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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63498
Automatic Translation
1, 1
1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

Summary

Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA curtas que são difundidas em eucariotes. A maioria dos miRNAs são transcritas de introns, e sua maturação envolve diferentes proteínas de ligação de RNA no núcleo. MiRNAs maduras frequentemente mediam o silenciamento genético, e isso se tornou uma ferramenta importante para compreender eventos pós-transcrição. Além disso, pode ser explorado como uma metodologia promissora para terapias genéticas. No entanto, atualmente há uma falta de métodos diretos para avaliar a expressão miRNA em culturas de células mamíferas. Aqui, descrevemos um método eficiente e simples que auxilia na determinação da biogênese e maturação do miRNA através da confirmação de sua interação com sequências de destino. Além disso, este sistema permite a separação da maturação exógena do miRNA de sua atividade endógena usando um promotor indutível de doxiciclina capaz de controlar a transcrição miRNA primária (pri-miRNA) com alta eficiência e baixo custo. Esta ferramenta também permite a modulação com proteínas de ligação de RNA em um plasmídeo separado. Além de seu uso com uma variedade de diferentes miRNAs e seus respectivos alvos, ele pode ser adaptado a diferentes linhas celulares, desde que sejam favoráveis à transfecção.

Introduction

O splicing precursor de mRNA é um processo importante para a regulação da expressão genética em eucariotes1. A remoção de introns e a união de exons em RNA maduro é catalisada pelo emendatoroso, um complexo de 2 megadalton ribonucleoproteína composto por 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 e U6) juntamente com mais de 100 proteínas 2,3. A reação de emenda ocorre co-transcrição, e o emendamento é montado a cada novo intron guiado pelo reconhecimento de locais de emenda conservados nos limites exon-intron e dentro do intron4. Diferentes introns podem ter diferentes taxas de emenda, apesar da notável conservação do complexo de emendas e seus componentes. Além das diferenças na conservação do local de emenda, as sequências regulatórias distribuídas em introns e exons podem guiar proteínas de ligação de RNA (RBP) e estimular ou reprimiro splicing 5,6. HuR é um RBP onipresentemente expresso e é um fator importante para controlar a estabilidade do mRNA7. Resultados anteriores do nosso grupo mostraram que o HuR pode se ligar a introns contendo miRNAs, indicando que essa proteína pode ser um fator importante para facilitar o processamento e a maturação do miRNA, levando também à geração de isóformes alternativos de emenda 6,8,9.

Muitas microRNAs (miRNAs) são codificadas a partir de sequências intrônicas. Enquanto alguns fazem parte do intron, outros são conhecidos como "mirtrons" e são formados por todo o intron10,11. miRNAs são RNAs curtas sem codificação, variando de 18 a 24 nucleotídeos no comprimento12. Sua sequência madura mostra complementaridade parcial ou total com sequências de destino em mRNAs, afetando, portanto, taxas de decadência de tradução e/ou mRNA. As combinações de miRNAs e alvos levam a célula a diferentes resultados. Vários miRNAs podem conduzir células para fenótipos pró ou anti-tumorais13. MiRNAs oncogênicas geralmente têm como alvo mRNAs que desencadeiam uma característica supressiva, levando ao aumento da proliferação celular, migração e invasão14. Por outro lado, miRNAs supressivas de tumores podem atingir mRNAs oncogênicas ou mRNAs relacionados ao aumento da proliferação celular.

O processamento e o amadurecimento das miRNAs também dependem de sua origem. A maioria dos miRNAs intrônicos são processados com a participação do microprocessador, formado pela ribonuclease Drosha e cofatores proteicos12. Mirtrons são processados com a atividade do emendarosome independentemente de Drosha15. Considerando a alta frequência de miRNAs encontradas dentro dos introns, imaginamos que as proteínas de ligação de RNA envolvidas com o splicing também poderiam facilitar o processamento e a maturação desses miRNAs. Notavelmente, o RBP hnRNP A2/B1 já foi associado com o microprocessador e a biogênese miRNA16.

Já relatamos anteriormente que várias proteínas de ligação de RNA, como hnRNPs e HuR, estão associadas a miRNAs intrônicas por espectrometria de massa17. A associação de HuR (ELAVL1) com miRNAs do cluster tronic miR-17-92 foi confirmada por meio de imunoprecipitação e na análise de silico 9. miR-17-92 é um cluster miRNA intrônico composto por seis miRNAs com expressão aumentada em diferentes cânceres18,19. Este cluster também é conhecido como "oncomiR-1" e é composto por miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b, e miR-92a. miR-19a e miR-19b estão entre os miRNAs mais oncogênicos deste cluster19. O aumento da expressão do HuR estimula a síntese miR-19a e miR-19b 9. Uma vez que as regiões intrônicas que flanqueiam este aglomerado estão associadas ao HuR, desenvolvemos um método para investigar se essa proteína poderia regular a expressão e a maturação de miR-19b. Uma previsão importante de nossa hipótese foi que, como proteína regulatória, o HuR poderia facilitar a biogênese do miRNA, levando a alterações fenotípicas. Uma possibilidade era que os miRNAs fossem processados pela estimulação do HuR, mas não seriam maduros e funcionais e, portanto, os efeitos da proteína não impactariam diretamente o fenótipo. Por isso, desenvolvemos um ensaio de repórter emenda para investigar se um RBP como o HuR poderia afetar a biogênese e o amadurecimento de um miRNA intronic. Ao confirmar o processamento e amadurecimento do miRNA, nosso ensaio mostra a interação com a sequência de destino e a geração de um miRNA maduro e funcional. Em nosso ensaio, acoplamos a expressão de um aglomerado de miRNA intrônico com um plasmídeo de luciferase para verificar se há ligação de alvo de miRNA em células cultivadas.

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Protocol

Uma visão geral do protocolo descrito aqui é retratada na Figura 1.

1. Construção plasmid

  1. pCAGGS-Cre: Este plasmídeo foi fornecido pelo Dr. E. Makeyev21.
  2. pRD-miR-17-92:
    1. Amplie pré-miR-17-92 por PCR usando 0,5 μM de cada primer específico (Tabela de Materiais), 150 ng de cDNA, 1 mM dNTPs, 1x tampão PCR Taq e 5 U de polimerase de DNA Taq de alta fidelidade. Realize uma reação pcr de controle sem modelo (use água em vez de cDNA) para verificar se há contaminação de DNA.
    2. Ligate o produto PCR em pRD-RIPE (gentilmente fornecido pelo Dr. E. Makeyev, Nanyang Technology University, Cingapura)21 dentro do intron entre os locais de restrição EcoRI e EcoRV usando ligase de DNA, criando pRD-miR-17-92. Confirme a integridade da sequência por sanger sequenciamento.
  3. pmiRGLO-RAP-IB
    1. Projete primers para frente e para trás ladeados por sites de restrição XhoI/XbaI e com um site de restrição NotI dentro. Misture as quantidades equimolares de primers dianteiros e invertidos e incubar a mistura a 90 °C por 5 min, depois transfira para 37 °C por 15 minutos. Como controles, use primers com sequências de alvo mexidas (Tabela de Materiais).
    2. Cutule os fragmentos enaltados usando enzimas de restrição XhoI/XbaI e liga-os a jusante da sequência luc2 em pmiR-GLO, gerando pmiRGLO-RAP-IB-30-UTR (Luc-RAP-1B) e pmiRGLO-mexido-30-UTR (Luc-scrambled) construções repórteres. Confirme a ligadura com o decote NotI.
      NOTA: Certifique-se de que as saliências criadas após o ressarem do primer são complementares ao vetor após a reação do decote.
  4. pFLAG-HuR
    1. Para gerar um plasmídeo de super-expressagem hur, amplie a sequência HuR com primers específicos. Misture 300 ng de cDNA, 0,5 μM de cada primer específico, 1 mM dNTPs mix, 1x tampão PCR e 5 U de polimerase de DNA Taq de alta fidelidade.
    2. Liga o produto PCR em pGEM-T e confirme a integridade da sequência de DNA pelo sequenciamento Sanger. Remova o fragmento hur do pGEM-T e subclone-o no vetor de expressão de mamíferos pFLAG-CMV-3 para gerar o vetor pFLAG-HuR.

2. Cultura celular

NOTA: A linha celular HeLa-Cre foi um presente do Dr. E. Makeyev21, e a célula cancerígena da tireoide papilar (BCPAP) foi gentilmente fornecida pelo Dr. Massimo Santoro (Universidade "Federico II", Nápoles, Itália). Células HeLa, células cancerígenas papilares (BCPAP) e HEK-293T foram usadas para sobreexpressar HuR.

  1. Manter as células em DMEM/alta glicose suplementadas com soro bovino fetal de 10%, Piruvato de sódio 1 mM, 200 mM L-glutamina e 1x penicilina-estreptomicina (100 penicilina U/mL, 100 μg/mL streptomicin) em placas de Petri de 100 mm, salvo indicação em contrário. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada e controlada (5% de CO2).
  2. Incubar células aderentes com trippsina/EDTA (mistura de solução de 0,5%) a 37 °C por 3-5 min. Deixe-os se desprender da placa (o período de incubação pode variar de acordo com o tipo celular).
  3. Realize transfecções com um reagente de transfecção à base de lipídio seguindo as instruções do fabricante. Certifique-se de que as culturas celulares são aproximadamente 70% confluentes. Use quantidades similares de DNA para todas as combinações de transfecção, conforme descrito abaixo, adicionando os DNAs apropriados. Realize experimentos de transfecção em réplicas.
    1. Misture 200 ng de DNA e 1,25 μL de reagente de transfecção em 100 μL do meio de cultura. Adicione a mistura de transfecção às células. Incubar as células com as misturas de transfecção por 4h a 37 °C. Em seguida, substitua o meio por meio contendo 10% de FBS e incuba por mais 24 horas antes de adicionar os antibióticos para seleção.

3. Superexpressão hur

  1. Transfect pFLAG-HuR e pFLAG vazio em HeLa. Selecione células aumentando a concentração de geneticina (G418) (1 μg/mL) de 100 μg/mL para 1000 μg/mL, gerando linhas celulares estáveis.
  2. Confirme a superexpressão com PCR quantitativo usando primers específicos para HuR mRNA, conforme descrito na etapa 7.

4. Isolamento total do RNA

  1. Use células recém-coletadas. Trippsinize 70% de culturas celulares confluentes (para este ensaio, foram utilizadas células HeLa-Cre), conforme descrito na etapa 2.2.
  2. Coletar a pelota celular por centrifugação por 5 min a 500 x g a 4 °C e lavá-la com 1x PBS (salina tamponada com fosfato); repetir a centrifugação.
  3. Resuspenja a pelota de célula em 1 mL de PBS 1x e transfira-a para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL.
  4. Centrifugar por 5 min a 500 x g a 4 °C.
  5. Pesar a pelota seca da célula e ajustar os volumes e o tamanho dos tubos em conformidade. 1 mg de células produz aproximadamente 1 μg de RNA total.
  6. Em um capô, adicione 500-1.000 μL de fenol/clorofórmio à pelota celular (idealmente 750 μL por 0,25 g de células) e homogeneize-o por pipetar para cima e para baixo e misturar com o vórtice.
  7. Incubar a mistura por 5 min a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) para permitir a dissociação completa dos complexos de nucleoproteína.
  8. Centrifugar a amostra a 500 x g por 5 min a 4 °C.
  9. Transfira o supernatante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 200 μL de clorofórmio por 1 mL de fenol:clorofórmio usado. Tampe os tubos de amostra com segurança.
  10. Misture vigorosamente por 15 s (à mão ou brevemente vórtice a uma velocidade mais baixa) e incubar à temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) por 2 min a 3 min.
  11. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
  12. Verifique a presença de uma fase de fenol-clorofórmio vermelho inferior, uma fase intermediária e uma fase aquosa superior incolor. O RNA permanece na fase aquosa superior. Em um capô, colete a fase aquosa, evitando entrar em contato com a fase intermediária e transfira para um tubo fresco.
  13. Precipitar o RNA misturando a fase aquosa com 400 μL de isopropanol de grau molecular (proporção 1:1 para fenol/clorofórmio usado) e 2 μL de glicogênio em cada tubo (ajudará a visualizar a presença da pelota).
  14. Misture vigorosamente à mão ou homogeneize com a ponta para ~10 s. Incubar por 15 min ou durante a noite a −20 °C.
  15. Centrifugar a amostra a 12.000 x g por 20 min a 4 °C e descartar o sobrenatante.
  16. Lave a pelota de RNA adicionando 3 volumes de 100% de etanol (aproximadamente 1 mL, diluído com água DEPC) e misture a amostra por vórtice até que a pelota seja liberada e flutue do fundo.
  17. Centrifugar a 7.500 x g por 5 min a 4 °C.
  18. Lave a pelota de RNA 1x adicionando 1 mL de 75% de etanol e misture a amostra com vórtice até que a pelota seja liberada e flutue do fundo. Repita a centrifugação conforme descrito na etapa 4.17.
  19. Realize um giro adicional de centrifugação de 5 s para coletar líquido residual do lado do tubo e remova qualquer líquido residual com uma pipeta sem perturbar a pelota.
  20. Seque brevemente a pelota de RNA abrindo a tampa do tubo à temperatura ambiente por 3-5 min e dissolva a pelota de RNA em 20-50 μL de água tratada com DEPC sem RNase. Incubar o RNA por 10 min a 55-60 °C para facilitar a ressuspensão da pelota.

5. Determinação da concentração e qualidade total do RNA

  1. Determine a concentração de RNA medindo a absorvância a 260 nm e 280 nm usando um espectrofotômetro. Obtenha dados espectrais completos antes de usar as amostras em aplicações a jusante.
  2. Controle a qualidade do RNA resolvendo 800-1000 ng em um gel de 1,5% de agarose usando tampão 0,5X TBE (base Tris de 45 mM, ácido bórico de 45 mM, 1 mM EDTA). Total de RNA se separa em duas bandas referentes a 28S e 18S rRNAs.
    1. Faça todos os reagentes e lave todos os equipamentos utilizados para a execução do gel com água tratada com DEPC. A água tratada com DEPC é preparada no capô adicionando 1 mL de dietilpiroto a 1000 mL de água ultra-pura. Incubar por ~2 h em temperatura ambiente ou a 37 °C e autoclave. Guarde em temperatura ambiente por até 10 meses.
      NOTA: A eletroforese do total de RNAs de mamíferos leva à separação de rRNAs 28S e 18S a uma proporção de aproximadamente 2:1. As bandas devem estar intactas e visíveis como duas bandas afiadas. RNA degradado resultará em bandas embaçadas.

6. Transcrição reversa

  1. Defina a reação de transcrição reversa usando 1 μg de RNA total.
  2. Realize a transcrição reversa (RT) usando enzima transcriptase reversa (ver Tabela de Materiais) e primers de decamer aleatórios de 50 ng/μL.
    1. Misture RNA, primers aleatórios e 1 mM dNTP mix (10 mM) em 10 μL. Incubar a 65 °C por 5 min e no gelo por 1 min. Adicione os seguintes reagentes: tampão 1x RT, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U do inibidor RNase e 200 U de Transcriptase Reversa.
    2. Incubar por 10 min a 25 °C e por 1h a 50 °C (as temperaturas podem mudar se diferentes enzimas forem usadas). Termine a reação incubando a 85 °C por 5 min. cDNAs podem ser armazenados a −20 °C.

7. PCR quantitativo

  1. Para montar a reação em um volume final de 15 μL, misture 3 μL de cDNA (100 ng/μL), 3,2 pmol de cada primer, 6 μL de mix mestre contendo dNTPs e enzima, e 2,8 μL de água ultrapura.
    NOTA: Use primers para genes constitutivos endógenos como controles (genes de limpeza) para normalizar os níveis de expressão de HuR mRNA e miRNAs. β-Actin e snRNA U6 (RNU6B) são opções disponíveis para a normalização de mRNAs e miRNAs, respectivamente, mas outros genes também podem ser adequados dependendo do caso.
  2. Quantifique os níveis de expressão usando o método delta-delta Ct (2-ΔΔCt)20.

8. O ensaio do repórter

  1. Células usadas para o ensaio
    1. Transfeito os plasmídeos nas células HeLa-Cre da seguinte forma. Transfect com pTK-Renilla (40 ng), depois pRD-miR-17-92, gerando HeLa-Cre-miR-17-92, e selecionando com 1 μg/mL puramycina.
    2. Transfect HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla com pmiRGLO-RAP-IB-30-UTR ou pmiRGLO-mexido-30-UTR, separadamente. Selecione usando penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL). Essas transfecções geram Luc-RAP-1-B e Luc-mexido.
    3. Transfem as células com pFLAG-HuR ou pFLAG vazio (passo 3).
    4. Prossiga para a cultura celular, conforme detalhado na etapa 2.2., com HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-mexido, HeLa-Cre miR-17-92-HuR, e HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc até aproximadamente 80% de confluência. Induza com 1 μL de doxiciclina (1 μg/mL) por 30 min a 37 °C. Além disso, mantenha todas as células sem doxiciclina como controles, pelo mesmo período.
      NOTA: A concentração final da doxiciclina depende da linha celular escolhida. Um excesso de doxiciclina pode ser tóxico para células de mamíferos.
  2. Ensaio luminescente
    1. Para quantificar e comparar diferentes intensidades de luminescência, use o kit de ensaio de repórter dual-luciferase. Descongele as soluções de ensaio de luciferase e deixe-as em temperatura ambiente antes de iniciar o ensaio.
    2. Prepare a mistura Stop and Glo (tubos de tampa azul) misturando 200 μL do substrato em 10 mL de Luciferase Assay Buffer II. Prepare a mistura LAR II (tubos de tampa verde) misturando 10 mL de Luciferase Assay Buffer II no frasco âmbar do Substrato de Ensaio De Luciferase II e agite bem.
    3. Transfira as soluções para tubos de centrífugas de 15 mL previamente identificados e protegidos contra a luz.
      NOTA: Como alternativa, as soluções podem ser previamente preparadas em alíquotas de 1-2 mL e congeladas a −80 °C protegidas da luz em papel alumínio.
    4. Realizar as leituras de luminescência utilizando um equipamento como Synergy; medida expressa luciferase como unidades de luz relativa (RLU).
    5. Exportar os resultados para uma planilha para análise estatística posterior.
    6. Realize a normalização da atividade de vagalume-luciferase pelo controle Renilla (luciferase/Renilla) e plote isso como unidades de luz relativas (RLU) em um gráfico. Repita isso para grupos com e sem indução de doxiciclina.
    7. Calcular o erro médio e padrão da média (SEM). Realize o teste t ou ANOVA bidirecional de um aluno seguido do pós-teste de Tukey para permitir a comparação em grupo. Essas análises estão disponíveis em um pacote como GraphPad Prism. As diferenças nos valores p < 0,05 são consideradas significativas.

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Representative Results

Nossa hipótese inicial era que o HuR poderia facilitar a biogênese miRNA intronic, vinculando-se à sua sequência pré-miRNA. Assim, a conexão da expressão HuR e da biogênese de cluster miR-17-92 poderia apontar para um novo mecanismo que rege o amadurecimento desses miRNAs. A superexpressão do HuR após a transfecção do pFLAG-HuR foi confirmada em três linhas celulares diferentes: HeLa, BCPAP e HEK-293T (Figura 2). Como controles, foram utilizadas células não traduzídas e células transfectadas com vetores pFLAG vazios. É importante ressaltar que a superexpressão do HuR nessas células estimula a expressão do miR-19a (Resultado suplementar da Tabela 1 relatado em Gatti da Silva et al.9).

Para confirmar que os miRNAs induzidos eram genuinamente funcionais, um sistema de repórteres in vitro foi projetado, como descrito aqui. O intron artificial em pRD-RIPE separa duas regiões de codificação do eGFP. Este está sob o controle de um elemento responsivo de tetraciclina (TRE). A expressão do eGFP é, portanto, controlada pela presença do antibiótico doxiciclina (DOX) no meio celular (Figura 3).

Uma pesquisa em silico usando miRbase e TargetScan revelou possíveis alvos de mRNA para miR-19a e miR-19b (componentes do cluster miR-17-92). Como alvo potencial para ambas as miRNAs, foi escolhida a sequência 5' TTTGCACA 3', encontrada na região DO RAP-IB 3' UTR (Tabela Suplementar 2). Rap-IB é um membro gtPase da família de proteínas associadas a Ras (RAS). Os miRNAs induzidos foram corretamente processados e funcionais em nosso ensaio, pois hibridizados para a sequência de destino clonada ao lado da luciferase (ver Figura 3, alvo pmiR-GLO). Assim, bloqueou a tradução da luciferase, que se refletiu na redução da atividade da luciferase (Figura 3). Como controle para este ensaio, embaralhamos a sequência de alvos, substituindo-a por 5' GGGTAAA 3' em plasmídeos mexidos de Luc (sequências de alvo e mexidas são sublinhadas nas sequências de oligos na Tabela de Materiais).

Em condições regulares e sem indução do plasmídeo pRD-miR-17-92, miR-19a endógeno e/ ou miR-19b encontrou o alvo em pmiR-GLO, o que levou à redução da atividade da luciferase (dados não mostrados). Após a suplementação do DOX, observou-se uma ligeira e não estatisticamente significativa redução da atividade da luciferase em células com sequência de alvo mexida. Isso pode ser devido à presença de sequências de destino para outros miRNAs nesta sequência. Observou-se forte redução da atividade da luciferase com o RAP-IB 3'UTR sobre o aumento da expressão miR-19a e miR-19b de pRD-miR-17-92 em comparação com as células HeLa-Cre (ver Figura 4, compare barras laranja e preta). A transfecção do pFLAG-HuR nessas células por si só não alterou a atividade da luciferase (ver Figura 4, compare barras cinza e preta). No entanto, a superexpressão do HuR aliada à suplementação de doxiciclina, estimulando a expressão do cluster miR-17-92, reduziu ainda mais a atividade da luciferase (ver Figura 4, compare barras cinza e vermelha). Isso indica uma regulação positiva do HuR sobre miR-19a e miR-19b, juntamente com o processamento correto e a maturação desses miRNAs, que foram capazes de encontrar com sucesso seus alvos (HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc) (ver Figura 4).

O uso deste sistema de repórteres confirmou que o HuR induz a expressão e a maturação adequada do miR-19a e miR-19b em células HeLa.

Figure 1
Figura 1: Uma visão geral conceitual do protocolo descrito aqui. Plasmídeos contendo o miRNA, sequência de alvos, proteína regulatória e pTK-Renilla foram transfectados em células cultivadas. Após a seleção de antibióticos, essas células foram utilizadas para induzir a expressão miRNA (com doxiciclina), com quantificação subsequente da atividade luciferase, e para análise de RNA para confirmar a superexpressão do HuR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Confirmação da sobre-expressão FLAG-HuR em (A) HeLa, (B) BCPAP e (C) hek293T por qPCR. A transfecção com pFLAG vazio foi usada como controle (barras brancas). β-actin foi utilizado para normalizar os valores do TC. O eixo y representa a mudança de expressão calculada após a normalização. As barras de erro representam erros padrão calculados a partir de três medidas independentes. **P <0.005, ****P < 0,0005 (figura adaptada de Gatti da Silva et al.9). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Sistema de repórter miRNA intronic. (A) Representação esquemática do plasmídeo pRD-RIPE que gerou pRD-miR-17-92. pré-miR-17-92 foi inserido dentro do intron e estava sob o controle de um promotor indutível dox; à direita, o plasmídeo pmiR-GLO com sequência de alvo RAP-IB 3'UTR (pmiRGLO-RAP-IB); o controle tinha a sequência de alvo mexido (pmiRGLO-mexido). (B) Detalhe na sequência de pmiRGLO-RAP-IB, com foco na sequência de destino complementar ao miR-19a e miR-19b. A atividade da luciferase é reduzida após a interação do miRNA e do alvo (figura adaptada de Gatti da Silva et al.9). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: As células HeLa-Cre foram co-transfilidas com os repórteres plasmídeos pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-mexido, pRD-miR-17-92, e pFLAG-HuR. Atividade de luciferase em células HeLa-Cre não traduzidas (preto), HeLa-Cre miR-17-92-mexido (branco), HeLa-Cre-HuR (cinza), HeLa-Cre miR-17-92-luc (laranja) e HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (vermelho). A atividade da luciferase foi quantificada como descrita no protocolo como a atividade relativa da luciferase de vagalume à luciferase renilla (observada com pTK-Renilla) e normalizada após a adição de doxiciclina. É mostrado como "unidades relativas de luz" (RLU) no eixo y. **P < 0,005; P < 0,0005 (figura adaptada de Gatti da Silva et al.9). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Valores de TC bruto observados para qPCR para analisar a expressão miR-19. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela Suplementar 2: Sequência de alvos RAP-IB 3'UTR e miR-19. Clique aqui para baixar esta Tabela.

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Discussion

O emenda pré-mRNA é um processo importante para a regulação da expressão genética, e seu controle pode desencadear efeitos fortes sobre modificações fenotípicascelulares 22,23. Mais de 70% dos miRNAs são transcritos de introns em humanos, e nós imaginamos que seu processamento e maturação poderiam ser facilitados por emendar proteínas regulatórias24,25. Desenvolvemos um método para analisar o processamento e a função de miRNA intrônicos em células cultivadas. Nosso ensaio usa quatro plasmídeos diferentes e nos permite testar a maturação de miRNAs endógenos e exógenos ou induzidos. O método descrito aqui pode ser realizado em 2-3 dias e não requer reagentes caros.

Considerando que o HuR é uma proteína de ligação de RNA importante para a estabilidade do mRNA e é imuno-precipitada com miR-18 e miR-19a miRNAs17, este ensaio testou se poderia conduzir biogênese e maturação intronic miRNA. O HuR não é encontrado no núcleo de emendas, mas interage com proteínas envolvidas com a estabilização mRNA26. Consistentemente, a superexpressão do HuR tem sido associada ao desenvolvimento de cânceres de ovário e bexiga27,28. Em células cancerígenas papilares, observamos que o HuR aumenta a proliferação celular, migração e invasão9. O HuR também afeta a estabilidade do mRNA dos reguladores do ciclo celular, como PTEN, cyclin A2 e cyclin D2, aumentando a proliferação e migração celular e levando a características tumorigênicas29,30. No entanto, uma parte significativa desses mRNAs também têm seqüências-alvo para miR-19a e miR-19b. Notavelmente, o HuR pode se ligar à região intrônica onde esses miRNAs são transcritos, levando à noção de que pode controlar o splicing e o amadurecimento desses miRNAs e, consequentemente, melhorar as características tumorigênicas.

Para testar isso, este ensaio foi desenvolvido com quatro plasmídeos diferentes. O primeiro contém o miRNA cluster miR-17-92 inserido dentro de um intron, e sua expressão é controlada sobre a adição de doxiciclina. O segundo plasmídeo é o pmiR-GLO comercial carregando a sequência de alvos ao lado dos 3' do gene luc2. A vinculação do miRNA a esta sequência de destino afeta a expressão luc2, que pode ser medida em um ensaio de luminescência. O terceiro plasmídeo é o pFLAG-HuR, que induz a superexpressão desta proteína regulatória. Finalmente, pTK-Renilla também é usado para incluir a fluorescência de luciferase Renilla. Nossos resultados indicaram que o HuR estimula a expressão miR-17-92 e aumenta a associação de seus componentes com as sequências de destino, resultando, portanto, em moléculas de miRNA maduras e funcionais. Descrevemos a associação do HuR com o miRNA em outro artigo9. As sequências de destino utilizadas neste estudo foram específicas para miR-19a e miR-19b miRNAs. No entanto, este método também pode ser adaptado ao uso de sequências de alvo mais curtas ou mais longas, incluindo vários locais de destino. Neste caso, deve ser considerada a ligação inespecífica de miRNAs endógenas à sequência de destino ou sequências próximas. As sequências utilizadas podem ter outros possíveis locais de destino, o que pode afetar a atividade da luciferase. O método aqui descrito também poderia ser usado para validar diferentes alvos de um miRNA ou um grupo de miRNAs transcritas em conjunto, permitindo estudos funcionais de miRNAs e suas alterações fenotípicas específicas. Deve-se notar também que permite que os resultados sejam comparados entre diferentes linhas celulares e origens genéticas.

Os passos mais críticos para o uso mais amplo desse protocolo em células de mamíferos são a eficiência das etapas de transfecção e indução. Uma vez que diferentes plasmídeos são transfectados nas células, controles adequados também são críticos. Esses parâmetros mudam com o tamanho dos plasmídeos e são afetados pelo extenso tempo na cultura celular. Portanto, um ponto importante a ser considerado antes de iniciar o ensaio é a facilidade de transfecção das células escolhidas. Além disso, o uso extensivo de diferentes antibióticos para selecionar para os diferentes plasmídeos (gentamicina, puramicina e doxiciclina) e ativar a expressão pode ser prejudicial às células e reduzir a eficiência dos seguintes experimentos. É importante que este ensaio seja primeiro otimizado com células com eficiência de transfecção conhecida.

O repórter mostrou com sucesso que o aumento da expressão hur poderia induzir a biogênese miRNA e confirmou sua maturação funcional. É importante ressaltar que a superexpressão do HuR não afetou a quantidade de intron produzido, uma vez que não observamos a redução da atividade da luciferase nesta condição (Figura 4). Outros experimentos podem ser realizados para caracterizar RBPs e miRNAs usando este sistema de repórteres. Por exemplo, seria importante criar mutações únicas em sequências de miRNA ou em suas regiões de flanqueamento e analisar o impacto das proteínas regulatórias na biogênese miRNA. Isso permitiria a caracterização específica da biogênese de miRNAs individuais e também poderia melhorar o conhecimento sobre sequências conservadas para processamento e maturação de miRNA.

Consideramos que esta é uma importante contribuição metodológica para o estudo da biogênese e maturação do miRNA e do papel de emendar proteínas regulatórias nesses processos. Também poderia ser aplicado a estudos sobre a regulação e controle de mRNAs e miRNAs em diferentes tipos de células.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores são gratos a E. Makeyev (Nanyang Technology University, Cingapura) pelas células HeLa-Cre e plasmídeos pRD-RIPE e pCAGGS-Cre. Agradecemos o apoio de Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes e Anselmo Moriscot.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

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Pesquisa sobre câncer edição 184
Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas
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Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

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