Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En TNBS-indusert gnagermodell for å studere den patogene rollen som mekanisk stress i Crohns sykdom

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Den nåværende protokollen beskriver utviklingen av en Crohns-lignende kolittmodell hos gnagere. Transmural betennelse fører til stenose på TNBS innåndingssted, og mekanisk utvidelse observeres i segmentet proksimalt til stenose. Disse endringene tillater å studere mekanisk stress i kolitt.

Abstract

Inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) som Crohns sykdom (CD) er kroniske inflammatoriske lidelser i mage-tarmkanalen som påvirker omtrent 20 per 100.000 i Europa og USA. CD er preget av transmural betennelse, tarmfibrose og luminal stenose. Selv om antiinflammatoriske terapier kan bidra til å kontrollere betennelse, har de ingen effekt på fibrose og stenose i CD. Patogenesen av CD er ikke godt forstått. Aktuelle studier fokuserer hovedsakelig på avgrensning av dysregulerte tarmimmunitetsmekanismer. Mens CD-assosiert transmural betennelse, intestinal fibrose og luminal stenose alle representerer mekanisk stress til tarmveggen, er rollen som mekanisk stress i CD ikke godt definert. For å avgjøre om mekanisk stress spiller en uavhengig patogen rolle i CD, er det utviklet en protokoll av TNBS-indusert CD-lignende kolittmodell hos gnagere. Denne TNBS-induserte transmurale betennelses- og fibrosemodellen ligner patologiske kjennetegn på CD i tykktarmen. Det er indusert ved intrakolon instillasjon av TNBS i distal kolon av voksne Sprague-Dawley rotter. I denne modellen fører transmural betennelse til stenose på TNBS instillasjonssted (område I). Mekanisk distensjon observeres i den delen som er proksimal til innåndingsstedet (sted P), som representerer mekanisk stress, men ikke synlig betennelse. Den koloniske delen distal til betennelse (område D) presenterer verken betennelse eller mekanisk stress. Karakteristiske endringer av genuttrykk, immunrespons, fibrose og jevn muskelvekst på forskjellige steder (P, I og D) ble observert, og fremhevet en dyp innvirkning av mekanisk stress. Derfor vil denne modellen av CD-lignende kolitt hjelpe oss å bedre forstå CD-ens patogene mekanismer, spesielt rollen som mekanisk stress og mekanisk stressindusert genuttrykk i immundysregulering, tarmfibrose og vevsoppussing i CD.

Introduction

Inflammatorisk tarmsykdom (IBD), inkludert ulcerøs kolitt (UC) og Crohns sykdom (CD), er preget av kronisk betennelse i mage-tarmkanalen (GI). Det påvirker ~ 1-2 millioner amerikanere1. De estimerte årlige kostnadene for IBD-omsorg i USA er 11,8 milliarder dollar. I motsetning til UC er CDen preget av transmural betennelse ogstrenghetsdannelse 2,3. Strikturdannelse (stenose) forekommer hos opptil 70% av CD-pasientene3 og kan være forårsaket av transmural betennelse (inflammatorisk stenose) eller tarmfibrose (fibrotisk stenose)4,5. Intestinal fibrose er preget av overdreven kollagenavsetning og andre ekstracellulære matriser (ECM) med glatte muskelceller (SMC) som en av de viktigste mesenchymale celletypene som er involvert i prosessen 3,4. Glatt muskelhyperplasi assosiert med hypertrofi er en annen signifikant histologisk endring i fibrotisk stenose i CD6. Selv om streng dannelse i CD er forbundet med kronisk betennelse, er ingen antiinflammatorisk behandling effektiv, bortsett fra kirurgisk behandling 2,6. Imidlertid er tilbakefall etter operasjonen nesten 100%, gitt tilstrekkelig tid 2,7. Som en inflammatorisk respons kan fibrose og SMC hyperplasi også utvikle seg i ikke-inflammatoriske forhold (dvs. tarmobstruksjon) i tarmen 8,9; Det antas at både betennelsesavhengige og uavhengige mekanismer er involvert i strenghetsdannelse 3,4. Gitt at omfattende forskning på betennelsesavhengige mekanismer ikke har oversatt til noen effektiv terapi for streng dannelse, er det nødvendig med studier av mulig rolle av betennelsesuavhengige mekanismer i tarmfibrose.

Som en ikke-inflammatorisk faktor oppstår mekanisk stress (MS) forbundet med ødem, inflammatorisk celleinfiltrasjon, vevsdeformasjon, fibrose og stenose 10,11,12,13 ofte i IBD, spesielt CD, som er preget av transmural betennelse. Mekanisk stress er mest bemerkelsesverdig i stenotisk CD, hvor stenose (inflammatorisk eller fibrotisk) i betennelsesstedet presenterer mekanisk stress i det lokale vevet og fører til lumen distention i segmentet proksimalt til hindringsstedet10,14. Tidligere in vitro-studier har vist at mekanisk stress endrer genuttrykket til spesifikke inflammatoriske mediatorer (dvs. COX-2, IL-6)8,14,15 og vekstfaktorer (dvs. TGF-β) i mage-tarmvevet, spesielt tarm glatte muskelceller (SMC)16. Nyere studier fant også at uttrykket av spesifikke pro-fibrotiske mediatorer som bindevevsvekstfaktor (CTGF) er svært følsomt for mekanisk stress17,18. Det ble hypoteset at mekanisk stress kunne spille en uavhengig patogen rolle i CD-assosiert betennelse, fibrose og vevsoppussing. Imidlertid forblir den patogene betydningen av mekanisk stress i tarmbetennelse, fibrose og glatt muskelhyperplasi i CD stort sett uutforsket. Dette kan delvis skyldes at betennelse er en mer synlig og bedre studert prosess enn mekanisk stress. Enda viktigere er at det ikke har vært noen veldefinert dyremodell av IBD for å skille effekten av mekanisk stress fra betennelse.

Det nåværende arbeidet beskriver en gnagermodell av Crohns-lignende kolitt indusert ved intrakolon injeksjon av hapten reagens 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)19,20, som kan tjene formålet med å studere rollen som mekanisk stress i CD. Det ble funnet at TNBS instillasjon induserte en lokalisert (~ 2 cm lang) transmural betennelse med lumen innsnevring (stenose) i distal kolon. Stenosen fører til markert tarmdistensjon (mekanisk stress)14,15, men ikke synlig betennelse i det koloniske segmentet proksimalt til innåndingsstedet. Tvert imot presenterer kolonsegmentet distalt for stenosestedet verken betennelse eller mekanisk stress. Signifikante stedsspesifikke endringer i genuttrykk, betennelse, fibrose og SMC hyperplasi ble observert på de tre forskjellige stedene. Resultatene tyder på at mekanisk stress, spesielt mekanisk stressindusert genuttrykk, kan spille en kritisk rolle i utviklingen av fibrose og hyperplasi i Crohns kolitt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til den institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen ved University of Texas Medical Branch (#0907051C). Mannlige eller kvinnelige Sprague-Dawley rotter, ~ 8-9 uker gamle, ble brukt til studien.

1. Dyreforberedelse

  1. Raske rotter i 24 timer og behandle dem med (tarmrens, se Materialliste) over natten.
  2. Neste dag bedøver du rotter ved hjelp av et anestesisystem (se Materialfortegnelse) ved å eksponere dem for 2% isofluran sammen med 1 L/min oksygen under TNBS-administrasjon. Se etter reflekser eller klype tær for å bekrefte bedøvelse.
  3. Forbered fersk TNBS-løsning i henhold til kroppsvekter.
    MERK: TNBS - 65 mg/kg kroppsvekt i 250 μL 40% etanol ble brukt.
  4. Sett rotter i en liggende stilling på anestesibordet. For å indusere kolitt, sett gjennom anusen et medisinsk-grade open-end polyuretankateter i ~ 7-8 cm fra analkanten og innpod forsiktig TNBS (utarbeidet i trinn 1.3) i tykktarmen19. Administrer sham kontroll rotter med 250 μL saltvann bare.
  5. Etter å ha innpodet TNBS eller saltvann, hold rotter i liggende og litt head-down posisjon (~ 30°), med anus lukket i 2 min for å hjelpe TNBS distribusjon og unngå søl.
  6. Gi rotter mat og vann ad libitum i 7 dager og observere rotter daglig for kroppsvekt, matopptak, avføring og generell helsetilstand.

2. Vev preparater

  1. På dagen for eutanasi avliver du rottene ved hjelp av CO 2-innånding og bekrefter eutanasi med livmorhalsdislokasjon.
  2. Åpne rottelivet ved hjelp av kirurgisk saks og tang.
  3. Fjern forsiktig hele tykktarmen (over analkanalen) og overfør tykktarmen umiddelbart til iskald 1x HBSS-buffer.
  4. Rett opp kolonet i bufferen, og mål kolonlengden ved hjelp av en linjal. Ta nylontråd og sirkel rundt tykktarmen for å måle den ytre omkretsen av kolonsegmentene i kontroll og TNBS-behandlede rotter. Ta vev i full tykkelse for histologi.
  5. Skjær opp tykktarmen langs det mesenteriske brettet og rengjør tykktarmen godt med HBSS-buffer. Vurder tykktarmen for makroskopisk betennelsespoeng basert på kriteriene som tidligere beskrevet19 med minimale modifikasjoner.
    MERK: 0 = normal slimhinne; 1 = lokalisert hyperemi, men ingen erosjoner eller sår; 2 = sår og stenose (berørt område < 5 mm); 3 = alvorlig sår, arr og stenose (berørt område > 5 mm).
  6. Samle kolonvevsprøver fra P (del 2-3 cm før oral margin av betennelsesstedet), sted I (betennelsessted, vanligvis 4-6 cm fra enden av tykktarmen, hvor TNBS er innpodet til), og sted D (del 1-2 cm distal til aboral margin av betennelsessted), henholdsvis fra TNBS-behandlede rotter.
    MERK: Kolonvev på ~1-2 cm lang ble tatt fra hvert segment. I tillegg ble kolonvevet på 2 cm langt (~ 4-6 cm fra enden av tykktarmen) av saltvannsbehandlede rotter tatt som sham control (S) (figur 1).
  7. Ta vevsprøver fra hvert sted for full tykkelse forberedelse, og om ønskelig, mucosa / submucosa og muscularis externa lag, henholdsvis, samt21,22.
  8. Frys vevsprøver i flytende nitrogen først før du lagrer dem ved -80 °C for lagring opptil ett år og for fremtidige formål (dvs. RNA-preparater).

3. Histopatologisk vurdering av tarmbetennelse og fibrose

  1. Fest kolonvevet i full tykkelse i 10% formalin i 48 timer, og overfør deretter til 70% etanol i 24-48 timer.
  2. Bruk en mikrotom til å kutte parafinseksjoner med 5 μm tykkelse for henholdsvis Hematoxylin og eosin (H&E) og Massons Trichrome-flekkerpå henholdsvis 6,19,23 (se Materialfortegnelse).
  3. Anskaffe og vise bilder med et oppreist mikroskop utstyrt med et høyoppløselig kamera med kompatibel programvare (se Materialfortegnelsen).
  4. Grad betennelse og fibrose indekser av to uavhengige etterforskere, inkludert en gastrointestinal kirurgisk patolog i henhold til kriterier beskrevet tidligere 6,23 med modifikasjoner. Se Tilleggsfil 1 for poengsummene.
  5. Mål tykkelsen og celletallene til de sirkulære og langsgående muskellagene per tverrsnitt i fire visninger av hver H&E farget prøve og ta gjennomsnittet av de fire målingene for hver prøve.

4. RNA-ekstraksjon og kvantitativ RT-PCR

  1. Homogeniser utskilte kolonvev hentet fra sham-kontrollen og tre steder (P, I, D) av TNBS kolittrotter i ekstraksjonsreagenset til et RNA-ekstraksjonssett (se Materialtabell).
  2. Isoler RNA fra hver prøve ved hjelp av settet. Elute RNA-pelletsen i 30 μL RNase-fritt vann.
  3. Kvantifisere RNA-konsentrasjonen og se etter renhet ved hjelp av et mikrovolum UV-Vis spektrofotometer (se materialfortegnelse).
  4. Bruk 1 μg totalt RNA for å syntetisere cDNA21,22 ved hjelp av RNA-syntesesettet (se Materialtabell).
  5. Analyser og kvantifisere genuttrykksnivåer ved å utføre PCR i sanntid med 50 ng cDNA som mal, sonder av IL-6 og CTGF ved hjelp av et kommersielt PCR-sett for PCR-system i sanntid (se Materialfortegnelse).
  6. Bruk kontrollgen 18S rRNA til å normalisere prøvene og kvantifisere relativ genuttrykk ved hjelp av de oppnådde Cq-verdiene.

5. Statistisk analyse

  1. Bruk statistisk analyseprogramvare (se Materialfortegnelse) for å sammenligne sham control og TNBS kolittrotter.
  2. Se på p-verdien < 0,05 som statistisksignifikante 15,19.
  3. For å teste forskjellene mellom to grupper, bruk Students t-testanalyse og utfør en ANOVA-test hvis sammenligningene er mer enn to grupper15,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Makroskopisk syn på Crohns-lignende kolitt indusert ved intrakolonial instillasjon av TNBS
Som vist i figur 1 induserte intrakolonial instillasjon av TNBS hos rotter en lokalisert transmural betennelse (~ 2 cm i lengde) med fortykket tarmvegg og innsnevret lumen (stenose) på innpodingsstedet i distal kolon (figur 1A). Området for TNBS-instillasjon kalles område I. Som et resultat av transmural betennelse og stenose er både betennelse og mekanisk stress til stede på sted I. Stenosen på stedet jeg førte til markert lumen distention i segmentet proksimalt til stedet for TNBS instillasjon (p) (figur 1). Kolonomkretsen ble betydelig økt på P og I, sammenlignet med sham control colon (p < 0,05 vs. kontroll) (figur 1B). Mens mekanisk distended, stedet P viste ikke synlig betennelse. Tvert imot er det koloniske segmentet som er distalt for TNBS-innåndingsstedet, sted D og presenterer verken betennelse eller mekanisk distensjon (figur 1A, B).

For å bidra til å skille effekten av mekanisk stress fra betennelse, fulgte vi en unik design for å samle vevsprøver fra tykktarmen i modellen beskrevet i trinn 2.6. Site P er hovedfokuset i studien, da denne delen er mekanisk distended i CD-modellen. Sted D er selvkontroll, da det ikke presenterer mekanisk stress. Steder P og D viser ingen synlig betennelse (figur 1). Imidlertid opplever nettstedet jeg opplever betennelse og mekanisk stress (figur 1).

Stedsspesifikke endringer av betennelsespoeng på steder P, I og D hos kolittrotter
Kriteriene ble utviklet ved gradering av betennelse basert på den makroskopiske skåren av levende vev (0-3)19 og den mikroskopiske poengsummen av H&E-fargede prøver (0-3)23 som beskrevet med modifikasjoner. Resultatene viste at den makroskopiske skåren av betennelse på stedet I var 2,70 ± 0,20 i TNBS-behandlede rotter (7 dager etter induksjon av betennelse), dramatisk økt sammenlignet med sham-kontroller (0,30 ± 0,22, p < 0,05) og områdene P (0,80 ± 0,26) og D (0,50 ± 0,22) kolittrotter (figur 1C). Betennelsespoengene på steder P og D økes ikke signifikant sammenlignet med sham (figur 1C). Mikroskopisk avbildning viste TNBS behandlingsindusert transmural betennelse hos rotter (figur 2A). Den mikroskopiske skåren av betennelse på stedet jeg var 2,80 ± 0,27 i TNBS-behandlede rotter, igjen signifikant (p < 0,05, n = 5 hver gruppe) økt sammenlignet med det i sham-kontroller (0,3 ± 0,2) og på steder P (1,0 ± 0,31) og D (0,80 ± 0,38) kolittrotter. Betennelsespoengene på P og D ble ikke signifikant økt sammenlignet med sham (figur 2C).

Stedsspesifikke endringer av fibrose og glatt muskelhyperplasi og hypertrofi på steder P, I og D hos kolittrotter
Fibroseresultatet ble bestemt basert på Masons trichrome-flekk (figur 2B) på forskjellige steder (P, I, D) (figur 2A). Karaktersystemet for fibrose er beskrevet i tilleggsfil 1. Det ble funnet at fibrose score er betydelig økt ikke bare i stedet I (2,60 ± 0,25), men også på stedet P (1,60 ± 0,24) av kolittrotter, sammenlignet med sham control (0,40 ± 0,25. p < 0,05) (figur 2D). Tykkelsen og celletallet for sirkulære og langsgående glatte muskellag ble målt på forskjellige steder i H&E fargede prøver (4 visninger per prøve). Tykkelsen og celletallene til både sirkulære og langsgående glatte muskellag ble betydelig økt på steder I og P (figur 2E, F). Nettstedet D i kolittrotter viser ingen signifikant økning i fibrose score, glatte muskelcelletall eller muskeltykkelse (figur 2).

Stedsspesifikk uttrykk for mekanofølsomme gener på steder P, I og D hos kolittrotter
IL-6 spiller en kritisk rolle i tarmbetennelse, da det fremmer T-celledifferensiering, skader barrierefunksjon og påvirker nevromuskulær funksjon 8,24. CTGF er en anerkjent pro-fibrotisk mediator, da hemmingen kan reversere prosessen med fibrose17. Enda viktigere er at nyere studier fant at genuttrykket til IL-6 og CTGF er svært responsivt på mekanisk stress 8,14,18. Det stedsspesifikke uttrykket for IL-6 og CTGF mRNAer ble bestemt i full tykkelse vev av sham kontroll og TNBS kolitt rotter. MRNA-uttrykksnivåene il-6 og CTGF ble betydelig økt i betennelsesstedet (sted I) sammenlignet med sham-kontroller. På sted P, hvor det er mekanisk distensjon, men ingen synlig betennelse, ble mRNA-uttrykket for IL-6 og CTGF også dramatisk økt sammenlignet med kontrollrotter (figur 3A, B). IL-6- og CTGF mRNA-nivåene på sted D av kolittrotter var imidlertid ikke signifikant forskjellig fra det i sham-kontroller (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Gnagermodell av TNBS-indusert CD-lignende kolitt (7 dager). (A) Outlook-visning av skamkontroll og TNBS-behandlet kolon (øverst) og makroskopisk visning av slimhinnens overflate i det distale tykktarmen (bunn). De gule boksene indikerer forskjellige steder av kolonvev. S, sham kontroll; Jeg, betennelsessted; P, distended kolon området proksimalt til betennelse sted; D, ikke-distended nettstedet distal til betennelse. (B) Kolonomkrets i skamkontroll og forskjellige steder (P, I, D) av TNBS-behandlet kolon. (C) Makroskopisk betennelse score av sham kontroll kolon og ulike steder av TNBS-behandlet kolon. n = 5, * p < 0,05 vs. sham rotter av gruppen. Barer representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Histopatologisk vurdering. Mikroskopiske synspunkter i H&E (A) og Massons trichrome flekker (B) som viser kollagenfordeling i skam og forskjellige steder av kolittrotter. Kvantitativ analyse viser økt mikroskopisk betennelsesindeks (C), fibrose (D) og muskeltykkelse (hypertrofi) (E) og glatt muskelcellenummer (hyperplasi) (F) på steder I og P, men ikke D, i TNBS-behandlede rotter. I (E) og (F) er de åpne stolpene for det sirkulære glatte muskellaget, og stripete stenger er for det langsgående glatte muskellaget. n = 5 i hver gruppe, *p < 0,05 vs. sham rotter av gruppen. Stolper i grafer representerer SEM. Bars in (A) og (B) = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Stedsspesifikk uttrykk for mekanosensitive gener (IL-6 og CTGF) i CD-lignende kolitt. (A) Uttrykk for IL-6 mRNA i sham control colon og forskjellige steder (P, I og D) av TNBS-behandlet kolittkoloni. (B) Uttrykk for CTGF mRNA i sham control colon og forskjellige steder (P, I og D) av TNBS-behandlet kolitt kolon. n = 4 eller 5, *p < 0,05 vs. S (sham-kontroll). Barer representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Skår av betennelse og fibrose. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TNBS-indusert kolitt ble introdusert i 1989 og har blitt brukt som en eksperimentell modell av Crohns sykdom siden da 19,20,23. Betydelige trekk ved denne modellen hos gnagere inkluderer utviklingen av en transmural betennelse som ligner på histopatologiske lesjoner utviklet i menneskelig Crohns sykdom19,20. Tidligere studier på modellen har hovedsakelig fokusert på avvikende immunrespons i slimhinnelaget på stedet for synlig betennelse (nettstedet I) 19,20,23. Liten oppmerksomhet har blitt betalt til tarmdelene proksimal og distal til betennelse. Den nåværende studien på betennelsesstedet, så vel som det distended proksimale segmentet og det ikke-distended distale segmentet, avslører tilsynelatende stedsspesifikke endringer i genuttrykk, inflammatorisk respons og histopatologiske egenskaper. Modellen har blitt revidert for å adressere den potensielle patogene rollen som mekanisk stress i fibrose og vevsoppussing i Crohns sykdom.

Det ble funnet at akutt betennelse umiddelbart utvikles etter mucosal eksponering av TNBS i etanol og er toppet på dag 319. Transmural betennelse og inflammatorisk stenose er tilstede, som er forbundet med lumen distention på sted P i hver rotte behandlet med TNBS. Ved dag 7 er kronisk transmural betennelse godt utviklet på sted I, som funnet i den nåværende studien og rapportert andre steder20. I mellomtiden er fibrotiske endringer tydelige på nettstedet, preget av overdreven kollagenavsetning, som vist i den nåværende studien og andre steder20. TNBS instillasjon i etanol i distal kolon skader det lokale slimhinnevevet23 og fører til transmural betennelse i et lokalisert område i tykktarmen. Den transmurale betennelsen med inflammatorisk infiltrasjon, ødem og vevsdeformasjon 10,12,13 i instillasjonsstedet presenterer betennelse og mekanisk stress14 til det lokaliserte området (sted I). Videre forårsaker transmural betennelse også luminal stenose på stedet I10. Det ble funnet at stenose, en delvis tarmobstruksjon, forårsaker mekanisk distensjon i det proksimale segmentet (sted P). Delen som er distal til innåndingsstedet, er imidlertid ikke distended (område D). Som det finnes i de makroskopiske og histologiske skåringssystemene, mens stedet presenterer jeg både betennelse og mekanisk stress, lokaliteter P og D presenterer ikke betennelse. Videre viser sted P betydelig økt omkrets (og dermed mekanisk stress, i henhold til loven i Laplace14), men nettstedet D gjør det ikke. Derfor vil en studie på de stedsspesifikke endringene, spesielt nettstedet P, utforske den patogene betydningen av mekanisk stress i betennelsesmodellen i tarmen.

Det ble observert at uttrykket av mekanofølsomme gener IL-6 og CTGF ble økt på sted I og i mekanisk strukket sted P, men ikke i nabostedet D, hvor det ikke er mekanisk distensjon. For å undersøke hypotesen om at mekanisk stress kan bidra til utvikling av fibrose og glatt muskelhyperplasi, ble fibrose score og målt glatte muskelcelletall og muskeltykkelse på steder P, I og D bestemt separat. Det ble funnet at fibrose og SMC hyperplasi er til stede på nettsteder I og P. Fibrose og glatt muskelhyperplasi oppdages imidlertid ikke på sted D. Disse funnene indikerer at mekanisk stress kan spille en uavhengig patogen rolle i kollagensyntese og celleproliferasjon i tarmbetennelse. Videre studier er berettiget til å avgjøre om denne effekten kan formidles av mekanisk stressindusert uttrykk for pro-fibrotiske og vekstfaktorer som CTGF på nettstedene P og I.

Selv om den beskrevne dyremodellen selv kan brukes til å håndtere mekanisk stress i stenotisk CD-lignende kolitt, har den begrensninger i det langsiktige målet om å fullt ut definere den patogene rollen som mekanisk stress i betennelse. For eksempel kan effekten av mekanisk stress og betennelse på stedet I av den beskrevne modellen ikke differensieres. Selv om det antas at mekanisk stress er tilstede på stedet I på grunn av inflammatorisk infiltrasjon, vevsdeformasjon, stenose og distensjon, hvor mye mekanisk stress bidrar til de patologiske endringene, kan det ikke bestemmes. Ytterligere omfattende studier med in vitro-, in vivo- og ex vivo-tilnærminger kan være nødvendig. For eksempel kan forebygging av mekanisk distensjon ved å mate kolittdyrene utelukkende med et klart flytende kosthold25 bidra til å skape tap av mekanisk distensjonsstatus i kolittmodellen. På den annen side kan induksjon av ren mekanisk distensjon ved obstruksjonsbånd15 bidra til å skape en forsterkning av mekanisk stressmodell. Videre hjelper den in vitro mekaniske stretchmodellen i dyrkede celler14,15 i kvantitativ bestemmelse av effekten av mekanisk stress på genuttrykk og funksjon, da modus og omfang av mekanisk stress kan finstyres i in vitro-innstillingen.

For å forberede en reproduserbar modell av transmural og stenotisk betennelse i CD-lignende kolitt som beskrevet i studien, må TNBS ved 65 mg/kg i 250 μL 40% etanol brukes. Modellen ble testet hovedsakelig hos rotter, mann eller kvinne, 8-9 uker gammel. Etter instillasjon av TNBS ved dosen utvikles transmural betennelse konsekvent på det lokale innpodingsstedet. Betennelsen er forbundet med inflammatorisk celler infiltrasjon, ødem og tarmvegg fortykning, noe som fører til lumen innsnevring på innåndingsstedet, som ligner patologiske egenskaper ved Crohns sykdom20. Pilotstudier i laboratoriet viste at TNBS ved doser lavere enn 50 mg/kg i samme volum på 40% etanol kan forårsake tarmbetennelse, men ikke pålitelig stenose på sted I. Dermed ville det ikke være noen tilsynelatende mekanisk distensjon på sted P. På den annen side kan TNBS ved doser over 80 mg/kg forårsake alvorlig betennelse og dødsfall. Den nåværende protokollen som bruker TNBS ved 65 mg/kg i 250 μL 40% etanol forårsaker knapt dødsfall (1 av 16 rotter TNBS kolitt).

Det ble funnet at tarmrensing dagen før innånding av TNBS er et viktig skritt for å sikre en relativt ren kolon for en pålitelig modell av stenotisk kolitt. For det må rotter faste i 24 timer og gi tarmrens over natten før TNBS-behandling. Det er også viktig å holde rotter i en liggende og litt head-down posisjon med anus lukket i 2 minutter etter innånding av TNBS. Dette bidrar til å sikre en god fordeling av TNBS inne i det distale tykktarmen.

Oppsummert ble det funnet at intrakolon instillasjon av TNBS ved 65 mg / kg i 250 μL av 40% etanol konsekvent indusert CD-lignende kolitt hos rotter. Transmural betennelse i modellen er forbundet med stenose på TNBS instillasjonssted. Mekanisk distensjon, men ikke betennelse, observeres i segmentet proksimalt for stenosen. Verken betennelse eller mekanisk stress er tilstede i segmentet distalt for stenosen. Med disse endringene i forskjellige kolonsteder i en kolittrotte, kan mekanisk stress fra betennelse i CD-lignende kolitt skille seg ut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikt og har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes delvis av tilskudd fra NIH (R01 DK124611 til XZS) og det amerikanske forsvarsdepartementet (W81XWH-20-1-0681 til XZS). Histologiarbeidet ble gjort ved hjelp av UTMB Surgical Pathology Lab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
  2. Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
  3. Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
  4. Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
  5. Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
  6. Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
  7. Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
  8. Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
  9. Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
  10. Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
  11. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  12. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  13. Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
  14. Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
  15. Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
  16. Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
  17. Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24 (2012).
  18. Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
  19. Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
  20. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
  21. Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
  22. Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
  23. Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  24. Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
  25. Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

En TNBS-indusert gnagermodell for å studere den patogene rollen som mekanisk stress i Crohns sykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter