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Summary
본 프로토콜은 설치류에서 크론과 같은 대장염 모델의 개발을 설명합니다. 경막 염증은 TNBS 점안 부위에서 협착으로 이어지고, 협착증에 근접한 세그먼트에서 기계적 확대가 관찰됩니다. 이러한 변화는 대장염의 기계적 스트레스를 연구 할 수있게합니다.
Abstract
크론병(CD)과 같은 염증성 장 질환(IBD)은 유럽과 미국에서 1,00,000명당 약 20명에 영향을 미치는 위장관의 만성 염증성 질환이다. CD는 경막 염증, 장 섬유증 및 발광 협착증을 특징으로합니다. 항염증 요법은 염증을 조절하는 데 도움이 될 수 있지만 CD의 섬유증과 협착증에는 효능이 없습니다. CD의 병인은 잘 이해되지 않는다. 현재의 연구는 주로 조절되지 않는 장 면역 반응 메커니즘을 묘사하는 데 중점을 둡니다. CD 관련 경막 염증, 장 섬유증 및 발광 협착증은 모두 장 벽에 대한 기계적 스트레스를 나타내는 반면, CD에서 기계적 스트레스의 역할은 잘 정의되어 있지 않습니다. 기계적 스트레스가 CD에서 독립적 인 병원성 역할을하는지 여부를 결정하기 위해 설치류에서 TNBS 유도 CD 유사 대장염 모델의 프로토콜이 개발되었습니다. 이러한 TNBS-유도된 경막 염증 및 섬유증 모델은 결장에서의 CD의 병리학적 특징과 유사하다. 그것은 성인 Sprague-Dawley 래트의 원위 결장으로의 TNBS의 결장 내 점적에 의해 유도된다. 이 모델에서, 경막 염증은 TNBS 점안 부위 (부위 I)에서 협착을 일으킨다. 기계적 팽만감은 점적 부위(Site P)에 근접한 부분에서 관찰되며, 기계적 응력을 나타내지만 눈에 보이는 염증은 나타낸다. 염증에 원위 결장 부분 (사이트 D)은 염증이나 기계적 스트레스를 나타내지 않습니다. 다른 부위 (P, I 및 D)에서 유전자 발현, 면역 반응, 섬유증 및 평활근 성장의 독특한 변화가 관찰되어 기계적 스트레스의 중대한 영향을 강조했습니다. 따라서이 CD 유사 대장염 모델은 CD의 병원성 메커니즘, 특히 면역 조절 장애, 장 섬유증 및 CD의 조직 리모델링에서 기계적 스트레스 및 기계적 스트레스 유발 유전자 발현의 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
궤양성 대장염(UC) 및 크론병(CD)을 포함하는 염증성 장 질환(IBD)은 위장관(GI) 관에서 만성 염증을 특징으로 한다. 그것은 ~ 1-2 백만 명의 미국인에게 영향을 미칩니다1. 미국의 IBD 치료에 대한 예상 연간 비용은 $ 11.8 억입니다. UC와는 달리, CD는 경막 염증 및 협착 형성 2,3을 특징으로 한다. 협착 형성(stenosis)은 CD 환자3의 최대 70%에서 발생하며, 경막 염증(염증성 협착) 또는 장 섬유증(fibrotic stenosis)4,5에 의해 유발될 수 있다. 장 섬유증은 공정 3,4에 관여하는 주요 중간엽 세포 유형 중 하나로서 평활근 세포 (SMC)와 함께 과도한 콜라겐 침착 및 기타 세포외 매트릭스 (ECM)를 특징으로합니다. 비대와 관련된 평활근 과형성은CD6에서 섬유성 협착증의 또 다른 중요한 조직학적 변화이다. CD의 협착 형성은 만성 염증과 관련이 있지만, 외과 적 치료 2,6을 제외하고는 항 염증 치료가 효과적이지 않습니다. 그러나 수술 후 재발은 충분한 시간 2,7을 감안할 때 거의 100 %입니다. 염증 반응으로서, 섬유증 및 SMC 증식은 또한 장8,9에서 비염증성 상태 (즉, 장 폐쇄)에서 발생할 수 있다; 염증-의존적 및 독립적인 메카니즘 둘 모두가 협착 형성에 관여하는 것으로 여겨진다 3,4. 염증 의존성 메커니즘에 대한 광범위한 연구가 협착 형성을위한 효과적인 치료법으로 번역되지 않았 음을 감안할 때, 장 섬유증에서 염증 독립적 인 메커니즘의 가능한 역할에 대한 연구가 필요합니다.
비염증성 인자로서, 부종, 염증성 세포 침윤, 조직 변형, 섬유증, 및 협착증과 관련된 기계적 스트레스 (MS)10,11,12,13은 IBD, 특히 경막 염증을 특징으로 하는 CD에서 흔히 마주친다. 기계적 스트레스는 협착 CD에서 가장 현저하며, 염증 부위의 협착 (염증 또는 섬유성)은 국소 조직에 기계적 스트레스를 제공하고 폐색 부위10,14에 근접한 세그먼트에서 내강 팽창을 유도합니다. 이전의 시험관내 연구는 기계적 스트레스가 위장 조직, 특히 장 평활근 세포 (SMC)16에서 특정 염증 매개체 (즉, COX-2, IL-6)8,14,15 및 성장 인자 (즉, TGF-β)의 유전자 발현을 변화시킨다는 것을 입증했다. 최근의 연구는 또한 결합 조직 성장 인자 (CTGF)와 같은 특정 친 섬유성 매개체의 발현이 기계적 스트레스에 매우 민감하다는 것을 발견했다17,18. 기계적 스트레스가 CD 관련 염증, 섬유증 및 조직 리모델링에서 독립적 인 병원성 역할을 할 수 있다는 가설이 제기되었습니다. 그러나 CD에서 장 염증, 섬유증 및 평활근 증식증에서 기계적 스트레스의 병원성 중요성은 크게 탐구되지 않은 채로 남아 있습니다. 이것은 부분적으로 염증이 기계적 스트레스보다 더 눈에 띄고 더 잘 연구 된 과정이기 때문일 수 있습니다. 더 중요한 것은, 기계적 스트레스의 효과와 염증의 효과를 구별하기 위해 IBD의 잘 정의 된 동물 모델이 없다는 것입니다.
현재의 연구는 CD에서 기계적 스트레스의 역할을 연구하는 목적을 달성 할 수있는 합텐 시약 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰산 (TNBS) 19,20의 결장 내 주사에 의해 유도 된 크론과 같은 대장염의 설치류 모델을 설명합니다. TNBS 점안이 원위 결장에서의 내강 협착(stenosis)과 함께 국소적인(~2 cm 길이) 경막 염증을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 협착증은 현저한 장 팽만감 (기계적 스트레스)14,15로 이어지지만 점안 부위에 인접한 결장 세그먼트에서는 눈에 보이지 않는 염증을 일으킨다. 반대로, 협착 부위의 원위 결장 세그먼트는 염증이나 기계적 스트레스를 나타내지 않습니다. 유전자 발현, 염증, 섬유증, 및 SMC 과형성의 유의한 부위-특이적 변화가 세 개의 상이한 부위에서 관찰되었다. 결과는 기계적 스트레스, 특히 기계적 스트레스로 인한 유전자 발현이 크론 대장염에서 섬유증과 과형성을 일으키는 데 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 텍사스 대학 의료 지부 (#0907051C)의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행되었습니다. ∼8-9주령의 수컷 또는 암컷 Sprague-Dawley 래트를 연구에 사용하였다.
1. 동물 준비
- 24 시간 동안 빠른 쥐를 하룻밤 동안 완하제 (장 클렌저, 재료 표 참조)로 치료하십시오.
- 다음날, 마취 시스템을 사용하여 쥐를 마취 ( 재료 표 참조)하여 TNBS 투여 동안 1 L / min의 산소와 함께 2 % 이소 플루란에 노출시킵니다. 마취를 확인하기 위해 반사 신경이나 발가락을 꼬집는 것을 확인하십시오.
- 체중에 따라 신선한 TNBS 용액을 준비하십시오.
참고: TNBS - 40% 에탄올 250μL에 체중 65mg/kg이 사용되었다. - 쥐를 마취 테이블의 수핀 위치에 두십시오. 대장염을 유도하기 위해, 항문 가장자리로부터 ∼7-8 cm의 의료용 개방형 폴리우레탄 카테터를 항문을 통해 삽입하고 TNBS(단계 1.3에서 제조)를 결장19에 부드럽게 주입한다. 가짜 대조군 래트를 250 μL의 식염수로만 투여한다.
- TNBS 또는 식염수를 주입 한 후 쥐를 수핀과 약간 머리 아래로 위치 (~ 30 °)에 보관하고 항문을 2 분 동안 닫아 TNBS 분포를 돕고 유출을 피하십시오.
- 쥐에게 7 일 동안 음식과 물 광고 리비툼을 제공하고 체중, 음식 섭취량, 대변 및 일반적인 건강 상태에 대해 매일 쥐를 관찰하십시오.
2. 조직 준비
- 안락사 당일,CO2 흡입을 사용하여 쥐를 안락사시키고 자궁 경부 탈구로 안락사를 확인하십시오.
- 외과 용 가위와 집게를 사용하여 쥐 복부를 엽니 다.
- 조심스럽게 전체 결장 (항문 운하 위)을 제거하고 즉시 결장을 얼음처럼 차가운 1x HBSS 버퍼로 옮깁니다.
- 버퍼에서 콜론을 곧게 펴고 눈금자를 사용하여 콜론 길이를 측정합니다. 나일론 실을 취하여 결장 주위를 돌면서 대조군 및 TNBS 처리된 래트에서 결장 세그먼트의 외부 둘레를 측정하였다. 조직학을 위해 전체 두께 조직을 가져 가라.
- 장간막 보드를 따라 결장을 열고 HBSS 버퍼로 결장을 잘 청소하십시오. 최소 변형으로 앞서 기술된 바와 같은 기준에 기초하여 거시적 염증 점수에 대한 결장을 평가한다19 .
참고: 0 = 정상 점막; 1 = 국소 충혈이지만 침식이나 궤양 없음; 2 = 궤양 및 협착증 (환부 < 5 mm); 3 = 심한 궤양, 흉터 및 협착 (환부 > 5 mm). - TNBS 처리된 래트로부터 각각 부위 P(염증 부위의 구강 여백 전 2-3 cm 전), 부위 I(염증 부위, 전형적으로 TNBS가 주입되는 결장의 끝으로부터 4-6 cm), 및 부위 D(염증 부위의 복부 여백에 원위 부분 1-2 cm)로부터 결장 조직 샘플을 수집한다.
주: ∼1-2 cm-길이의 결장 조직은 각 세그먼트로부터 취하였다. 또한, 식염수 처리된 래트의 길이 2 cm(결장의 끝으로부터 ∼4-6 cm)의 결장 조직을 가짜 대조군(S)으로 취하였다(도 1). - 전체 두께 준비를 위해 각 부위에서 조직 샘플을 채취하고 원하는 경우 점막 / 점막하 및 근육 externa 층뿐만 아니라 각각21,22 개입니다.
- 조직 샘플을 액체 질소에서 먼저 동결시킨 후 -80°C에서 보관하여 최대 일년 동안 보관하고 향후 목적(즉, RNA 제제)을 위해 보관합니다.
3. 장내 염증과 섬유증의 조직병리학적 평가
- 전체 두께의 결장 조직을 48 시간 동안 10 % 포르말린에 고정시킨 다음 24-48 시간 동안 70 % 에탄올로 옮깁니다.
- 마이크로톰을 사용하여 헤마톡실린과 에오신(H&E) 및 마손의 삼색 염색 6,19,23(물질 표 참조)에 대해 각각 5μm 두께의 파라핀 절편을 절단한다.
- 호환되는 소프트웨어가 장착된 고해상도 카메라가 장착된 직립 현미경으로 이미지를 획득하고 봅니다( 자료표 참조).
- 등급 염증 및 섬유증 지수는 이전에 기술된 기준에 따라 위장관 외과 병리학자를 포함하는 두 명의 독립적인 조사자에 의해 6,23 변형과 함께 지수를 평가한다. 점수는 보충 파일 1을 참조하십시오.
- 단면당 원형 및 종방향 근육층의 두께와 세포 수를 각 H&E 염색된 표본의 네 가지 뷰로 측정하고 각 표본에 대한 네 가지 측정값의 평균을 취합니다.
4. RNA 추출 및 정량적 RT-PCR
- RNA 추출 키트의 추출 시약에서 TNBS 대장염 래트의 가짜 대조군 및 세 부위(P, I, D)로부터 수득된 적출된 결장 조직을 균질화 한다(표 참조).
- 키트를 이용하여 각 샘플로부터 RNA를 분리한다. RNA 펠렛을 30 μL의 RNase-free 물에 희석한다.
- RNA 농도를 정량화하고 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 순도를 확인합니다( 자료 표 참조).
- 총 RNA 1μg을 사용하여 RNA 합성 키트를 사용하여 cDNA21,22를 합성합니다(표 참조).
- 실시간 PCR 시스템용 상용 PCR 키트를 사용하여 50 ng의 cDNA, IL-6의 프로브 및 CTGF를 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행하여 유전자 발현 수준을 분석 및 정량한다( 표 참조).
- 대조군 유전자 18S rRNA를 사용하여 샘플을 정상화하고 수득된 Cq 값을 활용하여 상대적 유전자 발현을 정량화한다.
5. 통계 분석
- 통계 분석 소프트웨어 ( 자료 표 참조)를 사용하여 가짜 대조군과 TNBS 대장염 쥐를 비교하십시오.
- 0.05< p 값은 통계적으로 유의한15,19로 간주하십시오.
- 두 그룹 간의 차이를 테스트하려면 스튜던트 t-검정 분석을 사용하고 비교가 두 그룹15,19 이상인 경우 ANOVA 테스트를 수행합니다.
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Representative Results
TNBS의 결장 내 점적에 의해 유발된 크론유사 대장염의 거시적 관점
도 1에 나타난 바와 같이, 래트에서 TNBS의 결장내 점안은 원위 결장에서의 점적 부위에서 두꺼운 창벽과 좁아진 내강(협착증)으로 국소화된 경막 염증(길이∼2 cm)을 유도하였다(도 1A). TNBS 점안의 부위는 부위 I로 지칭된다. 경막 염증 및 협착증의 결과로, 염증과 기계적 스트레스가 모두 부위 I에 존재한다. 부위에서의 협착은 TNBS 점적 부위(부위 P)에 근접한 세그먼트에서 현저한 루멘 팽만감을 유도하였다(도 1). 결장 둘레는 가짜 대조군 결장과 비교하여 부위 P 및 I에서 유의하게 증가하였다 (p < 0.05 대 대조군) (도 1B). 기계적으로 흩어져있는 동안, 부위 P는 눈에 보이는 염증을 나타내지 않았다. 반대로, TNBS 점안 부위에 원위인 결장 분절은 부위 D이고 염증이나 기계적 팽만감을 나타내지 않는다(도 1A, B).
기계적 스트레스와 염증의 효과를 구별하기 위해 우리는 2.6 단계에서 설명한 모델에서 결장으로부터 조직 샘플을 수집하는 독특한 디자인을 따랐습니다. 사이트 P는 이 부분이 CD 모델에서 기계적으로 분산되어 있기 때문에 연구의 주요 초점입니다. 사이트 D는 기계적 스트레스를 나타내지 않기 때문에 자체 제어됩니다. 부위 P 및 D는 어떠한 가시적 염증도 나타내지 않는다(도 1). 그러나, 부위 I은 염증과 기계적 스트레스를 경험한다(그림 1).
대장염 래트에서 부위 P, I 및 D에서 염증 점수의 부위별 변화
기준은 변형과 함께 설명된 바와 같이 살아있는 조직의 거시적 스코어(0-3)19 및 H&E 염색된 표본의 현미경 스코어(0-3)23 에 기초하여 염증을 등급화하는 데 개발되었다. 결과는 TNBS 처리된 래트(염증 유도 후 7일)에서 염증 부위 I의 거시적 스코어가 2.70±0.20이었고, 가짜 대조군(0.30 ± 0.22, p <0.05)과 대장염 래트의 부위 P(0.80 ± 0.26) 및 D(0.50 ± 0.22)의 경우와 비교하여 극적으로 증가하였다(도 1C). 부위 P 및 D에서의 염증 점수는 sham에 비해 유의하게 증가하지 않는다(도 1C). 현미경 영상은 래트에서 TNBS 치료-유도된 경막 염증을 나타냈다(도 2A). 염증 부위 I에서의 현미경 스코어는 TNBS 처리된 래트에서 2.80 ± 0.27이었고, 다시 숍염 래트의 가짜 대조군 (0.3 < 0.2) 및 부위 P (1.0 ± 0.31) 및 D ( 0.80 ± 0.38)에서 그± 비해 유의하게 증가하였다. 부위 P 및 D에서의 염증 점수는 sham에 비해 유의하게 증가하지 않았다 (도 2C).
대장염 래트에서 부위 P, I 및 D에서의 섬유증 및 평활근 증식 및 비대의 부위별 변화
섬유증 스코어는 상이한 부위(P, I, D)에서의 메이슨의 삼색 염색(도 2B)에 기초하여 결정되었다(도 2A). 섬유증에 대한 등급 시스템은 보충 파일 1에 설명되어 있습니다. 섬유증 점수는 가짜 대조군(0.40 ± 0.25)에 비해 대장염 래트의 부위 I(2.60 ± 0.25)뿐만 아니라 부위 P(1.60 ± 0.24)에서도 유의하게 증가한다는 것이 발견되었다. p < 0.05) (도 2D). 원형 및 종방향 평활근층의 두께 및 세포 수는 H&E 염색된 표본(시편당 4뷰)의 여러 부위에서 측정되었다. 원형 및 종방향 평활근 층 둘 다의 두께 및 세포 수는 부위 I 및 P에서 유의하게 증가하였다(도 2E, F). 대장염 래트에서 부위 D는 섬유증 점수, 평활근 세포 수 또는 근육 두께에서 어떠한 유의한 증가도 나타내지 않는다(도 2).
부위-특이적 발현은 대장염 래트에서 부위 P, I 및 D에서 메카노-민감성 유전자의 특이적인 발현
IL-6는 T 세포 분화를 촉진하고 장벽 기능을 손상시키며 신경근 기능 8,24에 영향을 미치기 때문에 장 염증에 중요한 역할을 한다. CTGF는 잘 알려진 프로 섬유성 매개체이며, 그 억제는 섬유증17의 과정을 역전시킬 수 있습니다. 더 중요한 것은, 최근의 연구들은 IL-6 및 CTGF의 유전자 발현이 기계적 스트레스8,14,18에 매우 민감하다는 것을 발견하였다. IL-6 및 CTGF mRNAs의 부위-특이적 발현을 가짜 대조군 및 TNBS 대장염 래트의 전체 두께 조직에서 결정하였다. IL-6 및 CTGF의 mRNA 발현 수준은 가짜 대조군에 비해 염증 부위 (부위 I)에서 유의하게 증가하였다. 기계적 팽창이 있지만 가시적인 염증이 없는 부위 P에서, IL-6 및 CTGF의 mRNA 발현 또한 대조군 래트에 비해 극적으로 증가하였다(도 3A, B). 그러나, 대장염 래트의 부위 D에서의 IL-6 및 CTGF mRNA 수준은 가짜 대조군에서의 것과 유의하게 다르지 않았다 (도 3).
도 1: TNBS 유도 CD형 대장염의 설치류 모델(7일). (A) 가짜 대조군 및 TNBS 처리된 결장의 전망도(상단) 및 원위 결장의 점막 표면의 거시도(하단). 노란색 상자는 결장 조직의 다른 부위를 나타냅니다. S, 가짜 대조군; I, 염증 부위; P, 염증 부위에 근접한 이탈된 결장 부위; D, 염증에 원위 없는 비-원위 부위. (b) TNBS 처리된 결장의 가짜 대조군 및 상이한 부위(P, I, D)에서의 결장 둘레. (c) 가짜 대조군 결장 및 TNBS 처리된 결장의 상이한 부위의 거시적 염증 스코어. n=5, *p< 0.05 대 그룹의 가짜 래트이다. 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 조직병리학적 평가. H & E (A)와 Masson의 삼색 얼룩 (B)의 현미경 적 견해는 가짜 및 대장염 쥐의 다른 부위에서 콜라겐 분포를 보여줍니다. 정량적 분석은 TNBS 처리된 래트에서 증가된 미세한 염증 지수 (C), 섬유증 (D) 및 근육 두께 (비대) (E), 및 평활근 세포 수 (과형성) (F)를 보여 주지만 D는 아닌 부위 I 및 P에서 나타났다. (E) 및 (F)에서, 열린 막대는 원형 평활근 층을 위한 것이고, 줄무늬 막대는 종방향 평활근 층을 위한 것이다. n = 각 그룹에서 5, *p < 0.05 vs. 그룹의 가짜 쥐. 그래프의 막대는 SEM을 나타냅니다. 막대는 (A) 및 (B) = 100μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: CD 유사 대장염에서 메카노민감성 유전자 (IL-6 및 CTGF)의 부위-특이적 발현. (A) TNBS 처리된 대장염 결장의 가짜 대조군 결장 및 상이한 부위(P, I 및 D)에서의 IL-6 mRNA의 발현. (b) TNBS 처리된 대장염 결장의 가짜 대조군 결장 및 상이한 부위(P, I 및 D)에서의 CTGF mRNA의 발현. n = 4 또는 5, *p < 0.05 vs. S (가짜 제어). 막대는 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 염증 및 섬유증의 점수. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
TNBS 유발 대장염은 1989년에 도입되었으며 그 후 19,20,23년 이후 크론병의 실험 모델로 사용되어 왔다. 설치류에서이 모델의 중요한 특징은 인간 크론 병19,20에서 개발 된 조직 병리학 적 병변과 매우 유사한 경벽 염증의 발달을 포함합니다. 모델에 대한 이전의 연구는 주로 눈에 보이는 염증 부위 (사이트 I)의 점막층에서의 비정상적인 면역 반응에 초점을 맞추었다 19,20,23. 염증에 근접하고 원위 인 장 부분에 거의 관심을 기울이지 않았습니다. 염증 부위뿐만 아니라 이변된 근위 세그먼트 및 비-원위 분절에 대한 본 연구는 유전자 발현, 염증 반응 및 조직병리학적 특징의 명백한 부위-특이적 변화를 드러낸다. 이 모델은 크론병에서 섬유증 및 조직 리모델링에서 기계적 스트레스의 잠재적 병원성 역할을 다루기 위해 재검토되었다.
급성 염증은 에탄올에서 TNBS의 점막 노출 직후에 발생하며 3 일째19 일에 최고조에 달하는 것으로 나타났습니다. 경막 염증 및 염증성 협착증이 존재하며, 이는 TNBS로 치료된 모든 래트에서 부위 P에서의 내강 팽만감과 관련된다. 7일째까지, 만성 경막 염증은 현재 연구에서 발견되고 다른 곳에서보고된 바와 같이 부위 I에서 잘 발달된다20. 한편, 섬유성 변화는 본 연구 및 다른 곳(20)에서 볼 수 있는 바와 같이 과도한 콜라겐 침착을 특징으로 하는 부위에서 명백하다. 원위 결장에서의 에탄올에 TNBS를 점안하면 국소 점막 조직(23)을 손상시키고 결장 내의 국소 영역에서 경막 염증을 유발한다. 점적 부위에서 염증성 침윤, 부종 및 조직 변형(10,12,13)을 갖는 경막 염증은 국소 영역(Site I)에 염증 및 기계적 응력(14)을 제시한다. 더욱이, 경막 염증은 또한 부위 I10에서 발광 협착증을 일으킨다. 부분 장 폐쇄 인 협착증은 근위 세그먼트 (부위 P)에서 기계적 팽창을 일으킨다는 것이 발견되었습니다. 그러나, 점적 부위에 원위 부분은 분산되지 않는다(부위 D). 거시적 및 조직학적 스코어링 시스템에서 발견되는 바와 같이, 부위 I은 염증 및 기계적 스트레스를 모두 나타내는 반면, 부위 P 및 D는 염증을 나타내지 않는다. 더욱이, 부위 P는 상당히 증가된 둘레를 보여주지만(따라서 라플라스14의 법칙에 따른 기계적 응력), 부위 D는 그렇지 않다. 따라서 부위별 변화, 특히 부위 P에 대한 연구는 장의 염증 모델에서 기계적 스트레스의 병원성 중요성을 탐구 할 것입니다.
메카노 민감성 유전자 IL-6 및 CTGF의 발현은 부위 I 및 기계적으로 연신된 부위 P에서 증가하였으나, 기계적 팽만감이 없는 이웃 부위 D에서는 증가하지 않는 것으로 관찰되었다. 기계적 스트레스가 섬유증 및 평활근 과형성의 발달에 기여할 수 있다는 가설을 조사하기 위해, 섬유증 점수 및 부위 P, I 및 D에서의 평활근 세포 수 및 근육 두께를 측정하여 별도로 결정하였다. 섬유증 및 SMC 증식증이 부위 I 및 P에 존재한다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 섬유증 및 평활근 과형성은 부위 D에서 검출되지 않는다. 이러한 발견은 기계적 스트레스가 장내 염증에서 콜라겐 합성 및 세포 증식에 독립적 인 병원성 역할을 할 수 있음을 나타냅니다. 추가 연구는 이러한 효과가 부위 P 및 I에서의 CTGF와 같은 프로섬유성 및 성장 인자의 기계적 스트레스 유발 발현에 의해 매개될 수 있는지를 결정하기 위해 보증된다.
기술된 동물 모델 자체가 협착성 CD 유사 대장염에서 기계적 스트레스를 해결하기 위해 사용될 수 있지만, 염증에서 기계적 스트레스의 병원성 역할을 완전히 정의하는 것은 장기적인 목표에 한계를 갖는다. 예를 들어, 기술된 모델의 부위 I에서의 기계적 스트레스 및 염증의 효과는 분화될 수 없다. 염증성 침윤, 조직 변형, 협착 및 팽창으로 인해 부위 I에 기계적 스트레스가 존재한다고 가정하지만, 병리학 적 변화에 얼마나 많은 기계적 스트레스가 기여하는지 결정할 수는 없습니다. 시험관내, 생체내, 및 생체외 접근법을 사용하는 추가적인 포괄적인 연구가 필요할 수 있다. 예를 들어, 대장염 동물에게 명확한 액체 식이(25)를 배타적으로 공급함으로써 기계적 팽만감을 예방하는 것은 대장염 모델에서 기계적 팽창 손실 상태를 생성하는 데 도움이 될 수 있다. 한편, 폐색 밴드(15)에 의한 순수한 기계적 팽창의 유도는 기계적 응력 이득 모델을 생성하는 데 도움이 될 수 있다. 더욱이, 배양된 세포(14,15)에서의 시험관내 기계적 스트레치 모델은 기계적 스트레스의 모드 및 정도가 시험관내 설정에서 미세하게 조절될 수 있기 때문에, 유전자 발현 및 기능에 대한 기계적 스트레스의 영향의 정량적 결정을 보조한다.
연구에 설명 된대로 CD와 같은 대장염에서 경막 및 협착성 염증의 재현 가능한 모델을 준비하려면 40 % 에탄올 250 μL에서 65 mg / kg의 TNBS를 사용해야합니다. 상기 모델은 주로 8-9주령의 래트, 수컷 또는 암컷에서 시험하였다. 복용량에 TNBS를 점안 한 후, 경막 염증은 국소 점안 부위에서 지속적으로 발생합니다. 염증은 염증 세포 침윤, 부종 및 장 벽이 두꺼워지는 것과 관련이 있으며, 점적 부위에서 내강이 좁아지고 크론 병20의 병리학 적 특성과 유사합니다. 실험실에서의 파일럿 연구에 따르면 40 % 에탄올의 동일한 부피에서 50 mg / kg 미만의 용량의 TNBS는 장 염증을 유발할 수 있지만 사이트 I에서는 신뢰할 수있는 협착을 일으키지 않을 수 있습니다. 따라서, 부위 P에는 명백한 기계적 팽만감이 없을 것이다. 반면에 80 mg / kg 이상의 용량의 TNBS는 심각한 염증과 사망자를 유발할 수 있습니다. 40 % 에탄올의 250 μL에서 65 mg / kg의 TNBS를 사용하는 현재의 프로토콜은 거의 사망자를 일으키지 않습니다 (TNBS 대장염의 16 쥐 중 1 마리).
TNBS를 점안하기 전날 장 클렌징은 협착성 대장염의 신뢰할 수있는 모델에 대해 비교적 깨끗한 결장을 보장하는 중요한 단계임을 발견했습니다. 이를 위해 쥐는 TNBS 치료 전에 24 시간 동안 금식하고 밤새 장 클렌저를 제공해야합니다. TNBS를 점안 한 후 항문을 닫은 상태에서 쥐를 수핀과 약간 머리 아래로 유지하는 것도 중요합니다. 이것은 원위 결장 내에서 TNBS의 양호한 분포를 보장하는 데 도움이됩니다.
요약하면, 40% 에탄올 250 μL에서 65 mg/kg의 TNBS의 결장 내 점안이 래트에서 CD와 유사한 대장염을 지속적으로 유도한다는 것이 발견되었다. 모델에서 경막 염증은 TNBS 점안 부위에서의 협착과 관련이 있다. 염증은 아니지만 기계적 팽창은 협착증에 가까운 세그먼트에서 관찰됩니다. 염증이나 기계적 스트레스는 협착증의 원위 부분에 존재하지 않습니다. 대장염 쥐의 다른 결장 부위에서 이러한 변화로 인해 CD와 같은 대장염의 염증으로 인한 기계적 스트레스를 구별 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이없고 공개 할 것이 없다고보고합니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH (R01 DK124611에서 XZS로)와 미국 국방부 (W81XWH-20-1-0681에서 XZS로)의 보조금으로 부분적으로 지원됩니다. 조직학 작업은 UTMB 외과 병리학 연구소의 도움으로 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
References
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
- Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
- Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
- Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
- Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
- Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
- Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
- Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
- Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
- Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
- Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
- Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
- Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
- Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24 (2012).
- Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
- Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
- Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
- Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
- Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
- Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).
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면역학 및 감염 문제 181Erratum
Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.
