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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63498
Automatic Translation
1, 1
1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

Summary

Abbiamo sviluppato un saggio reporter di biogenesi di microRNA intronico da utilizzare in cellule in vitro con quattro plasmidi: uno con miRNA intronico, uno con il bersaglio, uno per sovraesprimere una proteina regolatrice e uno per Renilla luciferasi. Il miRNA è stato elaborato e potrebbe controllare l'espressione della luciferasi legandosi alla sequenza bersaglio.

Abstract

I microRNA (miRNA) sono molecole di RNA corte che sono diffuse negli eucarioti. La maggior parte dei miRNA sono trascritti da introni e la loro maturazione coinvolge diverse proteine leganti l'RNA nel nucleo. I miRNA maturi mediano frequentemente il silenziamento genico, e questo è diventato uno strumento importante per comprendere gli eventi post-trascrizionali. Oltre a ciò, può essere esplorato come una metodologia promettente per le terapie geniche. Tuttavia, attualmente mancano metodi diretti per valutare l'espressione dei miRNA nelle colture cellulari di mammifero. Qui, descriviamo un metodo efficiente e semplice che aiuta a determinare la biogenesi e la maturazione dei miRNA attraverso la conferma della sua interazione con le sequenze bersaglio. Inoltre, questo sistema consente la separazione della maturazione dei miRNA esogeni dalla sua attività endogena utilizzando un promotore inducibile dalla doxiciclina in grado di controllare la trascrizione primaria dei miRNA (pri-miRNA) con alta efficienza e basso costo. Questo strumento consente anche la modulazione con proteine leganti l'RNA in un plasmide separato. Oltre al suo uso con una varietà di miRNA diversi e i loro rispettivi bersagli, può essere adattato a diverse linee cellulari, a condizione che queste siano suscettibili di trasfezione.

Introduction

Lo splicing dell'mRNA precursore è un processo importante per la regolazione dell'espressione genica negli eucarioti1. La rimozione degli introni e l'unione degli esoni nell'RNA maturo è catalizzata dallo spliceosoma, un complesso ribonucleoproteico di 2 megadalton composto da 5 snRNA (U1, U2, U4, U5 e U6) insieme a più di 100 proteine 2,3. La reazione di splicing avviene co-trascrizionalmente e lo spliceosoma viene assemblato ad ogni nuovo introne guidato dal riconoscimento dei siti di giunzione conservati ai confini dell'esone-introne e all'interno dell'introne4. Introni diversi potrebbero avere velocità di splicing diverse nonostante la notevole conservazione del complesso dello spliceosoma e dei suoi componenti. Oltre alle differenze nella conservazione del sito di splicing, le sequenze regolatorie distribuite su introni ed esoni possono guidare le proteine leganti l'RNA (RBP) e stimolare o reprimere lo splicing 5,6. HuR è un RBP espresso ubiquitariamente ed è un fattore importante per controllare la stabilità dell'mRNA7. I risultati precedenti del nostro gruppo hanno mostrato che HuR può legarsi agli introni contenenti miRNA, indicando che questa proteina potrebbe essere un fattore importante per facilitare l'elaborazione e la maturazione dei miRNA, portando anche alla generazione di isoforme di splicing alternative 6,8,9.

Molti microRNA (miRNA) sono codificati da sequenze introniche. Mentre alcuni fanno parte dell'introne, altri sono noti come "mirtron" e sono formati dall'intero introne10,11. I miRNA sono brevi RNA non codificanti, che vanno da 18 a 24 nucleotidi di lunghezza12. La loro sequenza matura mostra una complementarità parziale o totale con le sequenze bersaglio negli mRNA, influenzando quindi i tassi di traduzione e/o di decadimento dell'mRNA. Le combinazioni di miRNA e bersagli guidano la cellula verso risultati diversi. Diversi miRNA possono guidare le cellule verso fenotipi pro- o anti-tumorali13. I miRNA oncogeni di solito prendono di mira gli mRNA che innescano una caratteristica soppressiva, portando ad un aumento della proliferazione cellulare, della migrazione e dell'invasione14. D'altra parte, i miRNA soppressivi del tumore potrebbero colpire mRNA oncogeni o mRNA correlati all'aumento della proliferazione cellulare.

Anche l'elaborazione e la maturazione dei miRNA dipendono dalla loro origine. La maggior parte dei miRNA intronici vengono elaborati con la partecipazione del microprocessore, formato dalla ribonucleasi Drosha e dai cofattori proteici12. I mirtroni vengono elaborati con l'attività dello spliceosoma indipendentemente da Drosha15. Considerando l'alta frequenza di miRNA presenti all'interno degli introni, abbiamo ipotizzato che le proteine leganti l'RNA coinvolte nello splicing potrebbero anche facilitare l'elaborazione e la maturazione di questi miRNA. In particolare, l'hnRNP RBP A2/B1 è già stato associato al microprocessore e alla biogenesi16 del miRNA.

Abbiamo precedentemente riportato che diverse proteine leganti l'RNA, come hnRNPs e HuR, sono associate a miRNA intronici dalla spettrometria di massa17. L'associazione di HuR (ELAVL1) con i miRNA del cluster intronico miR-17-92 è stata confermata utilizzando l'immunoprecipitazione e l'analisi in silico 9. miR-17-92 è un cluster di miRNA intronico composto da sei miRNA con aumentata espressione in diversi tumori18,19. Questo cluster è anche noto come "oncomiR-1" ed è composto da miR-17, miR-18 a, miR-19 a, miR-20, miR-19 b e miR-92 a. miR-19 a e miR-19b sono tra i miRNA più oncogeni di questo cluster 19. L'aumentata espressione di HuR stimola la sintesi di miR-19a e miR-19b 9. Poiché le regioni introniche che fiancheggiano questo cluster sono associate a HuR, abbiamo sviluppato un metodo per indagare se questa proteina potesse regolare l'espressione e la maturazione di miR-19a e miR-19b. Una previsione importante della nostra ipotesi era che, come proteina regolatrice, HuR potrebbe facilitare la biogenesi dei miRNA, portando ad alterazioni fenotipiche. Una possibilità era che i miRNA fossero processati dalla stimolazione di HuR ma non fossero maturi e funzionali e, quindi, gli effetti della proteina non avrebbero avuto un impatto diretto sul fenotipo. Pertanto, abbiamo sviluppato un saggio di splicing reporter per indagare se un RBP come HuR potrebbe influenzare la biogenesi e la maturazione di un miRNA intronico. Confermando l'elaborazione e la maturazione dei miRNA, il nostro test mostra l'interazione con la sequenza target e la generazione di un miRNA maturo e funzionale. Nel nostro test, abbiamo accoppiato l'espressione di un cluster di miRNA intronico con un plasmide di luciferasi per verificare il legame del bersaglio dei miRNA nelle cellule in coltura.

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Protocol

Una panoramica del protocollo qui descritto è illustrata nella Figura 1.

1. Costruzione plasmidica

  1. pCAGGS-Cre: Questo plasmide è stato fornito dal Dr. E. Makeyev21.
  2. pRD-miR-17-92:
    1. Amplificare pre-miR-17-92 mediante PCR utilizzando 0,5 μM di ciascun primer specifico (Table of Materials), 150 ng di cDNA, 1 mM dNTPs, 1x tampone Taq PCR e 5 U di Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà. Eseguire una reazione PCR di controllo senza modello (utilizzare acqua anziché cDNA) per verificare la contaminazione del DNA.
    2. Collegare il prodotto PCR in pRD-RIPE (gentilmente fornito dal Dr. E. Makeyev, Nanyang Technological University, Singapore)21 all'interno dell'introne tra i siti di restrizione EcoRI ed EcoRV usando DNA ligasi, creando pRD-miR-17-92. Confermare l'integrità della sequenza mediante sequenziamento Sanger.
  3. pmiRGLO-RAP-IB
    1. Progettare primer avanti e indietro affiancati da siti di restrizione XhoI / XbaI e con un sito di restrizione NotI all'interno. Mescolare quantità equimolari di primer avanti e indietro e incubare la miscela a 90 °C per 5 minuti, quindi trasferire a 37 °C per 15 minuti. Come controlli, utilizzate primer con sequenze di destinazione codificate (Table of Materials).
    2. Fendere i frammenti ricotti usando enzimi di restrizione XhoI/XbaI e ligarli a valle della sequenza luc2 in pmiR-GLO, generando costrutti reporter pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) e pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled). Confermare la legatura con la scissione NotI.
      NOTA: Assicurarsi che le sporgenze create dopo la ricottura del primer siano complementari al vettore dopo la reazione di scissione.
  4. pFLAG-HuR
    1. Per generare un plasmide che sovraesprime HuR, amplificare la sequenza HuR con primer specifici. Mescolare 300 ng di cDNA, 0,5 μM di ciascun primer specifico, 1 mM di miscela dNTPs, 1x tampone PCR e 5 U di Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà.
    2. Collegare il prodotto PCR in pGEM-T e confermare l'integrità della sequenza di DNA mediante sequenziamento Sanger. Rimuovere il frammento HuR da pGEM-T e subclonarlo nel vettore di espressione dei mammiferi pFLAG-CMV-3 per generare il vettore pFLAG-HuR.

2. Coltura cellulare

NOTA: La linea cellulare HeLa-Cre è stata un dono del Dr. E. Makeyev21, e la cellula di cancro papillare della tiroide (BCPAP) è stata gentilmente fornita dal Dr. Massimo Santoro (Università "Federico II", Napoli, Italia). Le cellule HeLa, le cellule tumorali papillari della tiroide (BCPAP) e HEK-293T sono state utilizzate per sovraesprimere HuR.

  1. Mantenere le cellule in DMEM/alto contenuto di glucosio integrato con siero bovino fetale al 10%, 1 mM di piruvato di sodio, 200 mM di L-glutammina e 1x penicillina-streptomicina (100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina) in piastre di Petri da 100 mm, se non diversamente indicato. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato in atmosfera controllata (5% CO2).
  2. Incubare cellule aderenti con tripsina/EDTA (miscela di soluzione allo 0,5%) a 37 °C per 3-5 minuti. Lasciateli staccare dalla piastra (il periodo di incubazione può variare a seconda del tipo di cellula).
  3. Eseguire le trasfezioni con un reagente di trasfezione a base lipidica seguendo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che le colture cellulari siano circa il 70% confluenti. Utilizzare quantità simili di DNA per tutte le combinazioni di trasfezione, come descritto di seguito, aggiungendo i DNA appropriati. Eseguire esperimenti di trasfezione in repliche.
    1. Mescolare 200 ng di DNA e 1,25 μL di reagente di trasfezione in 100 μL del terreno di coltura. Aggiungere la miscela di trasfezione alle celle. Incubare le cellule con le miscele di trasfezione per 4 h a 37 °C. Quindi, sostituire il mezzo con terreno contenente il 10% di FBS e incubare per altre 24 ore prima di aggiungere gli antibiotici per la selezione.

3. Sovraespressione di HuR

  1. Transfettare pFLAG-HuR e svuotare pFLAG in HeLa. Selezionare le cellule aumentando la concentrazione di geneticina (G418) (1 μg/mL) da 100 μg/mL a 1000 μg/mL, generando linee cellulari stabili.
  2. Confermare la sovraespressione con PCR quantitativa utilizzando primer specifici per l'mRNA HuR, come descritto nella fase 7.

4. Isolamento totale dell'RNA

  1. Utilizzare celle appena raccolte. Tripsinizzare colture cellulari confluenti al 70% (per questo test sono state utilizzate cellule HeLa-Cre), come descritto al punto 2.2.
  2. Raccogliere il pellet cellulare mediante centrifugazione per 5 minuti a 500 x g a 4 °C e lavarlo con 1x PBS (soluzione salina tamponata fosfato); Ripetere la centrifugazione.
  3. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di 1x PBS e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
  4. Centrifugare per 5 min a 500 x g a 4 °C.
  5. Pesare il pellet a secco e regolare di conseguenza i volumi e le dimensioni dei tubi. 1 mg di cellule produce circa 1 μg di RNA totale.
  6. In una cappa, aggiungere 500-1.000 μL di fenolo/cloroformio al pellet cellulare (idealmente 750 μL per 0,25 g di cellule) e omogeneizzarlo mediante pipettaggio su e giù e mescolando con il vortice.
  7. Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente (da 20 °C a 25 °C) per consentire la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici.
  8. Centrifugare il campione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
  9. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e aggiungere 200 μL di cloroformio per 1 mL di fenolo:cloroformio utilizzato. Tappare saldamente le provette del campione.
  10. Mescolare vigorosamente per 15 s (a mano o brevemente vortexing a velocità inferiore) e incubare a temperatura ambiente (da 20 °C a 25 °C) per 2 minuti a 3 minuti.
  11. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
  12. Verificare la presenza di una fase fenolo-cloroformio rosso inferiore, una fase intermedia e una fase acquosa superiore incolore. L'RNA rimane nella fase acquosa superiore. In una cappa, raccogliere la fase acquosa, evitando di contattare la fase intermedia, e trasferire in un tubo fresco.
  13. Precipitare l'RNA mescolando la fase acquosa con 400 μL di isopropanolo di grado molecolare (rapporto 1:1 con fenolo/cloroformio utilizzato) e 2 μL di glicogeno in ogni tubo (aiuterà a visualizzare la presenza del pellet).
  14. Mescolare energicamente a mano o omogeneizzare con la punta per ~10 s. Incubare per 15 minuti o per una notte a -20 °C.
  15. Centrifugare il campione a 12.000 x g per 20 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
  16. Lavare il pellet di RNA aggiungendo 3 volumi di etanolo al 100% (circa 1 ml, diluito con acqua DEPC) e mescolare il campione per vortice fino a quando il pellet viene rilasciato e galleggia dal fondo.
  17. Centrifugare a 7.500 x g per 5 minuti a 4 °C.
  18. Lavare il pellet di RNA 1x aggiungendo 1 ml di etanolo al 75% e mescolare il campione a vortice fino a quando il pellet viene rilasciato e galleggia dal fondo. Ripetere la centrifugazione come descritto al punto 4.17.
  19. Eseguire un'ulteriore centrifugazione di 5 s per raccogliere il liquido residuo dal lato del tubo e rimuovere qualsiasi liquido residuo con una pipetta senza disturbare il pellet.
  20. Asciugare brevemente all'aria il pellet di RNA aprendo il tappo del tubo a temperatura ambiente per 3-5 minuti e sciogliere il pellet di RNA in 20-50 μL di acqua trattata con DEPC priva di RNasi. Incubare l'RNA per 10 minuti a 55-60 °C per facilitare la risospensione del pellet.

5. Determinazione della concentrazione totale e della qualità dell'RNA

  1. Determinare la concentrazione di RNA misurando l'assorbanza a 260 nm e 280 nm utilizzando uno spettrofotometro. Ottenere dati spettrali completi prima di utilizzare i campioni nelle applicazioni a valle.
  2. Controllare la qualità dell'RNA risolvendo 800-1000 ng su un gel di agarosio all'1,5% utilizzando tampone TBE 0,5X (45 mM Tris base, 45 mM acido borico, 1 mM EDTA). L'RNA totale si separa in due bande che si riferiscono agli rRNA 28S e 18S.
    1. Produrre tutti i reagenti e lavare tutte le attrezzature utilizzate per far funzionare il gel con acqua trattata con DEPC. L'acqua trattata con DEPC viene preparata nella cappa aggiungendo 1 ml di dietilpirocarbonato a 1000 ml di acqua ultrapura. Incubare per ~2 h a temperatura ambiente o a 37 °C e in autoclave. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 10 mesi.
      NOTA: L'elettroforesi degli RNA totali dei mammiferi porta alla separazione degli rRNA 28S e 18S con un rapporto di circa 2:1. Le bande devono essere intatte e visibili come due bande taglienti. L'RNA degradato si tradurrà in bande sfocate.

6. Trascrizione inversa

  1. Impostare la reazione di trascrizione inversa utilizzando 1 μg di RNA totale.
  2. Eseguire la trascrizione inversa (RT) utilizzando l'enzima trascrittasi inversa (vedi Tabella dei materiali) e primer decamer casuali da 50 ng/μL.
    1. Mescolare RNA, primer casuali e 1 mM dNTP mix (10 mM) in 10 μL. Incubare a 65 °C per 5 minuti e su ghiaccio per 1 min. Aggiungere i seguenti reagenti: 1x tampone RT, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U di inibitore della RNasi e 200 U di trascrittasi inversa.
    2. Incubare per 10 minuti a 25 °C e per 1 ora a 50 °C (le temperature possono variare se vengono utilizzati enzimi diversi). Terminare la reazione incubando a 85 °C per 5 min. I cDNA possono essere conservati a -20 °C.

7. PCR quantitativa

  1. Per assemblare la reazione in un volume finale di 15 μL, mescolare 3 μL di cDNA (100 ng/μL), 3,2 pmol di ciascun primer, 6 μL di master mix contenente i dNTP e l'enzima e 2,8 μL di acqua ultrapura.
    NOTA: Utilizzare primer per geni costitutivi endogeni come controlli (geni housekeeping) per normalizzare i livelli di espressione di mRNA e miRNA HuR. β-actina e snRNA U6 (RNU6B) sono opzioni disponibili per la normalizzazione di mRNA e miRNA, rispettivamente, ma anche altri geni potrebbero essere adatti a seconda dei casi.
  2. Quantificare i livelli di espressione utilizzando il metodo delta-delta Ct (2-ΔΔCt)20.

8. Il saggio del reporter

  1. Cellule utilizzate per il test
    1. Trasfettare i plasmidi nelle cellule HeLa-Cre come segue. Transfettare con pTK-Renilla (40 ng), quindi pRD-miR-17-92, generando HeLa-Cre-miR-17-92 e selezionando con 1 μg/mL di puromicina.
    2. Transfettare HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla con pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR o pmiRGLO-strapazzato-3ʹ-UTR, separatamente. Selezionare utilizzando penicillina (100 U / ml) e streptomicina (100 μg / ml). Queste trasfezioni generano Luc-RAP-1-B e Luc-scrambled.
    3. Trasfettare le celle con pFLAG-HuR o pFLAG vuoto (passo 3).
    4. Procedere alla coltura cellulare, come descritto al punto 2.2., con HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-strapazzato, HeLa-Cre miR-17-92-HuR e HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc fino a circa l'80% della confluenza. Indurre con 1 μL di doxiciclina (1 μg/ml) per 30 minuti a 37 °C. Inoltre, mantenere tutte le cellule senza doxiciclina come controlli, per lo stesso periodo.
      NOTA: La concentrazione finale di doxiciclina dipende dalla linea cellulare scelta. Un eccesso di doxiciclina può essere tossico per le cellule di mammifero.
  2. Saggio luminescente
    1. Per quantificare e confrontare diverse intensità di luminescenza, utilizzare il kit di analisi del reporter Dual-luciferasi. Scongelare le soluzioni di analisi della luciferasi e lasciarle a temperatura ambiente prima di iniziare il test.
    2. Preparare la miscela Stop e Glo (tubi con cappuccio blu) miscelando 200 μL del substrato in 10 ml di Luciferase Assay Buffer II. Preparare la miscela LAR II (tubi con cappuccio verde) mescolando 10 mL di Luciferase Assay Buffer II nel flaconcino ambrato di Luciferase Assay Substrate II e agitare bene.
    3. Trasferire le soluzioni in provette da centrifuga da 15 mL precedentemente identificate e protette dalla luce.
      NOTA: In alternativa, le soluzioni possono essere preventivamente preparate in aliquote da 1-2 ml e congelate a -80 °C al riparo dalla luce in un foglio di alluminio.
    4. Eseguire le letture della luminescenza utilizzando un'apparecchiatura come Synergy; misurare la luciferasi espressa come unità di luce relativa (RLU).
    5. Esporta i risultati in un foglio di calcolo per ulteriori analisi statistiche.
    6. Eseguire la normalizzazione dell'attività della lucciola-luciferasi da parte del controllo Renilla (luciferasi / Renilla) e tracciarla come unità di luce relativa (RLU) in un grafico. Ripetere questa operazione per i gruppi con e senza induzione della doxiciclina.
    7. Calcolare la media e l'errore standard della media (SEM). Esegui un t-test di Student o ANOVA bidirezionale seguito dal post-test di Tukey per consentire il confronto di gruppo. Queste analisi sono disponibili in un pacchetto come GraphPad Prism. Le differenze a valori p < 0,05 sono considerate significative.

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Representative Results

La nostra ipotesi iniziale era che HuR potesse facilitare la biogenesi dei miRNA intronici legandosi alla sua sequenza pre-miRNA. Pertanto, la connessione tra l'espressione di HuR e la biogenesi del cluster miR-17-92 potrebbe indicare un nuovo meccanismo che governa la maturazione di questi miRNA. La sovraespressione di HuR dopo trasfezione di pFLAG-HuR è stata confermata in tre diverse linee cellulari: HeLa, BCPAP e HEK-293T (Figura 2). Come controlli, sono state utilizzate cellule non trasfettate e cellule trasfettate con vettori pFLAG vuoti. È importante sottolineare che abbiamo osservato che la sovraespressione di HuR in queste cellule stimola l'espressione di miR-19a (Risultati della Tabella supplementare 1 riportati in Gatti da Silva et al.9).

Per confermare che i miRNA indotti erano realmente funzionali, è stato progettato un sistema di reporter in vitro , come descritto qui. L'introne artificiale in pRD-RIPE separa due regioni codificanti di eGFP. Questa cassetta è sotto il controllo di un elemento sensibile alla tetraciclina (TRE). L'espressione di eGFP è, quindi, controllata dalla presenza dell'antibiotico doxiciclina (DOX) nel mezzo cellulare (Figura 3).

Una ricerca in silico utilizzando miRbase e TargetScan ha rivelato possibili bersagli di mRNA per miR-19 a e miR-19 b (componenti del cluster miR-17-92). Come potenziale bersaglio per entrambi i miRNA, è stata scelta la sequenza 5' TTTGCACA 3', trovata nella regione UTR di RAP-IB 3' (Tabella supplementare 2). RAP-IB è un membro GTPasi della famiglia di proteine associate a Ras (RAS). I miRNA indotti sono stati correttamente elaborati e funzionali nel nostro test in quanto ibridati alla sequenza bersaglio clonata accanto alla luciferasi (vedi Figura 3, bersaglio pmiR-GLO). Pertanto, ha bloccato la traduzione della luciferasi, che si rifletteva in una ridotta attività della luciferasi (Figura 3). Come controllo per questo test, abbiamo codificato la sequenza target, sostituendola con 5' GGGTAAA 3' nel plasmide strapazzato di Luc (le sequenze target e scrambled sono sottolineate nelle sequenze oligos nella tabella dei materiali).

In condizioni regolari e senza induzione del plasmide pRD-miR-17-92, miR-19a e/o miR-19b endogeni hanno trovato il bersaglio su pmiR-GLO, che ha portato a una ridotta attività della luciferasi (dati non mostrati). Dopo la supplementazione di DOX, è stata osservata una riduzione lieve e non statisticamente significativa dell'attività della luciferasi nelle cellule con una sequenza target criptata. Ciò potrebbe essere dovuto alla presenza di sequenze bersaglio per altri miRNA in questa sequenza. Una forte riduzione dell'attività della luciferasi è stata osservata con RAP-IB 3'UTR dopo un aumento dell'espressione di miR-19 a e miR-19 b da pRD-miR-17-92rispetto alle cellule HeLa-Cre(vedere Figura 4, confrontare barre arancioni e nere). La trasfezione di pFLAG-HuR in queste cellule di per sé non ha modificato l'attività della luciferasi (vedere Figura 4, confrontare le barre grigie e nere). Tuttavia, la sovraespressione di HuR accoppiata con l'integrazione di doxiciclina, stimolando l'espressione del cluster miR-17-92, ha ulteriormente ridotto l'attività della luciferasi (vedere Figura 4, confrontare le barre grigie e rosse). Ciò indica una regolazione positiva di HuR su miR-19 a e miR-19 b, unita alla corretta elaborazione e maturazione di questi miRNA, che sono stati in grado di trovare con successo i loro bersagli (HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc) (vedi Figura 4).

L'uso di questo sistema reporter ha confermato che HuR induce l'espressione e la corretta maturazione di miR-19 a e miR-19b nelle cellule HeLa.

Figure 1
Figura 1: Una panoramica concettuale del protocollo qui descritto. I plasmidi contenenti il miRNA, la sequenza bersaglio, la proteina regolatrice e pTK-Renilla sono stati trasfettati in cellule in coltura. Dopo la selezione antibiotica, queste cellule sono state utilizzate per indurre l'espressione di miRNA (con doxiciclina), con successiva quantificazione dell'attività della luciferasi e per l'analisi dell'RNA per confermare la sovraespressione di HuR. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Conferma della sovraespressione di FLAG-HuR nelle cellule (A) HeLa, (B) BCPAP e (C) HEK293T mediante qPCR. La trasfezione con pFLAG vuoto è stata utilizzata come controllo (barre bianche). β-actina è stata utilizzata per normalizzare i valori Ct. L'asse y rappresenta il cambiamento di espressione della piega calcolato dopo la normalizzazione. Le barre di errore rappresentano errori standard calcolati da tre misurazioni indipendenti. **P <0.005, ****P < 0.0005 (cifra adattata da Gatti da Silva et al.9). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Sistema reporter miRNA Intronic. (A) Rappresentazione schematica del plasmide pRD-RIPE che ha generato pRD-miR-17-92. pre-miR-17-92 era inserito all'interno dell'introne ed era sotto il controllo di un promotore inducibile da dox; a destra, il plasmide pmiR-GLO con sequenza target RAP-IB 3'UTR (pmiRGLO-RAP-IB); il controllo aveva la sequenza di destinazione criptata (pmiRGLO-scrambled). (B) Dettaglio sulla sequenza di pmiRGLO-RAP-IB, concentrandosi sulla sequenza bersaglio complementare a miR-19 a e miR-19b. L'attività della luciferasi è ridotta dall'interazione del miRNA e del bersaglio (figura adattata da Gatti da Silva et al.9). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Le cellule HeLa-Cre sono state co-trasfettate con plasmidi reporter pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-scrambled, pRD-miR-17-92 e pFLAG-HuR. Attività della luciferasi su cellule HeLa-Cre non trasfettate (nero), HeLa-Cre miR-17-92-strapazzate (bianco), HeLa-Cre-HuR (grigio), HeLa-Cre miR-17-92-luc (arancione) e HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (rosso). L'attività della luciferasi è stata quantificata come descritto nel protocollo come attività relativa della luciferasi della lucciola alla renilla luciferasi (osservata con pTK-Renilla) e normalizzata dopo l'aggiunta di doxiciclina. Viene mostrato come "unità di luce relativa" (RLU) sull'asse y. **P < 0,005; P < 0,0005 (cifra adattata da Gatti da Silva et al.9). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella supplementare 1: Valori di Ct grezzi osservati per qPCR per analizzare l'espressione di miR-19. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 2: Sequenza RAP-IB 3'UTR e sequenza bersaglio miR-19. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Lo splicing pre-mRNA è un processo importante per la regolazione dell'espressione genica e il suo controllo può innescare forti effetti sulle modificazioni fenotipiche cellulari22,23. Più del 70% dei miRNA sono trascritti da introni nell'uomo, e abbiamo ipotizzato che la loro elaborazione e maturazione potrebbe essere facilitata dallo splicing delle proteine regolatrici24,25. Abbiamo sviluppato un metodo per analizzare l'elaborazione e la funzione dei miRNA intronici in cellule in coltura. Il nostro test utilizza quattro diversi plasmidi e ci permette di testare la maturazione di miRNA endogeni ed esogeni o indotti. Il metodo qui descritto può essere eseguito in 2-3 giorni e non richiede costosi reagenti.

Considerando che HuR è una proteina legante l'RNA importante per la stabilità dell'mRNA ed è immunoprecipitata con miRNA miR-18 e miR-19a 17, questo test ha testato se potesse guidare la biogenesi e la maturazione dei miRNA intronici. HuR non si trova nel nucleo degli spliceosomi ma interagisce con le proteine coinvolte nella stabilizzazione dell'mRNA26. Coerentemente, la sovraespressione di HuR è stata associata allo sviluppo di tumori dell'ovaio e della vescica27,28. Nelle cellule tumorali papillari della tiroide, abbiamo osservato che HuR aumenta la proliferazione, la migrazione e l'invasione cellulare9. HuR influenza anche la stabilità dell'mRNA dei regolatori del ciclo cellulare come PTEN, ciclina A2 e ciclina D2, aumentando la proliferazione e la migrazione cellulare e portando a caratteristiche tumorigeniche29,30. Tuttavia, una parte significativa di questi mRNA ha anche sequenze bersaglio per miR-19 a e miR-19b. In particolare, HuR può legarsi alla regione intronica in cui questi miRNA sono trascritti, portando alla nozione che può controllare lo splicing e la maturazione di questi miRNAe, di conseguenza, migliorare le caratteristiche tumorigeniche.

Per verificarlo, questo test è stato sviluppato con quattro diversi plasmidi. Il primo contiene il cluster di miRNA miR-17-92 inserito all'interno di un introne e la sua espressione è controllata dall'aggiunta di doxiciclina. Il secondo plasmide è il pmiR-GLO commerciale che porta la sequenza bersaglio accanto al 3' del gene luc2. Il legame del miRNA a questa sequenza bersaglio influenza l'espressione di luc2, che può essere misurata su un saggio di luminescenza. Il terzo plasmide è pFLAG-HuR, che induce la sovraespressione di questa proteina regolatrice. Infine, pTK-Renilla è anche usato per includere la fluorescenza della Renilla luciferasi. I nostri risultati hanno indicato che HuR stimola l'espressione di miR-17-92 e aumenta l'associazione dei suoi componenti con le sequenze bersaglio, risultando quindi in molecole di miRNA mature e funzionali. Descriviamo l'associazione di HuR con miRNA in un altro articolo9. Le sequenze bersaglio utilizzate in questo studio erano specifiche per i miRNAmiR-19 a e miR-19b. Tuttavia, questo metodo può anche essere adattato all'uso di sequenze target più brevi o più lunghe, inclusi più siti target. In questo caso, nell'analisi deve essere considerato il legame aspecifico dei miRNA endogeni alla sequenza bersaglio o alle sequenze vicine alle sequenze vicine. Le sequenze utilizzate potrebbero avere altri possibili siti bersaglio, che potrebbero influenzare l'attività della luciferasi. Il metodo qui descritto potrebbe anche essere utilizzato per validare diversi bersagli di un miRNA o di un gruppo di miRNA trascritti insieme, consentendo studi funzionali dei miRNA e delle loro specifiche alterazioni fenotipiche. Va anche notato che consente di confrontare i risultati tra diverse linee cellulari e background genetici.

I passi più critici per l'uso più ampio di questo protocollo nelle cellule di mammifero sono l'efficienza delle fasi di trasfezione e induzione. Poiché diversi plasmidi vengono trasfettati nelle cellule, anche controlli adeguati sono fondamentali. Questi parametri cambiano con le dimensioni dei plasmidi e sono influenzati dal lungo tempo di coltura cellulare. Pertanto, un punto importante da considerare prima di iniziare il test è la facilità di trasfezione delle cellule scelte. Inoltre, l'uso estensivo di diversi antibiotici per selezionare i diversi plasmidi (gentamicina, puromicina e doxiciclina) e attivare l'espressione può essere dannoso per le cellule e ridurre l'efficienza dei seguenti esperimenti. È importante che questo test sia prima ottimizzato con cellule con efficienza di trasfezione nota.

Il reporter ha dimostrato con successo che una maggiore espressione di HuR potrebbe indurre la biogenesi dei miRNA e ha confermato la sua maturazione funzionale. È importante sottolineare che la sovraespressione di HuR non ha influenzato la quantità di introne prodotto poiché non abbiamo osservato una ridotta attività della luciferasi in questa condizione (Figura 4). Ulteriori esperimenti possono essere eseguiti per caratterizzare RBP e miRNA utilizzando questo sistema di reporter. Ad esempio, sarebbe importante creare singole mutazioni nelle sequenze di miRNA o nelle loro regioni fiancheggianti e analizzare l'impatto delle proteine regolatrici nella biogenesi dei miRNA. Ciò consentirebbe la caratterizzazione specifica della biogenesi dei singoli miRNA e potrebbe anche migliorare le conoscenze sulle sequenze conservate per l'elaborazione e la maturazione dei miRNA.

Riteniamo che questo sia un importante contributo metodologico verso lo studio della biogenesi e della maturazione dei miRNA e il ruolo delle proteine regolatrici dello splicing in questi processi. Potrebbe anche essere applicato a studi sulla regolazione e il controllo di mRNA e miRNA in diversi tipi di cellule.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Gli autori sono grati a E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) per le cellule HeLa-Cre e i plasmidi pRD-RIPE e pCAGGS-Cre. Ringraziamo Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes e Anselmo Moriscot per il loro supporto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

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References

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Ricerca sul cancro numero 184
Un saggio reporter per analizzare la maturazione dei microRNA intronici in cellule di mammifero
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Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

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