Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een TNBS-geïnduceerd knaagdiermodel om de pathogene rol van mechanische stress bij de ziekte van Crohn te bestuderen

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Het huidige protocol beschrijft de ontwikkeling van een Crohn-achtig colitismodel bij knaagdieren. Transmurale ontsteking leidt tot stenose op de TNBS-instillatieplaats en mechanische vergroting wordt waargenomen in het segment proximaal met de stenose. Deze veranderingen maken het mogelijk om mechanische stress bij colitis te bestuderen.

Abstract

Inflammatoire darmziekten (IBD) zoals de ziekte van Crohn (CD) zijn chronische ontstekingsaandoeningen van het maagdarmkanaal die ongeveer 20 per 1.00.000 in Europa en de VS beïnvloeden. CD wordt gekenmerkt door transmurale ontsteking, darmfibrose en luminale stenose. Hoewel ontstekingsremmende therapieën kunnen helpen bij het beheersen van ontstekingen, hebben ze geen werkzaamheid op fibrose en stenose in CD. De pathogenese van CD is niet goed begrepen. Huidige studies richten zich voornamelijk op het afbakenen van ontregelde immuunresponsmechanismen van de darm. Hoewel CD-geassocieerde transmurale ontsteking, darmfibrose en luminale stenose allemaal mechanische stress op de darmwand vertegenwoordigen, is de rol van mechanische stress in CD niet goed gedefinieerd. Om te bepalen of mechanische stress een onafhankelijke pathogene rol speelt bij CD, is een protocol van TNBS-geïnduceerd CD-achtig colitismodel bij knaagdieren ontwikkeld. Dit TNBS-geïnduceerde transmurale ontstekings- en fibrosemodel lijkt op pathologische kenmerken van CD in de dikke darm. Het wordt geïnduceerd door intrakolonische instillatie van TNBS in de distale dikke darm van volwassen Sprague-Dawley-ratten. In dit model leidt transmurale ontsteking tot stenose op de TNBS-instillatieplaats (site I). Mechanische uitzetting wordt waargenomen in het gedeelte proximaal tot de instillatieplaats (site P), wat mechanische stress vertegenwoordigt, maar geen zichtbare ontsteking. Colongedeelte distale tot ontsteking (site D) presenteert geen ontsteking of mechanische stress. Onderscheidende veranderingen van genexpressie, immuunrespons, fibrose en gladde spiergroei op verschillende plaatsen (P, I en D) werden waargenomen, wat een diepgaande impact van mechanische stress benadrukte. Daarom zal dit model van CD-achtige colitis ons helpen de pathogene mechanismen van CD beter te begrijpen, met name de rol van mechanische stress en mechanische stress-geïnduceerde genexpressie bij immuunontregeling, darmfibrose en weefselremodellering in CD.

Introduction

Inflammatoire darmziekte (IBD), waaronder colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD), wordt gekenmerkt door chronische ontsteking in het maagdarmkanaal (GI). Het treft ~ 1-2 miljoen Amerikanen1. De geschatte jaarlijkse kosten voor IBD-zorg in de VS zijn $ 11,8 miljard. In tegenstelling tot UC wordt de CD gekenmerkt door transmurale ontsteking en strictuurvorming 2,3. Strictuurvorming (stenose) komt voor bij maximaal 70% van de CD-patiënten3 en kan worden veroorzaakt door transmurale ontsteking (inflammatoire stenose) of darmfibrose (fibrotische stenose)4,5. Darmfibrose wordt gekenmerkt door overmatige collageenafzetting en andere extracellulaire matrices (ECM) met gladde spiercellen (SMC) als een van de belangrijkste mesenchymale celtypen die betrokken zijn bij het proces 3,4. Gladde spierhyperplasie geassocieerd met hypertrofie is een andere significante histologische verandering in fibrotische stenose bij CD6. Hoewel strictuurvorming in CD geassocieerd is met chronische ontsteking, is geen ontstekingsremmende behandeling effectief, behalve chirurgische behandeling 2,6. Postoperatieve recidieven zijn echter bijna 100%, mits voldoende tijd 2,7. Als ontstekingsreactie kunnen fibrose en SMC-hyperplasie zich ook ontwikkelen bij niet-inflammatoire aandoeningen (d.w.z. darmobstructie) in de darm 8,9; er wordt aangenomen dat zowel ontstekingsafhankelijke als onafhankelijke mechanismen betrokken zijn bij strictuurvorming 3,4. Aangezien uitgebreid onderzoek naar de ontstekingsafhankelijke mechanismen zich niet heeft vertaald in een effectieve therapie voor strictuurvorming, zijn studies nodig naar de mogelijke rol van ontstekingsonafhankelijke mechanismen bij darmfibrose.

Als een niet-inflammatoire factor wordt mechanische stress (MS) geassocieerd met oedeem, inflammatoire celinfiltratie, weefselvervorming, fibrose en stenose 10,11,12,13 vaak aangetroffen bij IBD, vooral CD, die wordt gekenmerkt door transmurale ontsteking. Mechanische stress is het meest opmerkelijk bij stenotische CD, waar stenose (inflammatoir of fibrotisch) op de ontstekingsplaats mechanische stress in het lokale weefsel presenteert en leidt tot lumenuitzetting in het segment proximaal tot de obstructieplaats 10,14. Eerdere in vitro studies hebben aangetoond dat mechanische stress de genexpressie van specifieke ontstekingsmediatoren (d.w.z. COX-2, IL-6)8,14,15 en groeifactoren (d.w.z. TGF-β) in de gastro-intestinale weefsels, met name darm gladde spiercellen (SMC)16, verandert. Recente studies toonden ook aan dat de expressie van specifieke pro-fibrotische mediatoren zoals bindweefselgroeifactor (CTGF) zeer gevoelig is voor mechanische stress 17,18. Er werd verondersteld dat mechanische stress een onafhankelijke pathogene rol zou kunnen spelen bij CD-geassocieerde ontsteking, fibrose en weefselremodellering. De pathogene betekenis van mechanische stress bij darmontsteking, fibrose en gladde spierhyperplasie bij CD blijft echter grotendeels onontgonnen. Dit kan deels komen doordat ontsteking een zichtbaarder en beter bestudeerd proces is dan mechanische stress. Wat nog belangrijker is, er is geen goed gedefinieerd diermodel van IBD om het effect van mechanische stress te onderscheiden van dat van ontsteking.

Het huidige werk beschrijft een knaagdiermodel van Crohn-achtige colitis geïnduceerd door intrakolonische injectie van haptenreagens 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS)19,20, dat het doel kan dienen om de rol van mechanische stress in CD te bestuderen. Het bleek dat TNBS-instillatie een gelokaliseerde (~ 2 cm lengte) transmurale ontsteking veroorzaakte met lumenvernauwing (stenose) in de distale dikke darm. De stenose leidt tot duidelijke darmuitzetting (mechanische stress)14,15 maar niet zichtbare ontsteking in het colonsegment proximaal tot de instillatieplaats. Integendeel, het colonsegment distale naar de stenoseplaats vertoont geen ontsteking of mechanische stress. Significante site-specifieke veranderingen in genexpressie, ontsteking, fibrose en SMC-hyperplasie werden waargenomen op de drie verschillende locaties. De resultaten suggereren dat mechanische stress, met name mechanische stress-geïnduceerde genexpressie, een cruciale rol kan spelen bij het ontwikkelen van fibrose en hyperplasie bij colitis van Crohn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik van de University of Texas Medical Branch (#0907051C). Mannelijke of vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten, ~ 8-9 weken oud, werden gebruikt voor de studie.

1. Bereiding van dieren

  1. Vast ratten gedurende 24 uur en behandel ze 's nachts met laxeermiddel (darmreiniger, zie Tabel met materialen).
  2. De volgende dag verdooft u ratten met behulp van een anesthesiesysteem (zie Materiaaltabel) door ze bloot te stellen aan 2% isofluraan samen met 1 L /min zuurstof tijdens toediening van TNBS. Controleer op reflexen of knijp tenen om de verdoving te bevestigen.
  3. Bereid verse TNBS-oplossing volgens lichaamsgewicht.
    OPMERKING: TNBS - 65 mg/kg lichaamsgewicht in 250 μL van 40% ethanol werd gebruikt.
  4. Zet ratten in rugligging op de anesthesietafel. Om colitis te induceren, brengt u via de anus een open polyurethaankatheter van medische kwaliteit in gedurende ~ 7-8 cm van de anale berm en brengt u TNBS (bereid in stap 1.3) voorzichtig in de dikke darm19 in. Dien de schijnbestrijdingsratten toe met slechts 250 μL zoutoplossing.
  5. Houd na het inbrengen van TNBS of zoutoplossing de ratten in rugligging en iets naar beneden (~ 30 °), met de anus gedurende 2 minuten gesloten om de TNBS-distributie te helpen en morsen te voorkomen.
  6. Voorzie ratten gedurende 7 dagen van voedsel en water ad libitum en observeer de ratten dagelijks op lichaamsgewicht, voedselopname, uitwerpselen en algemene gezondheidstoestand.

2. Weefselpreparaten

  1. Euthanasie op de dag van euthanasie de ratten met behulp van CO 2-inhalatie en bevestig euthanasie met cervicale dislocatie.
  2. Open de buik van de rat met een schaar en een tang van chirurgische kwaliteit.
  3. Verwijder voorzichtig de gehele dikke darm (boven het anale kanaal) en breng de dikke darm onmiddellijk over op ijskoude 1x HBSS-buffer.
  4. Maak de dubbele punt in de buffer recht en meet de colonlengte met behulp van een liniaal. Neem nylondraad en cirkel rond de dikke darm om de externe omtrek van de dikke darmsegmenten onder controle en met TNBS behandelde ratten te meten. Neem weefsels van volledige dikte voor histologie.
  5. Snijd de dikke darm langs de mesenteriale plank open en reinig de dikke darm goed met HBSS-buffer. Beoordeel de colon op macroscopische ontstekingsscore op basis van de criteria zoals eerder beschreven19 met minimale wijzigingen.
    OPMERKING: 0 = normaal slijmvlies; 1 = gelokaliseerde hyperemie maar geen erosies of zweren; 2 = zweer en stenose (getroffen gebied < 5 mm); 3 = ernstige maagzweer, litteken en stenose (getroffen gebied > 5 mm).
  6. Verzamel darmweefselmonsters van plaats P (deel 2-3 cm vóór de orale marge van de ontstekingsplaats), plaats I (ontstekingsplaats, meestal 4-6 cm van het einde van de dikke darm, waar TNBS wordt toegediend) en plaats D (deel 1-2 cm distaal naar de aborale marge van ontstekingsplaats), respectievelijk van met TNBS behandelde ratten.
    OPMERKING: Colonweefsel van ~ 1-2 cm lang werd uit elk segment genomen. Bovendien werden de colonweefsels van 2 cm lang (~ 4-6 cm van het einde van de dikke darm) van de met zoutoplossing behandelde ratten als schijncontrole (S) genomen (figuur 1).
  7. Neem weefselmonsters van elke plaats voor voorbereiding op volledige dikte en, indien gewenst, respectievelijk de lagen mucosa / submucosa en muscularis externa, evenals21,22.
  8. Vries weefselmonsters eerst in vloeibare stikstof in voordat ze bij -80 °C worden bewaard voor opslag tot één jaar en voor toekomstige doeleinden (d.w.z. RNA-preparaten).

3. Histopathologische beoordeling van darmontsteking en fibrose

  1. Fixeer de dikke darmweefsels van volledige dikte in 10% formaline gedurende 48 uur en breng vervolgens over op 70% ethanol gedurende 24-48 uur.
  2. Gebruik een microtoom om paraffinesecties van 5 μm dikte te snijden voor respectievelijk Hematoxyline en eosine (H & E) en Masson's Trichrome-vlekken 6,19,23 (zie Tabel met materialen).
  3. Verkrijg en bekijk beelden met een rechtopstaande microscoop die is uitgerust met een camera met hoge resolutie en compatibele software (zie Materiaaltabel).
  4. Graad ontsteking en fibrose indexen door twee onafhankelijke onderzoekers, waaronder een gastro-intestinale chirurgische patholoog volgens criteria eerder beschreven 6,23 met modificaties. Zie Aanvullend Dossier 1 voor de scores.
  5. Meet de dikte en het celaantal van de cirkelvormige en longitudinale spierlagen per doorsnede in vier weergaven van elk H & E-gekleurd monster en neem het gemiddelde van de vier metingen voor elk monster.

4. RNA-extractie en kwantitatieve RT-PCR

  1. Homogeniseren van weggesneden colonweefsel verkregen uit de schijncontrole en drie plaatsen (P, I, D) van TNBS colitis ratten in het extractiereagens van een RNA-extractiekit (zie Tabel met materialen).
  2. Isoleer RNA van elk monster met behulp van de kit. Eluteer de RNA-pellet in 30 μL RNase-vrij water.
  3. Kwantificeer de RNA-concentratie en controleer op zuiverheid met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer met microvolume (zie Materiaaltabel).
  4. Gebruik 1 μg totaal RNA om cDNA21,22 te synthetiseren met behulp van de RNA-synthesekit (zie Tabel met materialen).
  5. Analyseer en kwantificeer genexpressieniveaus door real-time PCR uit te voeren met 50 ng cDNA als sjabloon, probes van IL-6 en CTGF met behulp van een commerciële PCR-kit voor real-time PCR-systeem (zie Tabel met materialen).
  6. Gebruik controlegenen 18S-rRNA om de monsters te normaliseren en relatieve genexpressie te kwantificeren met behulp van de verkregen Cq-waarden.

5. Statistische analyse

  1. Gebruik statistische analysesoftware (zie Tabel met materialen) om schijncontrole en TNBS colitis ratten te vergelijken.
  2. Beschouw de p-waarde < 0,05 als statistisch significant15,19.
  3. Om de verschillen tussen twee groepen te testen, gebruikt u de t-testanalyse van Student en voert u een ANOVA-test uit als vergelijkingen meer dan twee groepen zijn15,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Macroscopische weergave van Crohn-achtige colitis geïnduceerd door intra-colon instillatie van TNBS
Zoals te zien is in figuur 1, veroorzaakte intrakolonische instillatie van TNBS bij ratten een gelokaliseerde transmurale ontsteking (~ 2 cm lang) met verdikte darmwand en vernauwd lumen (stenose) op de plaats van instillatie in de distale dikke darm (figuur 1A). De site van TNBS instillatie wordt aangeduid als site I. Als gevolg van transmurale ontsteking en stenose zijn zowel ontsteking als mechanische stress aanwezig op plaats I. De stenose op plaats I leidde tot een duidelijke lumenuitzetting in het segment proximaal met de plaats van TNBS-instillatie (plaats P) (figuur 1). De colonomtrek was significant verhoogd op de plaatsen P en I, vergeleken met de schijncontrole colon (p < 0,05 vs. controle) (figuur 1B). Hoewel mechanisch opgezwollen, vertoonde site P geen zichtbare ontsteking. Integendeel, het colonsegment distale naar de TNBS-instillatieplaats is plaats D en vertoont geen ontsteking of mechanische uitzetting (figuur 1A,B).

Om het effect van mechanische stress van ontsteking te helpen onderscheiden, volgden we een uniek ontwerp bij het verzamelen van weefselmonsters uit de dikke darm in het model beschreven in stap 2.6. Site P is de primaire focus van het onderzoek, omdat dit deel mechanisch is opgezwollen in het CD-model. Site D is zelfbeheersing, omdat het geen mechanische spanning vertoont. Plaatsen P en D vertonen geen zichtbare ontsteking (figuur 1). Wel ervaar ik ontstekingen en mechanische stress (figuur 1).

Plaatsspecifieke veranderingen in de ontstekingsscore op de plaatsen P, I en D bij colitisratten
Criteria werden ontwikkeld bij het beoordelen van ontstekingen op basis van de macroscopische score van levend weefsel (0-3)19 en de microscopische score van H&E-gekleurde monsters (0-3)23 zoals beschreven met modificaties. De resultaten toonden aan dat de macroscopische score van ontsteking op plaats I 2,70 ± 0,20 was bij de met TNBS behandelde ratten (7 dagen na inductie van ontsteking), dramatisch toegenomen in vergelijking met die van schijncontroles (0,30 ± 0,22, p < 0,05) en die van locaties P (0,80 ± 0,26) en D (0,50 ± 0,22) van colitisratten (figuur 1C). De ontstekingsscores op de plaatsen P en D zijn niet significant verhoogd in vergelijking met sham (figuur 1C). Microscopische beeldvorming toonde TNBS-behandelingsgeïnduceerde transmurale ontsteking bij ratten (figuur 2A). De microscopische score van ontsteking op plaats I was 2,80 ± 0,27 bij de met TNBS behandelde ratten, opnieuw significant (p < 0,05, n = 5 per groep) verhoogd in vergelijking met die bij schijncontroles (0,3 ± 0,2) en op plaatsen P (1,0 ± 0,31) en D (0,80 ± 0,38) van colitisratten. De ontstekingsscores op de plaatsen P en D waren niet significant verhoogd in vergelijking met sham (figuur 2C).

Plaatsspecifieke veranderingen van fibrose en gladde spierhyperplasie en hypertrofie op plaatsen P, I en D bij colitisratten
De fibrosescore werd bepaald op basis van Mason's trichrome vlek (figuur 2B) op verschillende plaatsen (P, I, D) (figuur 2A). Het beoordelingssysteem voor fibrose wordt beschreven in aanvullend dossier 1. Het bleek dat de fibrosescore significant verhoogd is, niet alleen in site I (2,60 ± 0,25), maar ook in site P (1,60 ± 0,24) van de colitisratten, vergeleken met schijncontrole (0,40 ± 0,25. p < 0,05) (figuur 2D). De dikte en het celaantal van cirkelvormige en longitudinale gladde spierlagen werden gemeten op verschillende plaatsen in H & E-gekleurde monsters (4 weergaven per monster). De dikte en het celaantal van zowel cirkelvormige als longitudinale gladde spierlagen waren significant verhoogd op de plaatsen I en P (figuur 2E,F). De plaats D bij de colitisratten vertoont geen significante toename van de fibrosescore, het aantal gladde spiercellen of de spierdikte (figuur 2).

Plaatsspecifieke expressie van mechano-gevoelige genen op plaatsen P, I en D bij colitisratten
IL-6 speelt een cruciale rol bij darmontsteking, omdat het T-celdifferentiatie bevordert, de barrièrefunctie beschadigt en de neuromusculaire functiebeïnvloedt 8,24. CTGF is een goed erkende pro-fibrotische mediator, omdat de remming ervan het proces van fibrose kan omkeren17. Wat nog belangrijker is, recente studies hebben aangetoond dat genexpressie van IL-6 en CTGF zeer gevoelig is voor mechanische stress 8,14,18. De plaatsspecifieke expressie van IL-6 en CTGF mRNA's werd bepaald in het weefsel van volledige dikte van sham control en TNBS colitis ratten. De mRNA-expressieniveaus van IL-6 en CTGF waren significant verhoogd op de ontstekingsplaats (plaats I) in vergelijking met schijncontroles. Op plaats P, waar sprake is van mechanische uitzetting maar geen zichtbare ontsteking, was de mRNA-expressie van IL-6 en CTGF ook dramatisch verhoogd in vergelijking met controleratten (figuur 3A,B). De IL-6- en CTGF-mRNA-niveaus op plaats D van colitisratten verschilden echter niet significant van die in schijncontroles (figuur 3).

Figure 1
Figuur 1: Knaagdiermodel van TNBS-geïnduceerde CD-achtige colitis (7 dagen). (A) Vooruitzichten van schijncontrole en met TNBS behandelde dikke darm (boven) en macroscopische weergave van het slijmvliesoppervlak van de distale dikke darm (onder). De gele vakken geven verschillende plaatsen van darmweefsel aan. S, schijncontrole; Ik, ontstekingsplaats; P, opgezwollen colonplaats proximaal tot ontstekingsplaats; D, niet-opgezwollen plaats distale tot ontsteking. (B) Colonomtrek in schijncontrole en verschillende plaatsen (P, I, D) van de met TNBS behandelde dikke darm. (C) Macroscopische ontstekingsscore van schijncontrole colon en verschillende plaatsen van met TNBS behandelde dikke darm. n = 5, *p < 0,05 vs. schijnratten van de groep. Balken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Histopathologische beoordeling. Microscopische weergaven in H & E (A) en Masson's trichrome vlekken (B) die collageenverdeling in schijn en verschillende plaatsen van colitisratten laten zien. Kwantitatieve analyse toont een verhoogde microscopische ontstekingsindex (C), fibrose (D) en spierdikte (hypertrofie) (E) en het aantal gladde spiercellen (hyperplasie) (F) op plaatsen I en P, maar niet D, bij met TNBS behandelde ratten. In (E) en (F) zijn de open staven voor de cirkelvormige gladde spierlaag en gestreepte staven voor de longitudinale gladde spierlaag. n = 5 in elke groep, *p < 0,05 vs. schijnratten van de groep. Balken in grafieken vertegenwoordigen SEM. Balken in (A) en (B) = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Plaatsspecifieke expressie van mechanosensitieve genen (IL-6 en CTGF) bij CD-achtige colitis. (A) Expressie van IL-6 mRNA in schijncontrole colon en verschillende plaatsen (P, I en D) van met TNBS behandelde colitis colon. (B) Expressie van CTGF-mRNA in schijncontrole colon en verschillende plaatsen (P, I en D) van met TNBS behandelde colitis colon. n = 4 of 5, *p < 0,05 vs. S (schijncontrole). Balken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: Score van ontsteking en fibrose. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TNBS-geïnduceerde colitis werd geïntroduceerd in 1989 en wordt sindsdien gebruikt als een experimenteel model van de ziekte van Crohn 19,20,23. Belangrijke kenmerken van dit model bij knaagdieren zijn de ontwikkeling van een transmurale ontsteking die sterk lijkt op de histopathologische laesies die zijn ontwikkeld bij de ziekte van Crohn bij de mens19,20. Eerdere studies over het model hebben zich voornamelijk gericht op afwijkende immuunrespons in de slijmvlieslaag op de plaats van zichtbare ontsteking (de plaats I)19,20,23. Er is weinig aandacht besteed aan de darmgedeelten proximaal en distaal voor ontstekingen. De huidige studie op de ontstekingsplaats, evenals het opgezwollen proximale segment en het niet-opgezwollen distale segment, onthult schijnbare plaatsspecifieke veranderingen in genexpressie, ontstekingsreactie en histopathologische kenmerken. Het model is opnieuw bekeken om de potentiële pathogene rol van mechanische stress bij fibrose en weefselremodellering bij de ziekte van Crohn aan te pakken.

Het bleek dat acute ontsteking onmiddellijk wordt ontwikkeld na mucosale blootstelling van TNBS in ethanol en wordt gepiekt op dag 319. Transmurale ontsteking en inflammatoire stenose zijn aanwezig, wat geassocieerd is met lumenuitzetting op plaats P bij elke rat die met TNBS wordt behandeld. Op dag 7 is chronische transmurale ontsteking goed ontwikkeld op plaats I, zoals gevonden in de huidige studie en elders gerapporteerd20. Ondertussen zijn fibrotische veranderingen zichtbaar in de site, gekenmerkt door overmatige collageenafzetting, zoals te zien in de huidige studie en elders20. TNBS-instillatie in ethanol in de distale dikke darm verwondt het lokale slijmvliesweefsel23 en leidt tot transmurale ontsteking in een gelokaliseerd gebied in de dikke darm. De transmurale ontsteking met inflammatoire infiltratie, oedeem en weefselvervorming10,12,13 op de instillatieplaats presenteren ontsteking en mechanische stress14 in het gelokaliseerde gebied (site I). Bovendien veroorzaakt transmurale ontsteking ook luminale stenose op plaats I10. Het bleek dat stenose, een gedeeltelijke darmobstructie, mechanische uitzetting veroorzaakt in het proximale segment (site P). Het distale deel naar de instillatieplaats is echter niet opgezwollen (site D). Zoals gevonden in de macroscopische en histologische scoresystemen, terwijl site I zowel ontsteking als mechanische stress presenteert, vertonen sites P en D geen ontsteking. Bovendien vertoont site P een significant verhoogde omtrek (en dus mechanische belasting, volgens de wet van Laplace14), maar site D niet. Daarom zal een studie naar de site-specifieke veranderingen, met name de site P, het pathogene belang van mechanische stress in het ontstekingsmodel in de darm onderzoeken.

Er werd waargenomen dat de expressie van mechano-gevoelige genen IL-6 en CTGF verhoogd was in plaats I en in mechanisch uitgerekte site P, maar niet in naburige site D, waar er geen mechanische uitzetting is. Om de hypothese te onderzoeken dat mechanische stress kan bijdragen aan de ontwikkeling van fibrose en gladde spierhyperplasie, werden fibrosescores en gemeten gladde spiercelaantallen en spierdikte op de plaatsen P, I en D afzonderlijk bepaald. Het bleek dat fibrose en SMC-hyperplasie aanwezig zijn op de plaatsen I en P. Fibrose en gladde spierhyperplasie worden echter niet gedetecteerd op plaats D. Deze bevindingen geven aan dat mechanische stress een onafhankelijke pathogene rol kan spelen bij collageensynthese en celproliferatie bij darmontsteking. Verdere studies zijn gerechtvaardigd om te bepalen of dit effect kan worden gemedieerd door mechanische stress-geïnduceerde expressie van pro-fibrotische en groeifactoren zoals CTGF op de plaatsen P en I.

Hoewel het beschreven diermodel zelf kan worden gebruikt om mechanische stress bij stenotische CD-achtige colitis aan te pakken, heeft het beperkingen in het langetermijndoel om de pathogene rol van mechanische stress bij ontsteking volledig te definiëren. Zo kunnen de effecten van mechanische stress en ontsteking op plaats I van het beschreven model niet worden onderscheiden. Hoewel wordt aangenomen dat mechanische stress aanwezig is op plaats I vanwege inflammatoire infiltratie, weefselvervorming, stenose en uitzetting, kan niet worden bepaald hoeveel mechanische stress bijdraagt aan de pathologische veranderingen daar. Verdere uitgebreide studies met behulp van in vitro, in vivo en ex vivo benaderingen kunnen nodig zijn. Het voorkomen van mechanische uitzetting door de colitisdieren uitsluitend te voeren met een helder vloeibaar dieet25 kan bijvoorbeeld helpen bij het creëren van een verlies van mechanische uitzettingsstatus in het colitismodel. Aan de andere kant kan inductie van zuivere mechanische uitzetting door obstructieband15 helpen bij het creëren van een gain-of-mechanical stress-model. Bovendien helpt het in vitro mechanische stretchmodel in gekweekte cellen14,15 bij de kwantitatieve bepaling van de effecten van mechanische stress op genexpressie en -functie, omdat de modus en omvang van mechanische stress fijn kunnen worden gecontroleerd in de in vitro setting.

Om een reproduceerbaar model van transmurale en stenotische ontsteking bij CD-achtige colitis voor te bereiden, zoals beschreven in het onderzoek, moet TNBS bij 65 mg/kg in 250 μL 40% ethanol worden gebruikt. Het model werd voornamelijk getest bij ratten, mannelijk of vrouwelijk, 8-9 weken oud. Na instillatie van TNBS in de dosis wordt transmurale ontsteking consequent ontwikkeld op de lokale instillatieplaats. De ontsteking wordt geassocieerd met ontstekingscellen infiltratie, oedeem en verdikking van de darmwand, wat leidt tot lumenvernauwing op de instillatieplaats, die lijkt op pathologische kenmerken van de ziekte van Crohn20. Pilotstudies in het laboratorium toonden aan dat TNBS bij doses lager dan 50 mg / kg in hetzelfde volume van 40% ethanol darmontsteking kan veroorzaken, maar geen betrouwbare stenose op locatie I. Er zou dus geen duidelijke mechanische uitzetting zijn in site P. Aan de andere kant kan TNBS bij doses van meer dan 80 mg / kg ernstige ontstekingen en sterfgevallen veroorzaken. Het huidige protocol met TNBS bij 65 mg/kg in 250 μL 40% ethanol veroorzaakt nauwelijks dodelijke slachtoffers (1 op de 16 ratten met TNBS-colitis).

Het bleek dat darmreiniging de dag voor instillatie van TNBS een belangrijke stap is om een relatief schone dikke darm te garanderen voor een betrouwbaar model van stenotische colitis. Daarvoor moeten ratten 24 uur vasten en 's nachts darmreiniger geven voordat ze TNBS-behandeling krijgen. Het is ook belangrijk om ratten in rugligging en iets naar beneden te houden met de anus gesloten gedurende 2 minuten na indruppeling van TNBS. Dit helpt om te zorgen voor een goede verdeling van TNBS in de distale dikke darm.

Samenvattend bleek dat intrakolonische instillatie van TNBS bij 65 mg/kg in 250 μL 40% ethanol consequent CD-achtige colitis veroorzaakte bij ratten. Transmurale ontsteking in het model is geassocieerd met stenose op de TNBS-instillatieplaats. Mechanische uitzetting, maar geen ontsteking, wordt waargenomen in het segment proximaal aan de stenose. Noch ontsteking noch mechanische stress is aanwezig in het segment distale van de stenose. Met deze veranderingen in verschillende colonplaatsen bij een colitisrat kan mechanische stress van ontsteking bij CD-achtige colitis worden onderscheiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs melden geen belangenverstrengeling en hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van NIH (R01 DK124611 aan XZS) en het Amerikaanse ministerie van Defensie (W81XWH-20-1-0681 aan XZS). Het histologische werk werd gedaan met de hulp van het UTMB Surgical Pathology Lab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
  2. Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
  3. Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
  4. Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
  5. Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
  6. Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
  7. Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
  8. Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
  9. Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
  10. Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
  11. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  12. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  13. Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
  14. Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
  15. Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
  16. Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
  17. Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24 (2012).
  18. Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
  19. Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
  20. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
  21. Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
  22. Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
  23. Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  24. Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
  25. Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).

Tags

Immunologie en infectie Nummer 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

Een TNBS-geïnduceerd knaagdiermodel om de pathogene rol van mechanische stress bij de ziekte van Crohn te bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter