Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En TNBS-induceret gnavermodel til undersøgelse af den patogene rolle af mekanisk stress i Crohns sygdom

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Den nuværende protokol beskriver udviklingen af en Crohns-lignende colitis-model hos gnavere. Transmural inflammation fører til stenose på TNBS-instillationsstedet, og mekanisk forstørrelse observeres i segmentet proksimalt til stenose. Disse ændringer gør det muligt at studere mekanisk belastning i colitis.

Abstract

Inflammatoriske tarmsygdomme (IBD) såsom Crohns sygdom (CD) er kroniske inflammatoriske lidelser i mave-tarmkanalen, der påvirker ca. 20 pr. 1.00.000 i Europa og USA. CD er kendetegnet ved transmural inflammation, intestinal fibrose og luminal stenose. Selvom antiinflammatoriske terapier kan hjælpe med at kontrollere inflammation, har de ingen effekt på fibrose og stenose i CD. Patogenesen af CD er ikke godt forstået. Nuværende undersøgelser fokuserer primært på at afgrænse dysregulerede tarmimmunresponsmekanismer. Mens CD-associeret transmural inflammation, intestinal fibrose og luminal stenose alle repræsenterer mekanisk belastning på tarmvæggen, er rollen som mekanisk belastning i CD ikke veldefineret. For at afgøre, om mekanisk belastning spiller en uafhængig patogen rolle i CD, er der udviklet en protokol med TNBS-induceret CD-lignende colitismodel hos gnavere. Denne TNBS-inducerede transmurale inflammation og fibrose model ligner patologiske kendetegn ved CD i tyktarmen. Det induceres af intrakolonisk indånding af TNBS i den distale tyktarm hos voksne Sprague-Dawley-rotter. I denne model fører transmural inflammation til stenose på TNBS-instillationsstedet (Site I). Mekanisk afstand observeres i den del, der er proksimal til instillationsstedet (Site P), hvilket repræsenterer mekanisk belastning, men ikke synlig betændelse. Colonic del distal til betændelse (Site D) præsenterer hverken betændelse eller mekanisk stress. Særlige ændringer af genekspression, immunrespons, fibrose og glat muskelvækst på forskellige steder (P, I og D) blev observeret, hvilket fremhævede en dybtgående virkning af mekanisk stress. Derfor vil denne model af CD-lignende colitis hjælpe os med bedre at forstå CD's patogene mekanismer, især rollen som mekanisk stress og mekanisk stressinduceret genekspression i immundysregulering, tarmfibrose og vævsombygning i CD.

Introduction

Inflammatorisk tarmsygdom (IBD), herunder ulcerøs colitis (UC) og Crohns sygdom (CD), er karakteriseret ved kronisk betændelse i mave-tarmkanalen (GI). Det påvirker ~ 1-2 millioner amerikanere1. De anslåede årlige omkostninger til IBD-pleje i USA er 11,8 milliarder dollars. I modsætning til UC er cd'en karakteriseret ved transmural inflammation og strikturdannelse 2,3. Strikturdannelse (stenose) forekommer hos op til 70 % af CD-patienterne3 og kan være forårsaget af transmural inflammation (inflammatorisk stenose) eller tarmfibrose (fibrotisk stenose)4,5. Tarmfibrose er karakteriseret ved overdreven kollagenaflejring og andre ekstracellulære matricer (ECM) med glatte muskelceller (SMC) som en af de vigtigste mesenkymale celletyper, der er involveret i processen 3,4. Glat muskelhyperplasi forbundet med hypertrofi er en anden signifikant histologisk ændring i fibrotisk stenose i CD6. Selvom strikturdannelse i CD er forbundet med kronisk inflammation, er ingen antiinflammatorisk behandling effektiv, undtagen kirurgisk behandling 2,6. Imidlertid er tilbagefald efter operationen næsten 100%, givet tilstrækkelig tid 2,7. Som en inflammatorisk reaktion kan fibrose og SMC hyperplasi også udvikle sig under ikke-inflammatoriske tilstande (dvs. tarmobstruktion) i tarmen 8,9; det antages, at både inflammationsafhængige og uafhængige mekanismer er involveret i strikturdannelse 3,4. I betragtning af at omfattende forskning i de inflammationsafhængige mekanismer ikke har oversat til nogen effektiv terapi til strikturdannelse, er der behov for undersøgelser af den mulige rolle inflammationsuafhængige mekanismer i tarmfibrose.

Som en ikke-inflammatorisk faktor er mekanisk stress (MS) forbundet med ødem, inflammatorisk celleinfiltration, vævsdeformation, fibrose og stenose 10,11,12,13 almindeligt forekommende i IBD, især CD, som er karakteriseret ved transmural inflammation. Mekanisk belastning er mest bemærkelsesværdig i stenotisk CD, hvor stenose (inflammatorisk eller fibrotisk) på inflammationsstedet præsenterer mekanisk belastning i det lokale væv og fører til lumen-afstand i segmentet proksimalt til obstruktionsstedet10,14. Tidligere in vitro-undersøgelser har vist, at mekanisk stress ændrer genekspressionen af specifikke inflammatoriske mediatorer (dvs. COX-2, IL-6)8,14,15 og vækstfaktorer (dvs. TGF-β) i mave-tarmvævene, især tarmglate muskelceller (SMC)16. Nylige undersøgelser viste også, at ekspressionen af specifikke profibrotiske mediatorer såsom bindevævsvækstfaktor (CTGF) er meget følsom over for mekanisk belastning17,18. Det blev antaget, at mekanisk stress kan spille en uafhængig patogen rolle i CD-associeret inflammation, fibrose og vævsombygning. Imidlertid forbliver den patogene betydning af mekanisk stress i tarmbetændelse, fibrose og glat muskelhyperplasi i CD stort set uudforsket. Dette kan blandt andet skyldes, at inflammation er en mere synlig og bedre undersøgt proces end mekanisk belastning. Endnu vigtigere har der ikke været nogen veldefineret dyremodel af IBD til at skelne effekten af mekanisk belastning fra inflammation.

Det nuværende arbejde beskriver en gnavermodel af Crohns-lignende colitis induceret af intrakolonisk injektion af haptenreagens 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (TNBS)19,20, som kan tjene formålet med at studere rollen som mekanisk belastning i CD. Det blev konstateret, at TNBS-instillation inducerede en lokaliseret (~ 2 cm lang) transmural betændelse med lumenindsnævring (stenose) i den distale tyktarm. Stenose fører til markant tarmdistention (mekanisk belastning)14,15, men ikke synlig betændelse i tyktarmssegmentet proksimalt til indåndingsstedet. Tværtimod præsenterer tyktarmssegmentet distalt til stenosestedet hverken betændelse eller mekanisk belastning. Signifikante stedspecifikke ændringer i genekspression, inflammation, fibrose og SMC hyperplasi blev observeret på de tre forskellige steder. Resultaterne tyder på, at mekanisk stress, især mekanisk stressinduceret genekspression, kan spille en kritisk rolle i udviklingen af fibrose og hyperplasi i Crohns colitis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til det institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg ved University of Texas Medical Branch (#0907051C). Mandlige eller kvindelige Sprague-Dawley rotter, ~ 8-9 uger gamle, blev brugt til undersøgelsen.

1. Tilberedning af dyr

  1. Hurtige rotter i 24 timer og behandl dem med afføringsmiddel (tarmrens, se Materialetabel) natten over.
  2. Den næste dag bedøves rotter ved hjælp af et anæstesisystem (se materialetabel) ved at udsætte dem for 2% isofluran sammen med 1 l / min ilt under TNBS-administration. Kontroller for reflekser eller klemme tæer for at bekræfte anæstesi.
  3. Forbered frisk TNBS-opløsning i henhold til kropsvægte.
    BEMÆRK: TNBS - 65 mg/kg legemsvægt i 250 μL 40% ethanol blev anvendt.
  4. Sæt rotter i liggende stilling på anæstesibordet. For at fremkalde colitis skal du gennem anus indsætte et åbent polyurethankateter af medicinsk kvalitet i ~ 7-8 cm fra analkanten og forsigtigt indgyde TNBS (fremstillet i trin 1.3) i tyktarmen19. Administrer sham-kontrolrotterne med kun 250 μL saltvand.
  5. Efter indgødning af TNBS eller saltvand skal du holde rotter i liggende og let nedadgående position (~ 30 °), med anus lukket i 2 minutter for at hjælpe TNBS-distribution og undgå spild.
  6. Giv rotter mad og vand ad libitum i 7 dage og observer rotterne dagligt for kropsvægt, fødeoptagelse, afføring og generel sundhedstilstand.

2. Vævspræparater

  1. På dagen for eutanasi aflives rotterne ved hjælp af CO2 - indånding og bekræfter eutanasi med cervikal dislokation.
  2. Åbn rottelivet ved hjælp af kirurgisk saks og tang.
  3. Fjern forsigtigt hele tyktarmen (over analkanalen) og overfør tyktarmen straks til iskold 1x HBSS-buffer.
  4. Ret tyktarmen i bufferen og mål kolonlængden ved hjælp af en lineal. Tag nylontråd og cirkel rundt om tyktarmen for at måle den ydre omkreds af tyktarmssegmenterne i kontrol og TNBS-behandlede rotter. Tag væv i fuld tykkelse til histologi.
  5. Skær tyktarmen op langs det mesenteriske bord og rengør tyktarmen godt med HBSS-buffer. Vurder tyktarmen for makroskopisk inflammationsscore baseret på kriterierne som tidligere beskrevet19 med minimale ændringer.
    BEMÆRK: 0 = normal slimhinde; 1 = lokaliseret hyperæmi, men ingen erosioner eller sår; 2 = sår og stenose (berørt område < 5 mm); 3 = svær mavesår, ar og stenose (berørt område > 5 mm).
  6. Indsaml tyktarmsvævsprøver fra sted P (del 2-3 cm før den orale margen af inflammationsstedet), sted I (inflammationssted, typisk 4-6 cm fra enden af tyktarmen, hvor TNBS indlægges til) og sted D (del 1-2 cm distal til aboralmargenen på inflammationsstedet) fra TNBS-behandlede rotter.
    BEMÆRK: Tyktarmsvæv på ~ 1-2 cm langt blev taget fra hvert segment. Derudover blev tyktarmsvævene på 2 cm lange (~ 4-6 cm fra enden af tyktarmen) hos de saltvandsbehandlede rotter taget som sham control (S) (figur 1).
  7. Udtage vævsprøver fra hvert sted til forberedelse i fuld tykkelse og om ønsket henholdsvis slimhinde/submucosa og muscularis externa lag samt21,22.
  8. Vævsprøver fryses i flydende nitrogen først, inden de opbevares ved -80 °C til opbevaring i op til et år og til fremtidige formål (dvs. RNA-præparater).

3. Histopatologisk vurdering af tarmbetændelse og fibrose

  1. Fastgør tyktarmsvævet i fuld tykkelse i 10% formalin i 48 timer, og overfør derefter til 70% ethanol i 24-48 timer.
  2. Brug et mikrotome til at skære paraffinsektioner med en tykkelse på 5 μm for henholdsvis hæmatoxylin og eosin (H&E) og Massons trikrompletter 6,19,23 (se materialetabel).
  3. Hent og se billeder med et opretstående mikroskop udstyret med et kamera med høj opløsning og kompatibel software (se Materialetabel).
  4. Grade inflammation og fibrose indekser af to uafhængige efterforskere, herunder en gastrointestinal kirurgisk patolog i henhold til kriterier beskrevet tidligere 6,23 med modifikationer. Se Supplerende fil 1 for partiturerne.
  5. Tykkelsen og celletallene for de cirkulære og langsgående muskellag pr. tværsnit måles i fire afbildninger af hver H&E-farvet prøve, og der tages gennemsnittet af de fire målinger for hver prøve.

4. RNA-ekstraktion og kvantitativ RT-PCR

  1. Homogeniser udskåret tyktarmsvæv opnået fra sham-kontrollen og tre steder (P, I, D) af TNBS-colitisrotter i ekstraktionsreagenset i et RNA-ekstraktionssæt (se materialetabel).
  2. Isoler RNA fra hver prøve ved hjælp af kittet. Elute RNA-pelleten i 30 μL RNase-frit vand.
  3. Kvantificer RNA-koncentrationen og kontroller for renhed ved hjælp af et mikrovolum UV-Vis-spektrofotometer (se tabel over materialer).
  4. Brug 1 μg totalt RNA til at syntetisere cDNA21,22 ved hjælp af RNA-syntesesættet (se Tabel over materialer).
  5. Analyser og kvantificer genekspressionsniveauer ved at udføre PCR i realtid med 50 ng cDNA som skabelon, sonder af IL-6 og CTGF ved hjælp af et kommercielt PCR-kit til PCR-system i realtid (se Tabel over materialer).
  6. Brug kontrolgen 18S rRNA til at normalisere prøverne og kvantificere relativ genekspression ved hjælp af de opnåede Cq-værdier.

5. Statistisk analyse

  1. Brug statistisk analysesoftware (se tabel over materialer) til at sammenligne sham-kontrol og TNBS-colitisrotter.
  2. Betragt p-værdien < 0,05 som statistisk signifikant15,19.
  3. For at teste forskellene mellem to grupper skal du bruge Elevens t-testanalyse og udføre en ANOVA-test, hvis sammenligningerne er mere end to grupper15,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Makroskopisk visning af Crohns-lignende colitis induceret af intra-colonisk indånding af TNBS
Som vist i figur 1 inducerede intrakolonial indånding af TNBS hos rotter en lokaliseret transmural inflammation (~ 2 cm i længden) med fortykket tarmvæg og indsnævret lumen (stenose) på indåndingsstedet i det distale tyktarm (figur 1A). Stedet for TNBS-instillation kaldes websted I. Som et resultat af transmural betændelse og stenose er både betændelse og mekanisk stress til stede på sted I. Stenose på sted I førte til markant lumendistention i segmentet proksimalt til stedet for TNBS-instillation (sted P) (figur 1). Tyktarmsomkredsen blev signifikant øget på steder P og I sammenlignet med sham-kontrolkolon (p < 0,05 vs. kontrol) (figur 1B). Mens det var mekanisk udspilet, viste sted P ikke synlig betændelse. Tværtimod er kolonsegmentet distalt til TNBS-instillationsstedet sted D og præsenterer hverken betændelse eller mekanisk afstand (figur 1A, B).

For at hjælpe med at skelne effekten af mekanisk stress fra betændelse fulgte vi et unikt design ved indsamling af vævsprøver fra tyktarmen i modellen beskrevet i trin 2.6. Site P er det primære fokus i undersøgelsen, da denne del er mekanisk udspilet i CD-modellen. Site D er selvkontrol, da det ikke præsenterer mekanisk belastning. Steder P og D viser ingen synlig betændelse (figur 1). Men stedet oplever jeg betændelse og mekanisk belastning (figur 1).

Stedsspecifikke ændringer af inflammationsscore på steder P, I og D hos colitisrotter
Der blev udviklet kriterier for klassificering af inflammation baseret på den makroskopiske score for levende væv (0-3)19 og den mikroskopiske score for H&E-farvede prøver (0-3)23 som beskrevet med modifikationer. Resultaterne viste, at den makroskopiske score for inflammation på sted I var 2,70 ± 0,20 i de TNBS-behandlede rotter (7 dage efter induktion af betændelse), steg dramatisk sammenlignet med sham-kontroller (0,30 ± 0,22, p < 0,05) og for steder P (0,80 ± 0,26) og D (0,50 ± 0,22) af colitisrotter (figur 1C). Inflammationsscorerne på stederne P og D øges ikke signifikant sammenlignet med sham (figur 1C). Mikroskopisk billeddannelse viste TNBS-behandlingsinduceret transmural inflammation hos rotter (figur 2A). Den mikroskopiske score for inflammation på sted I var 2,80 ± 0,27 hos de TNBS-behandlede rotter, igen signifikant (p < 0,05, n = 5 hver gruppe) steg sammenlignet med den i sham-kontroller (0,3 ± 0,2) og på steder P (1,0 ± 0,31) og D (0,80 ± 0,38) af colitisrotter. Inflammationsscorerne på stederne P og D blev ikke signifikant øget sammenlignet med sham (figur 2C).

Stedspecifikke ændringer af fibrose og glat muskelhyperplasi og hypertrofi på steder P, I og D hos colitisrotter
Fibrose score blev bestemt ud fra Masons trikromplet (figur 2B) på forskellige steder (P, I, D) (figur 2A). Karaktersystemet for fibrose er beskrevet i Supplerende fil 1. Det blev konstateret, at fibrose score er signifikant øget ikke kun i site I (2,60 ± 0,25), men også i site P (1,60 ± 0,24) af colitis rotter, sammenlignet med sham kontrol (0,40 ± 0,25. p < 0,05) (figur 2D). Tykkelsen og celleantallet af cirkulære og langsgående glatte muskellag blev målt forskellige steder i H&E-farvede prøver (4 visninger pr. Prøve). Tykkelsen og celleantallet for både cirkulære og langsgående glatte muskellag blev signifikant øget på steder I og P (figur 2E,F). Stedet D i colitis rotterne viser ingen signifikant stigning i fibrose score, glatte muskelcelletal eller muskeltykkelse (figur 2).

Stedspecifik ekspression af mekanofølsomme gener på sted P, I og D hos colitisrotter
IL-6 spiller en kritisk rolle i tarmbetændelse, da det fremmer T-celledifferentiering, beskadiger barrierefunktionen og påvirker neuromuskulær funktion 8,24. CTGF er en velkendt profibrotisk mediator, da dens hæmning kan vende processen med fibrose17. Endnu vigtigere viste nylige undersøgelser, at genekspression af IL-6 og CTGF er meget lydhør over for mekanisk belastning 8,14,18. Den stedsspecifikke ekspression af IL-6 og CTGF mRNA'er blev bestemt i vævet i fuld tykkelse af sham-kontrol og TNBS colitis rotter. RNA-ekspressionsniveauerne af IL-6 og CTGF blev signifikant øget på inflammationsstedet (sted I) sammenlignet med sham-kontroller. På sted P, hvor der er mekanisk afstand, men ingen synlig inflammation, blev mRNA-ekspressionen af IL-6 og CTGF også dramatisk øget sammenlignet med kontrolrotter (figur 3A,B). IL-6- og CTGF-mRNA-niveauer i sted D af colitisrotter var imidlertid ikke signifikant forskellige fra niveauet i sham-kontroller (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Gnavermodel af TNBS-induceret CD-lignende colitis (7 dage). (A) Outlook-visning af sham-kontrol og TNBS-behandlet tyktarm (øverst) og makroskopisk visning af slimhindeoverfladen i det distale tyktarm (nederst). De gule felter angiver forskellige steder af tyktarmsvæv. S, falsk kontrol; Jeg, betændelsessted; P, udspilet tyktarmssted proksimalt til inflammationssted; D, ikke-udspilet sted distal til betændelse. (B) Kolonomkreds i sham-kontrol og forskellige steder (P, I, D) af TNBS-behandlet tyktarm. (C) Makroskopisk inflammation score af sham kontrol tyktarm og forskellige steder af TNBS-behandlet tyktarm. n = 5, *p < 0,05 vs. sham rotter i gruppen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Histopatologisk vurdering. Mikroskopiske visninger i H & E (A) og Massons trikrompletter (B), der viser kollagenfordeling i sham og forskellige steder af colitis rotter. Kvantitativ analyse viser øget mikroskopisk inflammationsindeks (C), fibrose (D) og muskeltykkelse (hypertrofi) (E) og glat muskelcelletal (hyperplasi) (F) på steder I og P, men ikke D, hos TNBS-behandlede rotter. I (E) og (F) er de åbne stænger til det cirkulære glatte muskellag, og stribede stænger er til det langsgående glatte muskellag. n = 5 i hver gruppe, *p < 0,05 vs. falske rotter i gruppen. Søjler i (A) og (B) = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Stedspecifik ekspression af mekanosensitive gener (IL-6 og CTGF) i CD-lignende colitis. (A) Ekspression af IL-6 mRNA i sham-kontrolkolon og forskellige steder (P, I og D) af TNBS-behandlet colitis kolon. (B) Ekspression af CTGF mRNA i sham control kolon og forskellige steder (P, I og D) af TNBS-behandlet colitis kolon. n = 4 eller 5, *p < 0,05 vs. S (sham kontrol). Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Score af betændelse og fibrose. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TNBS-induceret colitis blev introduceret i 1989 og er blevet brugt som en eksperimentel model af Crohns sygdom siden da 19,20,23. Væsentlige træk ved denne model hos gnavere omfatter udviklingen af en transmural betændelse, der ligner de histopatologiske læsioner udviklet i human Crohns sygdom19,20. Tidligere undersøgelser af modellen har primært fokuseret på afvigende immunrespons i slimhindelaget på stedet for synlig betændelse (stedet I) 19,20,23. Der er kun lagt lidt vægt på tarmdelene proksimale og distale for betændelse. Den foreliggende undersøgelse af inflammationsstedet, såvel som det udspilede proksimale segment og det ikke-udspilede distale segment, afslører tilsyneladende stedspecifikke ændringer i genekspression, inflammatorisk respons og histopatologiske egenskaber. Modellen er blevet revideret for at imødegå den potentielle patogene rolle af mekanisk stress i fibrose og vævsombygning i Crohns sygdom.

Det blev konstateret, at akut inflammation straks udvikles efter slimhindeeksponering af TNBS i ethanol og toppede på dag 319. Transmural inflammation og inflammatorisk stenose er til stede, hvilket er forbundet med lumen distention i site P i hver rotte behandlet med TNBS. På dag 7 er kronisk transmural inflammation veludviklet på sted I, som fundet i den aktuelle undersøgelse og rapporteret andetsteds20. I mellemtiden er fibrotiske ændringer tydelige på stedet, karakteriseret ved overdreven kollagenaflejring, som det ses i denne undersøgelse og andre steder20. TNBS-indånding i ethanol i det distale tyktarm beskadiger det lokale slimhindevæv23 og fører til transmural betændelse i et lokaliseret område i tyktarmen. Den transmurale inflammation med inflammatorisk infiltration, ødem og vævsdeformation 10,12,13 på indåndingsstedet præsenterer betændelse og mekanisk belastning14 til det lokaliserede område (Site I). Desuden forårsager transmural betændelse også luminal stenose på sted I10. Det blev konstateret, at stenose, en delvis tarmobstruktion, forårsager mekanisk afstand i det proksimale segment (sted P). Den del, der er distal til instillationsstedet, er imidlertid ikke udspilet (sted D). Som det findes i de makroskopiske og histologiske scoringssystemer, mens site I præsenterer både betændelse og mekanisk stress, præsenterer steder P og D ikke betændelse. Desuden viser sted P signifikant øget omkreds (og dermed mekanisk belastning i henhold til loven i Laplace14), men sted D gør det ikke. Derfor vil en undersøgelse af de stedsspecifikke ændringer, især stedet P, undersøge den patogene betydning af mekanisk belastning i inflammationsmodellen i tarmen.

Det blev observeret, at ekspressionen af mekanofølsomme gener IL-6 og CTGF blev øget på sted I og i mekanisk strakt sted P, men ikke i nabosted D, hvor der ikke er nogen mekanisk afstand. For at undersøge hypotesen om, at mekanisk stress kan bidrage til udviklingen af fibrose og glat muskelhyperplasi, fibrose score og målt glat muskelcelletal og muskeltykkelse på steder P, I og D blev bestemt separat. Det blev konstateret, at fibrose og SMC hyperplasi er til stede på steder I og P. Imidlertid påvises fibrose og glat muskelhyperplasi ikke på sted D. Disse resultater tyder på, at mekanisk stress kan spille en uafhængig patogen rolle i kollagensyntese og celleproliferation i tarmbetændelse. Yderligere undersøgelser er berettigede for at afgøre, om denne effekt kan medieres af mekanisk stressinduceret ekspression af profibrotiske og vækstfaktorer såsom CTGF på stederne P og I.

Selvom den beskrevne dyremodel selv kan bruges til at tackle mekanisk belastning i stenotisk CD-lignende colitis, har den begrænsninger i det langsigtede mål om fuldt ud at definere den patogene rolle af mekanisk stress i inflammation. For eksempel kan virkningerne af mekanisk belastning og betændelse på sted I i den beskrevne model ikke differentieres. Selvom det antages, at mekanisk stress er til stede på sted I på grund af inflammatorisk infiltration, vævsdeformation, stenose og afstand, kan det ikke bestemmes, hvor meget mekanisk stress der bidrager til de patologiske ændringer der. Der kan være behov for yderligere omfattende undersøgelser ved hjælp af in vitro-, in vivo- og ex vivo-tilgange. For eksempel kan forebyggelse af mekanisk afstand ved udelukkende at fodre colitisdyrene med en klar flydende kost25 bidrage til at skabe en tab af mekanisk afstandsstatus i colitismodellen. På den anden side kan induktion af ren mekanisk afstand ved obstruktionsbånd15 bidrage til at skabe en forstærkning af mekanisk belastningsmodel. Desuden hjælper den mekaniske in vitro-strækmodel i dyrkede celler14,15 med den kvantitative bestemmelse af virkningerne af mekanisk belastning på genekspression og funktion, da tilstanden og omfanget af mekanisk belastning kan styres fint i in vitro-indstillingen.

For at fremstille en reproducerbar model af transmural og stenotisk inflammation i CD-lignende colitis som beskrevet i undersøgelsen skal TNBS ved 65 mg/kg i 250 μL 40 % ethanol anvendes. Modellen blev hovedsageligt testet hos rotter, hanner eller hunner, der er 8-9 uger gamle. Efter indånding af TNBS i dosis udvikles transmural inflammation konsekvent på det lokale instillationssted. Betændelsen er forbundet med inflammatoriske celler infiltration, ødem og tarmvæg fortykkelse, hvilket fører til lumen indsnævring på instillationsstedet, der ligner patologiske egenskaber ved Crohns sygdom20. Pilotundersøgelser i laboratoriet viste, at TNBS ved doser lavere end 50 mg / kg i samme volumen af 40% ethanol kan forårsage tarmbetændelse, men ikke pålidelig stenose på sted I. Der ville således ikke være nogen tilsyneladende mekanisk afstand på sted P. På den anden side kan TNBS ved doser på over 80 mg/kg forårsage alvorlig betændelse og dødsfald. Den nuværende protokol, der anvender TNBS ved 65 mg/kg i 250 μL 40 % ethanol, forårsager næppe dødsfald (1 ud af 16 rotter af TNBS colitis).

Det blev konstateret, at tarmrensning dagen før indånding af TNBS er et vigtigt skridt for at sikre en relativt ren tyktarm for en pålidelig model af stenotisk colitis. Til det skal rotter faste i 24 timer og give tarmrens natten over før TNBS-behandling. Det er også vigtigt at holde rotter i en liggende og let hoved-ned position med anus lukket i 2 minutter efter indånding af TNBS. Dette hjælper med at sikre en god fordeling af TNBS inde i det distale tyktarm.

Sammenfattende blev det konstateret, at intrakolonial indånding af TNBS ved 65 mg / kg i 250 μL 40% ethanol konsekvent inducerede CD-lignende colitis hos rotter. Transmural inflammation i modellen er forbundet med stenose på TNBS-instillationsstedet. Mekanisk afstand, men ikke betændelse, observeres i segmentet proksimalt til stenose. Hverken betændelse eller mekanisk belastning er til stede i segmentet distal til stenose. Med disse ændringer i forskellige tyktarmssteder i en colitis rotte kan mekanisk stress fra betændelse i CD-lignende colitis skelnes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikt og har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde støttes delvist af bevillinger fra NIH (R01 DK124611 til XZS) og det amerikanske forsvarsministerium (W81XWH-20-1-0681 til XZS). Histologiarbejdet blev udført ved hjælp af UTMB Surgical Pathology Lab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
  2. Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
  3. Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
  4. Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
  5. Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
  6. Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
  7. Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
  8. Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
  9. Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
  10. Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
  11. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  12. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  13. Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
  14. Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
  15. Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
  16. Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
  17. Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24 (2012).
  18. Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
  19. Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
  20. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
  21. Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
  22. Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
  23. Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  24. Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
  25. Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).

Tags

Immunologi og infektion udgave 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

En TNBS-induceret gnavermodel til undersøgelse af den patogene rolle af mekanisk stress i Crohns sygdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter