Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Crohn Hastalığında Mekanik Stresin Patojenik Rolünü İncelemek için TNBS Kaynaklı Bir Kemirgen Modeli

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Mevcut protokol, kemirgenlerde Crohn benzeri bir kolit modelinin gelişimini açıklamaktadır. Transmural inflamasyon TNBS damlatma bölgesinde darlığa yol açar ve darlığa yakın segmentte mekanik genişleme gözlenir. Bu değişiklikler kolitte mekanik stresin incelenmesine izin verir.

Abstract

Crohn hastalığı (CD) gibi inflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD), Avrupa ve ABD'de 1.00.000'de yaklaşık 20'yi etkileyen gastrointestinal sistemin kronik enflamatuar hastalıklarıdır. ÇH transmural inflamasyon, intestinal fibroz ve luminal stenoz ile karakterizedir. Anti-inflamatuar tedaviler inflamasyonu kontrol etmeye yardımcı olsa da, CD'de fibroz ve darlık üzerinde hiçbir etkinliği yoktur. ÇH'nin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır. Mevcut çalışmalar esas olarak düzensiz bağırsak immün yanıt mekanizmalarını tanımlamaya odaklanmaktadır. CD ile ilişkili transmural inflamasyon, intestinal fibroz ve luminal stenozun hepsi bağırsak duvarına mekanik stresi temsil ederken, mekanik stresin CD'deki rolü iyi tanımlanmamıştır. Mekanik stresin CD'de bağımsız bir patojenik rol oynayıp oynamadığını belirlemek için, kemirgenlerde TNBS kaynaklı CD benzeri kolit modelinin bir protokolü geliştirilmiştir. TNBS ile indüklenen bu transmural inflamasyon ve fibroz modeli, kolondaki ÇH'nin patolojik özelliklerine benzemektedir. TNBS'nin yetişkin Sprague-Dawley sıçanlarının distal kolonuna intrakolonik damlatılması ile indüklenir. Bu modelde transmural inflamasyon TNBS damlatma bölgesinde darlığa yol açar (Site I). Mekanik distansiyon, damlatma bölgesine (Site P) proksimal kısımda gözlenir, mekanik stresi temsil eder, ancak görünür inflamasyonu temsil etmez. Enflamasyona distal kolonik kısım (Site D) ne inflamasyon ne de mekanik stres göstermez. Farklı bölgelerde (P, I ve D) gen ekspresyonu, immün yanıt, fibroz ve düz kas büyümesinde belirgin değişiklikler gözlendi ve mekanik stresin derin bir etkisi vurgulandı. Bu nedenle, bu CD benzeri kolit modeli, CD'nin patojenik mekanizmalarını, özellikle mekanik stresin ve mekanik strese bağlı gen ekspresyonunun immün disregülasyon, bağırsak fibrozu ve CD'deki doku yeniden şekillenmesindeki rolünü daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır.

Introduction

Ülseratif kolit (UC) ve Crohn hastalığı (CD) dahil olmak üzere inflamatuar barsak hastalığı (IBD), gastrointestinal (GI) sistemde kronik inflamasyon ile karakterizedir. ~ 1-2 milyon Amerikalıyı etkiler1. ABD'de IBD bakımı için tahmini yıllık maliyetler 11,8 milyar dolardır. UC'den farklı olarak, CD transmural inflamasyon ve striktür oluşumu 2,3 ile karakterizedir. Darlık oluşumu (darlık) ÇH hastalarının %70'inde görülür 3 ve transmural inflamasyondan (inflamatuar stenoz) veya intestinalfibrozdan (fibrotik stenoz) kaynaklanabilir4,5. İntestinal fibrozis, aşırı kollajen birikimi ve proseste yer alan ana mezenkimal hücre tiplerinden biri olarak düz kas hücreleri (SMC) ile diğer hücre dışı matrisler (ECM) ile karakterizedir 3,4. Hipertrofi ile ilişkili düz kas hiperplazisi, CD6'da fibrotik stenozda bir diğer önemli histolojik değişikliktir. ÇH'de darlık oluşumu kronik inflamasyon ile ilişkili olmasına rağmen, cerrahi tedavi dışında hiçbir antienflamatuar tedavi etkili değildir 2,6. Ancak ameliyat sonrası nüksler yeterli süre verildiğinde neredeyse %100'dür 2,7. Enflamatuar bir yanıt olarak, fibroz ve SMC hiperplazisi bağırsakta enflamatuar olmayan durumlarda (yani bağırsak tıkanıklığı) da gelişebilir 8,9; striktür oluşumunda hem inflamasyona bağımlı hem de bağımsız mekanizmaların rol oynadığı düşünülmektedir 3,4. Enflamasyona bağımlı mekanizmalara yönelik kapsamlı araştırmaların striktür oluşumu için etkili bir tedaviye dönüşmediği göz önüne alındığında, bağırsak fibrozisinde inflamasyondan bağımsız mekanizmaların olası rolüne ilişkin çalışmalara ihtiyaç vardır.

Non-inflamatuar bir faktör olarak ödem, inflamatuar hücre infiltrasyonu, doku deformasyonu, fibrozis ve darlık ile ilişkili mekanik stres (MS)10,11,12,13 İBH'de, özellikle transmural inflamasyon ile karakterize ÇH'de sık rastlanmaktadır. Mekanik stres en çok inflamasyon bölgesindeki darlığın (inflamatuar veya fibrotik) lokal dokuda mekanik stres oluşturduğu ve obstrüksiyon bölgesine yakın segmentte lümen distansiyonuna yol açtığı stenotik CD'de dikkat çekicidir10,14. Önceki in vitro çalışmalar, mekanik stresin gastrointestinal dokularda, özellikle bağırsak düz kas hücrelerinde (SMC) spesifik inflamatuar mediatörlerin (yani, COX-2, IL-6) 8,14,15 ve büyüme faktörlerinin (yani TGF-β) gen ekspresyonunu değiştirdiğini göstermiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar ayrıca, bağ dokusu büyüme faktörü (CTGF) gibi spesifik pro-fibrotik mediatörlerin ekspresyonunun mekanik strese karşı oldukça duyarlı olduğunu bulmuştur17,18. Mekanik stresin CD ile ilişkili inflamasyon, fibroz ve doku yeniden şekillenmesinde bağımsız bir patojenik rol oynayabileceği varsayılmıştır. Bununla birlikte, bağırsak iltihabı, fibroz ve CD'deki düz kas hiperplazisinde mekanik stresin patojenik önemi büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Bunun nedeni kısmen inflamasyonun mekanik stresten daha görünür ve daha iyi çalışılmış bir süreç olması olabilir. Daha da önemlisi, mekanik stresin etkisini inflamasyonunkinden ayırt etmek için iyi tanımlanmış bir hayvan modeli yoktur.

Mevcut çalışma, CD'deki mekanik stresin rolünü incelemek amacıyla hizmet edebilecek hapten reaktifi 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit (TNBS)19,20'nin intrakolonik enjeksiyonu ile indüklenen Crohn benzeri kolitin kemirgen modelini tanımlamaktadır. TNBS instilasyonunun distal kolonda lümen daralması (darlık) ile lokalize (~2 cm uzunluğunda) transmural inflamasyona neden olduğu bulundu. Darlık, belirgin barsak distansiyonuna (mekanik stres) yol açar14,15 ancak damlatma bölgesine proksimal kolon segmentinde gözle görülmeyen inflamasyona yol açar. Aksine, darlık bölgesine distal olan kolon segmenti ne inflamasyon ne de mekanik stres göstermez. Üç farklı bölgede gen ekspresyonu, inflamasyon, fibroz ve SMC hiperplazisinde bölgeye özgü önemli değişiklikler gözlendi. Sonuçlar, mekanik stresin, özellikle mekanik strese bağlı gen ekspresyonunun, Crohn kolitinde fibroz ve hiperplazi gelişiminde kritik bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri, Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi'nin (#0907051C) kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesine göre yürütülmüştür. Çalışma için ~ 8-9 haftalık erkek veya dişi Sprague-Dawley sıçanları kullanıldı.

1. Hayvan hazırlığı

  1. Hızlı sıçanlar 24 saat boyunca ve gece boyunca müshil (bağırsak temizleyici, Malzeme Tablosuna bakınız) ile tedavi edin.
  2. Ertesi gün, TNBS uygulaması sırasında 1 L / dak oksijen ile birlikte% 2 izoflurana maruz bırakarak bir anestezi sistemi kullanarak sıçanları anestezi altına alın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Anesteziyi onaylamak için refleksleri kontrol edin veya ayak parmaklarını sıkıştırın.
  3. Vücut ağırlıklarına göre taze TNBS çözeltisi hazırlayın.
    NOT: TNBS - 65 mg / kg vücut ağırlığında 250 μL% 40 etanol kullanıldı.
  4. Sıçanları anestezi masasında sırtüstü pozisyonda koyun. Koliti indüklemek için, anüs içinden anal köşeden ~ 7-8 cm boyunca tıbbi sınıf açık uçlu bir poliüretan kateter yerleştirin ve TNBS'yi (adım 1.3'te hazırlanan) kolon19'a nazikçe damlatın. Sahte kontrol sıçanlarını sadece 250 μL salin ile uygulayın.
  5. TNBS veya salin damlattıktan sonra, TNBS dağılımına yardımcı olmak ve dökülmeleri önlemek için sıçanları sırtüstü ve hafif baş aşağı pozisyonda (~ 30 °) tutun, anüs 2 dakika kapalı tutun.
  6. Sıçanlara 7 gün boyunca yiyecek ve su ad libitum sağlayın ve sıçanları vücut ağırlığı, yiyecek alımları, dışkı ve genel sağlık durumu için günlük olarak gözlemleyin.

2. Doku preparatları

  1. Ötanazi gününde, CO2 inhalasyonunu kullanarak sıçanları ötenazi yapın ve servikal çıkık ile ötenaziyi onaylayın.
  2. Cerrahi sınıf makas ve forseps kullanarak sıçan karnını açın.
  3. Tüm kolonu (anal kanalın üstünde) dikkatlice çıkarın ve kolonu hemen buz gibi soğuk 1x HBSS tamponuna aktarın.
  4. Tampondaki iki noktayı düzeltin ve bir cetvel kullanarak iki nokta üst üste uzunluğunu ölçün. Naylon ipliği alın ve kontroldeki kolon segmentlerinin ve TNBS ile tedavi edilen sıçanların dış çevresini ölçmek için kolonun etrafında daire çizin. Histoloji için tam kalınlıkta dokular alın.
  5. Kolonu mezenterik tahta boyunca kesin ve kolonu HBSS tamponu ile iyice temizleyin. Makroskopik inflamasyon skoru için kolonu, daha önce tarif edildiği gibi kriterlere göre değerlendirin19 minimal modifikasyonlarla.
    NOT: 0 = normal mukoza; 1 = lokalize hiperemi ancak erozyon veya ülser yok; 2 = ülser ve darlık (etkilenen bölge < 5 mm); 3 = şiddetli ülser, yara izi ve darlık (etkilenen bölge > 5 mm).
  6. TNBS ile tedavi edilen sıçanlardan sırasıyla P bölgesinden (inflamasyon bölgesinin oral marjından 2-3 cm önceki kısım), bölge I'den (inflamasyon bölgesi, tipik olarak TNBS'nin aşılandığı kolonun ucundan 4-6 cm) ve D bölgesinden (inflamasyon bölgesinin aboral marjına 1-2 cm distal kısım) kolon dokusu örnekleri toplayın.
    NOT: Her segmentten ~1-2 cm uzunluğunda kolon dokusu alındı. Ayrıca salin ile tedavi edilen sıçanların 2 cm uzunluğundaki (kolonun ucundan ~4-6 cm) kolon dokuları sahte kontrol (S) olarak alınmıştır (Şekil 1).
  7. Tam kalınlıkta preparasyon için her bölgeden doku örnekleri alın ve istenirse sırasıyla mukoza / submukoza ve muscularis eksterna katmanları ve21,22.
  8. Doku örneklerini bir yıla kadar ve gelecekteki amaçlar için (yani, RNA preparatları) depolamak için -80 ° C'de saklamadan önce sıvı azotta dondurun.

3. Bağırsak iltihabı ve fibrozisin histopatolojik değerlendirmesi

  1. Tam kalınlıktaki kolon dokularını 48 saat boyunca% 10 formalin içinde sabitleyin, ardından 24-48 saat boyunca% 70 etanol'e aktarın.
  2. Hematoksilin ve eozin (H & E) ve Masson'un Trikrom boyaları 6,19,23 için sırasıyla 5 μm kalınlığında parafin kesitlerini kesmek için bir mikrotom kullanın (bkz.
  3. Uyumlu yazılıma sahip yüksek çözünürlüklü bir kamerayla donatılmış dik bir mikroskopla görüntüleri elde edin ve görüntüleyin (bkz.
  4. Dereceli inflamasyon ve fibrozis indeksleri, daha önce tarif edilen kriterlere göre bir gastrointestinal cerrahi patolog da dahil olmak üzere iki bağımsız araştırmacı tarafından 6,23 modifikasyonlarla birlikte. Puanlar için Ek Dosya 1'e bakın.
  5. Her H&E boyalı numunenin dört görünümünde kesit başına dairesel ve uzunlamasına kas katmanlarının kalınlığını ve hücre numaralarını ölçün ve her örnek için dört ölçümün ortalamasını alın.

4. RNA ekstraksiyonu ve kantitatif RT-PCR

  1. Sahte kontrolden ve TNBS kolit sıçanlarının üç bölgesinden (P, I, D) elde edilen eksize kolon dokularını, bir RNA ekstraksiyon kitinin ekstraksiyon reaktifinde homojenize edin (bakınız Malzeme Tablosu).
  2. Kiti kullanarak RNA'yı her numuneden izole edin. RNA peletini 30 μL RNaz içermeyen suda süzün.
  3. RNA konsantrasyonunu ölçün ve bir mikro hacimli UV-Vis spektrofotometresi kullanarak saflığı kontrol edin (bkz.
  4. RNA sentez kitini kullanarak cDNA21,22'yi sentezlemek için 1 μg toplam RNA kullanın (bkz.
  5. Gerçek zamanlı PCR sistemi için ticari bir PCR kiti kullanarak şablon olarak 50 ng cDNA, IL-6 probları ve CTGF ile gerçek zamanlı PCR gerçekleştirerek gen ekspresyon seviyelerini analiz edin ve ölçün (bkz.
  6. Örnekleri normalleştirmek ve elde edilen Cq değerlerini kullanarak göreceli gen ekspresyonunu ölçmek için kontrol geni 18S rRNA'yı kullanın.

5. İstatistiksel analiz

  1. Sahte kontrol ve TNBS kolit sıçanlarını karşılaştırmak için istatistiksel analiz yazılımını kullanın (bakınız Malzeme Tablosu).
  2. 0.05 < p değerinin istatistiksel olarak anlamlı15,19 olduğunu düşünün.
  3. İki grup arasındaki farkları test etmek için, Student'ın t-testi analizini kullanın ve karşılaştırmalar ikiden fazla grup15,19 ise bir ANOVA testi yapın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TNBS'nin intrakolonik instilasyonu ile indüklenen Crohn benzeri kolitin makroskopik görünümü
Şekil 1'de gösterildiği gibi, sıçanlarda TNBS'nin intrakolonik damlatılması, distal kolonda damlatma bölgesinde kalınlaşmış bağırsak duvarı ve daralmış lümen (stenoz) ile lokalize bir transmural inflamasyona (~ 2 cm uzunluğunda) neden olmuştur (Şekil 1A). TNBS damlatma yeri site I olarak adlandırılır. Transmural inflamasyon ve darlığın bir sonucu olarak, bölge I'de hem inflamasyon hem de mekanik stres mevcuttur. Bölgedeki darlık, TNBS damlatma bölgesine (site P) yakın segmentte belirgin lümen distansiyonuna yol açmıştır (Şekil 1). Kolon çevresi, P ve I bölgelerinde, sahte kontrol kolonuna kıyasla anlamlı olarak artmıştır (p < 0.05'e karşı kontrol) (Şekil 1B). Mekanik olarak şişkin olmasına rağmen, P bölgesi görünür inflamasyon göstermedi. Aksine, TNBS damlatma bölgesine distal kolonik segment D bölgesidir ve ne inflamasyon ne de mekanik distansiyon göstermez (Şekil 1A,B).

Mekanik stresin inflamasyondan etkisini ayırt etmeye yardımcı olmak için, adım 2.6'da açıklanan modelde kolondan doku örnekleri toplamada benzersiz bir tasarım izledik. Site P, çalışmanın ana odak noktasıdır, çünkü bu bölüm CD modelinde mekanik olarak şişirilmiştir. D bölgesi, mekanik gerilim göstermediği için kendi kendini kontrol eder. P ve D bölgeleri gözle görülür bir inflamasyon göstermez (Şekil 1). Bununla birlikte, iltihap ve mekanik stres yaşadığım yer (Şekil 1).

Kolit sıçanlarında P, I ve D bölgelerinde inflamasyon skorunun bölgeye özgü değişiklikleri
Enflamasyonun derecelendirilmesinde, canlı dokunun makroskobik skoruna (0-3)19 ve H&E boyalı örneklerin mikroskobik skoruna (0-3)23 göre modifikasyonlarla tarif edildiği gibi kriterler geliştirilmiştir. Sonuçlar, TNBS ile tedavi edilen sıçanlarda (inflamasyonun indüksiyonundan 7 gün sonra) 2.70 ± 0.20 olan bölge I'deki makroskopik inflamasyon skorunun, sahte kontrollere (0.30 ± 0.22, p < 0.05) ve kolit sıçanlarının P (0.80 ± 0.26) ve D (0.50 ± 0.22) bölgelerine kıyasla çarpıcı bir şekilde arttığını göstermiştir (Şekil 1C). P ve D bölgelerindeki inflamasyon skorları sahte ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak artmamıştır (Şekil 1C). Mikroskobik görüntülemede sıçanlarda TNBS tedavisine bağlı transmural inflamasyon saptandı (Şekil 2A). TNBS ile tedavi edilen sıçanlarda I. bölgedeki mikroskobik inflamasyon skoru 2.80 ± 0.27 idi, yine kolit sıçanlarının sahte kontrollerde (0.3 < 0.2) ve P (1.0 ± 0.31) ve D (0.80 ± 0.38) bölgelerinde olanlara kıyasla anlamlı olarak (p ± 0.05, n = 5 her grup) artmıştır. P ve D bölgelerindeki inflamasyon skorları sahte ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak artmamıştır (Şekil 2C).

Kolit sıçanlarında fibroz ve düz kas hiperplazisi ve P, I ve D bölgelerinde bölgeye özgü değişiklikler
Fibrozis skoru, Mason'un farklı bölgelerdeki (P, I, D) trikrom boyasına (Şekil 2B) göre belirlendi (Şekil 2A). Fibroz için derecelendirme sistemi Ek Dosya 1'de açıklanmıştır. Kolit sıçanlarının fibrozis skorunun sadece Saha I'de (2.60 ± 0.25) değil, aynı zamanda kolit sıçanlarının P bölgesinde (1.60 ± 0.24) de sahte kontrole (0.40 ± 0.25) göre anlamlı olarak arttığı bulunmuştur. p < 0.05) (Şekil 2D). Dairesel ve uzunlamasına düz kas tabakalarının kalınlığı ve hücre sayıları, H&E boyalı örneklerde farklı bölgelerde ölçülmüştür (örnek başına 4 görüntüleme). Hem dairesel hem de boyuna düz kas tabakalarının kalınlığı ve hücre sayıları bölge I ve P'de anlamlı olarak artmıştır (Şekil 2E,F). Kolit sıçanlarındaki D bölgesi, fibroz skorunda, düz kas hücre sayılarında veya kas kalınlığında anlamlı bir artış göstermemektedir (Şekil 2).

Kolit sıçanlarında P, I ve D bölgelerinde mekanoya duyarlı genlerin bölgeye özgü ekspresyonu
IL-6, T hücresi farklılaşmasını teşvik ettiği, bariyer fonksiyonuna zarar verdiği ve nöromüsküler fonksiyonu etkilediği için bağırsak iltihabında kritik bir rol oynar 8,24. CTGF, iyi bilinen bir pro-fibrotik mediatördür, çünkü inhibisyonu fibroz17 sürecini tersine çevirebilir. Daha da önemlisi, son çalışmalar IL-6 ve CTGF'nin gen ekspresyonunun mekanik strese oldukça duyarlı olduğunu bulmuştur 8,14,18. IL-6 ve CTGF mRNA'larının bölgeye özgü ekspresyonu, sahte kontrol ve TNBS kolit sıçanlarının tam kalınlıktaki dokusunda belirlendi. IL-6 ve CTGF'nin mRNA ekspresyon düzeyleri, sahte kontrollere kıyasla inflamasyon bölgesinde (site I) anlamlı olarak artmıştır. Mekanik distansiyonun olduğu ancak görünür inflamasyonun olmadığı P bölgesinde, IL-6 ve CTGF'nin mRNA ekspresyonu da kontrol sıçanlarına kıyasla dramatik olarak artmıştır (Şekil 3A,B). Bununla birlikte, kolit sıçanlarının D bölgesindeki IL-6 ve CTGF mRNA düzeyleri, sahte kontrollerdekinden anlamlı olarak farklı değildi (Şekil 3).

Figure 1
Şekil 1: TNBS kaynaklı CD benzeri kolitin kemirgen modeli (7 gün). (A) Sahte kontrolün ve TNBS ile tedavi edilen kolonun (üstte) görünüm görünümü ve distal kolonun mukozal yüzeyinin makroskopik görünümü (altta). Sarı kutular kolon dokusunun farklı bölgelerini gösterir. S, sahte kontrol; I, iltihap bölgesi; P, inflamasyon bölgesine proksimal şişmiş kolon bölgesi; D, inflamasyona distal olmayan yerleşim. (B) Sahte kontrolde kolon çevresi ve TNBS ile tedavi edilen kolonun farklı bölgeleri (P, I, D). (C) Sahte kontrol kolonunun makroskopik inflamasyon skoru ve TNBS ile tedavi edilen kolonun farklı bölgeleri. n = 5, *p < 0.05 ve grubun sahte sıçanları. Çubuklar SEM'i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Histopatolojik değerlendirme. H&E (A) ve Masson'un trikrom boyalarındaki (B) mikroskobik görünümler, sahte ve kolit sıçanlarının farklı bölgelerinde kollajen dağılımını göstermektedir. Kantitatif analiz, TNBS ile tedavi edilen sıçanlarda, I ve P bölgelerinde mikroskobik inflamasyon indeksinin (C), fibrozis (D) ve kas kalınlığının (hipertrofi) (E) ve düz kas hücre sayısının (hiperplazi) (F) arttığını, ancak D olmadığını göstermektedir. (E) ve (F)'de, açık çubuklar dairesel düz kas tabakası içindir ve çizgili çubuklar uzunlamasına düz kas tabakası içindir. n = her grupta 5, *p < 0,05'e karşılık grubun sahte fareleri. (A) ve (B) = 100 μm.

Figure 3
Şekil 3: CD benzeri kolitte mekanosensitif genlerin (IL-6 ve CTGF) bölgeye özgü ekspresyonu . (A) Sahte kontrol kolonunda ve TNBS ile tedavi edilen kolit kolonunun farklı bölgelerinde (P, I ve D) IL-6 mRNA ekspresyonu. (B) CTGF mRNA'nın sahte kontrol kolonunda ve TNBS ile tedavi edilen kolit kolonunun farklı bölgelerinde (P, I ve D) ekspresyonu. n = 4 veya 5, *p < 0,05'e kıyasla. S (sahte kontrol). Çubuklar SEM'i temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Enflamasyon ve fibroz skoru. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TNBS kaynaklı kolit 1989 yılında tanıtıldı ve o zamandan beri Crohn hastalığının deneysel bir modeli olarak kullanıldı 19,20,23. Kemirgenlerde bu modelin önemli özellikleri, insan Crohn hastalığında geliştirilen histopatolojik lezyonlara çok benzeyen bir transmural inflamasyonun gelişmesini içerir19,20. Model üzerinde yapılan önceki çalışmalar, esas olarak görünür inflamasyon bölgesindeki mukoza tabakasındaki anormal immün yanıta odaklanmıştır (site I)19,20,23. Enflamasyona proksimal ve distal bağırsak kısımlarına çok az dikkat edilmiştir. Enflamasyon bölgesi ile şişmiş proksimal segment ve şişkin olmayan distal segment üzerine yapılan bu çalışma, gen ekspresyonunda, inflamatuar yanıtta ve histopatolojik özelliklerde belirgin bölgeye özgü değişiklikleri ortaya koymaktadır. Model, fibroziste mekanik stresin potansiyel patojenik rolünü ve Crohn hastalığında doku yeniden şekillenmesini ele almak için tekrar gözden geçirilmiştir.

TNBS'nin etanolde mukozal maruziyetinden hemen sonra akut inflamasyonun geliştiği ve 3. gün19'da zirveye ulaştığı bulunmuştur. TNBS ile tedavi edilen her sıçanda P bölgesinde lümen distansiyonu ile ilişkili transmural inflamasyon ve inflamatuar stenoz mevcuttur. 7. günde, kronik transmural inflamasyon, mevcut çalışmada bulunduğu ve başka bir yerde20'de bildirildiği gibi, site I'de iyi gelişmiştir. Bu arada, bu çalışmada ve başka yerlerdegörüldüğü gibi aşırı kollajen birikimi ile karakterize edilen bölgede fibrotik değişiklikler belirgindir. Distal kolonda etanol içinde TNBS damlatılması, lokal mukoza dokusu23'e zarar verir ve kolonda lokalize bir bölgede transmural inflamasyona yol açar. İnflamatuar infiltrasyon, ödem ve doku deformasyonu ile seyreden transmural inflamasyon 10,12,13 lokalize bölgeye inflamasyon ve mekanik stres14 gösterir (Site I). Ayrıca, transmural inflamasyon da Saha I10'da luminal darlığa neden olur. Parsiyel barsak tıkanıklığı olan darlığın, proksimal segmentte (P bölgesi) mekanik distansiyona neden olduğu saptandı. Bununla birlikte, damlatma bölgesine distal olan kısım şişirilmemiştir (site D). Makroskopik ve histolojik skorlama sistemlerinde saptandığı gibi, bölge I hem inflamasyon hem de mekanik stres gösterirken, P ve D bölgeleri inflamasyon göstermez. Ayrıca, P bölgesi önemli ölçüde artmış çevre (ve dolayısıyla Laplace14 yasasına göre mekanik gerilme) gösterir, ancak D bölgesi bunu göstermez. Bu nedenle, bölgeye özgü değişiklikler, özellikle de P bölgesi üzerine yapılan bir çalışma, bağırsaktaki inflamasyon modelinde mekanik stresin patojenik önemini araştıracaktır.

Mekanoya duyarlı genler IL-6 ve CTGF'nin ekspresyonunun Saha I'de ve mekanik olarak gerilmiş bölge P'de arttığı, ancak mekanik distansiyonun olmadığı komşu bölge D'de artmadığı gözlendi. Mekanik stresin fibroz ve düz kas hiperplazisi gelişimine katkıda bulunabileceği hipotezini incelemek için, fibrozis skorları ve ölçülen düz kas hücre sayıları ve P, I ve D bölgelerindeki kas kalınlığı ayrı ayrı belirlenmiştir. Fibrozis ve SMC hiperplazisinin I ve P bölgelerinde mevcut olduğu bulundu. Bununla birlikte, fibroz ve düz kas hiperplazisi D bölgesinde tespit edilmez. Bu bulgular, mekanik stresin bağırsak iltihabında kollajen sentezinde ve hücre proliferasyonunda bağımsız patojenik rol oynayabileceğini göstermektedir. Bu etkinin, P ve I bölgelerindeki CTGF gibi pro-fibrotik ve büyüme faktörlerinin mekanik strese bağlı ekspresyonuna aracılık edip edemeyeceğini belirlemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Tanımlanan hayvan modelinin kendisi, stenotik CD benzeri kolitte mekanik stresi ele almak için kullanılabilse de, inflamasyonda mekanik stresin patojenik rolünü tam olarak tanımlamak için uzun vadeli hedefte sınırlamaları vardır. Örneğin, tarif edilen modelin I. bölgesindeki mekanik stres ve inflamasyonun etkileri ayırt edilemez. İnflamatuar infiltrasyon, doku deformasyonu, darlık ve distansiyon nedeniyle Saha I'de mekanik stresin mevcut olduğu varsayılsa da, mekanik stresin patolojik değişikliklere ne kadar katkıda bulunduğu belirlenememiştir. İn vitro, in vivo ve ex vivo yaklaşımları kullanan daha kapsamlı çalışmalara ihtiyaç duyulabilir. Örneğin, kolit hayvanlarını yalnızca berrak bir sıvı diyet25 ile besleyerek mekanik distansiyonun önlenmesi, kolit modelinde mekanik distansiyon kaybı durumunun yaratılmasına yardımcı olabilir. Öte yandan, obstrüksiyon bandı15 ile saf mekanik distansiyonun indüklenmesi, mekanik stres modelinin kazanılmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, kültürlü hücrelerdeki in vitro mekanik gerilme modeli14,15, mekanik stresin gen ekspresyonu ve fonksiyonu üzerindeki etkilerinin nicel olarak belirlenmesine yardımcı olur, çünkü mekanik stresin modu ve kapsamı in vitro ortamda hassas bir şekilde kontrol edilebilir.

Çalışmada tarif edildiği gibi CD benzeri kolitte tekrarlanabilir bir transmural ve stenotik inflamasyon modeli hazırlamak için,% 40 etanolün 250 μL'sinde 65 mg / kg'da TNBS kullanılmalıdır. Model esas olarak 8-9 haftalık erkek veya dişi sıçanlarda test edildi. TNBS'nin dozda damlatılmasından sonra, lokal damlatma bölgesinde transmural inflamasyon sürekli olarak gelişir. Enflamasyon, inflamatuar hücrelerin infiltrasyonu, ödem ve bağırsak duvarı kalınlaşması ile ilişkilidir ve damlatma bölgesinde lümen daralmasına yol açarak, Crohn hastalığının patolojik özelliklerine benzer20. Laboratuvardaki pilot çalışmalar, TNBS'nin% 40 etanol ile aynı hacimde 50 mg / kg'dan daha düşük dozlarda bağırsak iltihabına neden olabileceğini, ancak bölge I'de güvenilir darlığa neden olmayabileceğini göstermiştir. Böylece, P bölgesinde belirgin bir mekanik distansiyon olmayacaktır. Öte yandan, 80 mg / kg'dan daha yüksek dozlarda TNBS, ciddi inflamasyona ve ölümlere neden olabilir. TNBS'yi 250 μL% 40 etanolde 65 mg / kg'da kullanan mevcut protokol ölümlere neden olmaz (TNBS kolitinin 16 sıçanından 1'i).

TNBS'nin damlatılmasından bir gün önce bağırsak temizliğinin, güvenilir bir stenotik kolit modeli için nispeten temiz bir kolon sağlamak için önemli bir adım olduğu bulunmuştur. Bunun için, sıçanların 24 saat boyunca oruç tutmaları ve TNBS tedavisinden önce gece boyunca bağırsak temizleyici vermeleri gerekir. Sıçanları, TNBS'nin damlatılmasından sonra anüs 2 dakika kapalı olacak şekilde sırtüstü ve hafif baş aşağı pozisyonda tutmak da önemlidir. Bu, TNBS'nin distal kolon içinde iyi bir dağılımını sağlamaya yardımcı olur.

Özetle, TNBS'nin 250 μL'de% 40 etanol içinde 65 mg / kg'da intrakolonik instilasyonunun, sıçanlarda sürekli olarak CD benzeri koliti indüklediği bulunmuştur. Modeldeki transmural inflamasyon, TNBS damlatma bölgesindeki darlık ile ilişkilidir. Mekanik distansiyon, ancak inflamasyon değil, darlığa proksimal segmentte görülür. Darlığa distal segmentte ne inflamasyon ne de mekanik stres yoktur. Bir kolit sıçanındaki farklı kolon bölgelerindeki bu değişikliklerle, CD benzeri kolitte iltihaplanmadan kaynaklanan mekanik stres ayırt edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını ve açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını bildirmektedir.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen NIH (R01 DK124611'den XZS'ye) ve ABD Savunma Bakanlığı'ndan (W81XWH-20-1-0681'den XZS'ye) gelen hibelerle desteklenmektedir. Histoloji çalışmaları UTMB Cerrahi Patoloji Laboratuvarı yardımıyla yapıldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
  2. Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
  3. Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
  4. Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
  5. Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
  6. Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
  7. Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
  8. Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
  9. Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
  10. Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
  11. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  12. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  13. Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
  14. Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
  15. Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
  16. Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
  17. Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24 (2012).
  18. Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
  19. Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
  20. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
  21. Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
  22. Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
  23. Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  24. Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
  25. Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

Crohn Hastalığında Mekanik Stresin Patojenik Rolünü İncelemek için TNBS Kaynaklı Bir Kemirgen Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter