Summary

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

Published: June 16, 2022
doi:

Summary

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ”א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

Abstract

מיקרו-רנ”א (miRNAs) הן מולקולות רנ”א קצרות הנפוצות באאוקריוטים. רוב ה-miRNAs מתועתקים מאינטרונים, וההבשלה שלהם מערבת חלבונים קושרי RNA שונים בגרעין. miRNAs בוגרים מתווכים לעתים קרובות השתקת גנים, וזה הפך לכלי חשוב להבנת אירועים שלאחר שעתוק. מלבד זאת, ניתן לחקור אותה כמתודולוגיה מבטיחה לטיפולים גנטיים. עם זאת, כיום חסרות שיטות ישירות להערכת ביטוי miRNA בתרביות תאים של יונקים. במאמר זה נתאר שיטה יעילה ופשוטה המסייעת בקביעת הביוגנזה וההבשלה של miRNA באמצעות אישור האינטראקציה שלה עם רצפי מטרה. כמו כן, מערכת זו מאפשרת הפרדה של הבשלת miRNA אקסוגנית מהפעילות האנדוגנית שלה באמצעות מקדם דוקסיציקלין-אינדוקטיבי המסוגל לשלוט על שעתוק miRNA ראשוני (pri-miRNA) ביעילות גבוהה ובעלות נמוכה. כלי זה מאפשר גם אפנון עם חלבונים קושרי RNA בפלסמיד נפרד. בנוסף לשימוש בו עם מגוון של miRNAs שונים ואת המטרות שלהם בהתאמה, זה יכול להיות מותאם לקווי תאים שונים, בתנאי אלה מקובלים על transfection.

Introduction

שחבור mRNA מבשר הוא תהליך חשוב לוויסות ביטוי גנים באאוקריוטים1. הסרת אינטרונים ואיחוד האקסונים ברנ”א בוגר מזורזים על ידי ה-spliceosome, קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין של 2 מגה-דלטון המורכב מ-5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 ו-U6) יחד עם יותר מ-100 חלבונים 2,3. תגובת השחבור מתרחשת באופן משותף, והשחבור מורכב בכל אינטרון חדש המונחה על ידי זיהוי אתרי שחבור משומרים בגבולות אקסון-אינטרון ובתוך האינטרון4. אינטרונים שונים עשויים להיות בעלי קצבי שחבור שונים למרות השימור המדהים של קומפלקס השחבור ומרכיביו. בנוסף להבדלים בשימור אתרי שחבור, רצפים רגולטוריים המופצים על אינטרונים ואקסונים יכולים להנחות חלבונים קושרי RNA (RBP) ולעורר או לדכא שחבור 5,6. HuR הוא RBP המבוטא בכל מקום והוא גורם חשוב לשליטה ביציבות mRNA7. תוצאות קודמות מהקבוצה שלנו הראו כי HuR יכול להיקשר לאינטרונים המכילים miRNAs, מה שמצביע על כך שחלבון זה עשוי להיות גורם חשוב המקל על עיבוד והבשלה של miRNA, מה שמוביל גם ליצירת איזופורמים חלופיים של שחבור 6,8,9.

מיקרו-רנ”א רבים (miRNAs) מקודדים מרצפים אינטרוניים. בעוד שחלקם הם חלק מהאינטרון, אחרים ידועים בשם “מיטרונים” ונוצרים על ידי כל האינטרון10,11. miRNAs הם רנ”א קצרים שאינם מקודדים, הנעים בין 18 ל-24 נוקלאוטידים באורך12. הרצף הבוגר שלהם מראה השלמה חלקית או מלאה עם רצפי מטרה ב-mRNA, ולכן משפיע על קצב התרגום ו/או הדעיכה של mRNA. השילובים של miRNAs ומטרות מניעים את התא לתוצאות שונות. מספר miRNAs יכולים להניע תאים לפנוטיפים פרו-או אנטי-גידוליים13. miRNAs אונקוגניים מתמקדים בדרך כלל ב-mRNA המעוררים מאפיין מדכא, מה שמוביל לשגשוג תאי מוגבר, נדידה ופלישה14. מצד שני, miRNAs מדכאי גידול עשויים להתמקד ב-mRNA אונקוגני או mRNA הקשורים לשגשוג מוגבר של תאים.

העיבוד וההבשלה של miRNAs תלויים גם במקורם. רוב miRNAs אינטרוניים מעובדים בהשתתפות המיקרו-מעבד, שנוצר על ידי ריבונוקלאז דרושה וקו-פקטורים של חלבון12. מיטרונים מעובדים עם פעילות של spliceosome ללא תלות Drosha15. בהתחשב בתדירות הגבוהה של miRNAs שנמצאים בתוך אינטרונים, שיערנו שחלבונים קושרי RNA המעורבים בשחבור יכולים גם להקל על העיבוד וההבשלה של miRNAs אלה. יש לציין כי ה-RBP hnRNP A2/B1 כבר נקשר למיקרו-מעבד ולביוגנזה של miRNA16.

דיווחנו בעבר כי מספר חלבונים קושרי RNA, כגון hnRNPs ו-HuR, קשורים ל-miRNAs אינטרוניים על ידי ספקטרומטריית מסה17. הקשר של HuR (ELAVL1) עם miRNAs מהצביר הפנימי miR-17-92 אושר באמצעות מיצוי חיסוני ובניתוח סיליקו 9. miR-17-92 הוא אשכול miRNA אינטרוני המורכב משישה miRNAs עם ביטוי מוגבר בסוגי סרטן שונים18,19. אשכול זה ידוע גם בשם “oncomiR-1” והוא מורכב מ- miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b ו- miR-92 a. miR-19 a ו- miR-19 b הם בין ה– miRNAsהאונקוגניים ביותר של אשכול זה 19. הביטוי המוגבר של HuR מגרה את הסינתזה miR-19a ו-miR-19b 9. מאחר שאזורים אינטרוניים המקיפים את הצביר הזה קשורים ל-HuR, פיתחנו שיטה לחקור אם חלבון זה יכול לווסת את הביטוי וההבשלה של miR-19a ו-miR-19b. אחד התחזיות החשובות של ההשערה שלנו היה שכחלבון רגולטורי, HuR יכול להקל על ביוגנזה של miRNA, מה שמוביל לשינויים פנוטיפיים. אפשרות אחת הייתה ש-miRNAs עובדו על ידי גירוי של HuR אך לא יהיו בוגרים ומתפקדים, ולכן ההשפעות של החלבון לא ישפיעו ישירות על הפנוטיפ. לכן, פיתחנו בדיקת כתב שחבור כדי לחקור אם RBP כגון HuR יכול להשפיע על ביוגנזה והבשלה של miRNA אינטרוני. על ידי אישור עיבוד והבשלה של miRNA, הבדיקה שלנו מראה את האינטראקציה עם רצף המטרה ואת יצירת miRNA בוגר ומתפקד. בבדיקה שלנו, אנו משלבים את הביטוי של צביר miRNA אינטרוני עם פלסמיד לוציפראז כדי לבדוק אם יש קשירת מטרה של miRNA בתאים בתרבית.

Protocol

סקירה כללית של הפרוטוקול המתואר כאן מתוארת באיור 1. 1. בנייה פלסמידית pCAGGS-Cre: פלסמיד זה סופק על ידי ד”ר א. מקייב21. pRD-miR-17-92:הגבר pre-miR-17-92 על ידי PCR באמצעות 0.5 μM של כל פריימר ספציפי (טבלת חומרים), 150 ננוגרם של cDNA, 1 mM dNTP…

Representative Results

ההשערה הראשונית שלנו הייתה ש-HuR יכול להקל על ביוגנזה פנימית של miRNA על ידי קשירה לרצף הקדם-miRNA שלו. לפיכך, הקשר של ביטוי HuR וביוגנזה של אשכול miR-17-92 יכול להצביע על מנגנון חדש המסדיר את ההבשלה של miRNAs אלה. ביטוי יתר של HuR לאחר העברה של pFLAG-HuR אושר בשלושה קווי תאים שונים: HeLa, BCPAP ו-HEK-293T (?…

Discussion

שחבור קדם-mRNA הוא תהליך חשוב לוויסות ביטוי גנים, והבקרה שלו יכולה לגרום להשפעות חזקות על שינויים פנוטיפיים של תאים22,23. יותר מ-70% מה-miRNAs מתועתקים מאינטרונים בבני אדם, והשערנו שניתן להקל על העיבוד וההבשלה שלהם על ידי שחבור חלבונים רגולטוריים24,25</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים ל- E. Makeyev (האוניברסיטה הטכנולוגית של נאניאנג, סינגפור) על תאי HeLa-Cre ופלסמידים pRD-RIPE ו- pCAGGS-Cre. אנו מודים לעדנה קימורה, קרולינה פרסל גוסס, גיזלה ראמוס, לוסיה רוזטי לופס ואנסלמו מוריסקוט על תמיכתם.

Materials

Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

References

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs – MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Play Video

Cite This Article
Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

View Video