Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Репортерский анализ для анализа созревания интронной микроРНК в клетках млекопитающих

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63498
Automatic Translation
1, 1
1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

Summary

Мы разработали интронный анализ биогенеза микроРНК, который будет использоваться в клетках in vitro с четырьмя плазмидами: одна с интронной миРНК, одна с мишенью, одна для сверхэкспрессии регуляторного белка и одна для люциферазы Renilla. МиРНК была обработана и могла контролировать экспрессию люциферазы путем связывания с целевой последовательностью.

Abstract

МикроРНК (миРНК) представляют собой короткие молекулы РНК, которые широко распространены у эукариот. Большинство миРНК транскрибируются из интронов, и их созревание включает в себя различные РНК-связывающие белки в ядре. Зрелые микроРНК часто опосредуют глушение генов, и это стало важным инструментом для понимания посттранскрипционных событий. Кроме того, его можно исследовать как перспективную методологию генной терапии. Однако в настоящее время отсутствуют прямые методы оценки экспрессии миРНК в культурах клеток млекопитающих. Здесь мы описываем эффективный и простой метод, который помогает в определении биогенеза и созревания миРНК путем подтверждения ее взаимодействия с целевыми последовательностями. Кроме того, эта система позволяет отделить созревание экзогенной миРНК от ее эндогенной активности с помощью доксициклин-индуцируемого промотора, способного контролировать транскрипцию первичной миРНК (примиРНК) с высокой эффективностью и низкой стоимостью. Этот инструмент также позволяет модулировать РНК-связывающими белками в отдельной плазмиде. В дополнение к его использованию с различными миРНК и их соответствующими мишенями, он может быть адаптирован к различным клеточным линиям, при условии, что они поддаются трансфекции.

Introduction

Сплайсинг мРНК-предшественников является важным процессом регуляции экспрессии генов у эукариот1. Удаление интронов и объединение экзонов в зрелой РНК катализируется сплайсеосомой, 2-мегадальтонным рибонуклеопротеиновым комплексом, состоящим из 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 и U6) вместе с более чем 100 белками 2,3. Реакция сплайсинга происходит совместно транскрипционно, и сплайсеосома собирается на каждом новом интроне, руководствуясь распознаванием законсервированных участков сращивания на границах экзон-интрона и внутри интрона4. Различные интроны могут иметь разную скорость сплайсинга, несмотря на замечательное сохранение комплекса сплайсеосом и его компонентов. В дополнение к различиям в сохранении места сращивания, регуляторные последовательности, распределенные на интронах и экзонах, могут направлять РНК-связывающие белки (RBP) и стимулировать или подавлять сплайсинг 5,6. HuR является повсеместно экспрессируемым RBP и является важным фактором для контроля стабильности мРНК7. Предыдущие результаты нашей группы показали, что HuR может связываться с интронами, содержащими миРНК, что указывает на то, что этот белок может быть важным фактором для облегчения обработки и созревания миРНК, что также приводит к генерации альтернативных изоформ сплайсинга 6,8,9.

Многие микроРНК (миРНК) кодируются из интронных последовательностей. В то время как некоторые из них являются частью интрона, другие известны как «миртроны» и образованы целым интроном10,11. миРНК представляют собой короткие некодирующие РНК, в диапазоне от 18 до 24 нуклеотидов длиной12. Их зрелая последовательность демонстрирует частичную или полную комплементарность с целевыми последовательностями в мРНК, что влияет на скорость трансляции и/или распада мРНК. Комбинации миРНК и мишеней приводят клетку к различным результатам. Несколько микроРНК могут приводить клетки к про- или противоопухолевым фенотипам13. Онкогенные миРНК обычно нацелены на мРНК, которые вызывают супрессивную характеристику, что приводит к увеличению клеточной пролиферации, миграции и инвазии14. С другой стороны, опухолеподавляющие миРНК могут быть нацелены на онкогенные мРНК или мРНК, связанные с повышенной пролиферацией клеток.

Обработка и созревание миРНК также зависят от их происхождения. Большинство интронных миРНК обрабатываются с участием микропроцессора, образованного рибонуклеазой дрошей и белковыми кофакторами12. Миртроны обрабатываются активностью сплайсеосомы независимо от Drosha15. Учитывая высокую частоту миРНК, обнаруженных в интронах, мы предположили, что РНК-связывающие белки, участвующие в сплайсинге, также могут способствовать обработке и созреванию этих миРНК. Примечательно, что RBP hnRNP A2/B1 уже ассоциируется с микропроцессором и биогенезом миРНК16.

Ранее мы сообщали, что несколько РНК-связывающих белков, таких как hnRNP и HuR, связаны с интронными миРНК с помощью масс-спектрометрии17. Связь HuR (ELAVL1) с миРНК из интронного кластера miR-17-92 была подтверждена с использованием иммунопреципитации и анализа in silico 9. miR-17-92 представляет собой интронный кластер миРНК, состоящий из шести миРНК с повышенной экспрессией при различных видах рака18,19. Этот кластер также известен как «oncomiR-1» и состоит из miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b и miR-92a. miR-19a и miR-19b являются одними из самых онкогенных миРНК этого кластера19. Повышенная экспрессия HuR стимулирует синтез miR-19a и miR-19b 9. Поскольку интронные области, фланкирующие этот кластер, связаны с HuR, мы разработали метод исследования того, может ли этот белок регулировать экспрессию и созревание miR-19a и miR-19b. Одним из важных предсказаний нашей гипотезы было то, что в качестве регуляторного белка HuR может способствовать биогенезу миРНК, что приводит к фенотипическим изменениям. Одна из возможностей заключалась в том, что миРНК были обработаны стимуляцией HuR, но не были зрелыми и функциональными, и, следовательно, эффекты белка не влияли непосредственно на фенотип. Поэтому мы разработали сращивающий репортерный анализ, чтобы выяснить, может ли RBP, такой как HuR, влиять на биогенез и созревание интронной миРНК. Подтверждая обработку и созревание миРНК, наш анализ показывает взаимодействие с целевой последовательностью и генерацию зрелой и функциональной миРНК. В нашем анализе мы соединяем экспрессию интронного кластера миРНК с плазмидой люциферазы, чтобы проверить связывание миРНК-мишеней в культивируемых клетках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Обзор протокола, описанного здесь, показан на рисунке 1.

1. Плазмидная конструкция

  1. pCAGGS-Cre: Эта плазмида была предоставлена доктором Е. Макеевым21.
  2. пРД-миР-17-92:
    1. Амплифицируют премиР-17-92 с помощью ПЦР с использованием 0,5 мкМ каждого конкретного праймера (Таблица материалов), 150 нг кДНК, 1 мМ дНТП, 1x Taq ПЦР-буфера и 5 ЕД высокоточной Taq ДНК-полимеразы. Выполните реакцию ПЦР без шаблона (используйте воду вместо кДНК) для проверки загрязнения ДНК.
    2. Разложите продукт ПЦР в pRD-RIPE (любезно предоставленный доктором Е. Макеевым, Наньянский технологический университет, Сингапур)21 внутри интрона между участками ограничения EcoRI и EcoRV с использованием ДНК-лигазы, создавая pRD-miR-17-92. Подтверждение целостности последовательности с помощью секвенирования Сэнгера.
  3. пмиРГЛО-РАП-ИБ
    1. Проектируйте передние и обратные грунтовки, окруженные сайтами ограничения XhoI / XbaI и с одним сайтом ограничения NotI внутри. Смешайте эквимолярные количества прямой и обратной грунтовок и инкубируйте смесь при 90 °C в течение 5 мин, затем переведите до 37 °C в течение 15 мин. В качестве элементов управления используйте праймеры с зашифрованными целевыми последовательностями (Таблица материалов).
    2. Расщепляйте отожженные фрагменты с помощью ферментов рестрикции XhoI/XbaI и лигируйте их после последовательности luc2 на pmiR-GLO, генерируя репортерные конструкции pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) и pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). Подтвердите перевязку с расщеплением NotI.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что свесы, созданные после отжига грунтовки, дополняют вектор после реакции расщепления.
  4. пФЛАГ-Хур
    1. Чтобы создать сверхэкспрессирующую плазмиду HuR, усилите последовательность HuR специфическими праймерами. Смешайте 300 нг кДНК, 0,5 мкМ каждого конкретного праймера, смесь 1 мМ дНТП, 1 буфер ПЦР и 5 ЕД высокоточной ДНК-полимеразы Taq.
    2. Влифицируйте продукт ПЦР в pGEM-T и подтвердите целостность последовательности ДНК методом секвенирования Сэнгера. Удалите фрагмент HuR из pGEM-T и подключите его в вектор экспрессии млекопитающих pFLAG-CMV-3 для генерации вектора pFLAG-HuR.

2. Клеточная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия HeLa-Cre была подарком от доктора Э. Макеева21 года, а папиллярная клетка рака щитовидной железы (BCPAP) была любезно предоставлена доктором Массимо Санторо (Университет «Федерико II», Неаполь, Италия). Клетка HeLa, папиллярная клетка рака щитовидной железы (BCPAP) и HEK-293T использовались для сверхэкспрессии HuR.

  1. Поддерживайте клетки в DMEM / высоком уровне глюкозы, дополненных 10% фетальной бычьей сывороткой, 1 мМ пирувата натрия, 200 мМ L-глутамина и 1x пенициллин-стрептомицин (100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина) в чашках Петри по 100 мм, если не указано иное. Инкубировать клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с контролируемой атмосферой (5% CO2).
  2. Инкубировать адгезивные клетки трипсином/ЭДТА (0,5% смесь растворов) при 37 °C в течение 3-5 мин. Пусть они отделяются от пластины (инкубационный период может варьироваться в зависимости от типа клетки).
  3. Выполняйте трансфекции с помощью трансфекционного реагента на основе липидов в соответствии с инструкциями производителя. Убедитесь, что клеточные культуры примерно на 70% сливаются. Используйте аналогичные количества ДНК для всех комбинаций трансфекции, как описано ниже, путем добавления соответствующих ДНК. Проводите эксперименты по трансфекции в репликах.
    1. Смешайте 200 нг ДНК и 1,25 мкл трансфекционного реагента в 100 мкл питательной среды. Добавьте трансфекционную смесь в ячейки. Инкубировать клетки с трансфекционными смесями в течение 4 ч при 37 °C. Затем замените среду средой, содержащей 10% FBS, и инкубируйте еще 24 ч, прежде чем добавлять антибиотики для селекции.

3. Гиперэкспрессия HuR

  1. Трансфект pFLAG-HuR и пустой pFLAG в HeLa. Отбор клеток путем увеличения концентрации генетикина (G418) (1 мкг/мл) со 100 мкг/мл до 1000 мкг/мл, генерируя стабильные клеточные линии.
  2. Подтвердите гиперэкспрессию количественной ПЦР с помощью специфических праймеров для HuR мРНК, как описано в шаге 7.

4. Тотальная изоляция РНК

  1. Используйте свежесобранные клетки. Трипсинизировать 70% сливающихся клеточных культур (для этого анализа использовались клетки HeLa-Cre), как описано на этапе 2.2.
  2. Собрать ячейку гранулы центрифугированием в течение 5 мин при 500 х г при 4 °C и промыть ее 1x PBS (фосфатно-буферным физиологическим раствором); повторить центрифугирование.
  3. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 1 мл 1x PBS и перенесите ее в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  4. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г при 4 °C.
  5. Взвесьте гранулу сухой ячейки и соответствующим образом отрегулируйте объем и размер трубок. 1 мг клеток дает приблизительно 1 мкг общей РНК.
  6. В вытяжке добавляют 500-1000 мкл фенола/хлороформа в гранулу ячейки (в идеале 750 мкл на 0,25 г клеток) и гомогенизируют ее путем пипетирования вверх и вниз и смешивания с вихрем.
  7. Инкубировать смесь в течение 5 мин при комнатной температуре (от 20 °C до 25 °C) до полной диссоциации нуклеопротеиновых комплексов.
  8. Центрифугирование образца при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  9. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и добавьте 200 мкл хлороформа на 1 мл используемого фенола:хлороформа. Надежно закройте пробирки для образцов.
  10. Энергично перемешивать в течение 15 с (вручную или кратковременно вихря с меньшей скоростью) и инкубировать при комнатной температуре (от 20 °C до 25 °C) в течение 2 мин до 3 мин.
  11. Центрифугируйте образцы при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  12. Проверьте наличие нижней красной фенол-хлороформной фазы, промежуточной фазы и бесцветной верхней водной фазы. РНК остается в верхней водной фазе. В вытяжке соберите водную фазу, избегая контакта с промежуточной фазой, и переведите в свежую трубку.
  13. Осадите РНК путем смешивания водной фазы с 400 мкл изопропанола молекулярного класса (соотношение 1:1 к используемому фенолу/хлороформу) и 2 мкл гликогена в каждой пробирке (это поможет визуализировать присутствие гранулы).
  14. Энергично перемешайте вручную или гомогенизируйте наконечником в течение ~10 с. Инкубировать в течение 15 мин или на ночь при температуре −20 °C.
  15. Центрифугируйте образец при 12 000 х г в течение 20 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
  16. Промыть гранулу РНК, добавив 3 объема 100% этанола (примерно 1 мл, разбавленного водой DEPC) и перемешать образец путем вихря до тех пор, пока гранула не высвободится и не всплывет со дна.
  17. Центрифуга при 7 500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  18. Промыть гранулу РНК 1x, добавив 1 мл 75% этанола и перемешать образец путем вихря до тех пор, пока гранула не высвободится и не всплывет со дна. Повторите центрифугирование, как описано на этапе 4.17.
  19. Выполните дополнительное вращение центрифугирования на 5 с, чтобы собрать остаточную жидкость со стороны трубки и удалить любую остаточную жидкость пипеткой, не нарушая гранулу.
  20. Кратковременно высушите гранулу РНК на воздухе, открыв крышку трубки при комнатной температуре в течение 3-5 мин, и растворите гранулу РНК в 20-50 мкл воды, очищенной DEPC без РНКазы. Инкубируют РНК в течение 10 мин при 55-60 °C для облегчения повторного суспендирования гранулы.

5. Определение общей концентрации и качества РНК

  1. Определяют концентрацию РНК путем измерения абсорбции при 260 нм и 280 нм с помощью спектрофотометра. Получение полноспектральных данных перед использованием образцов в последующих приложениях.
  2. Контролируйте качество РНК путем разрешения 800-1000 нг на 1,5% агарозном геле с использованием буфера 0,5X TBE (45 мМ основания Tris, борной кислоты 45 мМ, 1 мМ ЭДТА). Общая РНК разделяется на две полосы, относящиеся к рРНК 28S и 18S.
    1. Сделайте все реагенты и промойте все оборудование, используемое для работы геля, водой, обработанной DEPC. Воду, обработанную DEPC, готовят в вытяжке путем добавления 1 мл диэтилпирокарбоната к 1000 мл сверхчистой воды. Инкубировать в течение ~2 ч при комнатной температуре или при 37 °C и автоклаве. Хранить при комнатной температуре до 10 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электрофорез общих РНК млекопитающих приводит к разделению рРНК 28S и 18S в соотношении приблизительно 2:1. Полосы должны быть неповрежденными и видимыми как две острые полосы. Деградированная РНК приведет к размытым полосам.

6. Обратная транскрипция

  1. Установите реакцию обратной транскрипции, используя 1 мкг общей РНК.
  2. Выполняют обратную транскрипцию (RT) с использованием фермента обратной транскриптазы (см. Таблицу материалов) и 50 нг/мкл случайных десятимерных праймеров.
    1. Смешайте РНК, случайные праймеры и смесь 1 мМ dNTP (10 мМ) в 10 мкл. Инкубировать при 65 °C в течение 5 мин и на льду в течение 1 мин. Добавьте следующие реагенты: 1x RT буфер, 5 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 40 ЕД ингибитора РНКазы и 200 ЕД обратной транскриптазы.
    2. Инкубировать в течение 10 мин при 25 °C и в течение 1 ч при 50 °C (температура может изменяться, если используются различные ферменты). Прекратить реакцию путем инкубации при 85 °C в течение 5 мин. cDNAs можно хранить при −20 °C.

7. Количественная ПЦР

  1. Чтобы собрать реакцию в конечном объеме 15 мкл, смешайте 3 мкл кДНК (100 нг/мкл), 3,2 пмоль каждого праймера, 6 мкл главной смеси, содержащей дНТП и фермент, и 2,8 мкл сверхчистой воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте праймеры для эндогенных конститутивных генов в качестве контроля (гены ведения хозяйства) для нормализации уровней экспрессии мРНК HuR и миРНК. β-Актин и snRNA U6 (RNU6B) являются доступными вариантами нормализации мРНК и миРНК соответственно, но другие гены также могут быть подходящими в зависимости от случая.
  2. Количественно оценить уровни экспрессии с помощью метода20 дельта-дельта Ct (2-ΔΔCt).

8. Репортерский анализ

  1. Клетки, используемые для анализа
    1. Трансфектируйте плазмиды в клетках HeLa-Cre следующим образом. Трансфектируют pTK-Renilla (40 нг), затем pRD-miR-17-92, генерируя HeLa-Cre-miR-17-92, и выбирают с 1 мкг/мл пуромицина.
    2. Трансфектировать HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla с pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR или pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, отдельно. Выбирают с помощью пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Эти трансфекции генерируют Luc-RAP-1-B и Luc-scrambled.
    3. Трансфектируйте ячейки с помощью pFLAG-HuR или пустого pFLAG (шаг 3).
    4. Перейдите к клеточной культуре, как описано в шаге 2.2., с HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR и HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc примерно до 80% слияния. Индуцировать с 1 мкл доксициклина (1 мкг/мл) в течение 30 мин при 37 °C. Кроме того, держите все клетки без доксициклина в качестве контрольной части в течение того же периода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация доксициклина зависит от клеточной линии выбора. Избыток доксициклина может быть токсичным для клеток млекопитающих.
  2. Люминесцентный анализ
    1. Для количественной оценки и сравнения различных интенсивностей люминесценции используйте набор для репортерного анализа Dual-luciferase. Разморозьте растворы люциферазы и оставьте их при комнатной температуре перед началом анализа.
    2. Приготовьте смесь Stop и Glo (трубки с синей крышкой), перемешав 200 мкл субстрата в 10 мл буфера анализа люциферазы II. Приготовьте смесь LAR II (зеленые колпачковые трубки), перемешав 10 мл люциферазного буфера анализа II в янтарный флакон люциферазного пробирного субстрата II и хорошо встряхните.
    3. Перенесите растворы в 15 мл центрифужных трубок, ранее идентифицированных и защищенных от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы растворы могут быть предварительно приготовлены в 1-2 мл аликвот и заморожены при −80 °C, защищенные от света в алюминиевой фольге.
    4. Выполняйте показания люминесценции с помощью такого оборудования, как Synergy; измерение экспрессированной люциферазы в виде относительных световых единиц (RLU).
    5. Экспортируйте результаты в электронную таблицу для дальнейшего статистического анализа.
    6. Выполните нормализацию активности светлячка-люциферазы с помощью контрольной Рениллы (люциферазы/Ренилла) и постройте ее в виде относительных световых единиц (RLU) на графике. Повторите это для групп с индукцией доксициклина и без нее.
    7. Рассчитайте среднее и стандартную погрешность среднего значения (SEM). Выполните t-тест Student или двусторонний ANOVA, а затем пост-тест Tukey, чтобы обеспечить групповое сравнение. Эти анализы доступны в таком пакете, как GraphPad Prism. Различия при p-значениях < 0,05 считаются значительными.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Наша первоначальная гипотеза заключалась в том, что HuR может способствовать интронному биогенезу миРНК путем связывания с ее премирнкальной последовательностью. Таким образом, связь экспрессии HuR и кластерного биогенеза miR-17-92 может указывать на новый механизм, управляющий созреванием этих миРНК. Сверхэкспрессия HuR при трансфекции pFLAG-HuR была подтверждена в трех различных клеточных линиях: HeLa, BCPAP и HEK-293T (рисунок 2). В качестве контроля использовались нетрансфектированные клетки и клетки, трансфектированные пустыми векторами pFLAG. Важно отметить, что мы заметили, что сверхэкспрессия HuR в этих клетках стимулирует экспрессию miR-19a (дополнительные результаты таблицы 1 , представленные в Gatti da Silva et al.9).

Чтобы подтвердить, что индуцированные микроРНК действительно функциональны, была разработана репортерная система in vitro , как описано здесь. Искусственный интрон в pRD-RIPE разделяет две кодирующие области eGFP. Эта кассета находится под управлением тетрациклинового чувствительного элемента (TRE). Экспрессия eGFP, таким образом, контролируется присутствием антибиотика доксициклина (DOX) в клеточной среде (Рисунок 3).

Поиск in silico с использованием miRbase и TargetScan выявил возможные мишени мРНК для miR-19a и miR-19b (компоненты кластера miR-17-92). В качестве потенциальной мишени для обеих микроРНК была выбрана последовательность 5' TTTGCACA 3', обнаруженная в области RAP-IB 3' UTR (Дополнительная таблица 2). RAP-IB является членом GTPase семейства Ras-ассоциированных белков (RAS). Индуцированные миРНК были правильно обработаны и функциональны в нашем анализе, поскольку они гибридизировались с целевой последовательностью, клонированной рядом с люциферазой (см. Рисунок 3, мишень pmiR-GLO). Поэтому он блокировал трансляцию люциферазы, что отражалось в снижении активности люциферазы (рисунок 3). В качестве контроля для этого анализа мы скремблировали целевую последовательность, заменив ее на 5' GGGTAAA 3' в плазмиде Люка (целевая и скремблированная последовательности подчеркнуты в последовательностях олиго в Таблице материалов).

В регулярных условиях и без индукции плазмиды pRD-miR-17-92 эндогенные miR-19a и/или miR-19b находили мишень на pmiR-GLO, что приводило к снижению активности люциферазы (данные не показаны). После приема добавок DOX наблюдалось незначительное и не статистически значимое снижение активности люциферазы в клетках с скремблированной целевой последовательностью. Это может быть связано с наличием целевых последовательностей для других микроРНК в этой последовательности. Сильное снижение активности люциферазы наблюдалось при RAT-IB 3'UTR при увеличении экспрессии miR-19a и miR-19b из pRD-miR-17-92 по сравнению с клетками HeLa-Cre (см. Рисунок 4, сравните оранжевые и черные полосы). Трансфекция pFLAG-HuR в этих клетках сама по себе не изменяла активность люциферазы (см. Рисунок 4, сравните серые и черные полосы). Однако сверхэкспрессия HuR в сочетании с добавками доксициклина, стимулирующая экспрессию кластера miR-17-92, еще больше снижала активность люциферазы (см. Рисунок 4, сравните серые и красные полосы). Это указывает на положительную регуляцию HuR над miR-19a и miR-19b в сочетании с правильной обработкой и созреванием этих miRNAs, которые смогли успешно найти свои цели (HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc) (см. Рисунок 4).

Использование этой репортерной системы подтвердило, что HuR индуцирует экспрессию и надлежащее созревание miR-19a и miR-19b в клетках HeLa.

Figure 1
Рисунок 1: Концептуальный обзор протокола, описанного здесь. Плазмиды, содержащие миРНК, целевую последовательность, регуляторный белок и pTK-Renilla, были трансфектированы в культивируемых клетках. После выбора антибиотика эти клетки использовали для индуцирования экспрессии миРНК (с доксициклином), с последующей количественной оценкой активности люциферазы и для анализа РНК для подтверждения гиперэкспрессии HuR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Подтверждение сверхэкспрессии FLAG-HuR в клетках (A) HeLa, (B) BCPAP и (C) HEK293T с помощью qPCR. В качестве элемента управления использовалась трансфекция с пустым pFLAG (белые полосы). β-актин использовался для нормализации значений Ct. Ось Y представляет собой изменение выражений, вычисляемое после нормализации. Полосы погрешностей представляют собой стандартные погрешности, рассчитанные на основе трех независимых измерений. **P <0,005, ****P < 0,0005 (рисунок взят из Gatti da Silva et al.9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Интронная система репортеров miRNA. (A) Схематическое представление плазмиды pRD-RIPE, которая генерировала pRD-miR-17-92. пре-миР-17-92 вводился внутрь интрона и находился под контролем докс-индуцируемого промотора; справа плазмида pmiR-GLO с целевой последовательностью RAP-IB 3'UTR (pmiRGLO-RAP-IB); элемент управления имел зашифрованную последовательность целей (pmiRGLO-scrambled). (B) Подробная информация о последовательности pmiRGLO-RAP-IB с уделением особого внимания целевой последовательности, дополняющей miR-19a и miR-19b. Активность Люциферазы снижается при взаимодействии миРНК и мишени (рисунок адаптирован из Gatti da Silva et al.9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Клетки HeLa-Cre были котрансфектированы репортерными плазмидами pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-scrambled, pRD-miR-17-92 и pFLAG-HuR. Активность люциферазы на нетрансфицированных клетках HeLa-Cre (черный), HeLa-Cre miR-17-92-scrambled (белый), HeLa-Cre-HuR (серый), HeLa-Cre miR-17-92-luc (оранжевый) и HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (красный). Активность люциферазы количественно определяли, как описано в протоколе, как относительную активность люциферазы светлячка к люциферазе Renilla (наблюдаемую с pTK-Renilla) и нормализовали после добавления доксициклина. Он показан как «относительные световые единицы» (RLU) на оси Y. **P < 0,005; P < 0,0005 (рисунок взят из Gatti da Silva et al.9). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Необработанные значения Ct, наблюдаемые для qPCR для анализа экспрессии miR-19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Последовательность RAP-IB 3'UTR и целевая последовательность miR-19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сплайсинг пре-мРНК является важным процессом для регуляции экспрессии генов, и его контроль может вызвать сильное воздействие на фенотипические модификации клеток22,23. Более 70% микроРНК транскрибируются из интронов у людей, и мы предположили, что их обработка и созревание могут быть облегчены путем сплайсинга регуляторных белков24,25. Мы разработали метод анализа интронной обработки и функционирования микроРНК в культивируемых клетках. Наш анализ использует четыре различные плазмиды и позволяет нам проверить созревание эндогенных и экзогенных или индуцированных миРНК. Описанный здесь метод может быть выполнен за 2-3 дня и не требует дорогостоящих реагентов.

Учитывая, что HuR является РНК-связывающим белком, важным для стабильности мРНК, и осаждается иммунитетом miR-18 и miR-19a miRNAs17, этот анализ проверил, может ли он стимулировать интронный биогенез и созревание миРНК. HuR не обнаруживается в ядре сплайсеосом, но взаимодействует с белками, участвующими в стабилизации мРНК26. Последовательно, сверхэкспрессия HuR была связана с развитием рака яичников и мочевого пузыря27,28. В папиллярных клетках рака щитовидной железы мы наблюдали, что HuR увеличивает пролиферацию клеток, миграцию и инвазию9. HuR также влияет на стабильность мРНК регуляторов клеточного цикла, таких как PTEN, циклин A2 и циклин D2, увеличивая пролиферацию и миграцию клеток и приводя к опухолевым характеристикам29,30. Однако значительная часть этих мРНК также имеет целевые последовательности для miR-19a и miR-19b. Примечательно, что HuR может связываться с интронной областью, где эти миРНК транскрибируются, что приводит к представлению о том, что он может контролировать сплайсинг и созревание этих миРНК и, следовательно, усиливать опухолевые признаки.

Чтобы проверить это, этот анализ был разработан с четырьмя различными плазмидами. Первый содержит кластер miRNA miR-17-92 , вставленный внутрь интрона, и его экспрессия контролируется при добавлении доксициклина. Вторая плазмида представляет собой коммерческий pmiR-GLO, несущий целевую последовательность рядом с 3' гена luc2. Связывание миРНК с этой целевой последовательностью влияет на экспрессию luc2, которая может быть измерена при анализе люминесценции. Третьей плазмидой является pFLAG-HuR, которая индуцирует сверхэкспрессию этого регуляторного белка. Наконец, pTK-Renilla также используется для включения флуоресценции люциферазы Renilla. Наши результаты показали, что HuR стимулирует экспрессию miR-17-92 и увеличивает ассоциацию его компонентов с целевыми последовательностями, что приводит к образованию зрелых и функциональных молекул миРНК. Мы описываем ассоциацию HuR с miRNA в другой статье9. Целевые последовательности, использованные в этом исследовании, были специфичны для miR-19a и miR-19b миРНК. Однако этот метод также может быть адаптирован для использования более коротких или более длинных целевых последовательностей, включая несколько целевых сайтов. В этом случае при анализе необходимо учитывать неспецифическое связывание эндогенных миРНК с целевой последовательностью или последовательностями поблизости. Используемые последовательности могут иметь другие возможные целевые участки, которые могут влиять на активность люциферазы. Метод, описанный здесь, также может быть использован для проверки различных мишеней мишеней миРНК или группы микроРНК, транскрибированных вместе, что позволяет проводить функциональные исследования миРНК и их специфических фенотипических изменений. Следует также отметить, что это позволяет сравнивать результаты между различными клеточными линиями и генетическими фонами.

Наиболее важными шагами для более широкого использования этого протокола в клетках млекопитающих являются эффективность этапов трансфекции и индукции. Поскольку различные плазмиды трансфектируются в клетки, адекватный контроль также имеет решающее значение. Эти параметры изменяются с размером плазмид и зависят от длительного времени в клеточной культуре. Поэтому важным моментом, который следует учитывать перед началом анализа, является легкость трансфекции выбранных клеток. Кроме того, широкое использование различных антибиотиков для выбора различных плазмид (гентамицин, пуромицин и доксициклин) и активации экспрессии может быть вредным для клеток и снижать эффективность следующих экспериментов. Важно, чтобы этот анализ сначала был оптимизирован с ячейками с известной эффективностью трансфекции.

Репортер успешно показал, что повышенная экспрессия HuR может индуцировать биогенез миРНК и подтвердил ее функциональное созревание. Важно отметить, что сверхэкспрессия HuR не влияла на количество произведенного интрона, поскольку мы не наблюдали снижения активности люциферазы в этом состоянии (рисунок 4). Дальнейшие эксперименты могут быть выполнены для характеристики RBP и miRNAs с использованием этой репортерной системы. Например, было бы важно создать единичные мутации в последовательностях миРНК или в их фланговых областях и проанализировать влияние регуляторных белков на биогенез миРНК. Это позволило бы конкретно охарактеризовать биогенез отдельных микроРНК, а также могло бы улучшить знания о сохраненных последовательностях для обработки и созревания миРНК.

Мы считаем, что это важный методологический вклад в изучение биогенеза и созревания миРНК и роли сплайсинга регуляторных белков в этих процессах. Он также может быть применен к исследованиям по регуляции и контролю мРНК и миРНК в различных типах клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарны Е. Макееву (Наньянский технологический университет, Сингапур) за клетки HeLa-Cre и плазмиды pRD-RIPE и pCAGGS-Cre. Мы благодарим Эдну Кимуру, Каролину Перселл Гоус, Гизелу Рамос, Люсию Россетти Лопес и Ансельмо Морискота за их поддержку.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Tags

Исследование рака выпуск 184
Репортерский анализ для анализа созревания интронной микроРНК в клетках млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. … More

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter