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Summary
本プロトコールは、げっ歯類におけるクローン様大腸炎モデルの開発を記載している。経壁炎症はTNBS点眼部位に狭窄をもたらし、狭窄の近位セグメントに機械的拡大が観察される。これらの変化は、大腸炎における機械的ストレスの研究を可能にする。
Abstract
クローン病(CD)などの炎症性腸疾患(IBD)は、ヨーロッパおよび米国で約20 per 1,00,000に影響を及ぼす胃腸管の慢性炎症性障害である。CDは、経壁炎症、腸線維症、および管腔狭窄症を特徴とする。抗炎症療法は炎症の制御に役立つかもしれませんが、CDの線維症や狭窄には効果がありません。CDの病因はよく分かっていない。現在の研究は、主に調節不全の腸内免疫応答メカニズムの描写に焦点を当てている。CD関連経壁炎症、腸管線維症、および管腔狭窄症はすべて腸壁への機械的ストレスを表すが、CDにおける機械的ストレスの役割は明確に定義されていない。機械的ストレスがCDにおいて独立した病原性役割を果たすかどうかを決定するために、げっ歯類におけるTNBS誘発CD様大腸炎モデルのプロトコールが開発されている。このTNBS誘発性経壁炎症および線維症モデルは、結腸におけるCDの病理学的特徴に類似している。これは、成体スプレイグ・ドーリーラットの遠位結腸へのTNBSの結腸内点滴入によって誘導される。このモデルでは、経壁炎症はTNBS点眼部位(サイトI)で狭窄をもたらす。機械的膨張は、点眼部位に近い部分(部位P)において観察され、機械的ストレスを表すが目に見えない炎症を表す。炎症に対する遠位結腸部分(部位D)は、炎症も機械的ストレスも示さない。異なる部位(P、I、およびD)における遺伝子発現、免疫応答、線維症、および平滑筋成長の特徴的な変化が観察され、機械的ストレスの深刻な影響が浮き彫りになった。したがって、CD様大腸炎のこのモデルは、CDの病原メカニズム、特に免疫調節不全、腸線維症、およびCDにおける組織リモデリングにおける機械的ストレスおよび機械的ストレス誘発遺伝子発現の役割をよりよく理解するのに役立ちます。
Introduction
炎症性腸疾患(IBD)は、潰瘍性大腸炎(UC)およびクローン病(CD)を含む、胃腸(GI)管における慢性炎症によって特徴付けられる。それは〜100万〜200万人のアメリカ人に影響を与えます1。米国におけるIBDケアの推定年間費用は118億ドルです。UCとは異なり、CDは経壁炎症および狭窄形成によって特徴付けられる2,3。狭窄形成(狭窄)は、CD患者3の最大70%で起こり、経壁炎症(炎症性狭窄)または腸線維症(線維性狭窄)4,5によって引き起こされる可能性がある。腸管線維症は、プロセス3,4に関与する主な間葉系細胞型の1つとして平滑筋細胞(SMC)を有する過剰なコラーゲン沈着および他の細胞外マトリックス(ECM)によって特徴付けられる。肥大に関連する平滑筋過形成は、CD6における線維性狭窄症における別の重要な組織学的変化である。CDにおける狭窄形成は慢性炎症と関連しているが、外科的治療を除いて抗炎症治療は有効ではない2,6。しかし、術後の再発はほぼ100%であり、十分な時間が与えられている2,7。炎症反応として、線維症およびSMC過形成はまた、腸内の非炎症状態(すなわち、腸閉塞)において発症し得る8,9;炎症依存性および独立したメカニズムの両方が狭窄形成に関与していると考えられている3,4。炎症依存性機構に関する広範な研究が狭窄形成のためのいかなる効果的な治療法にも変換されていないことを考えると、腸線維症における炎症非依存性機構の可能な役割に関する研究が必要である。
非炎症性因子として、浮腫、炎症性細胞浸潤、組織変形、線維症、および狭窄10、11、12、13に関連する機械的ストレス(MS)は、IBD、特にCDにおいて一般的に遭遇し、これは経壁炎症によって特徴付けられる。機械的ストレスは狭窄性CDにおいて最も顕著であり、炎症部位における狭窄(炎症性または線維性)は局所組織に機械的ストレスを提示し、閉塞部位10,14に近位するセグメントにおける内腔膨張をもたらす。以前のインビトロ研究は、機械的ストレスが胃腸組織、特に腸平滑筋細胞(SMC)16における特定の炎症メディエーター(すなわち、COX-2、IL-6)8、14、15および成長因子(すなわちTGF-β)の遺伝子発現を変化させることを実証している16。最近の研究はまた、結合組織成長因子(CTGF)などの特異的な親線維性メディエーターの発現が機械的ストレスに対して非常に敏感であることも見出した17,18。機械的ストレスがCD関連炎症、線維症、および組織リモデリングにおいて独立した病原性役割を果たす可能性があるという仮説が立てられた。しかしながら、CDにおける腸の炎症、線維症、および平滑筋過形成における機械的ストレスの病原的意義は、ほとんど未解明のままである。これは、炎症が機械的ストレスよりも目に見え、よりよく研究されたプロセスであるためかもしれません。さらに重要なことに、機械的ストレスの影響と炎症の影響を区別するために、IBDの明確に定義された動物モデルはなかった。
今回の研究は、ハプテン試薬2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)19,20の結腸内注射によって誘発されるクローン様大腸炎のげっ歯類モデルを記述しており、CDにおける機械的ストレスの役割を研究する目的に役立つ可能性がある。TNBS点眼は、遠位結腸の内腔狭窄(狭窄)を伴う局在性(長さ〜2cm)の経壁炎症を誘発することが見出された。狭窄は顕著な腸膨張(機械的ストレス)14,15をもたらすが、点眼部位に近位の結腸セグメントでは目に見えない炎症をもたらす。それどころか、狭窄部位の遠位にある結腸セグメントは、炎症も機械的ストレスも示さない。遺伝子発現、炎症、線維症、およびSMC過形成における有意な部位特異的変化が、3つの異なる部位において観察された。この結果は、機械的ストレス、特に機械的ストレス誘発遺伝子発現が、クローン大腸炎における線維症および過形成の発症に重要な役割を果たす可能性があることを示唆している。
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Protocol
すべての動物実験は、テキサス大学医学部(#0907051C)の施設動物ケアおよび使用委員会に従って実施した。生後〜8〜9週齢の雄または雌のSprague-Dawleyラットを本研究に使用した。
1. 動物の準備
- ラットを24時間絶食させ、一晩下剤(腸洗浄料、 材料表を参照)で処理する。
- 翌日、TNBS投与中にラットを麻酔システム( 材料表を参照)を用いて麻酔し、2%イソフルランと1L/分の酸素に曝露した。麻酔を確認するために反射神経やつま先をつまんでください。
- 体重に応じて新鮮なTNBS溶液を調製する。
注:TNBS - 250 μLの40%エタノール中の65 mg/kg体重を使用しました。 - ラットを麻酔テーブルの仰臥位に置きます。大腸炎を誘発するには、肛門から約7〜8cmの医療グレードのオープンエンドポリウレタンカテーテルを肛門を通して挿入し、TNBS(ステップ1.3で調製)を結腸19に穏やかに注入する。偽対照ラットに250 μLの生理食塩水のみを投与する。
- TNBSまたは生理食塩水を点眼した後、ラットを仰臥位に保ち、わずかに頭を下げた位置(〜30°)に保ち、TNBSの分布を助け、こぼれを避けるために肛門を2分間閉じます。
- ラットに7日間自由に食物と水を与え、体重、食物摂取、糞便、および一般的な健康状態についてラットを毎日観察する。
2. 組織製剤
- 安楽死の日に、CO2 吸入を用いてラットを安楽死させ、子宮頸部脱臼を伴う安楽死を確認する。
- 外科用グレードのはさみと鉗子を使用してラット腹部を開きます。
- 結腸全体(肛門管の上)を慎重に除去し、結腸を直ちに氷冷1x HBSS緩衝液に移す。
- バッファー内のコロンをまっすぐにし、定規を使用してコロンの長さを測定します。ナイロン糸を取り、結腸の周りを回って、対照およびTNBS処置ラットにおける結腸セグメントの外周を測定する。組織学のために全厚組織を取る。
- 腸間膜ボードに沿って結腸を切り開き、HBSSバッファーで結腸をよくきれいにします。最小限の修正で先に記載したような基準に基づいて結腸を巨視的炎症スコアについて評価する19 。
注: 0 = 正常な粘膜;1 = 局在性充血であるがびらんや潰瘍はない。2 = 潰瘍および狭窄(患部<5mm);3 = 重度の潰瘍、瘢痕、狭窄(患部>5mm)。 - 部位P(炎症部位の口腔縁の2〜3cm前の部分)、部位I(炎症部位、典型的には結腸の端部から4〜6cm、TNBSが点眼される場所)、および部位D(炎症部位の腹腔縁までの遠位1〜2cmの部分)から結腸組織サンプルをそれぞれ採取する。
注:〜1〜2cmの長さの結腸組織を各セグメントから採取した。さらに、生理食塩水処理ラットの長さ2cm(結腸の端部から約4〜6cm)の結腸組織を偽対照(S)として採取した(図1)。 - 全層調製のために各部位から組織サンプルを採取し、必要に応じて、粘膜/粘膜下層および筋膜外側層をそれぞれ採取する21,22。
- 組織サンプルを液体窒素で凍結してから、-80°Cで保存し、最大1年間保存し、将来の目的(RNA調製物など)に使用します。
3. 腸の炎症と線維症の病理組織学的評価
- 全厚結腸組織を10%ホルマリンで48時間固定し、次いで70%エタノールに24〜48時間移す。
- ミクロトームを使用して、ヘマトキシリンとエオジン(H&E)およびマッソンのトリクロム染色6、19、23(材料表を参照)について、それぞれ厚さ5μmのパラフィン切片を切断する。
- 互換性のあるソフトウェアを備えた高解像度カメラを搭載した直立顕微鏡で画像を取得して表示します( 材料表を参照)。
- グレード炎症および線維症指数は、以前に記載した基準に従った胃腸外科病理学者を含む2人の独立した研究者による6、23 の修正を伴う。スコアについては 、補足ファイル 1 を参照してください。
- 各H&E染色標本の4つのビューで断面ごとの円形および縦方向の筋肉層の厚さおよび細胞数を測定し、各標本について4つの測定値の平均をとる。
4. RNA抽出と定量RT-PCR
- TNBS大腸炎ラットの偽対照および3つの部位(P、I、D)から得られた摘出した結腸組織をRNA抽出キットの抽出試薬中でホモジナイズする( 材料表参照)。
- キットを利用して各サンプルからRNAを単離する。RNペレットを30 μLのRNase非含有水で溶出する。
- マイクロボリュームUV-Vis分光光度計を使用してRNA濃度を定量し、純度を確認します( 材料表を参照)。
- RNA合成キットを使用してcDNA21,22を合成するには、1μgの全RNAを使用します(材料表を参照)。
- リアルタイムPCRシステム用の市販のPCRキットを使用して、50ngのcDNA、IL-6のプローブ、およびCTGFを用いてリアルタイムPCRを行うことで、遺伝子発現レベルを分析および定量します( 材料表を参照)。
- 対照遺伝子18S rRNAを使用してサンプルを正規化し、得られたCq値を利用して相対遺伝子発現を定量します。
5. 統計解析
- 統計解析ソフトウェア( 材料表を参照)を利用して、偽対照ラットとTNBS大腸炎ラットを比較します。
- p値<0.05は統計的に有意な15,19であると考えてください。
- 2つのグループ間の差を検定するには、スチューデントのt検定分析を使用し、比較が3つ以上のグループである場合に分散分析を実行します15,19。
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Representative Results
TNBSの結腸内点眼によって誘発されるクローン様大腸炎の巨視的見解
図1に示すように、ラットにおけるTNBSの結腸内点眼は、遠位結腸の点眼部位において、腸壁が肥厚し、管腔が狭くなった(狭窄)を伴う局在性経壁炎症(長さ〜2cm)を誘発した(図1A)。TNBS点眼の部位をサイトIと呼ぶ。経壁炎症および狭窄の結果として、炎症および機械的ストレスの両方が部位Iに存在する。この部位における狭窄はTNBS点眼の部位(部位P)のセグメント近位における顕著な内腔膨張をもたらした(図1)。結腸周囲は、偽対照結腸(p<0.05対対照)と比較して、部位PおよびIにおいて有意に増加した(図1B)。機械的に歪んでいる間、部位Pは目に見える炎症を示さなかった。それどころか、TNBS点眼部位の遠位にある結腸セグメントは部位Dであり、炎症も機械的膨張も示さない(図1A、B)。
機械的ストレスの影響と炎症を区別するために、我々は、ステップ2.6で説明したモデルで結腸から組織サンプルを収集する際に、独自の設計に従った。サイトPは、CDモデルではこの部分が機械的に歪んでいるため、研究の主な焦点です。サイトDは、機械的ストレスを生じないため、自己制御である。部位PおよびDは、目に見える炎症を示さない(図1)。しかし、部位は炎症や機械的ストレスを経験する(図1)。
大腸炎ラットにおける部位P、I、およびDにおける炎症スコアの部位特異的変化
改変を加えて記載したように、生組織の巨視的スコア(0-3)19 およびH&E染色標本の顕微鏡的スコア(0-3)23 に基づいて炎症を等級付けする基準が開発された。結果は、部位Iにおける炎症の巨視的スコアが、TNBS処置ラット(炎症誘発後7日後)では2.70±0.20であり、偽対照(0.30±0.22、 p <0.05)および大腸炎ラットの部位P(0.80±0.26)およびD(0.50±0.22)と比較して劇的に増加したことを示した(図1C)。部位PおよびDにおける炎症スコアは、偽物と比較して有意に増加していない(図1C)。顕微鏡画像化は、ラットにおけるTNBS治療誘発性経壁炎症を示した(図2A)。部位Iにおける炎症の顕微鏡スコアは、TNBS処置ラットにおいて2.80±0.27であり、偽対照(0.3<0.2)および大腸炎ラットの部位P(1.0±0.31)およびD(0.80±0.38)におけるそれと比較して再び有意に増加した(p ±0.05、n=5各群)。部位PおよびDにおける炎症スコアは、偽物と比較して有意に増加しなかった(図2C)。
大腸炎ラットにおける部位P、I、およびDにおける線維症および平滑筋過形成および肥大の部位特異的変化
線維化スコアは、異なる部位(P、I、D)におけるメイソンのトリクロム染色(図2B)に基づいて決定した(図2A)。線維症の等級付けシステムは、補足ファイル1に記載されている。線維症スコアは、偽対照(0.40±0.25)と比較して、大腸炎ラットのサイトI(2.60±0.25)だけでなく、部位P(1.60±0.24)においても有意に増加することがわかった。05)(図2D)。<円形および縦方向の平滑筋層の厚さおよび細胞数を、H&E染色標本中の異なる部位で測定した(標本あたり4図)。円形および縦平滑筋層の両方の厚さおよび細胞数は、部位IおよびPにおいて有意に増加した(図2E、F)。大腸炎ラットにおける部位Dは、線維化スコア、平滑筋細胞数、または筋肉厚の有意な増加を示さない(図2)。
大腸炎ラットにおける部位P、I、Dにおけるメカノ感受性遺伝子の部位特異的発現
IL-6は、T細胞分化を促進し、バリア機能を損傷し、神経筋機能に影響を及ぼすため、腸の炎症において重要な役割を果たしている8,24。CTGFは、その阻害が線維化のプロセスを逆転させることができるので、よく知られた親線維化メディエーターである17。さらに重要なことに、最近の研究は、IL-6およびCTGFの遺伝子発現が機械的ストレスに対して高度に応答することを見出した8、14、18。IL-6およびCTGF mRNAの部位特異的発現を、偽対照およびTNBS大腸炎ラットの全層組織において決定した。IL-6およびCTGFのmRNA発現レベルは、偽対照と比較して炎症部位(部位I)において有意に増加した。機械的膨張はあるが目に見える炎症がない部位Pでは、IL-6およびCTGFのmRNA発現も対照ラットと比較して劇的に増加した(図3A、B)。しかしながら、大腸炎ラットのサイトDにおけるIL-6およびCTGF mRNAレベルは、偽対照におけるそれと有意に異ならなかった(図3)。
図1:TNBS誘発CD様大腸炎のげっ歯類モデル(7日目)の(A)偽対照およびTNBS処理結腸の見通し図(上)および遠位結腸の粘膜表面の巨視図(下)。黄色のボックスは、結腸組織の異なる部位を示す。S、偽の制御;I, 炎症部位;P、炎症部位に近位に位置する結腸部位;D, 炎症に遠位非遠位部位.(b)TNBS処理結腸の偽対照および異なる部位(P、I、D)における結腸周囲。(c)偽対照結腸およびTNBS処置結腸の異なる部位の巨視的炎症スコア。n = 5、*p<0.05対群の偽ラットである。バーはSEMを表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:病理組織学的評価H&E(A)およびマッソンのトリクローム染色(B)における顕微鏡的見解は、偽および大腸炎ラットの異なる部位におけるコラーゲン分布を示す。定量的分析は、TNBS処置ラットにおける顕微鏡的炎症指数(C)、線維症(D)および筋厚(肥大)(E)、および平滑筋細胞数(過形成)(F)の増加を示すが、Dではない部位IおよびPである。(E)及び(F)において、オープンバーは円形平滑筋層用であり、ストリークバーは縦平滑筋層用である。各グループでn = 5、*p<0.05対グループの偽のラット。グラフのバーはSEMを表します。(A)および(B)のバーは100 μmです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CD様大腸炎におけるメカノ感受性遺伝子(IL-6およびCTGF)の部位特異的発現。 (A)偽対照結腸におけるIL-6 mRNAの発現およびTNBS処置大腸炎結腸の異なる部位(P、I、およびD)。(b)偽対照結腸およびTNBS処置大腸炎結腸の異なる部位(P、I、およびD)におけるCTGF mRNAの発現。n = 4 または 5、*p < 0.05 対S (偽制御)。バーはSEMを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:炎症および線維症のスコア。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
TNBS誘発性大腸炎は1989年に導入され、それ以来クローン病の実験モデルとして使用されてきました 19,20,23.げっ歯類におけるこのモデルの重要な特徴は、ヒトクローン病において発症した病理組織学的病変によく似た経壁炎症の発症を含む19,20。このモデルに関する以前の研究は、主に目に見える炎症の部位(部位I)の粘膜層における異常な免疫応答に焦点を当ててきた19、20、23。炎症の近位および遠位の腸部分にはほとんど注意が払われていない。炎症部位、ならびに遠位近位セグメントおよび非遠位セグメントに関する本研究は、遺伝子発現、炎症反応、および組織病理学的特徴における明らかな部位特異的変化を明らかにしている。このモデルは、クローン病における線維症および組織リモデリングにおける機械的ストレスの潜在的な病原性役割に対処するために再検討されている。
急性炎症は、TNBSのエタノール中の粘膜曝露直後に発症し、3日目19でピークに達することが見出された。経壁炎症および炎症性狭窄が存在し、これはTNBSで処置されたすべてのラットにおいて部位Pにおける内腔膨張と関連している。7日目までに、慢性経壁炎症は、現在の研究で発見され、他の場所で報告されたように、サイトIでよく発達している20。一方、線維性変化は、本研究および他の場所に見られるように、過剰なコラーゲン沈着を特徴とする部位において明らかである20。遠位結腸におけるエタノール中のTNBS点眼は、局所粘膜組織23 を傷害し、結腸内の局在領域における経壁炎症を引き起こす。炎症性浸潤を伴う経壁炎症では、浮腫、および点眼部位における組織変形10、12、13 が局在領域(サイトI)に炎症および機械的ストレス14 を提示する。また、経壁炎症は部位I10の管腔狭窄症も引き起こす。部分的な腸閉塞である狭窄は、近位セグメント(部位P)に機械的膨張を引き起こすことが判明した。ただし、点眼部位に遠位する部分(部位D)は離散していない。巨視的および組織学的スコアリングシステムにおいて見出されるように、部位Iは炎症および機械的ストレスの両方を提示するが、部位PおよびDは炎症を示さない。さらに、サイトPは有意に増加した円周を示すが(したがって、ラプラス14の法則によれば機械的応力)、サイトDはそうではない。したがって、部位特異的変化、特に部位Pに関する研究は、腸内の炎症モデルにおける機械的ストレスの病原性の重要性を探るであろう。
メカノ感受性遺伝子IL-6およびCTGFの発現は、部位Iおよび機械的に伸張した部位Pでは増加したが、機械的膨張がない隣接部位Dでは増加しなかったことが観察された。機械的ストレスが線維症および平滑筋過形成の発症に寄与し得るという仮説を調べるために、線維症スコアならびに部位P、I、およびDにおける平滑筋細胞数および筋肉厚さを測定し、別々に決定した。線維症およびSMC過形成がサイトIおよびPに存在することがわかった。しかしながら、線維症および平滑筋過形成は、部位Dでは検出されない。これらの知見は、機械的ストレスが腸内炎症におけるコラーゲン合成および細胞増殖において独立した病原的役割を果たす可能性があることを示している。この効果が、部位PおよびIにおけるCTGFなどの親線維化および成長因子の機械的ストレス誘発発現によって媒介され得るかどうかを決定するために、さらなる研究が保証される。
記載された動物モデル自体は、狭窄性CD様大腸炎における機械的ストレスに対処するために使用することができるが、炎症における機械的ストレスの病原性役割を完全に定義するという長期目標には限界がある。例えば、記載されたモデルの部位Iにおける機械的ストレスおよび炎症の影響は区別できない。炎症性浸潤、組織変形、狭窄、および膨張のために部位Iに機械的ストレスが存在すると仮定されるが、病理学的変化にどの程度の機械的ストレスが寄与しているかは決定できない。インビトロ、インビボ、およびエキソビボアプローチを用いたさらなる包括的な研究が必要となり得る。例えば、透明な流動食25のみを大腸炎動物に給餌することによって機械的膨張を防止することは、大腸炎モデルにおいて機械的膨張喪失状態を作り出すのに役立ち得る。一方、閉塞バンド15による純粋な機械的膨張の誘導は、機械的応力の利得モデルの作成に役立ち得る。さらに、培養細胞14,15におけるインビトロ機械的ストレッチモデルは、機械的ストレスのモードおよび程度をin vitro設定で細かく制御することができるので、遺伝子発現および機能に対する機械的ストレスの影響の定量的決定を支援する。
本研究で記載されているように、CD様大腸炎における経壁および狭窄性炎症の再現性モデルを作製するには、250μLの40%エタノール中65mg/kgのTNBSを使用しなければならない。このモデルは、主に8〜9週齢の男性または女性であるラットで試験した。TNBSを用量で点眼した後、局所点眼部位で経壁炎症が一貫して発症する。この炎症は、炎症性細胞浸潤、浮腫、および腸壁肥厚と関連しており、点眼部位での内腔狭窄をもたらし、クローン病の病理学的特徴に類似している20。実験室でのパイロット研究では、同じ容量の40%エタノール中の50mg / kg未満の用量のTNBSが腸の炎症を引き起こす可能性があるが、サイトIでは信頼できる狭窄を引き起こす可能性があることが示された。したがって、部位Pに明らかな機械的膨張はないであろう。一方、80mg/kgを超える用量のTNBSは、重度の炎症および死亡を引き起こす可能性がある。250 μLの40%エタノール中65 mg/kgのTNBSを使用する現在のプロトコルでは、死亡者はほとんど発生しません(TNBS大腸炎の16匹に1匹)。
TNBSの点眼前日の腸クレンジングは、狭窄性大腸炎の信頼できるモデルのために比較的きれいな結腸を確保するための重要なステップであることが判明した。そのためには、ラットはTNBS治療の前に一晩中24時間断食し、腸洗浄料を与える必要があります。TNBSの点眼後、ラットを仰臥位でわずかに頭を下げた状態に保ち、肛門を2分間閉じておくことも重要です。これは、遠位結腸内のTNBSの良好な分布を確実にするのに役立つ。
要約すると、250μLの40%エタノール中の65mg/kgのTNBSの結腸内点眼が、ラットにおいて一貫してCD様大腸炎を誘発することを見出した。モデルにおける経壁炎症は、TNBS点眼部位における狭窄と関連している。機械的膨張は、炎症ではないが、狭窄の近位セグメントにおいて観察される。炎症も機械的ストレスも狭窄の遠位セグメントには存在しない。大腸炎ラットにおける異なる結腸部位におけるこれらの変化により、CD様大腸炎における炎症からの機械的ストレスを区別することができる。
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Disclosures
著者らは利益相反を報告しておらず、開示するものも何もない。
Acknowledgments
この作業は、NIH(R01 DK124611からXZSまで)と米国国防総省(W81XWH-20-1-0681からXZSまで)からの助成金によって部分的にサポートされています。組織学の研究は、UTMB外科病理学研究室の助けを借りて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
References
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免疫学と感染、第181号、Erratum
Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.
