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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Um modelo de roedor induzido pela TNBS para estudar o papel patogênico do estresse mecânico na doença de Crohn

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de colite semelhante a Crohn em roedores. A inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS, e o alargamento mecânico é observado no segmento proximal à estenose. Essas mudanças permitem estudar o estresse mecânico na colite.

Abstract

Doenças inflamatórias intestinais (DII) como a doença de Crohn (CD) são doenças inflamatórias crônicas do trato gastrointestinal que afetam aproximadamente 20 por 1.00.000 na Europa e nos EUA. O CD é caracterizado por inflamação transmural, fibrose intestinal e estenose luminal. Embora terapias anti-inflamatórias possam ajudar a controlar a inflamação, elas não têm eficácia na fibrose e estenose em CD. A patogênese do CD não é bem compreendida. Os estudos atuais se concentram principalmente na delineação de mecanismos de resposta imune intestinal desregulados. Embora a inflamação transmural associada ao CD, a fibrose intestinal e a estenose luminal representem estresse mecânico na parede intestinal, o papel do estresse mecânico no CD não é bem definido. Para determinar se o estresse mecânico desempenha um papel patogênico independente no CD, um protocolo do modelo de colite induzida por TNBS em roedores foi desenvolvido. Este modelo de inflamação transmural e fibrose induzido pelo TNBS se assemelha a marcas patológicas do CD no cólon. É induzida pela instilação intracolônica de TNBS no cólon distal de ratos adultos Sprague-Dawley. Neste modelo, a inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS (Site I). A distensão mecânica é observada na porção proximal ao local de instilação (Local P), representando estresse mecânico, mas não inflamação visível. A porção córica distal à inflamação (Local D) não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações distintas da expressão genética, resposta imune, fibrose e crescimento muscular suave em diferentes locais (P, I e D), destacando um profundo impacto do estresse mecânico. Portanto, este modelo de colite semelhante a CD nos ajudará a entender melhor os mecanismos patogênicos do CD, particularmente o papel do estresse mecânico e da expressão genética induzida pelo estresse mecânico na desregulação imunológica, fibrose intestinal e remodelação tecidual em CD.

Introduction

A doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa (UC) e doença de Crohn (CD), é caracterizada por inflamação crônica no trato gastrointestinal (GI). Afeta ~1-2 milhões de americanos1. Os custos anuais estimados para os cuidados com o IBD nos EUA são de US$ 11,8 bilhões. Ao contrário da UC, o CD é caracterizado pela inflamação transmural e formação de rigidridade 2,3. A formação rigorosa (estenose) ocorre em até 70% dos pacientes com CD3 e pode ser causada por inflamação transmural (estenose inflamatória) ou fibrose intestinal (estenose fibrosa)4,5. A fibrose intestinal é caracterizada pela deposição excessiva de colágeno e outras matrizes extracelulares (ECM) com células musculares lisas (SMC) como um dos principais tipos de células mesenquimais envolvidas no processo 3,4. A hiperplasia muscular lisa associada à hipertrofia é outra mudança histológica significativa na estenose fibrosa no CD6. Embora a formação de rigor em CD esteja associada à inflamação crônica, nenhum tratamento anti-inflamatório é eficaz, exceto o tratamento cirúrgico 2,6. No entanto, as recidivas pós-cirurgia são quase 100%, dado tempo suficiente 2,7. Como resposta inflamatória, a fibrose e a hiperplasia SMC também podem desenvolver-se em condições não inflamatórias (ou seja, obstrução intestinal) no intestino 8,9; acredita-se que tanto mecanismos dependentes da inflamação quanto independentes estejam envolvidos na formação rigorosa 3,4. Dado que uma extensa pesquisa sobre os mecanismos dependentes da inflamação não se traduziu em nenhuma terapia eficaz para a formação de estritos, são necessários estudos sobre o possível papel de mecanismos independentes da inflamação na fibrose intestinal.

Como fator não inflamatório, o estresse mecânico (EM) associado ao edema, infiltração de células inflamatórias, deformação tecidual, fibrose e estenose 10,11,12,13 é comumente encontrado no DIB, especialmente o CD, que é caracterizado por inflamação transmural. O estresse mecânico é mais notável no CD estenético, onde a estenose (inflamatória ou fibrosa) no local da inflamação apresenta estresse mecânico no tecido local e leva à distensão do lúmen no segmento proximal ao local da obstrução10,14. Estudos in vitro anteriores demonstraram que o estresse mecânico altera a expressão genética de mediadores inflamatórios específicos (ou seja, COX-2, IL-6)8,14,15 e fatores de crescimento (ou seja, TGF-β) nos tecidos gastrointestinais, especialmente células musculares lisas do intestino (SMC)16. Estudos recentes também descobriram que a expressão de mediadores pró-fibrosos específicos, como o fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) é altamente sensível ao estresse mecânico17,18. Foi a hipótese de que o estresse mecânico poderia desempenhar um papel patogênico independente na inflamação associada ao CD, fibrose e remodelagem tecidual. No entanto, a significância patogênica do estresse mecânico na inflamação intestinal, fibrose e hiperplasia muscular lisa em CD permanece em grande parte inexplorada. Isso pode ser em parte porque a inflamação é um processo mais visível e melhor estudado do que o estresse mecânico. Mais importante, não houve nenhum modelo animal bem definido de IBD para distinguir o efeito do estresse mecânico do da inflamação.

O trabalho atual descreve um modelo de roedor da colite semelhante a Crohn induzida pela injeção intracolônica de reagente hapten 2,4,6-6-trinitrobenzeno ácido sulfônico (TNBS)19,20, que pode servir para estudar o papel do estresse mecânico em CD. Verificou-se que a instilação TNBS induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com estreitamento de lúmen (estenose) no cólon distal. A estenose leva à distensão intestinal marcada (estresse mecânico)14,15, mas não inflamação visível no segmento cólon proximal ao local de instilação. Pelo contrário, o segmento de cólon distal ao local da estenose não apresenta inflamação nem estresse mecânico. Foram observadas alterações significativas na expressão genética, inflamação, fibrose e hiperplasia SMC nos três locais diferentes. Os resultados sugerem que o estresse mecânico, particularmente a expressão genética induzida pelo estresse mecânico, pode desempenhar um papel crítico no desenvolvimento de fibrose e hiperplasia na colite de Crohn.

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Protocol

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com o comitê institucional de cuidados e uso de animais da University of Texas Medical Branch (#0907051C). Ratos de Sprague-Dawley masculinos ou femininos, com ~8-9 semanas de idade, foram usados para o estudo.

1. Preparação animal

  1. Ratos rápidos por 24 horas e tratá-los com laxante (limpador de intestino, ver Tabela de Materiais) durante a noite.
  2. No dia seguinte, anestesiam ratos usando um sistema de anestesia (ver Tabela de Materiais) expondo-os a 2% de isoflurane, juntamente com 1 L/min de oxigênio durante a administração da TNBS. Verifique se há reflexos ou dedo dos dedo do tom para confirmar a anestesia.
  3. Prepare a solução TNBS fresca de acordo com os pesos corporais.
    NOTA: TNBS - 65 mg/kg de peso corporal em 250 μL de 40% de etanol foi utilizado.
  4. Coloque ratos em uma posição supina na mesa de anestesia. Para induzir colite, insira através do ânus um cateter de poliuretano de nível médico aberto por ~7-8 cm da beira anal e instile suavemente o TNBS (preparado na etapa 1.3) no cólon19. Administrar os ratos de controle falso com 250 μL apenas de soro fisiológico.
  5. Depois de incutir TNBS ou soro fisiológico, mantenha os ratos na posição supina e ligeiramente para baixo (~30°), com o ânus fechado por 2 minutos para ajudar a distribuição TNBS e evitar derramamentos.
  6. Forneça aos ratos alimentos e água ad libitum por 7 dias e observe os ratos diariamente para o peso corporal, absorção de alimentos, fezes e condição geral de saúde.

2. Preparações teciduais

  1. No dia da eutanásia, eutanásia os ratos usando inalação de CO2 e confirmar eutanásia com deslocamento cervical.
  2. Abra o abdômen de rato usando tesouras de grau cirúrgico e fórceps.
  3. Remova cuidadosamente todo o cólon (acima do canal anal) e transfira o cólon imediatamente para o tampão HBSS 1x gelado.
  4. Endireitar o cólon no tampão e medir o comprimento do cólon usando uma régua. Pegue a linha de nylon e circule ao redor do cólon para medir a circunferência externa dos segmentos de cólon em controle e ratos tratados com TNBS. Tome tecidos de espessura total para histologia.
  5. Abra o cólon ao longo da placa mesentérica e limpe bem o cólon com tampão HBSS. Avalie o cólon para escore de inflamação macroscópica com base nos critérios descritos anteriormente19 com modificações mínimas.
    NOTA: 0 = mucosa normal; 1 = hiperemia localizada, mas sem erosões ou úlceras; 2 = úlcera e estenose (área afetada < 5 mm); 3 = úlcera grave, cicatriz e estenose (área afetada > 5 mm).
  6. Coletar amostras de tecido cólon do local P (porção de 2-3 cm antes da margem oral do local da inflamação), local I (local de inflamação, tipicamente 4-6 cm da extremidade do cólon, onde o TNBS é incutido) e local D (porção 1-2 cm distal à margem aboral do local de inflamação), respectivamente de ratos tratados com TNBS.
    NOTA: Tecido de cólon de ~1-2 cm de comprimento foi retirado de cada segmento. Além disso, os tecidos de cólon de 2 cm de comprimento (~4-6 cm da extremidade do cólon) dos ratos tratados com soro fisiológico foram tomados como controle falso (S) (Figura 1).
  7. Pegue amostras de tecido de cada local para preparação de espessura total e, se desejar, as camadas mucosa/submucosa e muscularis externas, respectivamente, bem como 21,22.
  8. Congele primeiro amostras de tecido em nitrogênio líquido antes de armazená-las a -80 °C para armazenamento até um ano e para fins futuros (ou seja, preparações de RNA).

3. Avaliação histopatológica da inflamação intestinal e fibrose

  1. Fixar os tecidos de cólon de espessura total em 10% de formalina por 48 h, depois transferir para 70% de etanol por 24-48 h.
  2. Use um microtome para cortar seções de parafina de 5 μm de espessura para Hemaoxilina e eosina (H&E) e as manchas tricromáticas de Masson 6,19,23 (ver Tabela de Materiais), respectivamente.
  3. Adquira e visualize imagens com um microscópio vertical equipado com uma câmera de alta resolução com software compatível (ver Tabela de Materiais).
  4. Índices de inflamação e fibrose de grau por dois pesquisadores independentes, incluindo um patologista cirúrgico gastrointestinal de acordo com critérios descritos anteriormente 6,23 com modificações. Consulte o Arquivo Complementar 1 para obter as pontuações.
  5. Meça a espessura e os números celulares das camadas musculares circulares e longitudinais por seção transversal em quatro pontos de vista de cada espécime manchado de H&E e tome a média das quatro medidas para cada espécime.

4. Extração de RNA e RT-PCR quantitativo

  1. Homogeneize tecidos de cólon excisados obtidos do controle de sham e três locais (P, I, D) de ratos de colite TNBS no reagente de extração de um kit de extração de RNA (ver Tabela de Materiais).
  2. Isole o RNA de cada amostra utilizando o kit. Elute a pelota RNA em 30 μL de água sem RNase.
  3. Quantifique a concentração de RNA e verifique se há pureza usando um especttômetro UV-Vis microvolume (ver Tabela de Materiais).
  4. Use 1 μg de RNA total para sintetizar cDNA21,22 utilizando o kit de síntese de RNA (ver Tabela de Materiais).
  5. Analise e quantifique os níveis de expressão genética realizando PCR em tempo real com 50 ng de cDNA como modelo, testes de IL-6 e CTGF usando um kit PCR comercial para sistema PCR em tempo real (ver Tabela de Materiais).
  6. Use o gene de controle 18S rRNA para normalizar as amostras e quantificar a expressão genética relativa utilizando os valores do Cq obtidos.

5. Análise estatística

  1. Utilize software de análise estatística (ver Tabela de Materiais) para comparar o controle de sham e os ratos de colite TNBS.
  2. Considere p valor < 0,05 para ser estatisticamente significativo15,19.
  3. Para testar as diferenças entre dois grupos, use a análise t-test do Student e realize um teste ANOVA se as comparações forem superiores a dois grupos15,19.

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Representative Results

Visão macroscópica da colite semelhante a Crohn induzida pela instilação intra-cólon do TNBS
Como mostrado na Figura 1, a instilação intracolônica de TNBS em ratos induziu uma inflamação transmural localizada (~2 cm de comprimento) com parede intestinal espessa e lúmen estreito (estenose) no local da instilação no cólon distal (Figura 1A). O site da instilação TNBS é referido como site I. Como resultado de inflamação transmural e estenose, tanto inflamação quanto estresse mecânico estão presentes no local I. A estenose no local eu levei à distensão de lumen marcada no segmento proximal ao local da instilação TNBS (site P) (Figura 1). A circunferência do cólon foi significativamente aumentada nos locais P e I, em comparação com o cólon de controle falso (p < 0,05 vs. controle) (Figura 1B). Embora mecanicamente distendido, o local P não apresentou inflamação visível. Pelo contrário, o segmento cólon distal ao local de instilação do TNBS é o local D e não apresenta inflamação nem distensão mecânica (Figura 1A,B).

Para ajudar a distinguir o efeito do estresse mecânico da inflamação, seguimos um desenho único na coleta de amostras de tecido do cólon no modelo descrito na etapa 2.6. O site P é o foco principal do estudo, pois esta parte é mecanicamente distendida no modelo de CD. O local D é autocontrole, pois não apresenta estresse mecânico. Os locais P e D não demonstram nenhuma inflamação visível (Figura 1). No entanto, no local eu experio inflamação e estresse mecânico (Figura 1).

Alterações específicas do local do escore de inflamação nos locais P, I e D em ratos de colite
Os critérios foram desenvolvidos na classificação da inflamação com base no escore macroscópico do tecido vivo (0-3)19 e no escore microscópico das amostras manchadas de H&E (0-3)23 , conforme descrito com modificações. Os resultados mostraram que o escore macroscópico de inflamação no local I foi de 2,70 ± 0,20 nos ratos tratados com TNBS (7 dias após a indução de inflamação), aumentou drasticamente em relação ao dos controles falsos (0,30 ± 0,22, p < 0,05) e dos locais P (0,80 ± 0,26) e D (0,50 ± 0,22) de ratos de colite (Figura 1C). Os escores de inflamação nos locais P e D não são significativamente aumentados em comparação com a farsa (Figura 1C). As imagens microscópicas mostraram inflamação transmural induzida pelo tratamento TNBS em ratos (Figura 2A). O escore microscópico de inflamação no local I foi de 2,80 ± 0,27 nos ratos tratados com TNBS, novamente significativamente (p < 0,05, n = 5 cada grupo) aumentou em relação ao dos controles falsos (0,3 ± 0,2) e nos locais P (1,0 ± 0,31) e D (0,80 ± 0,38) de ratos de colite. Os escores de inflamação nos locais P e D não foram significativamente aumentados em comparação com a farsa (Figura 2C).

Alterações específicas do local de fibrose e hiperplasia muscular lisa e hipertrofia nos locais P, I e D em ratos colite
O escore da fibrose foi determinado com base na mancha tricrômica de Mason (Figura 2B) em diferentes locais (P, I, D) (Figura 2A). O sistema de classificação para fibrose está descrito no Arquivo Suplementar 1. Verificou-se que o escore de fibrose é significativamente aumentado não apenas no local I (2,60 ± 0,25), mas também no local P (1,60 ± 0,24) dos ratos de colite, em comparação com o controle falso (0,40 ± 0,25). p < 0,05) (Figura 2D). A espessura e o número celular de camadas musculares lisas circulares e longitudinais foram medidos em diferentes locais em amostras manchadas de H&E (4 pontos de vista por espécime). A espessura e o número celular de camadas musculares lisas circulares e longitudinais foram significativamente aumentados nos locais I e P (Figura 2E,F). O local D nos ratos de colite não mostra nenhum aumento significativo no escore de fibrose, números de células musculares lisas ou espessura muscular (Figura 2).

Expressão específica do local de genes sensíveis ao mecano nos locais P, I e D em ratos colite
O IL-6 desempenha um papel crítico na inflamação intestinal, pois promove a diferenciação de células T, danifica a função da barreira e afeta a função neuromuscular 8,24. CTGF é um mediador pró-fibroso bem reconhecido, pois sua inibição pode reverter o processo de fibrose17. Mais importante, estudos recentes descobriram que a expressão genética do IL-6 e do CTGF é altamente responsiva ao estresse mecânico 8,14,18. A expressão específica do local de il-6 e ctgf mRNAs foram determinadas no tecido de espessura total do controle falso e dos ratos de colite TNBS. Os níveis de expressão mRNA de IL-6 e CTGF foram significativamente aumentados no local de inflamação (local I) em comparação com os controles falsos. No local P, onde há distensão mecânica, mas sem inflamação visível, a expressão mRNA de IL-6 e CTGF também foi dramaticamente aumentada em comparação com ratos de controle (Figura 3A,B). No entanto, os níveis de mRNA IL-6 e CTGF no local D de ratos de colite não foram significativamente diferentes dos dos controles falsos (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Modelo de roedor de colite induzida por CD induzida por TNBS (7 dias). (A) Visão do Outlook do controle falso e do cólon tratado com TNBS (topo) e visão macroscópica da superfície mucosa do cólon distal (inferior). As caixas amarelas indicam diferentes locais de tecido de cólon. S, controle falso; Eu, local de inflamação; P, distendido local do cólon proximal ao local da inflamação; D, local não distendido distal à inflamação. (B) Circunferência do cólon no controle falso e em diferentes locais (P, I, D) de cólon tratado com TNBS. (C) Escore de inflamação macroscópica de cólon de controle falso e diferentes locais de cólon tratado com TNBS. n = 5, *p < 0,05 vs. ratos falsos do grupo. Barras representam SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Avaliação histopatológica. Vistas microscópicas em H&E (A) e manchas tricromáticas de Masson (B) mostrando distribuição de colágeno em falsos e diferentes locais de ratos de colite. A análise quantitativa mostra aumento do índice de inflamação microscópica (C), fibrose (D) e espessura muscular (hipertrofia) (E), e número de células musculares lisas (hiperplasia) (F) nos locais I e P, mas não em D, em ratos tratados com TNBS. Em (E) e (F), as barras abertas são para a camada muscular suave circular, e as barras listradas são para a camada muscular suave longitudinal. n = 5 em cada grupo, *p < 0,05 vs. ratos falsos do grupo. Barras em gráficos representam SEM. Barras em (A) e (B) = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Expressão específica do local de genes mecanosensíveis (IL-6 e CTGF) em colite semelhante a CD. (A) Expressão de IL-6 mRNA em cólon de controle falso e diferentes locais (P, I e D) de cólite tratada com TNBS. (B) Expressão de CTGF mRNA em cólon de controle falso e diferentes locais (P, I e D) de cólon colite tratado com TNBS. n = 4 ou 5, *p < 0,05 vs. S (controle falso). Barras representam SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: Pontuação de inflamação e fibrose. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

A colite induzida pelo TNBS foi introduzida em 1989 e tem sido usada como modelo experimental da doença de Crohn desde então 19,20,23. Características significativas deste modelo em roedores incluem o desenvolvimento de uma inflamação transmural que se assemelha muito às lesões histopatológicas desenvolvidas na doença humana de Crohn19,20. Estudos anteriores sobre o modelo têm focado principalmente na resposta imune aberrante na camada de mucosa no local da inflamação visível (o local I)19,20,23. Pouca atenção tem sido dada às porções intestinais proximais e distais à inflamação. O presente estudo no local da inflamação, bem como o segmento proximal distendido e o segmento distendido distendido, revela alterações específicas da expressão genética, resposta inflamatória e características histopatológicas. O modelo foi revisitado para abordar o potencial papel patogênico do estresse mecânico na fibrose e remodelagem tecidual na doença de Crohn.

Verificou-se que a inflamação aguda é imediatamente desenvolvida após a exposição mucosa de TNBS no etanol e é pico no dia 319. Estão presentes inflamações transmuros e estenose inflamatória, que está associada à distensão do lúmen no local P em cada rato tratado com TNBS. Até o dia 7, a inflamação transmural crônica é bem desenvolvida no local I, conforme encontrado no presente estudo e relatado em outros lugares20. Enquanto isso, alterações fibroses são aparentes no local, caracterizadas pelo excesso de deposição de colágeno, como visto no presente estudo e em outros lugares20. A instilação de TNBS no etanol no cólon distal fere o tecido mucosa local23 e leva a inflamação transmural em uma área localizada no cólon. A inflamação transmural com infiltração inflamatória, edema e deformação tecidual 10,12,13 no local de instilação apresentam inflamação e estresse mecânico14 na área localizada (Local I). Além disso, a inflamação transmural também causa estenose luminal no local I10. Constatou-se que a estenose, uma obstrução intestinal parcial, causa distensão mecânica no segmento proximal (local P). No entanto, a parte distal para o local de instilação não é distendida (local D). Como encontrado nos sistemas de pontuação macroscópica e histológica, enquanto o local I apresenta inflamação e estresse mecânico, os locais P e D não apresentam inflamação. Além disso, o local P apresenta circunferência significativamente aumentada (e, portanto, estresse mecânico, de acordo com a lei de Laplace14), mas o local D não. Portanto, um estudo sobre as alterações específicas do local, especialmente o local P, explorará a importância patogênica do estresse mecânico no modelo de inflamação no intestino.

Observou-se que a expressão dos genes sensíveis ao mecano IL-6 e CTGF foi aumentada no local I e no local mecanicamente esticado P, mas não no local vizinho D, onde não há distensão mecânica. Para examinar a hipótese de que o estresse mecânico pode contribuir para o desenvolvimento de fibrose e hiperplasia muscular lisa, escores de fibrose e números de células musculares lisos medidos e espessura muscular nos locais P, I e D foram determinados separadamente. Verificou-se que a fibrose e a hiperplasia SMC estão presentes nos locais I e P. No entanto, a fibrose e a hiperplasia muscular lisa não são detectadas no local D. Esses achados indicam que o estresse mecânico pode desempenhar um papel patogênico independente na síntese de colágeno e na proliferação celular na inflamação intestinal. Outros estudos são justificados para determinar se esse efeito pode ser mediado pela expressão mecânica induzida pelo estresse de fatores pró-fibrosos e de crescimento, como CTGF nos locais P e I.

Embora o modelo animal descrito em si possa ser usado para lidar com o estresse mecânico em colite stenótica semelhante a CD, ele tem limitações no objetivo de longo prazo de definir totalmente o papel patogênico do estresse mecânico na inflamação. Por exemplo, os efeitos do estresse mecânico e inflamação no local I do modelo descrito não podem ser diferenciados. Embora se presuma que o estresse mecânico esteja presente no local I por causa de infiltração inflamatória, deformação tecidual, estenose e distensão, quanto estresse mecânico contribui para as mudanças patológicas que não podem ser determinadas. Outros estudos abrangentes usando abordagens in vitro, in vivo e ex vivo podem ser necessários. Por exemplo, prevenir a distensão mecânica alimentando os animais de colite exclusivamente com uma dieta líquida clara25 pode ajudar a criar um estado de perda de distensão mecânica no modelo de colite. Por outro lado, a indução de distensão mecânica pura por obstrução da banda15 pode ajudar a criar um modelo de estresse mecânico. Além disso, o modelo de estiramento mecânico in vitro em células cultivadas14,15 auxilia na determinação quantitativa dos efeitos do estresse mecânico na expressão e função genética, pois o modo e a extensão do estresse mecânico podem ser finamente controlados no cenário in vitro.

Para preparar um modelo reprodutível de inflamação transmural e estenótica em colite semelhante a CD, conforme descrito no estudo, deve-se utilizar TNBS a 65 mg/kg em 250 μL de 40% de etanol. O modelo foi testado principalmente em ratos, machos ou fêmeas, com idade entre 8 e 9 semanas. Após a instilação de TNBS na dose, a inflamação transmural é consistentemente desenvolvida no local de instilação. A inflamação está associada à infiltração de células inflamatórias, edema e espessamento da parede intestinal, levando ao estreitamento do lúmen no local da instilação, assemelhando-se a características patológicas da doença de Crohn20. Estudos-piloto no laboratório mostraram que tnbs em doses inferiores a 50 mg/kg no mesmo volume de 40% de etanol pode causar inflamação intestinal, mas não estanose confiável no local I. Assim, não haveria distensão mecânica aparente no local P. Por outro lado, tnbs em doses superiores a 80 mg/kg podem causar inflamação grave e fatalidades. O protocolo atual utilizando TNBS a 65 mg/kg em 250 μL de 40% de etanol dificilmente causa fatalidades (1 em cada 16 ratos de colite TNBS).

Descobriu-se que a limpeza intestinal no dia anterior à instilação do TNBS é um passo importante para garantir um cólon relativamente limpo para um modelo confiável de colite estenótica. Para isso, os ratos precisam jejuar por 24 horas e dar limpador de intestino durante a noite antes do tratamento tnbs. Também é importante manter os ratos em uma posição supina e ligeiramente de cabeça para baixo com o ânus fechado por 2 minutos após a instilação da TNBS. Isso ajuda a garantir uma boa distribuição de TNBS dentro do cólon distal.

Em resumo, verificou-se que a instilação intracolônica de TNBS a 65 mg/kg em 250 μL de 40% de etanol induziu consistentemente colite semelhante a CD em ratos. A inflamação transmural no modelo está associada à estenose no local de instilação do TNBS. A distensão mecânica, mas não inflamação, é observada no segmento proximal à estenose. Nem inflamação nem estresse mecânico estão presentes no segmento distal à estenose. Com essas mudanças em diferentes locais de cólon em um rato de colite, o estresse mecânico da inflamação na colite semelhante a CD pode ser distinguido.

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Disclosures

Os autores não relatam conflito de interesses e não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado em parte por subvenções do NIH (R01 DK124611 para XZS) e do Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH-20-1-0681 para XZS). O trabalho de histologia foi feito com a ajuda do Laboratório de Patologia Cirúrgica da UTMB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

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References

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Imunologia e Infecção Questão 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

Um modelo de roedor induzido pela TNBS para estudar o papel patogênico do estresse mecânico na doença de Crohn
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Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

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