Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

نموذج القوارض الناجم عن TNBS لدراسة الدور الممرض للإجهاد الميكانيكي في مرض كرون

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

يصف البروتوكول الحالي تطوير نموذج التهاب القولون الشبيه بكرون في القوارض. يؤدي الالتهاب عبر الجدارية إلى تضيق في موقع تقطير TNBS ، ويلاحظ تضخم ميكانيكي في الجزء القريب من التضيق. تسمح هذه التغييرات بدراسة الإجهاد الميكانيكي في التهاب القولون.

Abstract

أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) مثل مرض كرون (CD) هي اضطرابات التهابية مزمنة في الجهاز الهضمي تؤثر على ما يقرب من 20 لكل 1,00,000 في أوروبا والولايات المتحدة الأمريكية. يتميز CD بالالتهاب عبر الجدارية والتليف المعوي وتضيق اللمعان. على الرغم من أن العلاجات المضادة للالتهابات قد تساعد في السيطرة على الالتهاب ، إلا أنها لا تحتوي على أي فعالية على التليف والتضيق في CD. التسبب في CD ليست مفهومة جيدا. تركز الدراسات الحالية بشكل أساسي على تحديد آليات الاستجابة المناعية للأمعاء غير المنظمة. في حين أن الالتهاب عبر الجدارية المرتبط ب CD والتليف المعوي والتضيق المضيء كلها تمثل إجهادا ميكانيكيا لجدار الأمعاء ، فإن دور الإجهاد الميكانيكي في CD غير محدد جيدا. لتحديد ما إذا كان الإجهاد الميكانيكي يلعب دورا إمراضيا مستقلا في CD ، تم تطوير بروتوكول لنموذج التهاب القولون الشبيه بالقرص المضغوط الناجم عن TNBS في القوارض. يشبه هذا الالتهاب والتليف عبر الجدارية الناجم عن TNBS السمات المميزة المرضية ل CD في القولون. يتم تحريضه عن طريق التقطير داخل القولون من TNBS في القولون البعيد من الفئران Sprague-Dawley البالغة. في هذا النموذج ، يؤدي الالتهاب عبر الجدارية إلى تضيق في موقع تقطير TNBS (الموقع الأول). لوحظ انتفاخ ميكانيكي في الجزء القريب من موقع التقطير (الموقع P) ، مما يمثل الإجهاد الميكانيكي ولكن الالتهاب غير المرئي. الجزء القولوني البعيد عن الالتهاب (الموقع D) لا يمثل التهابا ولا إجهادا ميكانيكيا. لوحظت تغيرات مميزة في التعبير الجيني والاستجابة المناعية والتليف ونمو العضلات الملساء في مواقع مختلفة (P و I و D) ، مما يسلط الضوء على التأثير العميق للإجهاد الميكانيكي. لذلك ، سيساعدنا هذا النموذج من التهاب القولون الشبيه ب CD على فهم آليات CD المسببة للأمراض بشكل أفضل ، وخاصة دور الإجهاد الميكانيكي والتعبير الجيني الناجم عن الإجهاد الميكانيكي في خلل التنظيم المناعي والتليف المعوي وإعادة تشكيل الأنسجة في CD.

Introduction

يتميز مرض التهاب الأمعاء (IBD) ، بما في ذلك التهاب القولون التقرحي (UC) ومرض كرون (CD) ، بالتهاب مزمن في الجهاز الهضمي (GI). يؤثر على ~ 1-2 مليون أمريكي1. تبلغ التكاليف السنوية المقدرة لرعاية مرض الأمعاء الالتهابي في الولايات المتحدة 11.8 مليار دولار. على عكس UC ، يتميز القرص المضغوط بالتهاب عبر الجدارية وتشكيل تضيق 2,3. يحدث تكوين التضيق (التضيق) في ما يصل إلى 70٪ من مرضى CD3 وقد يكون سببه التهاب عبر الجدارية (تضيق التهابي) أو تليف معوي (تضيق ليفي)4,5. يتميز التليف المعوي بترسب الكولاجين المفرط والمصفوفات الأخرى خارج الخلية (ECM) مع خلايا العضلات الملساء (SMC) كأحد أنواع الخلايا الوسيطة الرئيسية المشاركة في العملية 3,4. تضخم العضلات الملساء المرتبط بالتضخم هو تغيير نسيجي كبير آخر في تضيق التضيق الليفي في CD6. على الرغم من أن تكوين التضيق في CD يرتبط بالالتهاب المزمن ، إلا أنه لا يوجد علاج مضاد للالتهابات فعال ، باستثناء العلاج الجراحي 2,6. ومع ذلك ، فإن تكرار ما بعد الجراحة هو ما يقرب من 100 ٪ ، مع إعطاء الوقت الكافي 2,7. كاستجابة التهابية ، قد يتطور التليف وتضخم SMC أيضا في الحالات غير الالتهابية (أي انسداد الأمعاء) في الأمعاء 8,9 ؛ ويعتقد أن كلا من الآليات المعتمدة على الالتهاب والمستقلة تشارك في تشكيل تضيق 3,4. بالنظر إلى أن الأبحاث المكثفة في الآليات المعتمدة على الالتهاب لم تترجم إلى أي علاج فعال لتشكيل التضيق ، هناك حاجة إلى دراسات حول الدور المحتمل للآليات المستقلة عن الالتهاب في التليف المعوي.

كعامل غير التهابي ، عادة ما يصادف الإجهاد الميكانيكي (MS) المرتبط بالوذمة ، وتسلل الخلايا الالتهابية ، وتشوه الأنسجة ، والتليف ، والتضيق 10،11،12،13 في IBD ، وخاصة CD ، الذي يتميز بالالتهاب عبر الجدارية. الإجهاد الميكانيكي هو الأكثر بروزا في CD stenotic ، حيث يمثل التضيق (التهابي أو الليفي) في موقع الالتهاب إجهادا ميكانيكيا في الأنسجة المحلية ويؤدي إلى انتفاخ التجويف في الجزء القريب من موقع الانسداد10,14. وقد أظهرت الدراسات السابقة في المختبر أن الإجهاد الميكانيكي يغير التعبير الجيني لوسطاء التهابيين محددين (أي COX-2 ، IL-6) 8،14،15 وعوامل النمو (أي TGF-β) في أنسجة الجهاز الهضمي ، وخاصة خلايا العضلات الملساء المعوية (SMC) 16. وجدت الدراسات الحديثة أيضا أن التعبير عن وسطاء محددين مؤيدين للتليف مثل عامل نمو النسيج الضام (CTGF) حساس للغاية للإجهاد الميكانيكي17,18. كان من المفترض أن الإجهاد الميكانيكي قد يلعب دورا مسببا مستقلا للأمراض في الالتهاب المرتبط بالقرص المضغوط والتليف وإعادة تشكيل الأنسجة. ومع ذلك ، فإن الأهمية المسببة للأمراض للإجهاد الميكانيكي في التهاب الأمعاء والتليف وتضخم العضلات الملساء في CD لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير. قد يكون هذا جزئيا لأن الالتهاب هو عملية أكثر وضوحا وأفضل دراسة من الإجهاد الميكانيكي. الأهم من ذلك ، لم يكن هناك نموذج حيواني محدد جيدا ل IBD للتمييز بين تأثير الإجهاد الميكانيكي وتأثير الالتهاب.

يصف العمل الحالي نموذجا للقوارض لالتهاب القولون الشبيه بكرون الناجم عن الحقن داخل القولون لكاشف هابتن 2,4,6-ثلاثي نيتروبنزين حمض السلفونيك (TNBS)19,20 ، والذي قد يخدم الغرض من دراسة دور الإجهاد الميكانيكي في CD. وقد وجد أن تقطير TNBS تسبب في التهاب موضعي (~ 2 سم في الطول) عبر الجدارية مع تضييق التجويف (تضيق) في القولون البعيد. يؤدي التضيق إلى انتفاخ الأمعاء الملحوظ (الإجهاد الميكانيكي) 14,15 ولكن لا يوجد التهاب مرئي في الجزء الذكري القريب من موقع التقطير. على العكس من ذلك ، فإن جزء القولون البعيد إلى موقع التضيق لا يمثل التهابا أو إجهادا ميكانيكيا. لوحظت تغيرات كبيرة خاصة بالموقع في التعبير الجيني والالتهاب والتليف وتضخم SMC في المواقع الثلاثة المختلفة. وتشير النتائج إلى أن الإجهاد الميكانيكي، وخاصة التعبير الجيني الناجم عن الإجهاد الميكانيكي، قد يلعب دورا حاسما في تطوير التليف وتضخم التنسج في التهاب القولون كرون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للفرع الطبي لجامعة تكساس (#0907051C). تم استخدام ذكور أو إناث فئران Sprague-Dawley ، التي يبلغ عمرها حوالي 8-9 أسابيع ، للدراسة.

1. إعداد الحيوان

  1. الفئران السريعة لمدة 24 ساعة ومعالجتها مع ملين (منظف الأمعاء، انظر جدول المواد) بين عشية وضحاها.
  2. في اليوم التالي ، تخدير الفئران باستخدام نظام التخدير (انظر جدول المواد) عن طريق تعريضها ل 2٪ من الإيسوفلوران جنبا إلى جنب مع 1 لتر / دقيقة من الأكسجين أثناء إعطاء TNBS. تحقق من وجود ردود فعل أو قرصة أصابع القدم لتأكيد التخدير.
  3. تحضير محلول TNBS الطازج وفقا لأوزان الجسم.
    ملاحظة: TNBS - تم استخدام 65 ملغم / كغم من وزن الجسم في 250 ميكرولتر من الإيثانول 40 ٪.
  4. ضع الفئران في وضع ضعيف على طاولة التخدير. للحث على التهاب القولون ، أدخل من خلال فتحة الشرج قسطرة بولي يوريثين مفتوحة النهاية من الدرجة الطبية لمدة ~ 7-8 سم من حافة الشرج وغرس بلطف TNBS (أعدت في الخطوة 1.3) في القولون19. إدارة الفئران السيطرة الوهمية مع 250 ميكرولتر من المياه المالحة فقط.
  5. بعد غرس TNBS أو المالحة ، احتفظ بالفئران في وضع ضعيف ورأسا لأسفل قليلا (~ 30 درجة) ، مع إغلاق فتحة الشرج لمدة 2 دقيقة للمساعدة في توزيع TNBS وتجنب الانسكابات.
  6. تزويد الفئران بالطعام والماء لمدة 7 أيام ومراقبة الفئران يوميا لوزن الجسم وامتصاص الطعام والبراز والحالة الصحية العامة.

2. مستحضرات الأنسجة

  1. في يوم القتل الرحيم ، القتل الرحيم للفئران باستخدام استنشاق CO2 وتأكيد القتل الرحيم مع خلع عنق الرحم.
  2. افتح بطن الفئران باستخدام مقص وملقط جراحي.
  3. قم بإزالة القولون بالكامل بعناية (فوق القناة الشرجية) وانقل القولون على الفور إلى المخزن المؤقت 1x HBSS البارد على الجليد.
  4. قم بتصويب القولون في المخزن المؤقت وقياس طول القولون باستخدام مسطرة. خذ خيط النايلون ودائرة حول القولون لقياس المحيط الخارجي لأجزاء القولون في السيطرة والفئران المعالجة ب TNBS. خذ أنسجة كاملة السماكة لعلم الأنسجة.
  5. اقطع القولون على طول لوح المساريق ونظف القولون جيدا باستخدام المخزن المؤقت HBSS. تقييم القولون للحصول على درجة الالتهاب العياني بناء على المعايير كما هو موضح سابقا19 مع الحد الأدنى من التعديلات.
    ملاحظة: 0 = الغشاء المخاطي الطبيعي; 1 = احتقان الدم الموضعي ولكن لا تآكل أو قرحة; 2 = القرحة والتضيق (المنطقة المصابة < 5 مم) ؛ 3 = قرحة شديدة وندبة وتضيق (المنطقة المصابة > 5 مم).
  6. جمع عينات أنسجة القولون من الموقع P (الجزء 2-3 سم قبل الهامش الفموي لموقع الالتهاب) ، والموقع الأول (موقع الالتهاب ، عادة 4-6 سم من نهاية القولون ، حيث يتم غرس TNBS إلى) ، والموقع D (الجزء 1-2 سم بعيد إلى الهامش الفموي لموقع الالتهاب) ، على التوالي من الفئران المعالجة ب TNBS.
    ملاحظة: تم أخذ أنسجة القولون التي يبلغ طولها ~ 1-2 سم من كل جزء. بالإضافة إلى ذلك ، تم أخذ أنسجة القولون التي يبلغ طولها 2 سم (~ 4-6 سم من نهاية القولون) للفئران المعالجة بالمحلول الملحي كعنصر تحكم زائف (S) (الشكل 1).
  7. خذ عينات الأنسجة من كل موقع لإعداد كامل السماكة ، وإذا رغبت في ذلك ، الغشاء المخاطي / تحت المخاطية وطبقات العضلات الخارجية ، على التوالي ، وكذلك21،22.
  8. قم بتجميد عينات الأنسجة في النيتروجين السائل أولا قبل تخزينها عند -80 درجة مئوية للتخزين لمدة تصل إلى عام واحد ولأغراض مستقبلية (أي مستحضرات الحمض النووي الريبي).

3. التقييم النسيجي المرضي لالتهاب الأمعاء والتليف

  1. إصلاح أنسجة القولون كاملة السماكة في 10 ٪ من الفورمالين لمدة 48 ساعة ، ثم نقلها إلى 70 ٪ من الإيثانول لمدة 24-48 ساعة.
  2. استخدم ميكروتوم لقطع أقسام البارافين بسماكة 5 ميكرومتر للهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) وبقع تريكروم من ماسون6،19،23 (انظر جدول المواد) ، على التوالي.
  3. احصل على الصور وعرضها باستخدام مجهر مستقيم مزود بكاميرا عالية الدقة مزودة ببرامج متوافقة (انظر جدول المواد).
  4. مؤشرات التهاب الصف والتليف من قبل اثنين من الباحثين المستقلين ، بما في ذلك أخصائي علم الأمراض الجراحي المعدي المعوي وفقا للمعايير الموضحة سابقا 6,23 مع التعديلات. انظر الملف التكميلي 1 للاطلاع على الدرجات.
  5. قم بقياس سمك وأعداد الخلايا لطبقات العضلات الدائرية والطولية لكل مقطع عرضي في أربع طرق عرض لكل عينة ملطخة H & E وخذ متوسط القياسات الأربعة لكل عينة.

4. استخراج الحمض النووي الريبي والكمية RT-PCR

  1. تجانس أنسجة القولون المستخلصة التي تم الحصول عليها من التحكم الوهمي وثلاثة مواقع (P و I و D) لفئران التهاب القولون TNBS في كاشف استخراج مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
  2. اعزل الحمض النووي الريبي عن كل عينة باستخدام المجموعة. قم بالتخلص من بيليه الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
  3. حدد تركيز الحمض النووي الريبي وتحقق من النقاء باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية UV-Vis صغير الحجم (انظر جدول المواد).
  4. استخدم 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لتوليف cDNA 21,22 باستخدام مجموعة توليف الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
  5. تحليل مستويات التعبير الجيني وقياسها كميا من خلال إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام 50 نانوغرام من cDNA كقالب ، ومجسات IL-6 ، و CTGF باستخدام مجموعة PCR تجارية لنظام PCR في الوقت الفعلي (انظر جدول المواد).
  6. استخدم جين التحكم 18S rRNA لتطبيع العينات وتحديد التعبير الجيني النسبي باستخدام قيم Cq التي تم الحصول عليها.

5. التحليل الإحصائي

  1. استخدم برنامج التحليل الإحصائي (انظر جدول المواد) لمقارنة التحكم الوهمي وفئران التهاب القولون TNBS.
  2. ضع في اعتبارك أن قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية15,19.
  3. لاختبار الاختلافات بين مجموعتين ، استخدم تحليل اختبار t الخاص بالطالب وقم بإجراء اختبار ANOVA إذا كانت المقارنات أكثر من مجموعتين15,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

منظر عياني لالتهاب القولون الشبيه بكرون الناجم عن التقطير داخل القولون ل TNBS
كما هو موضح في الشكل 1 ، أدى التقطير داخل القولون ل TNBS في الفئران إلى التهاب موضعي عبر الجدارية (~ 2 سم في الطول) مع جدار الأمعاء السميك وتجويف ضيق (تضيق) في موقع التقطير في القولون البعيد (الشكل 1A). يشار إلى موقع تقطير TNBS باسم الموقع الأول. نتيجة للالتهاب والتضيق عبر الجدارية ، يوجد كل من الالتهاب والإجهاد الميكانيكي في الموقع الأول. أدى التضيق في الموقع الأول إلى انتفاخ التجويف الملحوظ في الجزء القريب من موقع تقطير TNBS (الموقع P) (الشكل 1). وزاد محيط القولون زيادة كبيرة في الموقعين P وI، مقارنة بنقطتي التحكم الصوري (p < 0.05 مقابل السيطرة) (الشكل 1B). على الرغم من انتفاخه ميكانيكيا ، إلا أن الموقع P لم يظهر التهابا مرئيا. على العكس من ذلك ، فإن الجزء الاستعماري البعيد إلى موقع تقطير TNBS هو الموقع D ولا يعرض أي التهاب أو انتفاخ ميكانيكي (الشكل 1A ، B).

للمساعدة في التمييز بين تأثير الإجهاد الميكانيكي والالتهاب ، اتبعنا تصميما فريدا في جمع عينات الأنسجة من القولون في النموذج الموضح في الخطوة 2.6. الموقع P هو التركيز الأساسي للدراسة ، حيث أن هذا الجزء منتفخ ميكانيكيا في نموذج القرص المضغوط. الموقع D هو ضبط النفس ، لأنه لا يمثل الإجهاد الميكانيكي. لا يظهر الموقعان P و D أي التهاب مرئي (الشكل 1). ومع ذلك ، فإن الموقع الذي أعاني منه هو التهاب وإجهاد ميكانيكي (الشكل 1).

التغييرات الخاصة بالموقع لدرجة الالتهاب في المواقع P و I و D في فئران التهاب القولون
تم تطوير معايير في تصنيف الالتهاب بناء على النتيجة العيانية للأنسجة الحية (0-3)19 والنتيجة المجهرية للعينات الملطخة H & E (0-3)23 كما هو موضح مع التعديلات. أظهرت النتائج أن النتيجة العيانية للالتهاب في الموقع الأول كانت 2.70 ± 0.20 في الفئران المعالجة ب TNBS (بعد 7 أيام من تحريض الالتهاب) ، وزادت بشكل كبير مقارنة بالضوابط الصورية (0.30 ± 0.22 ، p < 0.05) والمواقع P (0.80 ± 0.26) و D (0.50 ± 0.22) من فئران التهاب القولون (الشكل 1C). لا يتم زيادة درجات الالتهاب في المواقع P و D بشكل كبير مقارنة بالصورية (الشكل 1C). أظهر التصوير المجهري التهابا عبر الجدارية ناجما عن علاج TNBS في الفئران (الشكل 2A). كانت النتيجة المجهرية للالتهاب في الموقع الأول 2.80 ± 0.27 في الفئران المعالجة من TNBS ، مرة أخرى بشكل ملحوظ (p < 0.05 ، n = 5 لكل مجموعة) زادت مقارنة بتلك الموجودة في الضوابط الصورية (0.3 ± 0.2) وفي المواقع P (1.0 ± 0.31) و D (0.80 ± 0.38) من الفئران التهاب القولون. لم يتم زيادة درجات الالتهاب في الموقعين P و D بشكل كبير مقارنة بالصورية (الشكل 2C).

التغيرات الخاصة بالموقع للتليف وتضخم العضلات الملساء وتضخمها في المواقع P و I و D في فئران التهاب القولون
تم تحديد درجة التليف بناء على بقعة ماسون ثلاثية الألوان (الشكل 2B) في مواقع مختلفة (P ، I ، D) (الشكل 2A). يتم وصف نظام الدرجات للتليف في الملف التكميلي 1. وجد أن درجة التليف تزداد بشكل كبير ليس فقط في الموقع الأول (2.60 ± 0.25) ولكن أيضا في الموقع P (1.60 ± 0.24) من فئران التهاب القولون ، مقارنة بالسيطرة الوهمية (0.40 ± 0.25. ص < 0.05) (الشكل 2 دال). تم قياس سمك وأعداد الخلايا لطبقات العضلات الملساء الدائرية والطولية في مواقع مختلفة في العينات الملطخة H & E (4 مشاهدات لكل عينة). وزاد سمك طبقات العضلات الملساء الدائرية والطولية وأعدادها الخلوية زيادة كبيرة في الموقعين I وP (الشكل 2E,F). لا يظهر الموقع D في فئران التهاب القولون أي زيادة كبيرة في درجة التليف أو أعداد خلايا العضلات الملساء أو سمك العضلات (الشكل 2).

التعبير الخاص بالموقع للجينات الحساسة للميكانو في المواقع P و I و D في فئران التهاب القولون
يلعب IL-6 دورا حاسما في التهاب الأمعاء ، لأنه يعزز تمايز الخلايا التائية ، ويضر بوظيفة الحاجز ، ويؤثر على الوظيفة العصبية العضلية 8,24. CTGF هو وسيط مؤيد للتليف معترف به جيدا ، حيث يمكن أن يؤدي تثبيطه إلى عكس عملية التليف17. الأهم من ذلك ، وجدت الدراسات الحديثة أن التعبير الجيني ل IL-6 و CTGF يستجيب بشكل كبير للإجهاد الميكانيكي8،14،18. تم تحديد التعبير الخاص بالموقع ل IL-6 و CTGF mRNAs في أنسجة السماكة الكاملة للتحكم في الصورة الظليلية وفئران التهاب القولون TNBS. زادت مستويات التعبير عن الحمض النووي الريبوزي المرسال ل IL-6 و CTGF بشكل كبير في موقع الالتهاب (الموقع الأول) مقارنة بالضوابط الصورية. في الموقع P ، حيث يوجد انتفاخ ميكانيكي ولكن لا يوجد التهاب مرئي ، زاد تعبير mRNA عن IL-6 و CTGF بشكل كبير مقارنة بالفئران الضابطة (الشكل 3A ، B). ومع ذلك ، فإن مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال IL-6 و CTGF في الموقع D من فئران التهاب القولون لم تكن مختلفة اختلافا كبيرا عن تلك الموجودة في الضوابط الصورية (الشكل 3).

Figure 1
الشكل 1: نموذج القوارض لالتهاب القولون الشبيه بالقرص المضغوط الناجم عن TNBS (7 أيام ). (أ) عرض توقعات للتحكم الوهمي والقولون المعالج ب TNBS (أعلى) وعرض عياني للسطح المخاطي للقولون البعيد (أسفل). تشير المربعات الصفراء إلى مواقع مختلفة من أنسجة القولون. S ، السيطرة الزائفة. أنا ، موقع الالتهاب. P ، انتفاخ موقع القولون القريب من موقع الالتهاب ؛ D ، موقع غير منتفخ بعيد عن الالتهاب. (ب) محيط القولون في السيطرة الوهمية والمواقع المختلفة (P ، I ، D) من القولون المعالج ب TNBS. (ج) درجة الالتهاب العياني للقولون الوهمي الخاضع للتحكم والمواقع المختلفة للقولون المعالج ب TNBS. n = 5 ، * p < 0.05 مقابل الفئران الزائفة للمجموعة. تمثل الأشرطة SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التقييم النسيجي المرضي. مناظر مجهرية في H&E (A) وبقع ماسون ثلاثية الألوان (B) تظهر توزيع الكولاجين في مواقع وهمية ومختلفة من الفئران التهاب القولون. يظهر التحليل الكمي زيادة مؤشر الالتهاب المجهري (C) والتليف (D) وسمك العضلات (تضخم) (E) وعدد خلايا العضلات الملساء (تضخم التنسج) (F) في الموقعين I و P ، ولكن ليس D ، في الفئران المعالجة TNBS. في (E) و (F) ، تكون القضبان المفتوحة لطبقة العضلات الملساء الدائرية ، والقضبان المخططة هي لطبقة العضلات الملساء الطولية. n = 5 في كل مجموعة، * p < 0.05 مقابل الفئران الوهمية للمجموعة. تمثل الأشرطة في الرسوم البيانية SEM. الأشرطة في (A) و (B) = 100 ميكرومتر.

Figure 3
الشكل 3: التعبير الخاص بالموقع للجينات الحساسة للميكانيكية (IL-6 و CTGF) في التهاب القولون الشبيه بالقرص المضغوط . (أ) التعبير عن IL-6 mRNA في القولون الخادع الخادع والمواقع المختلفة (P و I و D) من القولون المعالج ب TNBS. (ب) التعبير عن الحمض النووي الريبوزي المرسال CTGF في القولون الخادع الخادع والمواقع المختلفة (P و I و D) من القولون المعالج بالتهاب القولون المعالج ب TNBS. n = 4 أو 5 ، * p < 0.05 مقابل S (التحكم الصوري). تمثل الأشرطة SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: درجة الالتهاب والتليف. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم إدخال التهاب القولون الناجم عن TNBS في عام 1989 وتم استخدامه كنموذج تجريبي لمرض كرون منذ ذلك الحين19،20،23. تشمل السمات المهمة لهذا النموذج في القوارض تطور التهاب عبر الجدارية يشبه إلى حد كبير الآفات النسيجية المرضية التي تطورت في مرض كرون البشري19,20. ركزت الدراسات السابقة على النموذج بشكل أساسي على الاستجابة المناعية الشاذة في طبقة الغشاء المخاطي في موقع الالتهاب المرئي (الموقع I) 19،20،23. تم إيلاء القليل من الاهتمام لأجزاء الأمعاء القريبة والبعيدة عن الالتهاب. تكشف الدراسة الحالية على موقع الالتهاب ، وكذلك الجزء القريب المنتفخ والجزء البعيد غير المنتفخ ، عن تغييرات واضحة خاصة بالموقع في التعبير الجيني ، والاستجابة الالتهابية ، والسمات النسيجية المرضية. تمت إعادة النظر في النموذج لمعالجة الدور الممرض المحتمل للإجهاد الميكانيكي في التليف وإعادة تشكيل الأنسجة في مرض كرون.

وقد وجد أن الالتهاب الحاد يتطور على الفور بعد التعرض المخاطي ل TNBS في الإيثانول ويبلغ ذروته في اليوم 319. يوجد التهاب عبر الجدارية وتضيق التهابي ، والذي يرتبط بانتفاخ التجويف في الموقع P في كل فأر يعالج ب TNBS. بحلول اليوم 7 ، يتم تطوير الالتهاب المزمن عبر الجدارية بشكل جيد في الموقع الأول ، كما هو موجود في الدراسة الحالية وتم الإبلاغ عنه في مكان آخر20. وفي الوقت نفسه ، تظهر التغيرات الليفية في الموقع ، وتتميز بترسب الكولاجين المفرط ، كما هو موضح في هذه الدراسة وأماكن أخرى20. تقطير TNBS في الإيثانول في القولون البعيد يصيب أنسجة الغشاء المخاطي المحلي23 ويؤدي إلى التهاب عبر الجدارية في منطقة موضعية في القولون. الالتهاب عبر الجدارية مع التسلل الالتهابي ، والوذمة ، وتشوه الأنسجة 10،12،13 في موقع التقطير يقدم التهابا وإجهادا ميكانيكيا14 إلى المنطقة الموضعية (الموقع الأول). علاوة على ذلك ، يسبب الالتهاب عبر الجدارية أيضا تضيق اللمعان في الموقع I10. وجد أن التضيق ، وهو انسداد جزئي للأمعاء ، يسبب انتفاخا ميكانيكيا في الجزء القريب (الموقع P). ومع ذلك ، فإن الجزء البعيد إلى موقع التقطير غير منتفخ (الموقع D). كما هو موجود في أنظمة التسجيل العيانية والنسيجية ، في حين أن الموقع الأول يعرض كلا من الالتهاب والإجهاد الميكانيكي ، فإن المواقع P و D لا تقدم التهابا. وعلاوة على ذلك، يظهر الموقع P زيادة كبيرة في محيطه (وبالتالي الإجهاد الميكانيكي، وفقا لقانون لابلاس14)، ولكن الموقع دال لا يفعل ذلك. لذلك ، فإن دراسة حول التغييرات الخاصة بالموقع ، وخاصة الموقع P ، سوف تستكشف الأهمية المسببة للأمراض للإجهاد الميكانيكي في نموذج الالتهاب في الأمعاء.

ولوحظ أن التعبير عن الجينات الحساسة للميكانو IL-6 و CTGF قد زاد في الموقع I وفي الموقع P الممتد ميكانيكيا ، ولكن ليس في الموقع المجاور D ، حيث لا يوجد انتفاخ ميكانيكي. لدراسة الفرضية القائلة بأن الإجهاد الميكانيكي قد يساهم في تطور التليف وتضخم العضلات الملساء ، تم تحديد درجات التليف وقياس أعداد خلايا العضلات الملساء وسماكة العضلات في المواقع P و I و D بشكل منفصل. وقد وجد أن التليف وتضخم SMC موجودان في الموقعين I و P. ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن التليف وتضخم العضلات الملساء في الموقع D. تشير هذه النتائج إلى أن الإجهاد الميكانيكي قد يلعب دورا مسببا مستقلا في تخليق الكولاجين وتكاثر الخلايا في التهاب الأمعاء. هناك ما يبرر إجراء مزيد من الدراسات لتحديد ما إذا كان هذا التأثير يمكن أن يكون بوساطة التعبير الناجم عن الإجهاد الميكانيكي للعوامل المؤيدة للتليف والنمو مثل CTGF في الموقعين P و I.

على الرغم من أن النموذج الحيواني الموصوف نفسه يمكن استخدامه لمعالجة الإجهاد الميكانيكي في التهاب القولون الشبيه بالقرص المضغوط الضيق ، إلا أنه يحتوي على قيود في الهدف طويل الأجل المتمثل في تحديد الدور الممرض للإجهاد الميكانيكي في الالتهاب بشكل كامل. على سبيل المثال ، لا يمكن التمييز بين آثار الإجهاد الميكانيكي والالتهاب في الموقع الأول من النموذج الموصوف. على الرغم من أنه من المفترض أن الإجهاد الميكانيكي موجود في الموقع الأول بسبب التسلل الالتهابي وتشوه الأنسجة والتضيق والانتفاخ ، إلا أنه لا يمكن تحديد مقدار الإجهاد الميكانيكي الذي يساهم في التغيرات المرضية هناك. قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات الشاملة باستخدام نهج المختبر والجسم الحي وخارج الجسم الحي. على سبيل المثال ، قد يساعد منع الانتفاخ الميكانيكي عن طريق إطعام التهاب القولون حصريا بنظام غذائي سائل واضح25 في خلق حالة فقدان الانتفاخ الميكانيكي في نموذج التهاب القولون. من ناحية أخرى ، قد يساعد تحريض الانتفاخ الميكانيكي النقي بواسطة نطاق الانسداد15 في إنشاء نموذج إجهاد ميكانيكي مكتسب. علاوة على ذلك ، يساعد نموذج التمدد الميكانيكي في المختبر في الخلايا المستزرعة14,15 في التحديد الكمي لآثار الإجهاد الميكانيكي على التعبير الجيني والوظيفة ، حيث يمكن التحكم في وضع ومدى الإجهاد الميكانيكي بدقة في الإعداد المختبري.

لإعداد نموذج قابل للتكرار من الالتهاب عبر الجدارية والتضيق في التهاب القولون الشبيه بالقرص المضغوط كما هو موضح في الدراسة ، يجب استخدام TNBS عند 65 مجم / كجم في 250 ميكرولتر من الإيثانول 40٪. تم اختبار النموذج بشكل رئيسي في الفئران ، ذكورا أو إناثا ، تتراوح أعمارهم بين 8 و 9 أسابيع. بعد تقطير TNBS بالجرعة ، يتم تطوير الالتهاب عبر الجدارية باستمرار في موقع التقطير المحلي. يرتبط الالتهاب بتسلل الخلايا الالتهابية ، والوذمة ، وسماكة جدار الأمعاء ، مما يؤدي إلى تضييق التجويف في موقع التقطير ، يشبه الخصائص المرضية لمرض كرون20. أظهرت الدراسات التجريبية في المختبر أن TNBS بجرعات أقل من 50 ملغم / كغم في نفس الحجم من الإيثانول بنسبة 40٪ قد يسبب التهاب الأمعاء ولكن ليس تضيقا موثوقا به في الموقع الأول. وبالتالي، لن يكون هناك انتفاخ ميكانيكي واضح في الموقع P. من ناحية أخرى ، قد يسبب TNBS بجرعات أكبر من 80 ملغم / كغم التهابا حادا ووفيات. البروتوكول الحالي الذي يستخدم TNBS عند 65 مغ / كغ في 250 ميكرولتر من الإيثانول 40 ٪ بالكاد يسبب وفيات (1 من كل 16 فأرا من التهاب القولون TNBS).

وقد وجد أن تطهير الأمعاء في اليوم السابق لتقطير TNBS هو خطوة مهمة لضمان القولون نظيفة نسبيا لنموذج موثوق به من التهاب القولون التضيقي. لذلك ، تحتاج الفئران إلى الصيام لمدة 24 ساعة وإعطاء منظف الأمعاء بين عشية وضحاها قبل علاج TNBS. من المهم أيضا إبقاء الفئران في وضع ضعيف ورأسي لأسفل قليلا مع إغلاق فتحة الشرج لمدة 2 دقيقة بعد تقطير TNBS. هذا يساعد على ضمان توزيع جيد ل TNBS داخل القولون البعيد.

باختصار ، وجد أن التقطير داخل القولون من TNBS عند 65 ملغ / كغ في 250 ميكرولتر من الإيثانول 40 ٪ يحفز باستمرار التهاب القولون الشبيه بالقرص المضغوط في الفئران. يرتبط الالتهاب عبر الجدارية في النموذج بتضيق في موقع تقطير TNBS. لوحظ الانتفاخ الميكانيكي ، ولكن ليس الالتهاب ، في الجزء القريب من التضيق. لا يوجد التهاب أو إجهاد ميكانيكي في الجزء البعيد عن التضيق. مع هذه التغييرات في مواقع القولون المختلفة في فئران التهاب القولون ، يمكن تمييز الإجهاد الميكانيكي الناجم عن التهاب في التهاب القولون الشبيه بالقرص المضغوط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح وليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (R01 DK124611 إلى XZS) ووزارة الدفاع الأمريكية (W81XWH-20-1-0681 إلى XZS). تم إجراء أعمال علم الأنسجة بمساعدة مختبر علم الأمراض الجراحي UTMB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
  2. Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
  3. Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
  4. Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
  5. Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
  6. Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
  7. Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
  8. Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
  9. Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
  10. Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
  11. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  12. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  13. Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
  14. Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
  15. Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
  16. Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
  17. Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24 (2012).
  18. Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
  19. Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
  20. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
  21. Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
  22. Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
  23. Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  24. Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
  25. Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 181،

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

نموذج القوارض الناجم عن TNBS لدراسة الدور الممرض للإجهاد الميكانيكي في مرض كرون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter