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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63498
Automatic Translation
1, 1
1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

Summary

Desarrollamos un ensayo informador de biogénesis de microARN intrónico para ser utilizado en células in vitro con cuatro plásmidos: uno con miARN intrónico, uno con el objetivo, uno para sobreexpresar una proteína reguladora y uno para Renilla luciferasa. El miARN se procesó y pudo controlar la expresión de luciferasa uniéndose a la secuencia objetivo.

Abstract

Los microARN (miARN) son moléculas cortas de ARN que están muy extendidas en eucariotas. La mayoría de los miARN se transcriben a partir de intrones, y su maduración involucra diferentes proteínas de unión al ARN en el núcleo. Los miARN maduros con frecuencia median el silenciamiento génico, y esto se ha convertido en una herramienta importante para comprender los eventos post-transcripcionales. Además de eso, se puede explorar como una metodología prometedora para las terapias génicas. Sin embargo, actualmente hay una falta de métodos directos para evaluar la expresión de miRNA en cultivos celulares de mamíferos. Aquí, describimos un método eficiente y simple que ayuda a determinar la biogénesis y maduración de miRNA a través de la confirmación de su interacción con secuencias objetivo. Además, este sistema permite separar la maduración exógena de miRNA de su actividad endógena utilizando un promotor inducible por doxiciclina capaz de controlar la transcripción de miRNA primario (pri-miRNA) con alta eficiencia y bajo costo. Esta herramienta también permite la modulación con proteínas de unión a ARN en un plásmido separado. Además de su uso con una variedad de miRNAs diferentes y sus respectivas dianas, se puede adaptar a diferentes líneas celulares, siempre que sean susceptibles de transfección.

Introduction

El empalme de ARNm precursor es un proceso importante para la regulación de la expresión génica en eucariotas1. La eliminación de intrones y la unión de exones en ARN maduro es catalizada por el espliceosoma, un complejo ribonucleoproteico de 2 megadaltones compuesto por 5 snRNAs (U1, U2, U4, U5 y U6) junto con más de 100 proteínas 2,3. La reacción de empalme ocurre co-transcripcionalmente, y el espliceosoma se ensambla en cada nuevo intrón guiado por el reconocimiento de los sitios de empalme conservados en los límites exón-intrón y dentro del intrón4. Diferentes intrones pueden tener diferentes velocidades de empalme a pesar de la notable conservación del complejo de espliceosoma y sus componentes. Además de las diferencias en la conservación del sitio de empalme, las secuencias reguladoras distribuidas en intrones y exones pueden guiar las proteínas de unión al ARN (RBP) y estimular o reprimir el empalme 5,6. HuR es una RBP expresada ubicuamente y es un factor importante para controlar la estabilidad del ARNm7. Resultados previos de nuestro grupo mostraron que HuR puede unirse a intrones que contienen miRNAs, lo que indica que esta proteína podría ser un factor importante para facilitar el procesamiento y la maduración de miRNA, lo que también conduce a la generación de isoformas de empalme alternativas 6,8,9.

Muchos microARN (miARN) se codifican a partir de secuencias intrónicas. Mientras que algunos son parte del intrón, otros se conocen como "mirtrones" y están formados por todo el intrón10,11. Los miRNAs son ARN cortos no codificantes, que van de 18 a 24 nucleótidos de longitud12. Su secuencia madura muestra complementariedad parcial o total con las secuencias diana en los ARNm, lo que afecta a las tasas de traducción y/o decaimiento del ARNm. Las combinaciones de miARN y dianas conducen a la célula a diferentes resultados. Varios miRNAs pueden conducir células a fenotipos pro o antitumorales13. Los miARN oncogénicos generalmente se dirigen a ARNm que desencadenan una característica supresora que conduce a un aumento de la proliferación, migración e invasión celular14. Por otro lado, los miARN supresores de tumores podrían dirigirse a ARNm oncogénicos o ARNm relacionados con el aumento de la proliferación celular.

El procesamiento y la maduración de los miRNAs también dependen de su origen. La mayoría de los miRNAs intrónicos son procesados con la participación del microprocesador, formado por la ribonucleasa Drosha y los cofactores proteicos12. Los mirtrones se procesan con la actividad del espliceosoma independientemente de Drosha15. Teniendo en cuenta la alta frecuencia de miARN que se encuentran dentro de los intrones, planteamos la hipótesis de que las proteínas de unión al ARN involucradas con el empalme también podrían facilitar el procesamiento y la maduración de estos miARN. En particular, el RBP hnRNP A2/B1 ya se ha asociado con el microprocesador y la biogénesis del miARN16.

Hemos informado previamente que varias proteínas de unión a ARN, como hnRNPs y HuR, están asociadas con miRNAs intrónicos por espectrometría de masas17. La asociación de HuR (ELAVL1) con miRNAs del cluster intrónico miR-17-92 fue confirmada mediante inmunoprecipitación y análisis in silico 9. miR-17-92 es un grupo de miARN intrónico compuesto por seis miARN con mayor expresión en diferentes cánceres18,19. Este grupo también se conoce como "oncomiR-1" y está compuesto por miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b y miR-92 a. miR-19 a y miR-19b se encuentran entre los miRNAs más oncogénicos de este grupo 19. El aumento de la expresión de HuR estimula la síntesis de miR-19a y miR-19b 9. Dado que las regiones intrónicas que flanquean este grupo están asociadas con HuR, desarrollamos un método para investigar si esta proteína podría regular la expresión y maduración de miR-19a y miR-19b. Una predicción importante de nuestra hipótesis fue que, como proteína reguladora, HuR podría facilitar la biogénesis de miRNA, dando lugar a alteraciones fenotípicas. Una posibilidad era que los miRNAs fueran procesados por la estimulación de HuR pero no fueran maduros y funcionales y, por lo tanto, los efectos de la proteína no impactaran directamente en el fenotipo. Por lo tanto, desarrollamos un ensayo de splicing reporter para investigar si un RBP como HuR podría afectar la biogénesis y la maduración de un miRNA intrónico. Al confirmar el procesamiento y la maduración del miARN, nuestro ensayo muestra la interacción con la secuencia objetivo y la generación de un miARN maduro y funcional. En nuestro ensayo, acoplamos la expresión de un grupo de miARN intrónico con un plásmido luciferasa para verificar la unión al objetivo de miARN en células cultivadas.

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Protocol

En la figura 1 se muestra una descripción general del protocolo descrito aquí.

1. Construcción de plásmidos

  1. pCAGGS-Cre: Este plásmido fue proporcionado por el Dr. E. Makeyev21.
  2. pRD-miR-17-92:
    1. Amplíe el pre-miR-17-92 por PCR utilizando 0,5 μM de cada cebador específico (Tabla de materiales), 150 ng de ADNc, 1 mM dNTPs, 1x tampón Taq PCR y 5 U de ADN polimerasa Taq de alta fidelidad. Realice una reacción de PCR de control sin plantilla (use agua en lugar de ADNc) para verificar la contaminación del ADN.
    2. Ligue el producto de PCR en pRD-RIPE (amablemente proporcionado por el Dr. E. Makeyev, Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur)21 dentro del intrón entre los sitios de restricción EcoRI y EcoRV utilizando ADN ligasa, creando pRD-miR-17-92. Confirme la integridad de la secuencia mediante la secuenciación de Sanger.
  3. pmiRGLO-RAP-IB
    1. Diseñe cebadores delanteros e inversos flanqueados por sitios de restricción XhoI / XbaI y con un sitio de restricción NotI en el interior. Mezclar cantidades equimolares de cebadores directos e inversos e incubar la mezcla a 90 °C durante 5 min, luego transferir a 37 °C durante 15 min. Como controles, use cebadores con secuencias de objetivos codificadas (Tabla de materiales).
    2. Dividir los fragmentos recocidos usando enzimas de restricción XhoI/XbaI y ligarlos aguas abajo de la secuencia luc2 en pmiR-GLO, generando construcciones reporteras pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) y pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). Confirmar la ligadura con escote NoI.
      NOTA: Asegúrese de que los voladizos creados después del recocido de cebador sean complementarios al vector después de la reacción de escisión.
  4. pFLAG-HuR
    1. Para generar un plásmido de sobreexpresión de HuR, amplíe la secuencia de HuR con cebadores específicos. Mezcle 300 ng de ADNc, 0,5 μM de cada cebador específico, 1 mM de mezcla de dNTPs, 1x tampón de PCR y 5 U de ADN polimerasa Taq de alta fidelidad.
    2. Ligate el producto de PCR en pGEM-T y confirma la integridad de la secuencia de ADN mediante secuenciación de Sanger. Elimine el fragmento HuR de pGEM-T y subclónelo en el vector de expresión de mamíferos pFLAG-CMV-3 para generar el vector pFLAG-HuR.

2. Cultivo celular

NOTA: La línea celular HeLa-Cre fue un regalo del Dr. E. Makeyev21, y la célula de cáncer papilar de tiroides (BCPAP) fue amablemente proporcionada por el Dr. Massimo Santoro (Universidad "Federico II", Nápoles, Italia). Las células HeLa, las células papilares de cáncer de tiroides (BCPAP) y HEK-293T se utilizaron para sobreexpresar HuR.

  1. Mantener las células en DMEM/glucosa alta suplementada con suero bovino fetal al 10%, piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 200 mM y 1x penicilina-estreptomicina (100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina) en placas de Petri de 100 mm, a menos que se indique lo contrario. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada en atmósfera controlada (5%CO2).
  2. Incubar las células adherentes con tripsina/EDTA (mezcla de solución al 0,5%) a 37 °C durante 3-5 min. Déjelos separarse de la placa (el período de incubación puede variar según el tipo de célula).
  3. Realice las transfecciones con un reactivo de transfección a base de lípidos siguiendo las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que los cultivos celulares sean aproximadamente 70% confluentes. Use cantidades similares de ADN para todas las combinaciones de transfección, como se describe a continuación, agregando los ADN apropiados. Realizar experimentos de transfección en réplicas.
    1. Mezclar 200 ng de ADN y 1,25 μL de reactivo de transfección en 100 μL del medio de cultivo. Agregue la mezcla de transfección a las células. Incubar las células con las mezclas de transfección durante 4 h a 37 °C. Luego, reemplace el medio con un medio que contenga 10% de FBS e incube durante otras 24 h antes de agregar los antibióticos para la selección.

3. Sobreexpresión de HuR

  1. Transfecte pFLAG-HuR y vacíe pFLAG en HeLa. Seleccionar células aumentando la concentración de genética (G418) (1 μg/mL) de 100 μg/mL a 1000 μg/mL, generando líneas celulares estables.
  2. Confirme la sobreexpresión con PCR cuantitativa utilizando cebadores específicos para el ARNm de HuR, como se describe en el paso 7.

4. Aislamiento total de ARN

  1. Use celdas recién recolectadas. Tripsinizar al 70% de cultivos celulares confluentes (para este ensayo, se utilizaron células HeLa-Cre), como se describe en el paso 2.2.
  2. Recoger el pellet celular por centrifugación durante 5 min a 500 x g a 4 °C y lavarlo con 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato); Repita la centrifugación.
  3. Resuspender el pellet celular en 1 ml de 1x PBS y transferirlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  4. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C.
  5. Pese el pellet de celda seca y ajuste los volúmenes y el tamaño de los tubos en consecuencia. 1 mg de células produce aproximadamente 1 μg de ARN total.
  6. En una campana, agregue 500-1,000 μL de fenol / cloroformo al pellet celular (idealmente 750 μL por 0.25 g de células) y homogeneícelo pipeteando hacia arriba y hacia abajo y mezclándolo con el vórtice.
  7. Incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteínas.
  8. Centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
  9. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añada 200 μL de cloroformo por 1 ml de fenol:cloroformo utilizado. Tapa los tubos de muestra de forma segura.
  10. Mezclar vigorosamente durante 15 s (a mano o brevemente vórtice a una velocidad más baja) e incubar a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C) durante 2 min a 3 min.
  11. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  12. Compruebe la presencia de una fase inferior de fenol-cloroformo rojo, una fase intermedia y una fase acuosa superior incolora. El ARN permanece en la fase acuosa superior. En una campana, recoger la fase acuosa, evitando entrar en contacto con la fase intermedia, y transferir a un tubo nuevo.
  13. Precipitar ARN mezclando la fase acuosa con 400 μL de isopropanol de grado molecular (relación 1:1 a fenol/cloroformo utilizado) y 2 μL de glucógeno en cada tubo (ayudará a visualizar la presencia del pellet).
  14. Mezclar vigorosamente a mano u homogeneizar con la punta durante ~10 s. Incubar durante 15 min o durante la noche a -20 °C.
  15. Centrifugar la muestra a 12.000 g durante 20 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
  16. Lave el pellet de ARN agregando 3 volúmenes de etanol al 100% (aproximadamente 1 ml, diluido con agua DEPC) y mezcle la muestra mediante vórtice hasta que el pellet se libere y flote desde el fondo.
  17. Centrifugar a 7.500 x g durante 5 min a 4 °C.
  18. Lave el pellet de ARN 1x agregando 1 ml de etanol al 75% y mezcle la muestra por vórtice hasta que el pellet se libere y flote desde el fondo. Repita la centrifugación como se describe en el paso 4.17.
  19. Realice un centrifugado adicional de 5 s para recoger el líquido residual del lado del tubo y eliminar cualquier líquido residual con una pipeta sin alterar el pellet.
  20. Seque brevemente al aire el pellet de ARN abriendo la tapa del tubo a temperatura ambiente durante 3-5 minutos y disuelva el pellet de ARN en 20-50 μL de agua tratada con DEPC libre de RNasa. Incubar el ARN durante 10 min a 55-60 °C para facilitar la resuspensión del pellet.

5. Determinación de la concentración y calidad total de ARN

  1. Determinar la concentración de ARN midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nm utilizando un espectrofotómetro. Obtenga datos espectrales completos antes de utilizar las muestras en aplicaciones posteriores.
  2. Controle la calidad del ARN resolviendo 800-1000 ng en un gel de agarosa al 1,5% utilizando tampón TBE 0,5X (45 mM de base Tris, 45 mM de ácido bórico, 1 mM de EDTA). El ARN total se separa en dos bandas que se refieren a los ARNr 28S y 18S.
    1. Haga todos los reactivos y lave todo el equipo utilizado para hacer funcionar el gel con agua tratada con DEPC. El agua tratada con DEPC se prepara en la campana agregando 1 ml de dietilpirocarbonato a 1000 ml de agua ultrapura. Incubar durante ~2 h a temperatura ambiente o a 37 °C y en autoclave. Guarde este producto a temperatura ambiente hasta por 10 meses.
      NOTA: La electroforesis de los ARN totales de mamíferos conduce a la separación de los ARNr 28S y 18S en una proporción de aproximadamente 2:1. Las bandas deben estar intactas y visibles como dos bandas afiladas. El ARN degradado dará lugar a bandas borrosas.

6. Transcripción inversa

  1. Establezca la reacción de transcripción inversa utilizando 1 μg de ARN total.
  2. Realizar la transcripción inversa (RT) utilizando la enzima transcriptasa inversa (consulte la Tabla de materiales) y cebadores decámeros aleatorios de 50 ng/μL.
    1. Mezclar ARN, cebadores aleatorios y 1 mM de mezcla de dNTP (10 mM) en 10 μL. Incubar a 65 °C durante 5 min y en hielo durante 1 min. Agregue los siguientes reactivos: 1x tampón RT, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U de inhibidor de RNasa y 200 U de transcriptasa inversa.
    2. Incubar durante 10 min a 25 °C y durante 1 h a 50 °C (las temperaturas pueden cambiar si se utilizan diferentes enzimas). Terminar la reacción incubando a 85 °C durante 5 min. Los ADNc se pueden almacenar a -20 °C.

7. PCR cuantitativa

  1. Para ensamblar la reacción en un volumen final de 15 μL, mezcle 3 μL de ADNc (100 ng / μL), 3.2 pmol de cada cebador, 6 μL de mezcla maestra que contenga los dNTP y la enzima, y 2.8 μL de agua ultrapura.
    NOTA: Utilice cebadores para genes constitutivos endógenos como controles (genes de limpieza) para normalizar los niveles de expresión de ARNm y miARN de HuR. β-Actina y snRNA U6 (RNU6B) son opciones disponibles para la normalización de ARNm y miRNAs, respectivamente, pero otros genes también pueden ser adecuados dependiendo del caso.
  2. Cuantificar los niveles de expresión utilizando el método delta-delta Ct (2-ΔΔCt)20.

8. El ensayo del reportero

  1. Células utilizadas para el ensayo
    1. Transfectar los plásmidos en células HeLa-Cre de la siguiente manera. Transfecto con pTK-Renilla (40 ng), luego pRD-miR-17-92, generando HeLa-Cre-miR-17-92, y seleccionando con 1 μg/mL de puromicina.
    2. Transfecto HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla con pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR o pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, por separado. Seleccione el uso de penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL). Estas transfecciones generan Luc-RAP-1-B y Luc-scrambled.
    3. Transfecte las celdas con pFLAG-HuR o pFLAG vacío (paso 3).
    4. Proceder al cultivo celular, como se detalla en el paso 2.2., con HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-codificado, HeLa-Cre miR-17-92-HuR y HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc hasta aproximadamente el 80% de la confluencia. Inducir con 1 μL de doxiciclina (1 μg/ml) durante 30 min a 37 °C. Además, mantenga todas las células sin doxiciclina como controles, durante el mismo período.
      NOTA: La concentración final de doxiciclina depende de la línea celular de elección. Un exceso de doxiciclina puede ser tóxico para las células de mamíferos.
  2. Ensayo luminiscente
    1. Para cuantificar y comparar diferentes intensidades de luminiscencia, utilice el kit de ensayo Dual-luciferase reporter. Descongele las soluciones de ensayo de luciferasa y déjelas a temperatura ambiente antes de comenzar el ensayo.
    2. Prepare la mezcla Stop y Glo (tubos de tapa azul) mezclando 200 μL del sustrato en 10 ml de tampón II del ensayo de luciferasa. Prepare la mezcla LAR II (tubos de tapa verde) mezclando 10 ml de Luciferase Assay Buffer II en el vial ámbar de Luciferase Assay Substrate II y agite bien.
    3. Transfiera las soluciones a tubos centrífugos de 15 ml previamente identificados y protegidos de la luz.
      NOTA: Como alternativa, las soluciones pueden prepararse previamente en alícuotas de 1-2 ml y congelarse a −80 °C protegidas de la luz en papel de aluminio.
    4. Realizar las lecturas de luminiscencia utilizando un equipo como Synergy; medida expresada luciferasa como unidades de luz relativa (RLU).
    5. Exporte los resultados a una hoja de cálculo para su posterior análisis estadístico.
    6. Realizar la normalización de la actividad luciérnaga-luciferasa mediante el control Renilla (luciferasa/Renilla) y trazarla como unidades de luz relativa (RLU) en un gráfico. Repita esto para grupos con y sin inducción de doxiciclina.
    7. Calcular la media y el error estándar de la media (SEM). Realice una prueba t de Student o un ANOVA bidireccional seguido de la prueba posterior de Tukey para permitir la comparación grupal. Estos análisis están disponibles en un paquete como GraphPad Prism. Las diferencias en los valores de p < 0,05 se consideran significativas.

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Representative Results

Nuestra hipótesis inicial era que HuR podría facilitar la biogénesis intrónica de miARN al unirse a su secuencia de pre-miARN. Por lo tanto, la conexión de la expresión de HuR y la biogénesis del grupo miR-17-92 podría apuntar a un nuevo mecanismo que rige la maduración de estos miRNAs. La sobreexpresión de HuR tras la transfección de pFLAG-HuR se confirmó en tres líneas celulares diferentes: HeLa, BCPAP y HEK-293T (Figura 2). Como controles, se utilizaron células no transfectadas y células transfectadas con vectores pFLAG vacíos. Es importante destacar que observamos que la sobreexpresión de HuR en estas células estimula la expresión de miR-19a (Resultados de la Tabla Suplementaria 1 reportados en Gatti da Silva et al.9).

Para confirmar que los miRNAs inducidos eran genuinamente funcionales, se diseñó un sistema informador in vitro , como se describe aquí. El intrón artificial en pRD-RIPE separa dos regiones codificantes de eGFP. Este casete está bajo el control de un elemento sensible a la tetraciclina (TRE). La expresión de eGFP está, por lo tanto, controlada por la presencia del antibiótico doxiciclina (DOX) en el medio celular (Figura 3).

Una búsqueda in silico utilizando miRbase y TargetScan reveló posibles objetivos de ARNm para miR-19 a y miR-19 b (componentes del grupo miR-17-92). Como objetivo potencial para ambos miRNAs, se eligió la secuencia 5' TTTGCACA 3', encontrada en la región RAP-IB 3' UTR (Tabla Suplementaria 2). RAP-IB es un miembro GTPasa de la familia de proteínas asociadas a Ras (RAS). Los miRNAs inducidos se procesaron correctamente y fueron funcionales en nuestro ensayo, ya que se hibridaron a la secuencia diana clonada junto a la luciferasa (ver Figura 3, objetivo pmiR-GLO). Por lo tanto, bloqueó la traducción de luciferasa, lo que se reflejó en una actividad reducida de la luciferasa (Figura 3). Como control para este ensayo, codificamos la secuencia objetivo, reemplazándola por 5' GGGTAAA 3' en plásmido codificado de Luc (las secuencias objetivo y codificadas están subrayadas en las secuencias oligos en la Tabla de materiales).

En condiciones regulares y sin inducción del plásmido pRD-miR-17-92, miR-19a y/o miR-19b endógenos encontraron el objetivo en pmiR-GLO, lo que condujo a una actividad reducida de la luciferasa (datos no mostrados). Después de la suplementación con DOX, se observó una reducción leve y no estadísticamente significativa en la actividad de la luciferasa en células con una secuencia objetivo codificada. Esto podría deberse a la presencia de secuencias diana para otros miARN en esta secuencia. Se observó una fuerte reducción en la actividad de la luciferasa con RAP-IB 3'UTR tras el aumento de la expresión de miR-19 a y miR-19 b de pRD-miR-17-92en comparación con las células HeLa-Cre(ver Figura 4, comparar barras naranjas y negras). La transfección de pFLAG-HuR en estas células por sí sola no cambió la actividad de la luciferasa (ver Figura 4, comparar barras grises y negras). Sin embargo, la sobreexpresión de HuR junto con la suplementación con doxiciclina, estimulando la expresión del grupo miR-17-92, redujo aún más la actividad de la luciferasa (ver Figura 4, comparar barras grises y rojas). Esto indica una regulación positiva de HuR sobre miR-19 a y miR-19 b, junto con el correcto procesamiento y maduración de estos miRNAs, que fueron capaces de encontrar con éxito sus objetivos (HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc) (ver Figura 4).

El uso de este sistema reportero confirmó que HuR induce la expresión y maduración adecuada de miR-19 a y miR-19b en células HeLa.

Figure 1
Figura 1: Una descripción general conceptual del protocolo descrito aquí. Los plásmidos que contienen miARN, secuencia diana, proteína reguladora y pTK-Renilla se transfectaron en células cultivadas. Después de la selección de antibióticos, estas células se utilizaron para inducir la expresión de miARN (con doxiciclina), con la posterior cuantificación de la actividad de la luciferasa, y para el análisis de ARN para confirmar la sobreexpresión de HuR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Confirmación de la sobreexpresión de FLAG-HuR en células (A) HeLa, (B) BCPAP y (C) HEK293T mediante qPCR. Se utilizó como control la transfección con pFLAG vacío (barras blancas). Se utilizó β-actina para normalizar los valores de Ct. El eje y representa el cambio de pliegue de la expresión calculado después de la normalización. Las barras de error representan errores estándar calculados a partir de tres mediciones independientes. **P <0,005, ****P < 0,0005 (figura adaptada de Gatti da Silva et al.9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Sistema informador de miRNA intrónico. (A) Representación esquemática del plásmido pRD-RIPE que generó pRD-miR-17-92. pre-miR-17-92 se insertó dentro del intrón y estaba bajo el control de un promotor inducible por dox; a la derecha, el plásmido pmiR-GLO con secuencia diana RAP-IB 3'UTR (pmiRGLO-RAP-IB); el control tenía la secuencia de destino codificada (pmiRGLO-scrambled). (B) Detalle de la secuencia de pmiRGLO-RAP-IB, centrándose en la secuencia objetivo complementaria a miR-19 a y miR-19b. La actividad de la luciferasa se reduce tras la interacción del miARN y el objetivo (figura adaptada de Gatti da Silva et al.9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Las células HeLa-Cre fueron co-transfectadas con plásmidos reporteros pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-scrambled, pRD-miR-17-92 y pFLAG-HuR. Actividad de la luciferasa en células HeLa-Cre no transfectadas (negro), HeLa-Cre miR-17-92-revuelto (blanco), HeLa-Cre-HuR (gris), HeLa-Cre miR-17-92-luc (naranja) y HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (rojo). La actividad de la luciferasa se cuantificó como se describe en el protocolo como la actividad relativa de la luciferasa de luciérnaga a la renilla luciferasa (observada con pTK-Renilla) y se normalizó después de la adición de doxiciclina. Se muestra como "unidades de luz relativa" (RLU) en el eje y. **P < 0,005; P < 0,0005 (figura adaptada de Gatti da Silva et al.9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cuadro complementario 1: Valores de Ct bruto observados para qPCR para analizar la expresión de miR-19. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Cuadro complementario 2: Secuencia RAP-IB 3'UTR y secuencia objetivo miR-19. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

El empalme de pre-ARNm es un proceso importante para la regulación de la expresión génica, y su control puede desencadenar fuertes efectos sobre las modificaciones fenotípicas celulares22,23. Más del 70% de los miRNAs se transcriben a partir de intrones en humanos, y planteamos la hipótesis de que su procesamiento y maduración podrían facilitarse mediante el empalme de proteínas reguladoras24,25. Desarrollamos un método para analizar el procesamiento y la función del miARN intrónico en células cultivadas. Nuestro ensayo utiliza cuatro plásmidos diferentes y nos permite probar la maduración de miRNAs endógenos y exógenos o inducidos. El método descrito aquí se puede realizar en 2-3 días y no requiere reactivos costosos.

Teniendo en cuenta que HuR es una proteína de unión al ARN importante para la estabilidad del ARNm y está inmunoprecipitada con miRNAs miR-18 y miR-19a 17, este ensayo probó si podía impulsar la biogénesis y maduración del miRNA intrónico. HuR no se encuentra en el núcleo de los espliceosomas, pero interactúa con proteínas involucradas en la estabilización del ARNm26. Consistentemente, la sobreexpresión de HuR se ha asociado con el desarrollo de cánceres de ovario y vejiga27,28. En las células papilares de cáncer de tiroides, observamos que HuR aumenta la proliferación, migración e invasión celular9. HuR también afecta la estabilidad del ARNm de los reguladores del ciclo celular como PTEN, ciclina A2 y ciclina D2, aumentando la proliferación y migración celular y dando lugar a características tumorigénicas 29,30. Sin embargo, una parte significativa de estos ARNm también tienen secuencias objetivo para miR-19 a y miR-19b. En particular, HuR puede unirse a la región intrónica donde se transcriben estos miARN, lo que lleva a la noción de que puede controlar el empalme y la maduración de estos miARNy, en consecuencia, mejorar las características tumorigénicas.

Para probar eso, este ensayo se desarrolló con cuatro plásmidos diferentes. El primero contiene el grupo de miRNA miR-17-92 insertado dentro de un intrón, y su expresión se controla tras la adición de doxiciclina. El segundo plásmido es el pmiR-GLO comercial que lleva la secuencia diana junto al 3' del gen luc2. La unión del miARN a esta secuencia diana afecta a la expresión de luc2, que se puede medir en un ensayo de luminiscencia. El tercer plásmido es pFLAG-HuR, que induce la sobreexpresión de esta proteína reguladora. Finalmente, pTK-Renilla también se utiliza para incluir la fluorescencia de la Renilla luciferasa. Nuestros resultados indicaron que HuR estimula la expresión de miR-17-92 y aumenta la asociación de sus componentes con las secuencias objetivo, lo que resulta en moléculas de miARN maduras y funcionales. Describimos la asociación de HuR con miRNA en otro artículo9. Las secuencias diana utilizadas en este estudio fueron específicas para miRNAs miR-19 a y miR-19b. Sin embargo, este método también se puede adaptar al uso de secuencias de destino más cortas o más largas, incluidos múltiples sitios de destino. En este caso, la unión inespecífica de miRNAs endógenos a la secuencia objetivo o secuencias cercanas debe considerarse en el análisis. Las secuencias utilizadas podrían tener otros posibles sitios diana, lo que podría afectar la actividad de la luciferasa. El método descrito aquí también podría utilizarse para validar diferentes dianas de un miARN o un grupo de miARN transcritos juntos, permitiendo estudios funcionales de miARN y sus alteraciones fenotípicas específicas. También debe tenerse en cuenta que permite comparar los resultados entre diferentes líneas celulares y antecedentes genéticos.

Los pasos más críticos para el uso más amplio de este protocolo en células de mamíferos son la eficiencia de los pasos de transfección e inducción. Dado que diferentes plásmidos se transfectan en las células, los controles adecuados también son críticos. Estos parámetros cambian con el tamaño de los plásmidos y se ven afectados por el extenso tiempo en cultivo celular. Por lo tanto, un punto importante a considerar antes de comenzar el ensayo es la facilidad de transfección de las células elegidas. Además, el uso extensivo de diferentes antibióticos para seleccionar los diferentes plásmidos (gentamicina, puromicina y doxiciclina) y activar la expresión puede ser perjudicial para las células y reducir la eficiencia de los siguientes experimentos. Es importante que este ensayo se optimice primero con células con eficiencia de transfección conocida.

El reportero demostró con éxito que el aumento de la expresión de HuR podría inducir la biogénesis de miARN y confirmó su maduración funcional. Es importante destacar que la sobreexpresión de HuR no afectó la cantidad de intrón producido ya que no observamos una actividad reducida de la luciferasa en esta condición (Figura 4). Se pueden realizar experimentos adicionales para caracterizar RBP y miRNAs utilizando este sistema informador. Por ejemplo, sería importante crear mutaciones únicas en secuencias de miARN o en sus regiones flanqueantes y analizar el impacto de las proteínas reguladoras en la biogénesis de miARN. Esto permitiría la caracterización específica de la biogénesis de miARN individuales y también podría mejorar el conocimiento sobre secuencias conservadas para el procesamiento y maduración de miARN.

Consideramos que esta es una contribución metodológica importante para el estudio de la biogénesis y maduración de miRNA y el papel de las proteínas reguladoras de empalme en estos procesos. También podría aplicarse a estudios sobre la regulación y el control de ARNm y miARN en diferentes tipos de células.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores agradecen a E. Makeyev (Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur) por las células HeLa-Cre y los plásmidos pRD-RIPE y pCAGGS-Cre. Agradecemos a Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes y Anselmo Moriscot por su apoyo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

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Investigación del cáncer Número 184
Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos
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Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. … More

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

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