Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En TNBS-inducerad gnagaremodell för att studera den patogena rollen av mekanisk stress i Crohns sjukdom

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Det föreliggande protokollet beskriver utvecklingen av en Crohns-liknande kolitmodell hos gnagare. Transmural inflammation leder till stenos vid TNBS-instillationsstället, och mekanisk utvidgning observeras i segmentet proximalt till stenosen. Dessa förändringar gör det möjligt att studera mekanisk stress vid kolit.

Abstract

Inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD) som Crohns sjukdom (CD) är kroniska inflammatoriska störningar i mag-tarmkanalen som påverkar cirka 20 per 1 000 000 i Europa och USA. CD kännetecknas av transmural inflammation, tarmfibros och luminal stenos. Även om antiinflammatoriska terapier kan hjälpa till att kontrollera inflammation, har de ingen effekt på fibros och stenos i CD. Patogenesen av CD är inte väl förstådd. Aktuella studier fokuserar främst på att avgränsa dysreglerade tarmimmunsvarsmekanismer. Medan CD-associerad transmural inflammation, tarmfibros och luminal stenos alla representerar mekanisk stress på tarmväggen, är rollen som mekanisk stress i CD inte väl definierad. För att avgöra om mekanisk stress spelar en oberoende patogen roll i CD har ett protokoll för TNBS-inducerad CD-liknande kolitmodell hos gnagare utvecklats. Denna TNBS-inducerade transmurala inflammations- och fibrosmodell liknar patologiska kännetecken för CD i tjocktarmen. Det induceras av intrakolonisk instillation av TNBS i distal kolon hos vuxna Sprague-Dawley-råttor. I denna modell leder transmural inflammation till stenos vid TNBS-instillationsstället (site I). Mekanisk distans observeras i den del som är proximal till instillationsstället (site P), vilket representerar mekanisk stress men inte synlig inflammation. Kolondelen distal till inflammation (plats D) presenterar varken inflammation eller mekanisk stress. Distinkta förändringar av genuttryck, immunsvar, fibros och glattmuskeltillväxt på olika platser (P, I och D) observerades, vilket belyser en djupgående inverkan av mekanisk stress. Därför kommer denna modell av CD-liknande kolit att hjälpa oss att bättre förstå CD: s patogena mekanismer, särskilt rollen som mekanisk stress och mekaniskt stressinducerat genuttryck i immundysregulering, tarmfibros och vävnadsombyggnad i CD.

Introduction

Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), inklusive ulcerös kolit (UC) och Crohns sjukdom (CD), kännetecknas av kronisk inflammation i mag-tarmkanalen (GI). Det påverkar ~ 1-2 miljoner amerikaner1. De beräknade årliga kostnaderna för IBD-vård i USA är 11,8 miljarder dollar. Till skillnad från UC kännetecknas CD-skivan av transmural inflammation och strikturbildning 2,3. Strikturbildning (stenos) förekommer hos upp till 70 % av CD-patienterna3 och kan orsakas av transmural inflammation (inflammatorisk stenos) eller tarmfibros (fibrotisk stenos)4,5. Tarmfibros kännetecknas av överdriven kollagenavsättning och andra extracellulära matriser (ECM) med glattmuskelceller (SMC) som en av de viktigaste mesenkymala celltyperna som är involverade i processen 3,4. Glatt muskelhyperplasi associerad med hypertrofi är en annan signifikant histologisk förändring i fibrotisk stenos i CD6. Även om strikturbildning i CD är förknippad med kronisk inflammation, är ingen antiinflammatorisk behandling effektiv, förutom kirurgisk behandling 2,6. Återfall efter operationen är dock nästan 100%, givet tillräcklig tid 2,7. Som ett inflammatoriskt svar kan fibros och SMC-hyperplasi också utvecklas vid icke-inflammatoriska tillstånd (dvs. tarmobstruktion) i tarmen 8,9; man tror att både inflammationsberoende och oberoende mekanismer är involverade i strikturbildning 3,4. Med tanke på att omfattande forskning om de inflammationsberoende mekanismerna inte har översatts till någon effektiv terapi för strikturbildning behövs studier av den möjliga rollen av inflammationsoberoende mekanismer i tarmfibros.

Som en icke-inflammatorisk faktor är mekanisk stress (MS) associerad med ödem, inflammatorisk cellinfiltration, vävnadsdeformation, fibros och stenos 10,11,12,13 vanligt förekommande i IBD, särskilt CD, som kännetecknas av transmural inflammation. Mekanisk stress är mest anmärkningsvärd i stenotisk CD, där stenos (inflammatorisk eller fibrotisk) i inflammationsstället presenterar mekanisk stress i den lokala vävnaden och leder till lumendistans i segmentet proximalt till obstruktionsstället10,14. Tidigare in vitro-studier har visat att mekanisk stress förändrar genuttryck av specifika inflammatoriska mediatorer (dvs. COX-2, IL-6)8,14,15 och tillväxtfaktorer (dvs. TGF-β) i mag-tarmvävnaderna, särskilt tarms glatta muskelceller (SMC)16. Nyligen genomförda studier visade också att uttrycket av specifika profibrotiska mediatorer såsom bindvävstillväxtfaktor (CTGF) är mycket känsligt för mekanisk stress17,18. Det antogs att mekanisk stress kan spela en oberoende patogen roll i CD-associerad inflammation, fibros och vävnadsombyggnad. Den patogena betydelsen av mekanisk stress vid tarminflammation, fibros och glattmuskelhyperplasi i CD förblir emellertid i stort sett outforskad. Detta kan delvis bero på att inflammation är en mer synlig och bättre studerad process än mekanisk stress. Ännu viktigare är att det inte har funnits någon väldefinierad djurmodell av IBD för att skilja effekten av mekanisk stress från inflammation.

Det aktuella arbetet beskriver en gnagarmodell av Crohns-liknande kolit inducerad genom intrakolonisk injektion av haptenreagens 2,4,6-trinitrobensensulfonsyra (TNBS)19,20, som kan tjäna syftet att studera rollen som mekanisk stress i CD. Det visade sig att TNBS-instillation inducerade en lokaliserad (~ 2 cm lång) transmural inflammation med lumens förträngning (stenos) i den distala tjocktarmen. Stenosen leder till markant tarmdistans (mekanisk stress)14,15 men inte synlig inflammation i kolonsegmentet proximalt till instillationsstället. Tvärtom presenterar kolonsegmentet distalt till stenosstället varken inflammation eller mekanisk stress. Signifikanta platsspecifika förändringar i genuttryck, inflammation, fibros och SMC-hyperplasi observerades på de tre olika platserna. Resultaten tyder på att mekanisk stress, särskilt mekaniskt stressinducerat genuttryck, kan spela en avgörande roll för att utveckla fibros och hyperplasi i Crohns kolit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök utfördes enligt den institutionella djurvårds- och användningskommittén vid University of Texas Medical Branch (#0907051C). Manliga eller kvinnliga Sprague-Dawley-råttor, ~ 8-9 veckor gamla, användes för studien.

1. Beredning av djur

  1. Snabba råttor i 24 timmar och behandla dem med laxermedel (tarmrengöringsmedel, se Materialtabell) över natten.
  2. Nästa dag, bedöva råttor med hjälp av ett anestesisystem (se Materialtabell) genom att utsätta dem för 2% isofluran tillsammans med 1 L / min syre under TNBS-administrering. Kontrollera om reflexer eller nypa tårna för att bekräfta bedövning.
  3. Förbered färsk TNBS-lösning enligt kroppsvikter.
    OBS: TNBS - 65 mg / kg kroppsvikt i 250 μL av 40% etanol användes.
  4. Sätt råttor i ryggläge på anestesibordet. För att inducera kolit, sätt in genom anus en öppen polyuretankateter av medicinsk kvalitet i ~ 7-8 cm från analkanten och försiktigt införa TNBS (beredd i steg 1.3) i tjocktarmen19. Administrera endast skenkontrollråttorna med 250 μL saltlösning.
  5. Efter att ha instillerat TNBS eller saltlösning, håll råttorna i ryggläge och något nedåtgående läge (~ 30 °), med anus stängd i 2 minuter för att hjälpa TNBS-distribution och undvika spill.
  6. Ge råttor mat och vatten ad libitum i 7 dagar och observera råttorna dagligen för kroppsvikt, matupptag, avföring och allmänt hälsotillstånd.

2. Vävnadspreparat

  1. På dagen för eutanasi, avliva råttorna med CO 2-inandning och bekräfta eutanasi med cervikal förskjutning.
  2. Öppna råttbuken med sax och pincett av kirurgisk kvalitet.
  3. Ta försiktigt bort hela tjocktarmen (ovanför analkanalen) och överför tjocktarmen omedelbart till iskall 1x HBSS-buffert.
  4. Räta ut tjocktarmen i bufferten och mät kolonlängden med hjälp av en linjal. Ta nylontråd och cirkla runt tjocktarmen för att mäta den yttre omkretsen av kolonsegmenten i kontroll och TNBS-behandlade råttor. Ta vävnader med full tjocklek för histologi.
  5. Skär upp tjocktarmen längs det mesenteriska kortet och rengör tjocktarmen väl med HBSS-buffert. Bedöm kolon för makroskopisk inflammationspoäng baserat på kriterierna som tidigare beskrivits19 med minimala modifieringar.
    OBS: 0 = normal slemhinna; 1 = lokaliserad hyperemi men inga erosioner eller sår; 2 = sår och stenos (drabbat område < 5 mm); 3 = svår sår, ärr och stenos (drabbat område > 5 mm).
  6. Samla kolonvävnadsprover från plats P (del 2-3 cm före den orala marginalen för inflammationsstället), plats I (inflammationsställe, vanligtvis 4-6 cm från slutet av tjocktarmen, där TNBS sätts in till) och plats D (del 1-2 cm distal till den aborala marginalen för inflammationsstället), respektive från TNBS-behandlade råttor.
    OBS: Kolonvävnad på ~ 1-2 cm lång togs från varje segment. Dessutom togs kolonvävnaderna på 2 cm långa (~ 4-6 cm från slutet av tjocktarmen) hos de saltlösningsbehandlade råttorna som bluffkontroll (S) (Figur 1).
  7. Ta vävnadsprover från varje plats för beredning av full tjocklek, och om så önskas, slemhinna/ submukosa respektive muscularis externa lager, samt21,22.
  8. Frys vävnadsprover i flytande kväve först innan de förvaras vid -80 °C för förvaring i upp till ett år och för framtida ändamål (dvs. RNA-preparat).

3. Histopatologisk bedömning av tarminflammation och fibros

  1. Fixa kolonvävnaderna med full tjocklek i 10% formalin i 48 timmar och överför sedan till 70% etanol i 24-48 timmar.
  2. Använd en mikrotom för att skära paraffinsektioner med en tjocklek på 5 μm för hematoxylin och eosin (H&E) respektive Massons trikromfläckar 6,19,23 (se materialtabell).
  3. Skaffa och visa bilder med ett upprätt mikroskop utrustat med en högupplöst kamera med kompatibel programvara (se Materialtabell).
  4. Grad inflammation och fibros index av två oberoende utredare, inklusive en gastrointestinal kirurgisk patolog enligt kriterier som beskrivits tidigare 6,23 med modifieringar. Se kompletterande fil 1 för poängen.
  5. Mät tjockleken och cellantalet för de cirkulära och längsgående muskelskikten per tvärsnitt i fyra vyer av varje H & E-färgat prov och ta medelvärdet av de fyra mätningarna för varje prov.

4. RNA-extraktion och kvantitativ RT-PCR

  1. Homogenisera exciserade kolonvävnader erhållna från bluffkontrollen och tre ställen (P, I, D) av TNBS-kolitråttor i extraktionsreagenset för ett RNA-extraktionssats (se Materialtabell).
  2. Isolera RNA från varje prov med hjälp av satsen. Eluera RNA-pelleten i 30 μL RNasfritt vatten.
  3. Kvantifiera RNA-koncentrationen och kontrollera renheten med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer i mikrovolym (se Materialtabell).
  4. Använd 1 μg totalt RNA för att syntetisera cDNA21,22 med användning av RNA-syntessatsen (se Materialtabell).
  5. Analysera och kvantifiera genuttrycksnivåer genom att utföra PCR i realtid med 50 ng cDNA som mall, sonder av IL-6 och CTGF med hjälp av ett kommersiellt PCR-kit för PCR-system i realtid (se Materialtabell).
  6. Använd kontrollgen 18S rRNA för att normalisera proverna och kvantifiera relativt genuttryck med hjälp av de erhållna Cq-värdena.

5. Statistisk analys

  1. Använd statistisk analysprogramvara (se Materialtabell) för att jämföra skenkontroll och TNBS-kolitråttor.
  2. Betrakta p-värdet < 0,05 som statistiskt signifikant15,19.
  3. För att testa skillnaderna mellan två grupper, använd Studentens t-testanalys och utför ett ANOVA-test om jämförelserna är mer än två grupper15,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Makroskopisk bild av Crohns-liknande kolit inducerad av intrakolonisk instillation av TNBS
Som visas i figur 1 inducerade intrakolonisk instillation av TNBS hos råttor en lokaliserad transmural inflammation (~ 2 cm lång) med förtjockad tarmvägg och smalare lumen (stenos) på platsen för instillation i distal kolon (figur 1A). Platsen för TNBS-instillation kallas plats I. Som ett resultat av transmural inflammation och stenos finns både inflammation och mekanisk stress närvarande på plats I. Stenosen på plats I ledde till markerad lumendistans i segmentet proximalt till platsen för TNBS-instillation (plats P) (Figur 1). Kolonomkretsen ökade signifikant på platserna P och I, jämfört med skenkontrollkolon (p < 0,05 jämfört med kontroll) (Figur 1B). Medan den var mekaniskt utsträckt visade plats P inte synlig inflammation. Tvärtom är kolonsegmentet distalt till TNBS-instillationsstället plats D och presenterar varken inflammation eller mekanisk distans (figur 1A,B).

För att skilja effekten av mekanisk stress från inflammation följde vi en unik design för att samla vävnadsprover från tjocktarmen i modellen som beskrivs i steg 2.6. Site P är studiens primära fokus, eftersom denna del är mekaniskt distanserad i CD-modellen. Plats D är självkontroll, eftersom den inte uppvisar mekanisk stress. Platserna P och D visar ingen synlig inflammation (figur 1). Men platsen upplever jag inflammation och mekanisk stress (Figur 1).

Platsspecifika förändringar av inflammationspoäng på platserna P, I och D hos kolitråttor
Kriterier utvecklades för att gradera inflammation baserat på den makroskopiska poängen för levande vävnad (0-3) 19 och den mikroskopiska poängen för H &E-färgade prover (0-3) 23 som beskrivits med modifieringar. Resultaten visade att den makroskopiska poängen för inflammation på plats I var 2,70 ± 0,20 hos TNBS-behandlade råttor (7 dagar efter induktion av inflammation), ökade dramatiskt jämfört med den för bluffkontroller (0,30 ± 0,22, p < 0,05) och för platserna P (0,80 ± 0,26) och D (0,50 ± 0,22) för kolitråttor (figur 1C). Inflammationspoängen på platserna P och D ökar inte signifikant jämfört med sham (figur 1C). Mikroskopisk avbildning visade TNBS-behandlingsinducerad transmural inflammation hos råttor (figur 2A). Den mikroskopiska poängen för inflammation på plats I var 2,80 ± 0,27 hos de TNBS-behandlade råttorna, återigen signifikant (p < 0,05, n = 5 varje grupp) ökade jämfört med den i skenkontroller (0,3 ± 0,2) och på platserna P (1,0 ± 0,31) och D (0,80 ± 0,38) hos kolitråttor. Inflammationspoängen på platserna P och D ökade inte signifikant jämfört med sham (figur 2C).

Platsspecifika förändringar av fibros och glattmuskelhyperplasi och hypertrofi på platserna P, I och D hos kolitråttor
Fibrospoängen bestämdes baserat på Masons trikromfläck (figur 2B) på olika platser (P, I, D) (figur 2A). Graderingssystemet för fibros beskrivs i tilläggsfil 1. Det visade sig att fibrospoängen ökar signifikant inte bara på plats I (2,60 ± 0,25) utan också på plats P (1,60 ± 0,24) hos kolitråttorna, jämfört med skenkontroll (0,40 ± 0,25. p < 0,05) (figur 2D). Tjockleken och cellantalet hos cirkulära och längsgående glattmuskelskikt mättes på olika platser i H&E-färgade prover (4 vyer per prov). Tjockleken och cellantalet för både cirkulära och längsgående glattmuskelskikt ökade signifikant på platserna I och P (figur 2E,F). Plats D hos kolitråttorna visar ingen signifikant ökning av fibrospoäng, glattmuskelcellantal eller muskeltjocklek (figur 2).

Platsspecifikt uttryck av mekanokänsliga gener på platserna P, I och D hos kolitråttor
IL-6 spelar en avgörande roll i tarminflammation, eftersom det främjar T-celldifferentiering, skadar barriärfunktionen och påverkar neuromuskulär funktion 8,24. CTGF är en välkänd profibrotisk mediator, eftersom dess hämning kan vända processen med fibros17. Ännu viktigare, nya studier visade att genuttryck av IL-6 och CTGF är mycket mottagligt för mekanisk stress 8,14,18. Det platsspecifika uttrycket av IL-6 och CTGF mRNA bestämdes i vävnaden med full tjocklek hos skenkontroll och TNBS-kolitråttor. MRNA-uttrycksnivåerna av IL-6 och CTGF ökade signifikant på inflammationsstället (plats I) jämfört med skenkontroller. På plats P, där det finns mekanisk distans men ingen synlig inflammation, ökade också mRNA-uttrycket av IL-6 och CTGF dramatiskt jämfört med kontrollråttor (figur 3A,B). IL-6- och CTGF-mRNA-nivåerna på plats D hos kolitråttor skilde sig emellertid inte signifikant från dem vid skenkontroller (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Gnagare modell av TNBS-inducerad CD-liknande kolit (7 dagar). (A) Outlook-vy av bluffkontroll och TNBS-behandlad kolon (överst) och makroskopisk bild av slemhinnans yta av distal kolon (botten). De gula rutorna indikerar olika platser för kolonvävnad. S, skenkontroll; Jag, inflammationsplats; P, utsträckt kolonplats proximal till inflammationsplats; D, icke-utsträckt plats distal mot inflammation. (B) Kolonomkrets vid skenkontroll och olika ställen (P, I, D) av TNBS-behandlad tjocktarm. (C) Makroskopisk inflammationspoäng för sham control kolon och olika ställen för TNBS-behandlad kolon. n = 5, *p < 0,05 mot bluffråttor i gruppen. Staplar representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Histopatologisk bedömning. Mikroskopiska vyer i H & E (A) och Massons trikromfläckar (B) som visar kollagenfördelning i sham och olika platser för kolitråttor. Kvantitativ analys visar ökat mikroskopiskt inflammationsindex (C), fibros (D) och muskeltjocklek (hypertrofi) (E) och glattmuskelcellnummer (hyperplasi) (F) på platserna I och P, men inte D, hos TNBS-behandlade råttor. I (E) och (F) är de öppna stängerna för det cirkulära glatta muskelskiktet och streckade stänger är för det längsgående glatta muskelskiktet. n = 5 i varje grupp, *p < 0,05 vs. sham råttor i gruppen. Staplar i grafer representerar SEM. Staplar i (A) och (B) = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Platsspecifikt uttryck av mekanosensittiva gener (IL-6 och CTGF) i CD-liknande kolit. (A) Uttryck av IL-6 mRNA i skenkontrollkolon och olika platser (P, I och D) av TNBS-behandlad kolitkolon. (B) Uttryck av CTGF-mRNA i skenkontrollkolon och olika ställen (P, I och D) av TNBS-behandlad kolitkolon. n = 4 eller 5, *p < 0,05 vs. S (skenkontroll). Staplar representerar SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: Poäng av inflammation och fibros. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TNBS-inducerad kolit introducerades 1989 och har använts som en experimentell modell av Crohns sjukdom sedan dess 19,20,23. Betydande egenskaper hos denna modell hos gnagare inkluderar utvecklingen av en transmural inflammation som liknar de histopatologiska lesionerna som utvecklats vid mänsklig Crohns sjukdom19,20. Tidigare studier på modellen har främst fokuserat på avvikande immunsvar i slemhinneskiktet på platsen för synlig inflammation (stället I)19,20,23. Liten uppmärksamhet har ägnats åt tarmdelarna proximala och distala till inflammation. Den föreliggande studien på inflammationsstället, liksom det utsträckta proximala segmentet och det icke-distanserade distala segmentet, avslöjar uppenbara platsspecifika förändringar i genuttryck, inflammatoriskt svar och histopatologiska egenskaper. Modellen har setts över för att ta itu med den potentiella patogena rollen av mekanisk stress i fibros och vävnadsombyggnad vid Crohns sjukdom.

Det visade sig att akut inflammation utvecklas omedelbart efter slemhinneexponering av TNBS i etanol och är toppad vid dag 319. Transmural inflammation och inflammatorisk stenos är närvarande, vilket är förknippat med lumendistans i plats P hos varje råtta som behandlas med TNBS. Vid dag 7 är kronisk transmural inflammation välutvecklad på plats I, vilket finns i den aktuella studien och rapporteras någon annanstans20. Under tiden är fibrotiska förändringar uppenbara på platsen, kännetecknad av överdriven kollagenavsättning, vilket framgår av den aktuella studien och på andra håll20. TNBS-instillation i etanol i distal kolon skadar den lokala slemhinnans vävnad23 och leder till transmural inflammation i ett lokaliserat område i tjocktarmen. Den transmurala inflammationen med inflammatorisk infiltration, ödem och vävnadsdeformation 10,12,13 i instillationsstället presenterar inflammation och mekanisk stress14 till det lokaliserade området (plats I). Dessutom orsakar transmural inflammation också luminal stenos på plats I10. Det visade sig att stenos, en partiell tarmobstruktion, orsakar mekanisk distans i det proximala segmentet (plats P). Den del som är distal till instillationsstället är emellertid inte utsträckt (plats D). Som finns i de makroskopiska och histologiska poängsystemen, medan plats I presenterar både inflammation och mekanisk stress, uppvisar inte platserna P och D inflammation. Dessutom visar plats P signifikant ökad omkrets (och därmed mekanisk spänning, enligt lagen i Laplace14), men plats D gör det inte. Därför kommer en studie på de platsspecifika förändringarna, särskilt platsen P, att undersöka den patogena betydelsen av mekanisk stress i inflammationsmodellen i tarmen.

Det observerades att uttrycket av mekanokänsliga gener IL-6 och CTGF ökade på plats I och på mekaniskt sträckt plats P, men inte på angränsande plats D, där det inte finns någon mekanisk distans. För att undersöka hypotesen att mekanisk stress kan bidra till utvecklingen av fibros och glattmuskelhyperplasi bestämdes fibrospoäng och uppmätta glattmuskelcellantal och muskeltjocklek på platserna P, I och D separat. Det visade sig att fibros och SMC-hyperplasi finns på platserna I och P. Fibros och glattmuskelhyperplasi detekteras emellertid inte på plats D. Dessa fynd tyder på att mekanisk stress kan spela en oberoende patogen roll i kollagensyntes och cellproliferation vid tarminflammation. Ytterligare studier är motiverade för att avgöra om denna effekt kan medieras av mekaniskt stressinducerat uttryck av profibrotiska och tillväxtfaktorer såsom CTGF på platserna P och I.

Även om den beskrivna djurmodellen i sig kan användas för att hantera mekanisk stress i stenotisk CD-liknande kolit, har den begränsningar i det långsiktiga målet att fullt ut definiera den patogena rollen som mekanisk stress vid inflammation. Till exempel kan effekterna av mekanisk stress och inflammation på plats I i den beskrivna modellen inte differentieras. Även om det antas att mekanisk stress är närvarande på plats I på grund av inflammatorisk infiltration, vävnadsdeformation, stenos och distans, kan hur mycket mekanisk stress bidrar till de patologiska förändringarna där inte bestämmas. Ytterligare omfattande studier med in vitro-, in vivo- och ex vivo-metoder kan behövas. Till exempel kan förebyggande av mekanisk distans genom att mata kolitdjuren uteslutande med en klar flytande diet25 bidra till att skapa en förlust av mekanisk distansstatus i kolitmodellen. Å andra sidan kan induktion av ren mekanisk distans genom obstruktionsband15 bidra till att skapa en förstärkning av mekanisk spänningsmodell. Dessutom hjälper den in vitro-mekaniska sträckmodellen i odlade celler14,15 till kvantitativ bestämning av effekterna av mekanisk stress på genuttryck och funktion, eftersom läget och omfattningen av mekanisk spänning kan kontrolleras fint i in vitro-inställningen.

För att förbereda en reproducerbar modell av transmural och stenotisk inflammation vid CD-liknande kolit som beskrivs i studien måste TNBS vid 65 mg/kg i 250 μL 40% etanol användas. Modellen testades främst på råttor, hane eller hona, 8-9 veckor gamla. Efter instillation av TNBS i dosen utvecklas transmural inflammation konsekvent vid det lokala instillationsstället. Inflammationen är förknippad med infiltration av inflammatoriska celler, ödem och tarmväggsförtjockning, vilket leder till att lumen minskar vid instillationsstället, som liknar patologiska egenskaper hos Crohns sjukdom20. Pilotstudier i labbet visade att TNBS vid doser lägre än 50 mg/kg i samma volym av 40% etanol kan orsaka tarminflammation men inte tillförlitlig stenos på plats I. Således skulle det inte finnas någon uppenbar mekanisk distans i plats P. Å andra sidan kan TNBS vid doser större än 80 mg/kg orsaka allvarlig inflammation och dödsfall. Det nuvarande protokollet som använder TNBS vid 65 mg / kg i 250 μL av 40% etanol orsakar knappast dödsfall (1 av 16 råttor av TNBS-kolit).

Det visade sig att tarmrengöring dagen före instillation av TNBS är ett viktigt steg för att säkerställa en relativt ren kolon för en pålitlig modell av stenotisk kolit. För det måste råttor fasta i 24 timmar och ge tarmrengöring över natten före TNBS-behandling. Det är också viktigt att hålla råttor i ryggläge och något nedåt med anus stängd i 2 minuter efter instillation av TNBS. Detta bidrar till att säkerställa en god fördelning av TNBS inuti distal kolon.

Sammanfattningsvis konstaterades att intrakolonisk instillation av TNBS vid 65 mg/kg i 250 μL av 40% etanol konsekvent inducerade CD-liknande kolit hos råttor. Transmural inflammation i modellen är associerad med stenos vid TNBS-instillationsstället. Mekanisk distans, men inte inflammation, observeras i segmentet proximalt till stenosen. Varken inflammation eller mekanisk stress är närvarande i segmentet distalt mot stenosen. Med dessa förändringar i olika kolonställen hos en kolitråtta kan mekanisk stress från inflammation i CD-liknande kolit särskiljas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna rapporterar ingen intressekonflikt och har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds delvis av bidrag från NIH (R01 DK124611 till XZS) och det amerikanska försvarsdepartementet (W81XWH-20-1-0681 till XZS). Histologiarbetet gjordes med hjälp av UTMB Surgical Pathology Lab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
  2. Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
  3. Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
  4. Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
  5. Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn's disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
  6. Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn's and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
  7. Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn's disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
  8. Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
  9. Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
  10. Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
  11. Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
  12. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  13. Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
  14. Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
  15. Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
  16. Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
  17. Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, Supp 1 24 (2012).
  18. Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
  19. Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
  20. Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
  21. Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
  22. Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
  23. Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
  24. Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
  25. Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

En TNBS-inducerad gnagaremodell för att studera den patogena rollen av mekanisk stress i Crohns sjukdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter