR mRNA og miRNA. β-aktin og snRNA U6 (RNU6B) er tilgjengelige alternativer for normalisering av henholdsvis mRNA og miRNA, men andre gener kan også være egnet avhengig av saken.
  2. Kvantifiser uttrykksnivåene ved hjelp av delta-delta Ct (2-ΔΔCt) metode20.

8. Reporteranalysen

  1. Celler som brukes til analysen
    1. Transfekter plasmidene i HeLa-Cre-celler som følger. Transfekt med pTK-Renilla (40 ng), deretter pRD-miR-17-92, genererer HeLa-Cre-miR-17-92, og selekterer med 1 μg/ml puromycin.
    2. Transfekt HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla med pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR eller pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, separat. Velg ved hjelp av penicillin (100 U / ml) og streptomycin (100 μg / ml). Disse transfeksjonene genererer Luc-RAP-1-B og Luc-scrambled.
    3. Transfekter cellene med pFLAG-HuR eller tom pFLAG (trinn 3).
    4. Fortsett til cellekultur, som beskrevet i trinn 2.2., med HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR og HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc til omtrent 80% av samløpet. Induser med 1 μL doksysyklin (1 μg/ml) i 30 minutter ved 37 °C. Hold også alle cellene uten doksycyklin som kontroller, i samme periode.
      MERK: Den endelige konsentrasjonen av doksycyklin avhenger av cellelinjen. Et overskudd av doksycyklin kan være giftig for pattedyrceller.
  2. Selvlysende analyse
    1. For å kvantifisere og sammenligne forskjellige luminescensintensiteter, bruk Dual-luciferase reporter assay kit. Tine luciferase-analyseløsninger og la dem ligge i romtemperatur før analysen begynner.
    2. Forbered blandingen Stop og Glo (blå hetterør) ved å blande 200 μL av substratet i 10 ml Luciferase Assay Buffer II. Forbered blandingen LAR II (green cap tubes) ved å blande 10 ml Luciferase Assay Buffer II i det gule hetteglasset med Luciferase Assay Substrate II og rist godt.
    3. Overfør løsningene til 15 ml sentrifugerør som tidligere er identifisert og beskyttet mot lys.
      MERK: Som et alternativ kan løsningene tidligere fremstilles i 1-2 ml aliquots og fryses ved -80 ° C beskyttet mot lys i aluminiumsfolie.
    4. Utfør luminescensavlesningene ved hjelp av et utstyr som Synergy; måle uttrykt luciferase som relative lysenheter (RLU).
    5. Eksporter resultatene til et regneark for videre statistisk analyse.
    6. Utfør normalisering av firefly-luciferase aktivitet av kontrollen Renilla (lucifererase / Renilla) og plott det som relative lysenheter (RLU) i en grafikk. Gjenta dette for grupper med og uten doksysyklininduksjon.
    7. Beregn gjennomsnittet og standardfeilen til gjennomsnittet (SEM). Utfør en Student t-test eller toveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post-test for å tillate gruppesammenligning. Disse analysene er tilgjengelige i en pakke som GraphPad Prism. Forskjeller ved p-verdier < 0,05 regnes som signifikante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vår opprinnelige hypotese var at HuR kunne lette intronisk miRNA-biogenese ved å binde seg til sin pre-miRNA-sekvens. Dermed kan forbindelsen mellom HuR-ekspresjon og miR-17-92-klyngebiogenese peke på en ny mekanisme som styrer modningen av disse miRNA-ene. Overekspresjon av HuR ved transfeksjon av pFLAG-HuR ble bekreftet i tre forskjellige cellelinjer: HeLa, BCPAP og HEK-293T (figur 2). Som kontroller ble utransfiserte celler og celler transfisert med tomme pFLAG-vektorer brukt. Det er viktig at vi observerte at HuR-overekspresjon i disse cellene stimulerer uttrykket av miR-19a (supplerende tabell 1-resultater rapportert i Gatti da Silva et al.9).

For å bekrefte at de induserte miRNA-ene var genuint funksjonelle, ble det designet et in vitro-reportersystem , som beskrevet her. Den kunstige intronen i pRD-RIPE skiller to kodende regioner av eGFP. Denne kassetten er under kontroll av et tetracyklinresponsivt element (TRE). Uttrykket av eGFP styres dermed av tilstedeværelsen av antibiotikumet doxycyklin (DOX) i cellemediet (figur 3).

Et in silico-søk ved hjelp av miRbase og TargetScan avslørte mulige mRNA-mål for miR-19 a og miR-19 b (komponenter i miR-17-92-klyngen). Som et potensielt mål for begge miRNA ble sekvensen 5' TTTGCACA 3', funnet på RAP-IB 3' UTR-regionen, valgt (tilleggstabell 2). RAP-IB er et GTPase-medlem av den Ras-assosierte proteinfamilien (RAS). De induserte miRNA-ene ble korrekt behandlet og funksjonelle i vår analyse da de hybridiserte til målsekvensen klonet ved siden av luciferase (se figur 3, pmiR-GLO-mål). Den blokkerte derfor luciferaseoversettelsen, noe som gjenspeiles i redusert luciferaseaktivitet (figur 3). Som en kontroll for denne analysen krypterte vi målsekvensen, og erstattet den med 5 'GGGTAAA 3' i Luc-scrambled plasmid (mål og krypterte sekvenser er understreket i oligos-sekvensene i materialtabellen).

Under vanlige forhold og uten induksjon av pRD-miR-17-92-plasmidet fant endogent miR-19a og/ eller miR-19b målet på pmiR-GLO, noe som førte til redusert luciferaseaktivitet (data ikke vist). Etter DOX-tilskudd ble det observert en liten og ikke statistisk signifikant reduksjon i luciferaseaktivitet i celler med kryptert målsekvens. Dette kan skyldes tilstedeværelsen av målsekvenser for andre miRNA i denne sekvensen. En sterk reduksjon i luciferaseaktivitet ble observert med RAP-IB 3'UTR ved økt miR-19 a og miR-19 b uttrykk fra pRD-miR-17-92sammenlignet med HeLa-Cre-celler (se figur 4, sammenlign oransje og svarte søyler). Transfeksjonen av pFLAG-HuR i disse cellene i seg selv endret ikke luciferaseaktiviteten (se figur 4, sammenlign grå og svarte søyler). Imidlertid reduserte overekspresjon av HuR kombinert med doksycyklintilskudd, stimulerende uttrykk for miR-17-92-klyngen, ytterligere luciferaseaktivitet (se figur 4, sammenlign grå og røde søyler). Dette indikerer en positiv regulering av HuR over miR-19 a og miR-19 b, kombinert med korrekt prosessering og modning av disse miRNA-ene, som klarte å finne sine mål (HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc) (se figur 4).

Bruken av dette reportersystemet bekreftet at HuR induserer ekspresjon og riktig modning av miR-19 a og miR-19 b i HeLa-celler.

Figure 1
Figur 1: En konseptuell oversikt over protokollen beskrevet her. Plasmider som inneholdt miRNA, målsekvens, regulatorisk protein og pTK-Renilla ble transfisert i dyrkede celler. Etter antibiotikaseleksjon ble disse cellene brukt til å indusere miRNA-ekspresjon (med doksycyklin), med påfølgende kvantifisering av luciferaseaktivitet, og for RNA-analyse for å bekrefte HuR-overuttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Bekreftelse av FLAG-HuR-overuttrykk i (A) HeLa-, (B) BCPAP- og (C) HEK293T-celler ved qPCR. Transfeksjon med tom pFLAG ble brukt som kontroll (hvite søyler). β-aktin ble brukt til å normalisere Ct-verdier. Y-aksen representerer foldeendringen av uttrykk beregnet etter normalisering. Feilfeltene representerer standardfeil beregnet ut fra tre uavhengige målinger. **P <0.005, ****P < 0.0005 (figur tilpasset fra Gatti da Silva et al.9). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Intronisk miRNA-reportersystem. (A) Skjematisk fremstilling av pRD-RIPE-plasmidet som genererte pRD-miR-17-92. pre-miR-17-92 ble satt inn i intronen og var under kontroll av en dox-induserbar promotor; til høyre pmiR-GLO plasmid med RAP-IB 3'UTR målsekvens (pmiRGLO-RAP-IB); kontrollen hadde den krypterte målsekvensen (pmiRGLO-scrambled). (B) Detalj om sekvensen av pmiRGLO-RAP-IB, med fokus på målsekvensen komplementær til miR-19 a og miR-19b. Luciferase aktivitet reduseres ved interaksjon av miRNA og målet (figur tilpasset fra Gatti da Silva et al.9). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: HeLa-Cre-celler ble co-transfisert med reporterplasmider pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-scrambled, pRD-miR-17-92 og pFLAG-HuR. Luciferase aktivitet på utransfiserte HeLa-Cre celler (svart), HeLa-Cre miR-17-92-scrambled (hvit), HeLa-Cre-HuR (grå), HeLa-Cre miR-17-92-luc (oransje), og HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (rød). Luciferase aktivitet ble kvantifisert som beskrevet i protokollen som den relative aktiviteten av firefly luciferase til Renilla luciferase (observert med pTK-Renilla) og normalisert etter doxycyklin tillegg. Det vises som "relative light units" (RLU) på y-aksen. ** P < 0,005; P < 0,0005 (figur tilpasset fra Gatti da Silva et al.9). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende tabell 1 Rå Ct-verdier observert for qPCR for å analysere miR-19-uttrykk. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: RAP-IB 3'UTR sekvens og miR-19 målsekvens. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Pre-mRNA-spleising er en viktig prosess for regulering av genuttrykk, og kontrollen kan utløse sterke effekter på cellefenotypiske modifikasjoner22,23. Mer enn 70% av miRNA transkriberes fra introner hos mennesker, og vi antydet at deres behandling og modning kunne lettes ved å spleise regulatoriske proteiner24,25. Vi utviklet en metode for å analysere intronisk miRNA-prosessering og funksjon i dyrkede celler. Vår analyse bruker fire forskjellige plasmider og lar oss teste modningen av endogene og eksogene eller induserte miRNA. Metoden beskrevet her kan utføres på 2-3 dager og krever ikke dyre reagenser.

Med tanke på at HuR er et RNA-bindende protein som er viktig for mRNA-stabilitet og er immunutfelt med miR-18 og miR-19a miRNA17, testet denne analysen om den kunne drive intronisk miRNA-biogenese og modning. HuR finnes ikke i kjernen av spliceosomer, men interagerer med proteiner involvert i mRNA-stabilisering26. Konsekvent har overekspresjon av HuR vært assosiert med utvikling av eggstokk- og blærekreft27,28. I papillære skjoldbruskkreftceller observerte vi at HuR øker celleproliferasjon, migrasjon og invasjon9. HuR påvirker også mRNA-stabiliteten til cellesyklusregulatorer som PTEN, cyklin A2 og cyklin D2, øker celleproliferasjon og migrasjon og fører til tumorogene egenskaper29,30. Imidlertid har en betydelig del av disse mRNA-ene også målsekvenser for miR-19 a og miR-19b. Spesielt kan HuR binde seg til den introniske regionen der disse miRNA-ene transkriberes, noe som fører til forestillingen om at den kan kontrollere spleisingen og modningen av disse miRNA-eneog følgelig forbedre tumorogene egenskaper.

For å teste det, ble denne analysen utviklet med fire forskjellige plasmider. Den første inneholder miRNA-klyngen miR-17-92 satt inn i en intron, og uttrykket styres ved doksycyklintilsetning. Det andre plasmidet er det kommersielle pmiR-GLO som bærer målsekvensen ved siden av 3 'av luc2-genet. Binding av miRNA til denne målsekvensen påvirker luc2-ekspresjon, som kan måles ved en luminescensanalyse. Det tredje plasmidet er pFLAG-HuR, som induserer overekspresjonen av dette regulatoriske proteinet. Endelig brukes pTK-Renilla også til å inkludere Renilla luciferase fluorescens. Våre resultater indikerte at HuR stimulerer miR-17-92-uttrykk og øker assosiasjonen av komponentene med målsekvensene, noe som resulterer i modne og funksjonelle miRNA-molekyler. Vi beskriver assosiasjonen av HuR med miRNA i en annen artikkel9. Målsekvensene som ble brukt i denne studien var spesifikke for miR-19 a og miR-19b miRNA. Denne metoden kan imidlertid også tilpasses bruken av kortere eller lengre målsekvenser, inkludert flere målsteder. I dette tilfellet må uspesifikk binding av endogene miRNA til målsekvensen eller sekvensene i nærheten vurderes i analysen. Sekvensene som brukes, kan ha andre mulige målsteder, noe som kan påvirke luciferaseaktiviteten. Metoden beskrevet her kan også brukes til å validere forskjellige mål for et miRNA eller en gruppe miRNA transkribert sammen, noe som muliggjør funksjonelle studier av miRNA og deres spesifikke fenotypiske endringer. Det skal også bemerkes at det gjør at resultatene kan sammenlignes mellom forskjellige cellelinjer og genetiske bakgrunner.

De mest kritiske trinnene for bredere bruk av denne protokollen i pattedyrceller er effektiviteten av transfeksjons- og induksjonstrinnene. Siden forskjellige plasmider overføres til cellene, er tilstrekkelige kontroller også kritiske. Disse parametrene endres med størrelsen på plasmidene og påvirkes av den omfattende tiden i cellekulturen. Derfor er et viktig poeng som skal vurderes før analysen begynner, enkel transfeksjon av de valgte cellene. I tillegg kan den omfattende bruken av forskjellige antibiotika for å velge for de forskjellige plasmidene (gentamicin, puromycin og doxycyklin) og aktivere uttrykket være skadelig for celler og redusere effektiviteten til følgende eksperimenter. Det er viktig at denne analysen først optimaliseres med celler med kjent transfeksjonseffektivitet.

Reporteren viste vellykket at økt HuR-uttrykk kunne indusere miRNA-biogenese og bekreftet funksjonell modning. Det er viktig at overekspresjon av HuR ikke påvirket mengden intron som ble produsert siden vi ikke observerte redusert luciferaseaktivitet ved denne tilstanden (figur 4). Ytterligere eksperimenter kan utføres for å karakterisere RBP og miRNA ved hjelp av dette reportersystemet. For eksempel vil det være viktig å lage enkeltmutasjoner i miRNA-sekvenser eller i deres flankerende regioner og analysere virkningen av regulatoriske proteiner i miRNA-biogenese. Dette vil tillate spesifikk karakterisering av biogenesen til individuelle miRNA og kan også forbedre kunnskapen om konserverte sekvenser for miRNA-prosessering og modning.

Vi anser dette som et viktig metodologisk bidrag til studiet av miRNA-biogenese og modning og rollen som spleising av regulatoriske proteiner i disse prosessene. Det kan også brukes på studier om regulering og kontroll av mRNA og miRNA i forskjellige typer celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) for HeLa-Cre-cellene og pRD-RIPE og pCAGGS-Cre plasmider. Vi takker Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes og Anselmo Moriscot for deres støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Tags

Kreftforskning utgave 184
En reporteranalyse for å analysere intronisk mikroRNA-modning i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. … More

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter