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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Un modelo de roedor inducido por TNBS para estudiar el papel patogénico del estrés mecánico en la enfermedad de Crohn

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

El presente protocolo describe el desarrollo de un modelo de colitis similar a la enfermedad de Crohn en roedores. La inflamación transmural conduce a estenosis en el sitio de instilación de TNBS, y se observa agrandamiento mecánico en el segmento proximal a la estenosis. Estos cambios permiten estudiar el estrés mecánico en la colitis.

Abstract

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) como la enfermedad de Crohn (EC) son trastornos inflamatorios crónicos del tracto gastrointestinal que afectan aproximadamente a 20 por cada 1,00,000 en Europa y Estados Unidos. La EC se caracteriza por inflamación transmural, fibrosis intestinal y estenosis luminal. Aunque las terapias antiinflamatorias pueden ayudar a controlar la inflamación, no tienen eficacia en la fibrosis y la estenosis en la EC. La patogénesis de la EC no se entiende bien. Los estudios actuales se centran principalmente en delinear los mecanismos desregulados de la respuesta inmune intestinal. Si bien la inflamación transmural asociada a la EC, la fibrosis intestinal y la estenosis luminal representan estrés mecánico en la pared intestinal, el papel del estrés mecánico en la EC no está bien definido. Para determinar si el estrés mecánico desempeña un papel patógeno independiente en la EC, se ha desarrollado un protocolo de modelo de colitis similar a la EC inducido por TNBS en roedores. Este modelo de inflamación transmural y fibrosis inducida por TNBS se asemeja a las características patológicas de la EC en el colon. Es inducida por la instilación intracolonica de TNBS en el colon distal de ratas Sprague-Dawley adultas. En este modelo, la inflamación transmural conduce a estenosis en el sitio de instilación de TNBS (Sitio I). La distensión mecánica se observa en la porción proximal al sitio de instilación (Sitio P), lo que representa estrés mecánico pero no inflamación visible. La porción colónica distal a la inflamación (Sitio D) no presenta inflamación ni estrés mecánico. Se observaron cambios distintivos de la expresión génica, la respuesta inmune, la fibrosis y el crecimiento del músculo liso en diferentes sitios (P, I y D), destacando un profundo impacto del estrés mecánico. Por lo tanto, este modelo de colitis similar a la EC nos ayudará a comprender mejor los mecanismos patógenos de la EC, particularmente el papel del estrés mecánico y la expresión génica inducida por el estrés mecánico en la desregulación inmune, la fibrosis intestinal y la remodelación de tejidos en la EC.

Introduction

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), incluida la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC), se caracteriza por una inflamación crónica en el tracto gastrointestinal (GI). Afecta a ~1-2 millones de estadounidenses1. Los costos anuales estimados para la atención de la EII en los Estados Unidos son de $ 11.8 mil millones. A diferencia de la CU, la EC se caracteriza por inflamación transmural y formación deestenosis 2,3. La formación de estenosis (estenosis) ocurre en hasta el 70% de los pacientes con EC3 y puede ser causada por inflamación transmural (estenosis inflamatoria) o fibrosis intestinal (estenosis fibrótica)4,5. La fibrosis intestinal se caracteriza por una deposición excesiva de colágeno y otras matrices extracelulares (ECM) con células del músculo liso (SMC) como uno de los principales tipos de células mesenquimales implicadas en el proceso 3,4. La hiperplasia del músculo liso asociada con hipertrofia es otro cambio histológico significativo en la estenosis fibrótica en laEC 6. Aunque la formación de estenosis en la EC se asocia con inflamación crónica, ningún tratamiento antiinflamatorio es efectivo, excepto el tratamiento quirúrgico 2,6. Sin embargo, las recurrencias postquirúrgicas son casi del 100%, dado el tiempo suficiente 2,7. Como respuesta inflamatoria, la fibrosis y la hiperplasia SMC también pueden desarrollarse en condiciones no inflamatorias (es decir, obstrucción intestinal) en el intestino 8,9; se cree que tanto los mecanismos dependientes de la inflamación como los independientes están involucrados en la formación deestenosis 3,4. Dado que la extensa investigación sobre los mecanismos dependientes de la inflamación no se ha traducido en ninguna terapia efectiva para la formación de estenosis, se necesitan estudios sobre el posible papel de los mecanismos independientes de la inflamación en la fibrosis intestinal.

Como factor no inflamatorio, el estrés mecánico (EM) asociado con edema, infiltración de células inflamatorias, deformación tisular, fibrosis y estenosis 10,11,12,13 se encuentra comúnmente en la EII, especialmente la EC, que se caracteriza por inflamación transmural. El estrés mecánico es más notable en la EC estenótica, donde la estenosis (inflamatoria o fibrótica) en el sitio de inflamación presenta estrés mecánico en el tejido local y conduce a la distensión de la luz en el segmento proximal al sitio de obstrucción10,14. Estudios previos in vitro han demostrado que el estrés mecánico altera la expresión génica de mediadores inflamatorios específicos (es decir, COX-2, IL-6)8,14,15 y factores de crecimiento (es decir, TGF-β) en los tejidos gastrointestinales, especialmente las células del músculo liso intestinal (SMC)16. Estudios recientes también encontraron que la expresión de mediadores profibróticos específicos como el factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) es altamente sensible al estrés mecánico17,18. Se planteó la hipótesis de que el estrés mecánico podría desempeñar un papel patógeno independiente en la inflamación asociada a la EC, la fibrosis y la remodelación de los tejidos. Sin embargo, la importancia patogénica del estrés mecánico en la inflamación intestinal, la fibrosis y la hiperplasia del músculo liso en la EC permanece en gran medida inexplorada. Esto puede deberse en parte a que la inflamación es un proceso más visible y mejor estudiado que el estrés mecánico. Más importante aún, no ha habido un modelo animal bien definido de EII para distinguir el efecto del estrés mecánico del de la inflamación.

El presente trabajo describe un modelo de roedor de colitis similar a la enfermedad de Crohn inducida por inyección intracolínica del reactivo de hapteno ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS)19,20, que puede servir para estudiar el papel del estrés mecánico en la EC. Se encontró que la instilación de TNBS indujo una inflamación transmural localizada (~ 2 cm de longitud) con estrechamiento de la luz (estenosis) en el colon distal. La estenosis conduce a una marcada distensión intestinal (estrés mecánico)14,15 pero no a una inflamación visible en el segmento colónico proximal al sitio de instilación. Por el contrario, el segmento del colon distal al sitio de estenosis no presenta inflamación ni estrés mecánico. Se observaron cambios significativos específicos del sitio en la expresión génica, la inflamación, la fibrosis y la hiperplasia SMC en los tres sitios diferentes. Los resultados sugieren que el estrés mecánico, particularmente la expresión génica inducida por el estrés mecánico, puede desempeñar un papel crítico en el desarrollo de fibrosis e hiperplasia en la colitis de Crohn.

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Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Rama Médica de la Universidad de Texas (#0907051C). Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho o hembra, de ~ 8-9 semanas de edad, para el estudio.

1. Preparación animal

  1. Ayuna a las ratas durante 24 horas y trátalas con laxante (limpiador intestinal, ver Tabla de materiales) durante la noche.
  2. Al día siguiente, anestesiar a las ratas utilizando un sistema de anestesia (ver Tabla de Materiales) exponiéndolas a isoflurano al 2% junto con 1 L/min de oxígeno durante la administración de TNBS. Verifique si hay reflejos o pellizcos de los dedos de los pies para confirmar la anestesia.
  3. Prepare una solución fresca de TNBS de acuerdo con el peso corporal.
    NOTA: TNBS - se utilizaron 65 mg/kg de peso corporal en 250 μL de etanol al 40%.
  4. Coloque a las ratas en posición supina sobre la mesa de anestesia. Para inducir la colitis, inserte a través del ano un catéter de poliuretano abierto de grado médico durante ~ 7-8 cm desde el borde anal e insértele suavemente TNBS (preparado en el paso 1.3) en el colon19. Administrar las ratas de control simuladas con 250 μL de solución salina solamente.
  5. Después de instilar TNBS o solución salina, mantenga a las ratas en posición supina y ligeramente boca abajo (~ 30 °), con el ano cerrado durante 2 minutos para ayudar a la distribución de TNBS y evitar derrames.
  6. Proporcione a las ratas alimentos y agua ad libitum durante 7 días y observe a las ratas diariamente para determinar el peso corporal, la absorción de alimentos, las heces y el estado general de salud.

2. Preparaciones de tejidos

  1. El día de la eutanasia, sacrificar a las ratasusando la inhalación de CO 2 y confirmar la eutanasia con luxación cervical.
  2. Abra el abdomen de la rata con tijeras y fórceps de grado quirúrgico.
  3. Retire cuidadosamente todo el colon (por encima del canal anal) y transfiera el colon inmediatamente al tampón 1x HBSS helado.
  4. Enderece el colon en el búfer y mide la longitud del colon usando una regla. Tome hilo de nylon y rodee el colon para medir la circunferencia externa de los segmentos de colon en control y las ratas tratadas con TNBS. Tome tejidos de espesor completo para histología.
  5. Abra el colon a lo largo de la tabla mesentérica y limpie bien el colon con el tampón HBSS. Evaluar el colon para la puntuación de inflamación macroscópica en función de los criterios descritos anteriormente19 con modificaciones mínimas.
    NOTA: 0 = mucosa normal; 1 = hiperemia localizada pero sin erosiones ni úlceras; 2 = úlcera y estenosis (área afectada < 5 mm); 3 = úlcera grave, cicatriz y estenosis (área afectada > 5 mm).
  6. Recolectar muestras de tejido colónico del sitio P (porción 2-3 cm antes del margen oral del sitio de inflamación), el sitio I (sitio de inflamación, típicamente a 4-6 cm del final del colon, donde se inculca TNBS) y el sitio D (porción 1-2 cm distal al margen aboral del sitio de inflamación), respectivamente de ratas tratadas con TNBS.
    NOTA: Se tomó tejido del colon de ~ 1-2 cm de largo de cada segmento. Además, los tejidos del colon de 2 cm de largo (~ 4-6 cm desde el extremo del colon) de las ratas tratadas con solución salina se tomaron como control simulado (S) (Figura 1).
  7. Tomar muestras de tejido de cada sitio para la preparación de espesor completo, y si se desea, capas de mucosa/submucosa y muscularis externa, respectivamente, así como21,22.
  8. Primero congele muestras de tejido en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a -80 °C para almacenarlas hasta un año y para fines futuros (es decir, preparaciones de ARN).

3. Evaluación histopatológica de la inflamación intestinal y la fibrosis

  1. Fije los tejidos del colon de espesor completo en formalina al 10% durante 48 h, luego transfiera a etanol al 70% durante 24-48 h.
  2. Utilice un microtomo para cortar secciones de parafina de 5 μm de espesor para hematoxilina y eosina (H&E) y tinciones tricrómicas de Masson 6,19,23 (ver Tabla de materiales), respectivamente.
  3. Adquiera y vea imágenes con un microscopio vertical equipado con una cámara de alta resolución con software compatible (consulte la Tabla de materiales).
  4. Índices de inflamación y fibrosis de grado por dos investigadores independientes, entre ellos un patólogo quirúrgico gastrointestinal según criterios descritos anteriormente 6,23 con modificaciones. Consulte el Archivo Suplementario 1 para conocer las puntuaciones.
  5. Mida el grosor y el número de células de las capas musculares circulares y longitudinales por sección transversal en cuatro vistas de cada espécimen teñido de H&E y tome la media de las cuatro mediciones para cada espécimen.

4. Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa

  1. Homogeneizar los tejidos de colon extirpados obtenidos del control simulado y de tres sitios (P, I, D) de ratas con colitis TNBS en el reactivo de extracción de un kit de extracción de ARN (ver Tabla de Materiales).
  2. Aísle el ARN de cada muestra utilizando el kit. Eluya el gránulo de ARN en 30 μL de agua libre de RNasa.
  3. Cuantificar la concentración de ARN y comprobar la pureza utilizando un espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen (ver Tabla de Materiales).
  4. Utilice 1 μg de ARN total para sintetizar ADNc21,22 utilizando el kit de síntesis de ARN (ver Tabla de Materiales).
  5. Analizar y cuantificar los niveles de expresión génica mediante la realización de PCR en tiempo real con 50 ng de ADNc como plantilla, sondas de IL-6 y CTGF utilizando un kit de PCR comercial para el sistema de PCR en tiempo real (ver Tabla de Materiales).
  6. Utilizar el rRNA del gen de control 18S para normalizar las muestras y cuantificar la expresión génica relativa utilizando los valores de Cq obtenidos.

5. Análisis estadístico

  1. Utilice software de análisis estadístico (ver Tabla de Materiales) para comparar el control simulado y las ratas con colitis TNBS.
  2. Considere que el valor de p < 0,05 es estadísticamente significativo15,19.
  3. Para probar las diferencias entre dos grupos, utilice el análisis de la prueba t de Student y realice una prueba ANOVA si las comparaciones son más de dos grupos15,19.

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Representative Results

Visión macroscópica de la colitis similar a la de Crohn inducida por la instilación intracolónica de TNBS
Como se muestra en la Figura 1, la instilación intracolónica de TNBS en ratas indujo una inflamación transmural localizada (~ 2 cm de longitud) con pared intestinal engrosada y lumen estrechado (estenosis) en el sitio de instilación en el colon distal (Figura 1A). El sitio de instilación de TNBS se conoce como sitio I. Como resultado de la inflamación transmural y la estenosis, tanto la inflamación como el estrés mecánico están presentes en el sitio I. La estenosis en el sitio I condujo a una marcada distensión de la luz en el segmento proximal al sitio de instilación de TNBS (sitio P) (Figura 1). La circunferencia del colon aumentó significativamente en los sitios P e I, en comparación con el colon de control simulado (p < 0,05 vs. control) (Figura 1B). Aunque mecánicamente distendido, el sitio P no mostró inflamación visible. Por el contrario, el segmento colónico distal al sitio de instilación de TNBS es el sitio D y no presenta inflamación ni distensión mecánica (Figura 1A,B).

Para ayudar a distinguir el efecto del estrés mecánico de la inflamación, seguimos un diseño único en la recolección de muestras de tejido del colon en el modelo descrito en el paso 2.6. El sitio P es el foco principal del estudio, ya que esta parte está distendida mecánicamente en el modelo de EC. El sitio D es autocontrol, ya que no presenta estrés mecánico. Los sitios P y D no demuestran ninguna inflamación visible (Figura 1). Sin embargo, el sitio en el que experimento inflamación y estrés mecánico (Figura 1).

Cambios específicos del sitio de la puntuación de inflamación en los sitios P, I y D en ratas con colitis
Se desarrollaron criterios para clasificar la inflamación en función de la puntuación macroscópica del tejido vivo (0-3)19 y la puntuación microscópica de las muestras teñidas de H&E (0-3)23 como se describe con modificaciones. Los resultados mostraron que la puntuación macroscópica de inflamación en el sitio I fue de 2,70 ± 0,20 en las ratas tratadas con TNBS (7 días después de la inducción de la inflamación), aumentó dramáticamente en comparación con la de los controles simulados (0,30 ± 0,22, p < 0,05) y la de los sitios P (0,80 ± 0,26) y D (0,50 ± 0,22) de ratas colitis (Figura 1C). Las puntuaciones de inflamación en los sitios P y D no aumentan significativamente en comparación con la simulación (Figura 1C). Las imágenes microscópicas mostraron inflamación transmural inducida por el tratamiento con TNBS en ratas (Figura 2A). La puntuación microscópica de inflamación en el sitio I fue de 2,80 ± 0,27 en las ratas tratadas con TNBS, nuevamente significativamente (p < 0,05, n = 5 cada grupo) aumentó en comparación con la de los controles simulados (0,3 ± 0,2) y en los sitios P (1,0 ± 0,31) y D (0,80 ± 0,38) de ratas colitis. Las puntuaciones de inflamación en los sitios P y D no aumentaron significativamente en comparación con la simulación (Figura 2C).

Cambios específicos del sitio de fibrosis e hiperplasia e hipertrofia del músculo liso en los sitios P, I y D en ratas con colitis
La puntuación de fibrosis se determinó en función de la tinción tricrómica de Mason (Figura 2B) en diferentes sitios (P, I, D) (Figura 2A). El sistema de clasificación para la fibrosis se describe en el Archivo Complementario 1. Se encontró que la puntuación de fibrosis aumenta significativamente no solo en el sitio I (2,60 ± 0,25) sino también en el sitio P (1,60 ± 0,24) de las ratas colitis, en comparación con el control simulado (0,40 ± 0,25. p < 0,05) (Figura 2D). El grosor y el número de células de las capas circulares y longitudinales de músculo liso se midieron en diferentes sitios en especímenes teñidos de H&E (4 vistas por espécimen). El grosor y el número de células de las capas circulares y longitudinales del músculo liso aumentaron significativamente en los sitios I y P (Figura 2E, F). El sitio D en las ratas con colitis no muestra ningún aumento significativo en la puntuación de fibrosis, el número de células del músculo liso o el grosor muscular (Figura 2).

Expresión específica del sitio de genes mecanosensibles en los sitios P, I y D en ratas con colitis
La IL-6 desempeña un papel crítico en la inflamación intestinal, ya que promueve la diferenciación de las células T, daña la función de barrera y afecta la función neuromuscular 8,24. El CTGF es un mediador profibrótico bien reconocido, ya que su inhibición puede revertir el proceso de fibrosis17. Más importante aún, estudios recientes encontraron que la expresión génica de IL-6 y CTGF es altamente sensible al estrés mecánico 8,14,18. La expresión específica del sitio de IL-6 y CTGF mRNAs se determinó en el tejido de espesor completo de ratas de control simulado y colitis TNBS. Los niveles de expresión de ARNm de IL-6 y CTGF aumentaron significativamente en el sitio de inflamación (sitio I) en comparación con los controles simulados. En el sitio P, donde hay distensión mecánica pero no inflamación visible, la expresión de ARNm de IL-6 y CTGF también aumentó dramáticamente en comparación con las ratas de control (Figura 3A, B). Sin embargo, los niveles de ARNm de IL-6 y CTGF en el sitio D de ratas con colitis no fueron significativamente diferentes de los de los controles simulados (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Modelo de roedor de colitis similar a la EC inducida por TNBS (7 días). (A) Vista de perspectiva del control simulado y colon tratado con TNBS (arriba) y vista macroscópica de la superficie mucosa del colon distal (abajo). Los cuadros amarillos indican diferentes sitios de tejido del colon. S, control simulado; I, sitio de inflamación; P, sitio distendido del colon proximal al sitio de inflamación; D, sitio no distendido distal a la inflamación. (B) Circunferencia del colon en control simulado y diferentes sitios (P, I, D) del colon tratado con TNBS. (C) Puntuación de inflamación macroscópica del colon de control simulado y diferentes sitios del colon tratado con TNBS. n = 5, *p < 0,05 vs. ratas simuladas del grupo. Las barras representan SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Evaluación histopatológica. Vistas microscópicas en H&E (A) y tinciones tricrómicas de Masson (B) que muestran la distribución del colágeno en ratas simuladas y diferentes de colitis. El análisis cuantitativo muestra un aumento del índice de inflamación microscópica (C), fibrosis (D) y grosor muscular (hipertrofia) (E), y número de células del músculo liso (hiperplasia) (F) en los sitios I y P, pero no D, en ratas tratadas con TNBS. En (E) y (F), las barras abiertas son para la capa circular del músculo liso, y las barras rayadas son para la capa longitudinal del músculo liso. n = 5 en cada grupo, *p < 0,05 vs. Ratas simuladas del grupo. Las barras en los gráficos representan SEM. Barras en (A) y (B) = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Expresión site-specific de genes mecanosensibles (IL-6 y CTGF) en colitis similar a la EC. (A) Expresión de ARNm de IL-6 en colon de control simulado y diferentes sitios (P, I y D) de colitis de colon tratada con TNBS. (B) Expresión de ARNm ctgf en colon de control simulado y diferentes sitios (P, I y D) de colitis de colon tratada con TNBS. n = 4 o 5, *p < 0,05 vs. S (control simulado). Las barras representan SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Expediente complementario 1: Puntuación de inflamación y fibrosis. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La colitis inducida por TNBS se introdujo en 1989 y se ha utilizado como modelo experimental de la enfermedad de Crohn desde entonces 19,20,23. Las características significativas de este modelo en roedores incluyen el desarrollo de una inflamación transmural que se asemeja mucho a las lesiones histopatológicas desarrolladas en la enfermedad de Crohn humana19,20. Estudios previos sobre el modelo se han centrado principalmente en la respuesta inmune aberrante en la capa mucosa en el sitio de inflamación visible (el sitio I)19,20,23. Se ha prestado poca atención a las porciones intestinales proximales y distales a la inflamación. El presente estudio sobre el sitio de inflamación, así como el segmento proximal distendido y el segmento distal no distendido, revela cambios aparentes específicos del sitio en la expresión génica, la respuesta inflamatoria y las características histopatológicas. El modelo ha sido revisado para abordar el papel patógeno potencial del estrés mecánico en la fibrosis y la remodelación de tejidos en la enfermedad de Crohn.

Se encontró que la inflamación aguda se desarrolla inmediatamente después de la exposición mucosa de TNBS en etanol y alcanza su punto máximo en el día 319. La inflamación transmural y la estenosis inflamatoria están presentes, que se asocia con la distensión de la luz en el sitio P en cada rata tratada con TNBS. Para el día 7, la inflamación transmural crónica está bien desarrollada en el sitio I, como se encontró en el estudio actual y se informó en otra parte20. Mientras tanto, los cambios fibróticos son evidentes en el sitio, caracterizados por una deposición excesiva de colágeno, como se ve en el presente estudio y en otroslugares 20. La instilación de TNBS en etanol en el colon distal lesiona el tejido de la mucosa local23 y conduce a la inflamación transmural en un área localizada en el colon. La inflamación transmural con infiltración inflamatoria, edema y deformación tisular10,12,13 en el sitio de instilación presenta inflamación y estrés mecánico14 en el área localizada (Sitio I). Además, la inflamación transmural también causa estenosis luminal en el sitio I10. Se encontró que la estenosis, una obstrucción intestinal parcial, causa distensión mecánica en el segmento proximal (sitio P). Sin embargo, la parte distal al sitio de instilación no está distendida (sitio D). Como se encuentra en los sistemas de puntuación macroscópica e histológica, mientras que el sitio I presenta tanto inflamación como estrés mecánico, los sitios P y D no presentan inflamación. Además, el sitio P muestra un aumento significativo de la circunferencia (y por lo tanto de la tensión mecánica, de acuerdo con la ley de Laplace14), pero el sitio D no lo hace. Por lo tanto, un estudio sobre los cambios específicos del sitio, especialmente el sitio P, explorará la importancia patogénica del estrés mecánico en el modelo de inflamación en el intestino.

Se observó que la expresión de los genes mecanosensibles IL-6 y CTGF aumentó en el sitio I y en el sitio P estirado mecánicamente, pero no en el sitio vecino D, donde no hay distensión mecánica. Para examinar la hipótesis de que el estrés mecánico puede contribuir al desarrollo de fibrosis e hiperplasia del músculo liso, las puntuaciones de fibrosis y el número medido de células del músculo liso y el grosor muscular en los sitios P, I y D se determinaron por separado. Se encontró que la fibrosis y la hiperplasia SMC están presentes en los sitios I y P. Sin embargo, la fibrosis y la hiperplasia del músculo liso no se detectan en el sitio D. Estos hallazgos indican que el estrés mecánico puede desempeñar un papel patógeno independiente en la síntesis de colágeno y la proliferación celular en la inflamación intestinal. Se justifican estudios adicionales para determinar si este efecto puede estar mediado por la expresión inducida por el estrés mecánico de factores profibróticos y de crecimiento como el CTGF en los sitios P e I.

Aunque el modelo animal descrito en sí mismo se puede utilizar para abordar el estrés mecánico en la colitis estenótica similar a la EC, tiene limitaciones en el objetivo a largo plazo de definir completamente el papel patógeno del estrés mecánico en la inflamación. Por ejemplo, no se pueden diferenciar los efectos del estrés mecánico y la inflamación en el sitio I del modelo descrito. Aunque se supone que el estrés mecánico está presente en el sitio I debido a la infiltración inflamatoria, la deformación del tejido, la estenosis y la distensión, no se puede determinar cuánto estrés mecánico contribuye a los cambios patológicos allí. Es posible que se necesiten estudios exhaustivos adicionales que utilicen enfoques in vitro, in vivo y ex vivo. Por ejemplo, la prevención de la distensión mecánica alimentando a los animales colitis exclusivamente con una dieta líquida clara25 puede ayudar a crear un estado de pérdida de distensión mecánica en el modelo de colitis. Por otro lado, la inducción de distensión mecánica pura por la banda de obstrucción15 puede ayudar a crear un modelo de ganancia de tensión mecánica. Además, el modelo de estiramiento mecánico in vitro en células cultivadas14,15 ayuda en la determinación cuantitativa de los efectos del estrés mecánico en la expresión y función génica, ya que el modo y la extensión del estrés mecánico pueden controlarse finamente en el entorno in vitro.

Para preparar un modelo reproducible de inflamación transmural y estenótica en la colitis similar a la EC como se describe en el estudio, se debe utilizar TNBS a 65 mg / kg en 250 μL de etanol al 40%. El modelo se probó principalmente en ratas, macho o hembra, de 8-9 semanas de edad. Después de la instilación de TNBS a la dosis, la inflamación transmural se desarrolla constantemente en el sitio de instilación local. La inflamación se asocia con la infiltración de células inflamatorias, edema y engrosamiento de la pared intestinal, lo que lleva al estrechamiento de la luz en el sitio de instilación, que se asemeja a las características patológicas de la enfermedad de Crohn20. Los estudios piloto en el laboratorio mostraron que el TNBS a dosis inferiores a 50 mg / kg en el mismo volumen de etanol al 40% podría causar inflamación intestinal, pero no estenosis confiable en el sitio I. Por lo tanto, no habría distensión mecánica aparente en el sitio P. Por otro lado, el TNBS a dosis superiores a 80 mg/kg puede causar inflamación severa y muertes. El protocolo actual que utiliza TNBS a 65 mg/kg en 250 μL de etanol al 40% apenas causa muertes (1 de cada 16 ratas de colitis por TNBS).

Se encontró que la limpieza intestinal el día antes de la instilación de TNBS es un paso importante para garantizar un colon relativamente limpio para un modelo confiable de colitis estenótica. Para eso, las ratas necesitan ayunar durante 24 horas y administrar limpiador intestinal durante la noche antes del tratamiento con TNBS. También es importante mantener a las ratas en posición supina y ligeramente boca abajo con el ano cerrado durante 2 minutos después de la instilación de TNBS. Esto ayuda a asegurar una buena distribución de TNBS dentro del colon distal.

En resumen, se encontró que la instilación intracolónica de TNBS a 65 mg / kg en 250 μL de etanol al 40% indujo consistentemente colitis similar a la CD en ratas. La inflamación transmural en el modelo se asocia con estenosis en el sitio de instilación de TNBS. La distensión mecánica, pero no la inflamación, se observa en el segmento proximal a la estenosis. Ni la inflamación ni el estrés mecánico están presentes en el segmento distal a la estenosis. Con estos cambios en diferentes sitios del colon en una rata colitis, se puede distinguir el estrés mecánico de la inflamación en la colitis similar a la EC.

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Disclosures

Los autores informan que no hay conflicto de intereses y no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo es apoyado en parte por subvenciones de NIH (R01 DK124611 a XZS) y el Departamento de Defensa de los Estados Unidos (W81XWH-20-1-0681 a XZS). El trabajo de histología se realizó con la ayuda del Laboratorio de Patología Quirúrgica de UTMB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

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References

  1. Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
  2. Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
  3. Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
  4. Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
  5. Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
  6. Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
  7. Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
  8. Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
  9. Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
  10. Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
  11. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  12. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  13. Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
  14. Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
  15. Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
  16. Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
  17. Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24 (2012).
  18. Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
  19. Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
  20. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
  21. Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
  22. Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
  23. Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  24. Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
  25. Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).

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Inmunología e Infección Número 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

Un modelo de roedor inducido por TNBS para estudiar el papel patogénico del estrés mecánico en la enfermedad de Crohn
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Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

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