Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מודל מכרסמים המושרה על ידי TNBS לחקר התפקיד הפתוגניים של מתח מכני במחלת קרוהן

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הפיתוח של מודל קוליטיס דמוי קרוהן במכרסמים. דלקת טרנסמולרית מובילה להיצרות באתר ההחדרה של TNBS, והגדלה מכנית נצפתה במגזר הפרוקסימלי להיצרות. שינויים אלה מאפשרים ללמוד מתח מכני בקוליטיס.

Abstract

מחלות מעי דלקתיות (IBD) כגון מחלת קרוהן (CD) הן הפרעות דלקתיות כרוניות במערכת העיכול המשפיעות על כ -20 לכל 1,000,000 באירופה ובארה"ב. התקליטור מאופיין בדלקת טרנסמורלית, פיברוזיס מעיים והיצרות זוהרת. למרות טיפולים אנטי דלקתיים עשויים לעזור לשלוט בדלקת, אין להם יעילות על פיברוזיס והיצרות בתקליטור. הפתוגנזה של התקליטור אינה מובנת היטב. המחקרים הנוכחיים מתמקדים בעיקר בתיחום מנגנוני התגובה החיסונית של המעיים. בעוד שדלקת טרנסמולרית הקשורה לתקליטור, פיברוזיס מעיים והיצרות זוהרת מייצגים כולם מתח מכני על דופן המעיים, תפקיד הלחץ המכני בתקליטור אינו מוגדר היטב. כדי לקבוע אם מתח מכני ממלא תפקיד פתוגניים עצמאי בתקליטור, פותח פרוטוקול של מודל קוליטיס דמוי תקליטור המושרה TNBS במכרסמים. מודל זה של דלקת טרנסמורלית ופיברוזיס המושרה על ידי TNBS דומה לסימני היכר פתולוגיים של תקליטור במעי הגס. זה מושרה על ידי החדרה intracolonic של TNBS לתוך המעי הגס הדיסטלי של חולדות ספראג-דולי בוגרות. במודל זה, דלקת טרנסמורלית מובילה להיצרות באתר ההחדרה של TNBS (אתר I). התנערות מכנית נצפתה בחלק הקרוב לאתר ההחדרה (אתר P), המייצג מתח מכני אך לא דלקת גלויה. חלק המעי הגס דיסטלי לדלקת (אתר D) אינו מציג דלקת ולא מתח מכני. שינויים ייחודיים של ביטוי גנים, תגובה חיסונית, פיברוזיס, וצמיחת שרירים חלקה באתרים שונים (P, I, ו- D) נצפו, המדגישים השפעה עמוקה של מתח מכני. לכן, מודל זה של קוליטיס דמוי תקליטור יעזור לנו להבין טוב יותר את המנגנונים הפתוגניים של התקליטור, במיוחד את התפקיד של מתח מכני וביטוי גנים מכני המושרה בלחץ מכני בדיסרגציה חיסונית, פיברוזיס מעיים, ושיפוץ רקמות בתקליטור.

Introduction

מחלות מעי דלקתיות (IBD), כולל קוליטיס כיבית (UC) ומחלת קרוהן (CD), מאופיינת בדלקת כרונית במערכת העיכול (GI). זה משפיע על ~ 1-2 מיליון אמריקאים1. העלויות השנתיות המשוערות לטיפול במחלת המעי הרגיז בארה"ב הן 11.8 מיליארד דולר. שלא כמו UC, התקליטור מאופיין על ידי דלקת transmural ו היווצרות קפדנית 2,3. היווצרות קפדנית (היצרות) מתרחשת בעד 70% מחולי CD3 ועשויה להיגרם על ידי דלקת טרנסמורלית (היצרות דלקתית) או פיברוזיס מעיים (היצרות פיברוטית)4,5. פיברוזיס מעיים מאופיין בתצהיר קולגן מוגזם ומטריצות חוץ-תאיות אחרות (ECM) עם תאי שריר חלקים (SMC) כאחד מסוגי התאים המזנכימליים העיקריים המעורבים בתהליך 3,4. היפרפלזיה חלקה של שרירים הקשורים להיפרטרופיה היא שינוי היסטולוגי משמעותי נוסף בהיצרות הפיברוטית ב- CD6. למרות היווצרות קפדנית בתקליטור קשורה עם דלקת כרונית, אין טיפול אנטי דלקתי יעיל, למעט טיפול כירורגי 2,6. עם זאת, הישנות לאחר הניתוח הם כמעט 100%, נתון מספיק זמן 2,7. כתגובה דלקתית, פיברוזיס והיפרפלזיה SMC עלולים להתפתח גם במצבים לא דלקתיים (כלומר, חסימת מעיים) במעיים 8,9; הוא האמין כי הן מנגנונים תלויי דלקת ועצמאיים מעורבים היווצרות קפדנית 3,4. בהתחשב בכך מחקר מקיף לתוך מנגנונים תלויי דלקת לא תורגם לכל טיפול יעיל להיווצרות קפדנית, מחקרים לתוך התפקיד האפשרי של מנגנונים עצמאיים דלקת פיברוזיס מעיים נדרשים.

כגורם לא דלקתי, מתח מכני (MS) הקשורים בצקת, חדירת תאים דלקתיים, עיוות רקמות, פיברוזיס, והיצרות 10,11,12,13 הוא נתקל בדרך כלל IBD, במיוחד CD, אשר מאופיין על ידי דלקת טרנסמורלית. מתח מכני הוא המדהים ביותר בתקליטור רגיש, שבו היצרות (דלקתית או פיברוטית) באתר הדלקת מציגה מתח מכני ברקמה המקומית ומובילה להתנפחות לומן במגזר הפרוקסימלי לאתר החסימה10,14. מחקרים קודמים במבחנה הראו כי מתח מכני משנה ביטוי גנים של מתווכים דלקתיים ספציפיים (כלומר, COX-2, IL-6)8,14,15 וגורמי גדילה (כלומר, TGF-β) ברקמות מערכת העיכול, במיוחד תאי שריר חלקים במעיים (SMC)16. מחקרים אחרונים מצאו גם כי הביטוי של מתווכים פרו-פיברוטיים ספציפיים כגון גורם גדילה רקמת חיבור (CTGF) רגיש מאוד ללחץ מכני17,18. ההשערה הייתה כי מתח מכני עשוי לשחק תפקיד פתוגניים עצמאיים דלקת הקשורים CD, פיברוזיס, ושיפוץ רקמות. עם זאת, המשמעות הפתוגנית של מתח מכני בדלקת מעיים, פיברוזיס והיפרפלזיה חלקה של שרירים בתקליטור נותרה במידה רבה לא נחקרה. זה יכול להיות בחלקו כי דלקת היא תהליך גלוי יותר למד טוב יותר מאשר מתח מכני. חשוב מכך, לא היה מודל בעלי חיים מוגדר היטב של IBD כדי להבחין את ההשפעה של מתח מכני מזה של דלקת.

העבודה הנוכחית מתארת מודל מכרסם של קוליטיס דמוי קרוהן המושרה על ידי הזרקה intracolonic של ריאגנט הפטן 2,4,4,6-trinitrobenzene חומצה גופרתית (TNBS)19,20, אשר עשוי לשמש את המטרה ללמוד את התפקיד של מתח מכני בתקליטור. נמצא כי הטמעת TNBS גרמה לדלקת טרנסמורלית מקומית (~ 2 ס"מ באורך) עם לומן היצרות (היצרות) במעי הגס הדיסטלי. היצרות מובילה להתנפחות מעיים מסומנת (מתח מכני)14,15 אך לא דלקת גלויה במגזר המעי הגס בסמיכות לאתר ההחדרה. להיפך, קטע המעי הגס דיסטלי לאתר היצרות מציג לא דלקת ולא מתח מכני. שינויים משמעותיים ספציפיים לאתר בביטוי גנים, דלקת, פיברוזיס, היפרפלזיה SMC נצפו בשלושת האתרים השונים. התוצאות מצביעות על כך שמתח מכני, במיוחד ביטוי גנים מכני המושרה מלחץ, עשוי לשחק תפקיד קריטי בפיתוח פיברוזיס והיפרפלזיה בקוליטיס של קרוהן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של המחלקה הרפואית של אוניברסיטת טקסס (#0907051C). חולדות ספראג-דולי זכר או נקבה, ~ 8-9 שבועות, שימשו למחקר.

1. הכנת בעלי חיים

  1. חולדות מהירות במשך 24 שעות ולטפל בהם עם משלשל (ניקוי מעיים, ראה טבלת חומרים) לילה.
  2. למחרת, להרדים חולדות באמצעות מערכת הרדמה (ראה טבלת חומרים) על ידי חשיפתם 2% איזופלוריין יחד עם 1 ליטר / דקה של חמצן במהלך ניהול TNBS. בדוק אם קיימים רפלקסים או צבוט בהונות כדי לאשר הרדמה.
  3. הכן פתרון TNBS טרי על פי משקולות הגוף.
    הערה: TNBS - 65 מ"ג /ק"ג של משקל הגוף ב 250 μL של 40% אתנול שימש.
  4. שים חולדות בתנוחה סופית על שולחן ההרדמה. כדי לגרום קוליטיס, להכניס דרך פי הטבעת צנתר פוליאוריטן פתוח ברמה רפואית עבור ~ 7-8 ס"מ מן הסף אנאלי בעדינות להחדיר TNBS (מוכן בשלב 1.3) לתוך המעי הגס19. לנהל את חולדות שליטה מזויפת עם 250 μL של תמיסת מלח בלבד.
  5. לאחר החדרת TNBS או מלוחים, לשמור חולדות במצב supine ומעט ראש למטה (~ 30 °), עם פי הטבעת סגור במשך 2 דקות כדי לעזור הפצת TNBS ולמנוע דליפות.
  6. לספק חולדות עם מזון ומים ad libitum במשך 7 ימים ולבחון את החולדות מדי יום עבור משקל הגוף, ספיגת מזון, צואה, ומצב בריאותי כללי.

2. הכנות לרקמות

  1. ביום המתת חסד, המתת חסד החולדות באמצעות שאיפת CO2 ולאשר המתת חסד עם פריקת צוואר הרחם.
  2. פתח את בטן החולדה באמצעות מספריים ומלקחיים בדרגה כירורגית.
  3. הסר בזהירות את המעי הגס כולו (מעל התעלה האנאלית) והעבר את המעי הגס מיד למאגר HBSS 1x קר כקרח.
  4. יישר את נקודתיים במאגר ומדוד את אורך המעי הגס באמצעות סרגל. קח חוט ניילון ועיגול סביב המעי הגס כדי למדוד את ההיקף החיצוני של מקטעי המעי הגס בשליטה וחולדות שטופלו TNBS. קח רקמות בעובי מלא להיסטולוגיה.
  5. חותכים את המעי הגס לאורך הלוח המזנטרי ולנקות היטב את המעי הגס עם מאגר HBSS. להעריך את המעי הגס עבור ציון דלקת מקרוסקופית בהתבסס על הקריטריונים כפי שתואר בעבר19 עם שינויים מינימליים.
    הערה: 0 = רירית רגילה; 1 = היפרמיה מקומית אך ללא שחיקה או כיבים; 2 = כיב והיצרות (אזור מושפע < 5 מ"מ); 3 = כיב חמור, צלקת, היצרות (אזור מושפע > 5 מ"מ).
  6. לאסוף דגימות רקמה המעי הגס מאתר P (חלק 2-3 ס"מ לפני השוליים האוראליים של אתר דלקת), אתר I (אתר דלקת, בדרך כלל 4-6 ס"מ מסוף המעי הגס, שבו TNBS הוא החדיר), ואתר D (חלק 1-2 ס"מ דיסטלי לשוליים ביטול של אתר דלקת), בהתאמה מחולדות שטופלו TNBS.
    הערה: רקמת המעי הגס באורך של כ-1-2 ס"מ נלקחה מכל מקטע. בנוסף, רקמות המעי הגס שאורכן 2 ס"מ (כ-4-6 ס"מ מקצה המעי הגס) של החולדות שטופלו במלח נלקחו כשליטה מזויפת (S) (איור 1).
  7. קח דגימות רקמה מכל אתר להכנה בעובי מלא, ואם תרצה, רירית / submucosa ו muscularis externa שכבות, בהתאמה, כמו גם21,22.
  8. הקפאת דגימות רקמת חנקן נוזלי הראשון לפני אחסון אותם ב -80 °C (80 °F) לאחסון עד שנה אחת ולמטרות עתידיות (כלומר, הכנות RNA).

3. הערכה היסטופתולוגית של דלקת במעיים ופיברוזיס

  1. תקן את רקמות המעי הגס בעובי מלא ב 10% פורמלין עבור 48 שעות, ולאחר מכן להעביר 70% אתנול עבור 24-48 שעות.
  2. השתמש microtome לחתוך מקטעי פרפין של 5 מיקרומטר עובי עבור המטוקסילין ואאוזין (H&E) וכתמי טריכרום של מאסון 6,19,23 (ראה טבלת חומרים), בהתאמה.
  3. השג והצג תמונות באמצעות מיקרוסקופ זקוף המצויד במצלמה ברזולוציה גבוהה עם תוכנה תואמת (ראה טבלת חומרים).
  4. מדדי דלקת ופיברוזיס כיתה על ידי שני חוקרים עצמאיים, כולל פתולוג כירורגי במערכת העיכול על פי קריטריונים שתוארו בעבר 6,23 עם שינויים. ראה קובץ משלים 1 לקבלת הציונים.
  5. מדוד את העובי ומספרי התאים של שכבות השרירים המעגליות והאורך לכל חתך בארבע תצוגות של כל דגימה מוכתמת H&E וקח את הממוצע של ארבע המדידות עבור כל דגימה.

4. מיצוי RNA וכמותי RT-PCR

  1. Homogenize exced רקמות המעי הגס שהתקבלו מהבקרה המזויפת ושלושה אתרים (P, I, D) של חולדות קוליטיס TNBS בריאגנט החילוץ של ערכת מיצוי RNA (ראה טבלת חומרים).
  2. לבודד RNA מכל מדגם ניצול הערכה. לרומם את גלולה RNA ב 30 μL של מים ללא RNase.
  3. לכמת ריכוז RNA ולבדוק טוהר באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis microvolume (ראה טבלת חומרים).
  4. השתמש 1 מיקרוגרם של RNA הכולל כדי לסנתז cDNA21,22 באמצעות ערכת סינתזה RNA (ראה טבלת חומרים).
  5. לנתח ולכמת את רמות ביטוי הגנים על ידי ביצוע PCR בזמן אמת עם 50 ננוגרם של cDNA כתבנית, בדיקות של IL-6 ו- CTGF באמצעות ערכת PCR מסחרית למערכת PCR בזמן אמת (ראה טבלת חומרים).
  6. השתמש בגן בקרה 18S rRNA כדי לנרמל את הדגימות ולכמת ביטוי גנים יחסי תוך שימוש בערכי Cq שהושגו.

5. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטית (ראה טבלת חומרים) כדי להשוות שליטה מזויפת וחולדות קוליטיס TNBS.
  2. שקול ערך p < 0.05 להיות משמעותי מבחינה סטטיסטית15,19.
  3. כדי לבדוק את ההבדלים בין שתי קבוצות, השתמש בניתוח t-test של סטודנט ובצע בדיקת ANOVA אם ההשוואות הן יותר משתי קבוצות15,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מבט מקרוסקופי על קוליטיס דמוי קרוהן המושרה על ידי הטמעה תוך-קולונית של TNBS
כפי שניתן לראות באיור 1, הטמעה תוך-קולונית של TNBS בחולדות גרמה לדלקת טרנסמורלית מקומית (באורך של כ-2 ס"מ) עם דופן מעי מעובה ולומן מצומצם (היצרות) באתר ההחדרה במעי הגס הדיסטלי (איור 1A). האתר של הטמעת TNBS מכונה אתר I. כתוצאה מדלקת טרנסמורלית והיצרות, הן דלקת והן מתח מכני נמצאים באתר I. היצרות באתר אני הובילה להתנפחות לומן מסומנת בקטע הקרוב לאתר של הטמעת TNBS (אתר P) (איור 1). היקף המעי הגס גדל באופן משמעותי באתרים P ו- I, בהשוואה לנקודתיים של בקרה מזויפת (p < 0.05 לעומת שליטה) (איור 1B). בעוד נפוח מכנית, אתר P לא הראה דלקת גלויה. להיפך, קטע המעי הגס דיסטלי לאתר ההחדרה של TNBS הוא אתר D ואינו מציג דלקת או התנפחות מכנית (איור 1A,B).

כדי לעזור להבחין בין ההשפעה של מתח מכני מדלקת, עקבנו אחר עיצוב ייחודי באיסוף דגימות רקמה מהמעי הגס במודל המתואר בשלב 2.6. אתר P הוא המוקד העיקרי של המחקר, שכן חלק זה נפוח מכנית במודל התקליטור. אתר D הוא שליטה עצמית, כפי שהוא אינו מציג מתח מכני. אתרים P ו-D אינם מדגימים דלקת גלויה (איור 1). עם זאת, באתר אני חווה דלקת ומתח מכני (איור 1).

שינויים ספציפיים לאתר של ציון דלקת באתרים P, I, ו- D בחולדות קוליטיס
קריטריונים פותחו בדירוג דלקת בהתבסס על הציון המקרוסקופי של רקמה חיה (0-3)19 ואת הציון המיקרוסקופי של דגימות מוכתמות H&E (0-3)23 כמתואר עם שינויים. התוצאות הראו כי הציון המקרוסקופי של דלקת באתר הייתי 2.70 ± 0.20 בחולדות שטופלו ב- TNBS (7 ימים לאחר אינדוקציה של דלקת), עלה באופן דרמטי בהשוואה לזה של בקרות מזויפות (0.30 ± 0.22, p < 0.05) וזה של האתרים P (0.80 ± 0.26) ו- D (0.50 ± 0.22) של חולדות קוליטיס (איור 1C). ציוני הדלקת באתרים P ו-D אינם גדלים באופן משמעותי בהשוואה לזיוף (איור 1C). הדמיה מיקרוסקופית הראתה דלקת טרנסמורלית הנגרמת על ידי TNBS בחולדות (איור 2A). הציון המיקרוסקופי של דלקת באתר הייתי 2.80 ± 0.27 בחולדות שטופלו ב- TNBS, שוב באופן משמעותי (p < 0.05, n = 5 כל קבוצה) עלה בהשוואה לזה בבקרות מזויפות (0.3 ± 0.2) ובאתרים P (1.0 ± 0.31) ו- D (0.80 ± 0.38) של חולדות קוליטיס. ציוני הדלקת באתרים P ו-D לא עלו באופן משמעותי בהשוואה לזיוף (איור 2C).

שינויים ספציפיים לאתר של פיברוזיס והיפרפלזיה שרירים חלקה והיפרטרופיה באתרים P, I ו- D בחולדות קוליטיס
ציון הפיברוזיס נקבע על סמך כתם הטריכרום של מייסון (איור 2B) באתרים שונים (P, I, D) (איור 2A). מערכת הדירוג עבור פיברוזיס מתוארת בקובץ משלים 1. נמצא כי ציון פיברוזיס גדל באופן משמעותי לא רק באתר I (2.60 ± 0.25) אלא גם באתר P (1.60 ± 0.24) של חולדות קוליטיס, לעומת שליטה מזויפת (0.40 ± 0.25. עמ' < 0.05) (איור 2D). העובי ומספרי התאים של שכבות שרירים חלקות מעגליות ואורך נמדדו באתרים שונים בדגימות מוכתמות H&E (4 צפיות לכל דגימה). העובי ומספרי התאים של שכבות השריר החלקות המעגליות והאורך גדלו באופן משמעותי באתרים I ו- P (איור 2E, F). האתר D בחולדות קוליטיס אינו מראה עלייה משמעותית בציון פיברוזיס, מספרי תאי שריר חלקים או עובי שריר (איור 2).

ביטוי ספציפי לאתר של גנים רגישים למכנו באתרים P, I ו- D בחולדות קוליטיס
IL-6 ממלא תפקיד קריטי בדלקת במעיים, שכן הוא מקדם בידול תאי T, פוגע בתפקוד המחסום ומשפיע על תפקוד neuromuscular 8,24. CTGF הוא מתווך פרו-פיברוטי מוכר היטב, כמו עיכוב שלה יכול להפוך את התהליך של פיברוזיס17. חשוב מכך, מחקרים שנערכו לאחרונה מצאו כי ביטוי גנים של IL-6 ו- CTGF מגיב מאוד ללחץ מכני 8,14,18. הביטוי הספציפי לאתר של IL-6 ו- CTGF mRNAs נקבע ברקמת העובי המלא של שליטה מזויפת וחולדות קוליטיס TNBS. רמות הביטוי mRNA של IL-6 ו- CTGF גדלו באופן משמעותי באתר הדלקת (אתר I) בהשוואה לבקרות מזויפות. באתר P, שבו יש התנפחות מכנית אך אין דלקת נראית לעין, ביטוי ה-mRNA של IL-6 ו-CTGF גדל גם הוא באופן דרמטי בהשוואה לחולדות בקרה (איור 3A,B). עם זאת, רמות ה-mRNA של IL-6 ו-CTGF באתר D של חולדות קוליטיס לא היו שונות באופן משמעותי מזה שבבקרות מזויפות (איור 3).

Figure 1
איור 1: מודל מכרסם של קוליטיס דמוי תקליטור המושרה על-ידי TNBS (7 ימים). (A) תצוגת Outlook של בקרת זיוף ונקודתיים (עליונה) שטופלו ב- TNBS ותצוגה מקרוסקופית של פני השטח הריריים של המעי הגס הדיסטלי (למטה). הקופסאות הצהובות מצביעות על אתרים שונים של רקמת המעי הגס. S, שליטה מזויפת; אני, אתר דלקת; P, אתר המעי הגס נפוח פרוקסימלי לאתר דלקת; D, אתר לא נפוח דיסטלי לדלקת. (ב) היקף המעי הגס בשליטה מזויפת ואתרים שונים (P, I, D) של המעי הגס שטופלו ב- TNBS. (ג) ציון דלקת מקרוסקופית של נקודתיים שליטה מזויפת ואתרים שונים של המעי הגס שטופלו TNBS. n = 5, *p < 0.05 לעומת חולדות מזויפות של הקבוצה. מייצגי פעילויות מייצגים SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הערכה היסטופתולוגית. תצוגות מיקרוסקופיות בכתמי H&E (A) וכתמי הטריכום של מאסון (B) המראים התפלגות קולגן בזיוף ובאתרים שונים של חולדות קוליטיס. ניתוח כמותי מראה מדד דלקת מיקרוסקופי מוגבר (C), פיברוזיס (D) ועובי שרירים (היפרטרופיה) (E), ומספר תא שריר חלק (היפרפלזיה) (F) באתרים I ו- P, אך לא D, בחולדות שטופלו ב- TNBS. ב-(E) ו-(F), הסורגים הפתוחים מיועדים לשכבת השריר החלקה המעגלית, וסורגים מפוספסים מיועדים לשכבת השריר החלקה לאורך. n = 5 בכל קבוצה, *p < 0.05 לעומת עכברושים מזויפים של הקבוצה. עמודות בתרשימים מייצגות SEM. מייצגי פעילויות ב- (A) ו- (B) = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ביטוי ספציפי לאתר של גנים ממכנו-רגישים (IL-6 ו-CTGF) בקוליטיס דמוית CD. (A) ביטוי של IL-6 mRNA במעי הגס של בקרה מזויפת ואתרים שונים (P, I ו-D) של המעי הגס של קוליטיס שטופלו ב-TNBS. (B) ביטוי של mRNA CTGF במעי הגס שליטה מזויפת ואתרים שונים (P, I, ו- D) של המעי הגס קוליטיס שטופלו TNBS. n = 4 או 5, *p < 0.05 לעומת S (שליטה מזויפת). מייצגי פעילויות מייצגים SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: ציון של דלקת ופיברוזיס. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

קוליטיס הנגרמת על ידי TNBS הוצגה בשנת 1989, שימשה כמודל ניסיוני של מחלת קרוהן מאז 19,20,23. מאפיינים משמעותיים של מודל זה במכרסמים כוללים התפתחות של דלקת טרנסמולרית הדומה מאוד לנגעים ההיסטופתולוגיים שפותחו במחלת קרוהן אנושית19,20. מחקרים קודמים על המודל התמקדו בעיקר בתגובה חיסונית חריגה בשכבת הרירית באתר של דלקת גלויה (האתר I)19,20,23. תשומת לב מועטה הוקדשה לחלקי המעיים פרוקסימליים ודיסטליים לדלקת. המחקר הנוכחי באתר הדלקת, כמו גם את הקטע הפרוקסימלי הנפוח ואת קטע דיסטלי לא נפוח, חושף שינויים ספציפיים לאתר לכאורה בביטוי גנים, תגובה דלקתית, ותכונות היסטופתולוגיות. המודל נבדק מחדש כדי לטפל בתפקיד הפתוגניים הפוטנציאלי של מתח מכני בפיברוזיס ושיפוץ רקמות במחלת קרוהן.

נמצא כי דלקת חריפה מפותחת מיד לאחר חשיפה רירית של TNBS באתנול והוא הגיע לשיאו ביום 319. קיימת דלקת טרנסמורלית והיצרות דלקתית, הקשורה להתנפחות לומן באתר P בכל חולדה המטופלת ב- TNBS. ביום 7, דלקת טרנסמורלית כרונית מפותחת היטב באתר I, כפי שנמצא במחקר הנוכחי ודווח במקוםאחר 20. בינתיים, שינויים פיברוטיים ניכרים באתר, המאופיין בתצהיר קולגן מוגזם, כפי שניתן לראות במחקר הנוכחי ובמקומות אחרים20. הטמעת TNBS באתנול במעי הגס הדיסטלי פוגעת ברקמת הרירית המקומית23 ומובילה לדלקת טרנסמורלית באזור מקומי במעי הגס. דלקת transmural עם חדירה דלקתית, בצקת, ועיוות רקמות 10,12,13 באתר ההחדרה מציגים דלקת ומתח מכני14 לאזור המקומי (אתר I). יתר על כן, דלקת טרנסמולרית גורמת גם היצרות זוהרת באתר I10. נמצא כי היצרות, חסימת מעיים חלקית, גורמת להתנפחות מכנית בקטע הפרוקסימלי (אתר P). עם זאת, החלק דיסטלי לאתר ההחדרה אינו נפוח (אתר D). כפי שנמצא במערכות הניקוד המקרוסקופיות וההיסטולוגיות, בעוד שאתר אני מציג הן דלקת והן מתח מכני, אתרים P ו- D אינם מציגים דלקת. יתר על כן, אתר P מראה היקף מוגבר באופן משמעותי (ולכן מתח מכני, על פי החוק של לפלס14), אבל אתר D לא. לכן, מחקר על שינויים ספציפיים לאתר, במיוחד באתר P, יחקור את החשיבות הפתוגנית של מתח מכני במודל הדלקת במעיים.

זה נצפתה כי הביטוי של גנים רגישים mechano IL-6 ו CTGF הוגדל באתר I ובאתר נמתח מכנית P, אבל לא באתר השכן D, שבו אין התנפחות מכנית. כדי לבחון את ההשערה כי מתח מכני עשוי לתרום להתפתחות של פיברוזיס והיפרפלזיה שרירים חלקה, ציוני פיברוזיס ומספרי תאי שריר חלקים נמדדים ועובי שרירים באתרים P, I ו- D נקבעו בנפרד. נמצא כי פיברוזיס והיפרפלזיה SMC נמצאים באתרים I ו- P. עם זאת, פיברוזיס והיפרפלזיה שרירים חלקה אינם מזוהים באתר D. ממצאים אלה מצביעים על כך שמתח מכני עשוי לשחק תפקיד פתוגניים עצמאי בסינתזת קולגן והתפשטות תאים בדלקת המעיים. מחקרים נוספים מוצדקים כדי לקבוע אם השפעה זו עשויה להיות מתווכת על ידי ביטוי מכני המושרה בלחץ של גורמי גדילה פרו-פיברוטיים וצמיחה כגון CTGF באתרים P ו- I.

למרות המודל החייתי המתואר עצמו יכול לשמש כדי לטפל בלחץ מכני קוליטיס דמוי תקליטור stenotic, יש לו מגבלות במטרה ארוכת הטווח להגדיר באופן מלא את התפקיד הפתוגני של מתח מכני בדלקת. לדוגמה, ההשפעות של מתח מכני ודלקת באתר I של המודל המתואר לא ניתן להבדיל. למרות ההנחה כי מתח מכני קיים באתר I בגלל חדירה דלקתית, עיוות רקמות, היצרות, התנפחות, כמה מתח מכני תורם לשינויים הפתולוגיים שם לא ניתן לקבוע. מחקרים מקיפים נוספים באמצעות הפריה חוץ גופית, in vivo, וגישות ex vivo עשוי להיות נחוץ. לדוגמה, מניעת התנפחות מכנית על ידי האכלת בעלי החיים קוליטיס אך ורק עם דיאטה נוזלית ברורה25 עשוי לעזור ליצור מצב התנפחות אובדן מכני במודל קוליטיס. מצד שני, אינדוקציה של התנפחות מכנית טהורה על ידי רצועת חסימה15 עשוי לעזור ליצור מודל מתח רווח מכני. יתר על כן, מודל המתיחה המכני במבחנה בתאים מתורבתים14,15 מסייע בקביעה כמותית של ההשפעות של מתח מכני על ביטוי ותפקוד גנים, כמו מצב והיקף הלחץ המכני ניתן לשלוט היטב בסביבת הפריה חוץ גופית.

כדי להכין מודל לשחזור של דלקת טרנסמורלית ו stenotic בקוליטיס דמוי CD כפי שתואר במחקר, TNBS ב 65 מ"ג /ק"ג ב 250 μL של 40% אתנול חייב לשמש. המודל נבדק בעיקר בחולדות, זכר או נקבה, בני 8-9 שבועות. לאחר החדרת TNBS במינון, דלקת transmural מפותחת בעקביות באתר ההחדרה המקומי. הדלקת קשורה לחדירת תאים דלקתיים, בצקת ועיבוי דופן המעי, מה שמוביל לצמצום לומן באתר ההחדרה, הדומה למאפיינים פתולוגיים של מחלת קרוהן20. מחקרי פיילוט במעבדה הראו כי TNBS במינונים נמוכים מ 50 מ"ג/ק"ג באותו נפח של 40% אתנול עלול לגרום דלקת במעיים אבל לא היצרות אמינה באתר I. לפיכך, לא תהיה התנפחות מכנית לכאורה באתר P. מצד שני, TNBS במינונים גדולים מ 80 מ"ג/ק"ג עלול לגרום דלקת חמורה והרוגים. הפרוטוקול הנוכחי באמצעות TNBS ב 65 מ"ג/ק"ג ב 250 μL של 40% אתנול בקושי גורם למוות (1 מכל 16 חולדות של קוליטיס TNBS).

נמצא כי ניקוי המעיים יום לפני החדרת TNBS הוא צעד חשוב כדי להבטיח מעי גס נקי יחסית עבור מודל אמין של קוליטיס סטנוטית. לשם כך, חולדות צריכות לצום במשך 24 שעות ולתת ניקוי מעיים לילה לפני הטיפול TNBS. חשוב גם לשמור על חולדות בתנוחה עלובה ומעט עם ראש כלפי מטה עם פי הטבעת סגור במשך 2 דקות לאחר החדרת TNBS. זה עוזר להבטיח הפצה טובה של TNBS בתוך המעי הגס דיסטלי.

לסיכום, נמצא כי הטמעה אינטרקולונית של TNBS ב 65 מ"ג/ק"ג ב 250 μL של 40% אתנול באופן עקבי המושרה קוליטיס דמוי CD בחולדות. דלקת טרנסמולרית במודל קשורה להיצרות באתר ההחדרה של TNBS. התנפחות מכנית, אך לא דלקת, נצפתה במגזר הקרוב להיצרות. לא דלקת ולא מתח מכני נמצא במגזר דיסטלי להיצרות. עם שינויים אלה באתרי המעי הגס השונים בחולדת קוליטיס, מתח מכני מדלקת קוליטיס דמוי CD ניתן להבחין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מדווחים על ניגוד אינטרסים ואין להם מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי מענקים מ- NIH (R01 DK124611 ל- XZS) וממשרד ההגנה האמריקאי (W81XWH-20-1-0681 ל- XZS). עבודת ההיסטולוגיה נעשתה בעזרת המעבדה לפתולוגיה כירורגית UTMB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
  2. Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
  3. Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
  4. Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
  5. Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
  6. Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
  7. Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
  8. Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
  9. Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
  10. Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
  11. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  12. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  13. Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
  14. Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
  15. Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
  16. Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
  17. Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24 (2012).
  18. Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
  19. Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
  20. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
  21. Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
  22. Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
  23. Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  24. Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
  25. Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

מודל מכרסמים המושרה על ידי TNBS לחקר התפקיד הפתוגניים של מתח מכני במחלת קרוהן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter