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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Ein TNBS-induziertes Nagetiermodell zur Untersuchung der pathogenen Rolle von mechanischem Stress bei Morbus Crohn

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Entwicklung eines Morbus Crohn-ähnlichen Colitis-Modells bei Nagetieren. Eine transmurale Entzündung führt zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle, und eine mechanische Vergrößerung wird im Segment proximal zur Stenose beobachtet. Diese Änderungen ermöglichen die Untersuchung der mechanischen Belastung bei Colitis.

Abstract

Entzündliche Darmerkrankungen (IBD) wie Morbus Crohn (CD) sind chronisch entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes, von denen etwa 20 pro 1.00.000 in Europa und den USA betroffen sind. CD ist gekennzeichnet durch transmurale Entzündungen, Darmfibrose und Luminalstenose. Obwohl entzündungshemmende Therapien helfen können, Entzündungen zu kontrollieren, haben sie keine Wirksamkeit bei Fibrose und Stenose bei CD. Die Pathogenese der CD ist nicht gut verstanden. Aktuelle Studien konzentrieren sich hauptsächlich auf die Abgrenzung von dysregulierten Immunantwortmechanismen des Darms. Während CD-assoziierte transmurale Entzündungen, Darmfibrose und luminale Stenose alle eine mechanische Belastung der Darmwand darstellen, ist die Rolle der mechanischen Belastung bei CD nicht gut definiert. Um festzustellen, ob mechanischer Stress eine unabhängige pathogene Rolle bei CD spielt, wurde ein Protokoll des TNBS-induzierten CD-ähnlichen Kolitis-Modells bei Nagetieren entwickelt. Dieses TNBS-induzierte transmurale Entzündungs- und Fibrosemodell ähnelt pathologischen Kennzeichen von CD im Dickdarm. Es wird durch intrakolonische Instillation von TNBS in den distalen Dickdarm erwachsener Sprague-Dawley-Ratten induziert. In diesem Modell führt eine transmurale Entzündung zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle (Site I). Mechanische Dehnung wird in dem Teil proximal zur Instillationsstelle (Site P) beobachtet, der mechanische Belastung, aber keine sichtbare Entzündung darstellt. Der distale bis zur Entzündung (Punkt D) distale Dickdarmabschnitt stellt weder eine Entzündung noch eine mechanische Belastung dar. Markante Veränderungen der Genexpression, der Immunantwort, der Fibrose und des Wachstums der glatten Muskulatur an verschiedenen Stellen (P, I und D) wurden beobachtet, was einen tiefgreifenden Einfluss mechanischer Belastungen hervorhebt. Daher wird uns dieses Modell der CD-ähnlichen Kolitis helfen, die pathogenen Mechanismen von CD besser zu verstehen, insbesondere die Rolle von mechanischem Stress und mechanischer stressinduzierter Genexpression bei Immundysregulation, Darmfibrose und Gewebeumbau bei CD.

Introduction

Entzündliche Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD), sind durch chronische Entzündungen im Magen-Darm-Trakt (GI) gekennzeichnet. Es betrifft ~ 1-2 Millionen Amerikaner1. Die geschätzten jährlichen Kosten für die IBD-Pflege in den USA belaufen sich auf 11,8 Milliarden US-Dollar. Im Gegensatz zu UC ist die CD durch transmurale Entzündung und Strikturbildung gekennzeichnet 2,3. Strikturbildung (Stenose) tritt bei bis zu 70% der CD-Patientenauf 3 und kann durch transmurale Entzündung (entzündliche Stenose) oder Darmfibrose (fibrotische Stenose) verursacht werden4,5. Darmfibrose ist gekennzeichnet durch übermäßige Kollagenablagerung und andere extrazelluläre Matrizen (ECM) mit glatten Muskelzellen (SMC) als einer der wichtigsten mesenchymalen Zelltypen, die an dem Prozess beteiligtsind 3,4. Die mit Hypertrophie assoziierte Hyperplasie der glatten Muskulatur ist eine weitere signifikante histologische Veränderung der fibrotischen Stenose bei CD6. Obwohl die Strikturbildung bei CD mit chronischen Entzündungen verbunden ist, ist keine entzündungshemmende Behandlung wirksam, außer der chirurgischen Behandlung 2,6. Die rezidivierenden Fälle nach der Operation betragen jedoch fast 100%, wenn genügend Zeitzur Verfügung gestellt wird 2,7. Als Entzündungsreaktion können sich Fibrose und SMC-Hyperplasie auch bei nicht-entzündlichen Zuständen (d.h. Darmverschluss) im Darm entwickeln 8,9; Es wird angenommen, dass sowohl entzündungsabhängige als auch unabhängige Mechanismen an der Strikturbildung beteiligtsind 3,4. Angesichts der Tatsache, dass umfangreiche Forschungen zu den entzündungsabhängigen Mechanismen keine wirksame Therapie für die Strikturbildung geführt haben, sind Studien zur möglichen Rolle entzündungsunabhängiger Mechanismen bei Darmfibrose erforderlich.

Als nicht-entzündlicher Faktor tritt mechanischer Stress (MS) im Zusammenhang mit Ödemen, Infiltration entzündlicher Zellen, Gewebedeformation, Fibrose und Stenose10,11,12,13 häufig bei IBD auf, insbesondere bei CD, die durch transmurale Entzündungen gekennzeichnet ist. Mechanischer Stress ist am bemerkenswertesten bei stenotischer CD, wo Stenose (entzündlich oder fibrotisch) an der Entzündungsstelle mechanische Belastung im lokalen Gewebe darstellt und zu Lumendehnung im Segment proximal zur Obstruktionsstelle führt10,14. Frühere In-vitro-Studien haben gezeigt, dass mechanischer Stress die Genexpression spezifischer Entzündungsmediatoren (d. h. COX-2, IL-6)8,14,15 und Wachstumsfaktoren (d. h. TGF-β) im Magen-Darm-Gewebe, insbesondere der glatten Darmmuskelzellen (SMC)16, verändert. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass die Expression spezifischer profibrotischer Mediatoren wie des Bindegewebswachstumsfaktors (CTGF) sehr empfindlich auf mechanische Belastung reagiert17,18. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass mechanischer Stress eine unabhängige pathogene Rolle bei CD-assoziierten Entzündungen, Fibrosen und Gewebeumbauten spielen könnte. Die pathogene Bedeutung von mechanischem Stress bei Darmentzündungen, Fibrosen und Hyperplasie der glatten Muskulatur bei der KV bleibt jedoch weitgehend unerforscht. Dies kann zum Teil daran liegen, dass Entzündungen ein sichtbarerer und besser untersuchter Prozess sind als mechanischer Stress. Noch wichtiger ist, dass es kein klar definiertes Tiermodell von IBD gibt, um die Wirkung von mechanischem Stress von der von Entzündungen zu unterscheiden.

Die aktuelle Arbeit beschreibt ein Nagetiermodell der Morbushuhn-ähnlichen Colitis, die durch intrakolonische Injektion von Hapten Reagenz 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) 19,20 induziert wird, das dem Zweck dienen könnte, die Rolle der mechanischen Belastung bei CD zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass die TNBS-Instillation eine lokalisierte (~ 2 cm lange) transmurale Entzündung mit Lumenverengung (Stenose) im distalen Dickdarm induzierte. Die Stenose führt zu einer ausgeprägten Darmdehnung (mechanische Belastung)14,15, aber nicht zu einer sichtbaren Entzündung im Dickdarmsegment proximal zur Instillationsstelle. Im Gegenteil, das zur Stenosestelle distale Dickdarmsegment stellt weder eine Entzündung noch eine mechanische Belastung dar. Signifikante ortsspezifische Veränderungen in der Genexpression, Entzündung, Fibrose und SMC-Hyperplasie wurden an den drei verschiedenen Stellen beobachtet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass mechanischer Stress, insbesondere die mechanische, stressinduzierte Genexpression, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Fibrose und Hyperplasie bei Morbus Crohn Colitis spielen kann.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden nach dem institutionellen Komitee für Tierpflege und -nutzung der University of Texas Medical Branch (#0907051C) durchgeführt. Männliche oder weibliche Sprague-Dawley-Ratten, ~ 8-9 Wochen alt, wurden für die Studie verwendet.

1. Tierpräparation

  1. Fasten Sie Ratten für 24 h und behandeln Sie sie über Nacht mit Abführmittel (Darmreiniger, siehe Materialtabelle).
  2. Am nächsten Tag betäuben Sie Ratten mit einem Anästhesiesystem (siehe Materialtabelle), indem Sie sie während der TNBS-Verabreichung 2% Isofluran zusammen mit 1 l / min Sauerstoff aussetzen. Überprüfen Sie auf Reflexe oder Quetschzehen, um die Anästhesie zu bestätigen.
  3. Bereiten Sie frische TNBS-Lösung entsprechend dem Körpergewicht vor.
    HINWEIS: TNBS - 65 mg/kg Körpergewicht in 250 μL 40% Ethanol wurden verwendet.
  4. Setzen Sie Ratten in Rückenlage auf den Anästhesietisch. Um Colitis zu induzieren, führen Sie durch den Anus einen medizinischen offenen Polyurethankatheter für ~ 7-8 cm vom Analrand ein und instillieren Sie vorsichtig TNBS (hergestellt in Schritt 1.3) in den Dickdarm19. Verabreichen Sie die Scheinkontrollratten nur mit 250 μL Kochsalzlösung.
  5. Nach dem Einträufeln von TNBS oder Kochsalzlösung halten Sie die Ratten in Rückenlage und leicht mit dem Kopf nach unten (~ 30 °), wobei der Anus für 2 Minuten geschlossen ist, um die TNBS-Verteilung zu unterstützen und Verschüttungen zu vermeiden.
  6. Versorgen Sie Ratten 7 Tage lang ad libitum mit Nahrung und Wasser und beobachten Sie die Ratten täglich auf Körpergewicht, Nahrungsaufnahme, Kot und allgemeinen Gesundheitszustand.

2. Gewebepräparate

  1. Am Tag der Euthanasie die Ratten mit CO 2-Inhalation einschläfern und Euthanasie mit zervikaler Luxation bestätigen.
  2. Öffnen Sie den Hinterleib der Ratte mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette.
  3. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Dickdarm (oberhalb des Analkanals) und übertragen Sie den Dickdarm sofort in den eiskalten 1x HBSS-Puffer.
  4. Begradigen Sie den Doppelpunkt im Puffer und messen Sie die Dickdarmlänge mit einem Lineal. Nehmen Sie Nylonfaden und kreisen Sie um den Dickdarm, um den äußeren Umfang der Dickdarmsegmente in Kontroll- und TNBS-behandelten Ratten zu messen. Nehmen Sie Gewebe in voller Dicke für die Histologie.
  5. Schneiden Sie den Dickdarm entlang der mesenterialen Tafel auf und reinigen Sie den Dickdarm gut mit HBSS-Puffer. Beurteilen Sie den Dickdarm für makroskopische Entzündungswerte basierend auf den zuvor beschriebenen Kriterien19 mit minimalen Modifikationen.
    HINWEIS: 0 = normale Schleimhaut; 1 = lokalisierte Hyperämie, aber keine Erosionen oder Geschwüre; 2 = Geschwür und Stenose (betroffener Bereich < 5 mm); 3 = schweres Geschwür, Narbe und Stenose (betroffener Bereich > 5 mm).
  6. Sammeln Sie Kolongewebeproben von der Stelle P (Portion 2-3 cm vor dem oralen Rand der Entzündungsstelle), der Stelle I (Entzündungsstelle, typischerweise 4-6 cm vom Ende des Dickdarms, wo TNBS eingeträufelt wird) und der Stelle D (Portion 1-2 cm distal bis zum Aboralrand der Entzündungsstelle) bzw. von TNBS-behandelten Ratten.
    HINWEIS: Aus jedem Segment wurde Dickdarmgewebe von ~ 1-2 cm Länge entnommen. Zusätzlich wurden die 2 cm langen Dickdarmgewebe (~4-6 cm vom Ende des Dickdarms) der mit Kochsalzlösung behandelten Ratten als Scheinkontrolle (S) entnommen (Abbildung 1).
  7. Entnehmen Sie Gewebeproben von jeder Stelle für die Präparation in voller Dicke und, falls gewünscht, Schleimhaut-/Submukosa- bzw. Muscularis externa-Schichten sowie21,22.
  8. Gewebeproben zunächst in flüssigem Stickstoff einfrieren, bevor sie bei -80 °C gelagert werden, um sie bis zu einem Jahr und für zukünftige Zwecke (z. B. RNA-Präparate) zu lagern.

3. Histopathologische Beurteilung von Darmentzündungen und Fibrose

  1. Fixieren Sie das Dickdarmgewebe in voller Dicke in 10% Formalin für 48 h und übertragen Sie es dann für 24-48 h auf 70% Ethanol.
  2. Verwenden Sie ein Mikrotom, um Paraffinabschnitte von 5 μm Dicke für Hämatoxylin und Eosin (H & E) bzw. Massons Trichromflecken 6,19,23 (siehe Materialtabelle) zu schneiden.
  3. Erfassen und betrachten Sie Bilder mit einem aufrechten Mikroskop, das mit einer hochauflösenden Kamera mit kompatibler Software ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
  4. Grad Entzündungs- und Fibroseindizes von zwei unabhängigen Prüfärzten, darunter ein gastrointestinaler chirurgischer Pathologe nach zuvor beschriebenen Kriterien 6,23 mit Modifikationen. Siehe Ergänzende Datei 1 für die Partituren.
  5. Messen Sie die Dicke und Zellzahl der kreisförmigen und longitudinalen Muskelschichten pro Querschnitt in vier Ansichten jeder H & E-gefärbten Probe und nehmen Sie den Mittelwert der vier Messungen für jede Probe.

4. RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR

  1. Homogenisieren Sie herausgeschnittenes Dickdarmgewebe, das aus der Scheinkontrolle und drei Stellen (P, I, D) von TNBS-Colitis-Ratten im Extraktionsreagenz eines RNA-Extraktionskits gewonnen wurde (siehe Materialtabelle).
  2. Isolieren Sie RNA aus jeder Probe mit dem Kit. Eluieren Sie das RNA-Pellet in 30 μL RNase-freiem Wasser.
  3. Quantifizieren Sie die RNA-Konzentration und überprüfen Sie die Reinheit mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).
  4. Verwenden Sie 1 μg Gesamt-RNA, um cDNA21,22 mit dem RNA-Synthese-Kit zu synthetisieren (siehe Materialtabelle).
  5. Analysieren und quantifizieren Sie die Genexpression durch Durchführung einer Echtzeit-PCR mit 50 ng cDNA als Vorlage, Sonden von IL-6 und CTGF unter Verwendung eines kommerziellen PCR-Kits für ein Echtzeit-PCR-System (siehe Materialverzeichnis).
  6. Verwenden Sie das Kontrollgen 18S rRNA, um die Proben zu normalisieren und die relative Genexpression unter Verwendung der erhaltenen Cq-Werte zu quantifizieren.

5. Statistische Auswertung

  1. Verwenden Sie statistische Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien), um Scheinkontroll- und TNBS-Colitis-Ratten zu vergleichen.
  2. Betrachten Sie den p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant15,19.
  3. Um die Unterschiede zwischen zwei Gruppen zu testen, verwenden Sie die t-Test-Analyse von Student und führen Sie einen ANOVA-Test durch, wenn die Vergleiche mehr als zwei Gruppenumfassen 15,19.

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Representative Results

Makroskopische Ansicht der Morbus-Crohn-ähnlichen Colitis, induziert durch intrakolonische Instillation von TNBS
Wie in Abbildung 1 gezeigt, induzierte die intrakolone Instillation von TNBS bei Ratten eine lokalisierte transmurale Entzündung (~ 2 cm lang) mit verdickter Darmwand und verengtem Lumen (Stenose) an der Instillationsstelle im distalen Dickdarm (Abbildung 1A). Der Ort der TNBS-Instillation wird als Standort I bezeichnet. Als Folge einer transmuralen Entzündung und Stenose sind sowohl Entzündungen als auch mechanische Belastungen an Ort I vorhanden. Die Stenose an Ort I führte zu einer ausgeprägten Lumendehnung im Segment proximal zum Ort der TNBS-Instillation (Standort P) (Abbildung 1). Der Dickdarmumfang war an den Stellen P und I im Vergleich zum Scheinkontrollkolon signifikant erhöht (p < 0,05 vs. Kontrolle) (Abbildung 1B). Obwohl mechanisch aufgebläht, zeigte die Stelle P keine sichtbare Entzündung. Im Gegenteil, das kolonale Segment distal zur TNBS-Instillationsstelle ist Ort D und weist weder eine Entzündung noch eine mechanische Dehnung auf (Abbildung 1A, B).

Um die Wirkung von mechanischer Belastung von Entzündungen zu unterscheiden, folgten wir einem einzigartigen Design bei der Sammlung von Gewebeproben aus dem Dickdarm in dem in Schritt 2.6 beschriebenen Modell. Standort P ist der primäre Fokus der Studie, da dieser Teil im CD-Modell mechanisch erweitert wird. Site D ist die Selbstkontrolle, da sie keine mechanische Belastung darstellt. Die Stellen P und D zeigen keine sichtbare Entzündung (Abbildung 1). Die Stelle I erlebe jedoch Entzündungen und mechanische Belastungen (Abbildung 1).

Standortspezifische Veränderungen der Entzündung an den Stellen P, I und D bei Colitis-Ratten
Es wurden Kriterien für die Einstufung von Entzündungen entwickelt, die auf dem makroskopischen Score von lebendem Gewebe (0-3)19 und dem mikroskopischen Score von H&E-gefärbten Proben (0-3)23 basieren, wie mit Modifikationen beschrieben. Die Ergebnisse zeigten, dass der makroskopische Score der Entzündung an Ort I bei den mit TNBS behandelten Ratten (7 Tage nach Induktion der Entzündung) 2,70 ± 0,20 betrug, dramatisch erhöht war als bei Scheinkontrollen (0,30 ± 0,22, p < 0,05) und bei den Stellen P (0,80 ± 0,26) und D (0,50 ± 0,22) von Colitis-Ratten (Abbildung 1C). Die Entzündungswerte an den Stellen P und D sind im Vergleich zu Schein nicht signifikant erhöht (Abbildung 1C). Die mikroskopische Bildgebung zeigte eine durch TNBS-Behandlung induzierte transmurale Entzündung bei Ratten (Abbildung 2A). Der mikroskopische Score der Entzündung an Ort I betrug 2,80 ± 0,27 bei den mit TNBS behandelten Ratten, wiederum signifikant (p < 0,05, n = 5 pro Gruppe) im Vergleich zu dem bei Scheinkontrollen (0,3 ± 0,2) und an den Standorten P (1,0 ± 0,31) und D (0,80 ± 0,38) von Colitis-Ratten. Die Entzündungswerte an den Stellen P und D waren im Vergleich zu Schein nicht signifikant erhöht (Abbildung 2C).

Ortsspezifische Veränderungen der Fibrose und der Hyperplasie und Hypertrophie der glatten Muskulatur an den Stellen P, I und D bei Colitis-Ratten
Der Fibrose-Score wurde basierend auf Masons trichromem Fleck (Abbildung 2B) an verschiedenen Stellen (P, I, D) bestimmt (Abbildung 2A). Das Bewertungssystem für Fibrose ist in der Ergänzungsdatei 1 beschrieben. Es wurde festgestellt, dass der Fibrose-Score nicht nur an Ort I (2,60 ± 0,25), sondern auch an Ort P (1,60 ± 0,24) der Colitis-Ratten im Vergleich zur Scheinkontrolle (0,40 ± 0,25) signifikant erhöht ist. p < 0,05) (Abbildung 2D). Die Dicke und Zellzahl der kreisförmigen und longitudinalen glatten Muskelschichten wurden an verschiedenen Stellen in H & E-gefärbten Proben gemessen (4 Ansichten pro Probe). Die Dicke und Zellzahl der kreisförmigen und longitudinalen glatten Muskelschichten waren an den Stellen I und P signifikant erhöht (Abbildung 2E, F). Die Stelle D bei den Colitis-Ratten zeigt keinen signifikanten Anstieg des Fibrose-Scores, der Anzahl der glatten Muskelzellen oder der Muskeldicke (Abbildung 2).

Ortsspezifische Expression mechanosensitiver Gene an den Stellen P, I und D bei Colitisratten
IL-6 spielt eine entscheidende Rolle bei Darmentzündungen, da es die T-Zell-Differenzierung fördert, die Barrierefunktion schädigt und die neuromuskuläre Funktion beeinflusst 8,24. CTGF ist ein anerkannter profibrotischer Mediator, da seine Hemmung den Prozess der Fibroseumkehren kann 17. Noch wichtiger ist, dass neuere Studien ergaben, dass die Genexpression von IL-6 und CTGF sehr gut auf mechanische Belastung reagiert 8,14,18. Die ortsspezifische Expression von IL-6- und CTGF-mRNAs wurde im Volldickengewebe von Scheinkontroll- und TNBS-Colitis-Ratten bestimmt. Die mRNA-Expressionsspiegel von IL-6 und CTGF waren an der Entzündungsstelle (Stelle I) im Vergleich zu Scheinkontrollen signifikant erhöht. An Ort P, wo es eine mechanische Dehnung, aber keine sichtbare Entzündung gibt, war die mRNA-Expression von IL-6 und CTGF im Vergleich zu Kontrollratten ebenfalls dramatisch erhöht (Abbildung 3A,B). Die IL-6- und CTGF-mRNA-Spiegel an Ort D von Colitis-Ratten unterschieden sich jedoch nicht signifikant von denen in Scheinkontrollen (Abbildung 3).

Figure 1
Abbildung 1: Nagetiermodell der TNBS-induzierten CD-ähnlichen Kolitis (7 Tage). (A) Outlook-Ansicht der Scheinkontrolle und des TNBS-behandelten Dickdarms (oben) und makroskopische Ansicht der Schleimhautoberfläche des distalen Dickdarms (unten). Die gelben Kästchen zeigen verschiedene Stellen des Dickdarmgewebes an. S, Scheinkontrolle; I, Entzündungsstelle; P, aufgeblähte Darmstelle proximal zur Entzündungsstelle; D, nicht aufgeblähte Stelle distal zur Entzündung. (B) Dickdarmumfang bei Scheinkontrolle und verschiedenen Stellen (P, I, D) von TNBS-behandeltem Dickdarm. (C) Makroskopischer Entzündungswert des Scheinkontrollkolons und verschiedener Stellen des mit TNBS behandelten Dickdarms. n = 5, *p < 0,05 vs. Scheinratten der Gruppe . Balken repräsentieren SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Histopathologische Beurteilung. Mikroskopische Ansichten in H & E (A) und Massons trichromen Flecken (B), die die Kollagenverteilung in Schein- und verschiedenen Stellen von Colitis-Ratten zeigen. Die quantitative Analyse zeigt einen erhöhten mikroskopischen Entzündungsindex (C), Fibrose (D) und Muskeldicke (Hypertrophie) (E) sowie die Anzahl der glatten Muskelzellen (Hyperplasie) (F) an den Stellen I und P, aber nicht D bei TNBS-behandelten Ratten. In (E) und (F) sind die offenen Balken für die kreisförmige glatte Muskelschicht und gestreifte Balken für die Längsschicht der glatten Muskulatur. n = 5 in jeder Gruppe, *p < 0,05 vs. Scheinratten der Gruppe. Balken in Diagrammen stellen REM dar. Balken in (A) und (B) = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Ortsspezifische Expression mechanosensitiver Gene (IL-6 und CTGF) bei CD-ähnlicher Colitis . (A) Expression von IL-6-mRNA im Scheinkontrollkolon und an verschiedenen Stellen (P, I und D) von TNBS-behandeltem Colitis colon. (B) Expression von CTGF-mRNA im Scheinkontrollkolon und an verschiedenen Stellen (P, I und D) von TNBS-behandeltem Colitis-Dickdarm. n = 4 oder 5, *p < 0,05 vs. S (Scheinkontrolle). Balken repräsentieren SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Datei 1: Punktzahl von Entzündung und Fibrose. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

TNBS-induzierte Kolitis wurde 1989 eingeführt und wird seit 19,20,23 als experimentelles Modell für Morbus Crohn verwendet. Wesentliche Merkmale dieses Modells bei Nagetieren sind die Entwicklung einer transmuralen Entzündung, die den histopathologischen Läsionen, die bei menschlichem Morbus Crohn entwickelt wurden, sehr ähnlich ist19,20. Frühere Studien zum Modell haben sich hauptsächlich auf die aberrante Immunantwort in der Schleimhautschicht an der Stelle der sichtbaren Entzündung (der Stelle I) konzentriert19,20,23. Wenig Aufmerksamkeit wurde den Darmanteilen proximal und distal zu Entzündungen geschenkt. Die vorliegende Studie an der Entzündungsstelle sowie das aufgeblähte proximale Segment und das nicht aufgeblähte distale Segment zeigen offensichtliche ortsspezifische Veränderungen der Genexpression, der Entzündungsreaktion und der histopathologischen Merkmale. Das Modell wurde überarbeitet, um die potenzielle pathogene Rolle von mechanischem Stress bei Fibrose und Gewebeumbau bei Morbus Crohn zu untersuchen.

Es wurde festgestellt, dass eine akute Entzündung unmittelbar nach der Schleimhautexposition von TNBS in Ethanol entwickelt wird und am Tag 319 ihren Höhepunkt erreicht. Transmurale Entzündungen und entzündliche Stenosen sind vorhanden, was bei jeder mit TNBS behandelten Ratte mit einer Lumendehnung an der Stelle P einhergeht. Am Tag 7 ist die chronische transmurale Entzündung an Ort I gut entwickelt, wie in der aktuellen Studie gefunden und an anderer Stelle berichtet20. In der Zwischenzeit sind fibrotische Veränderungen an der Stelle offensichtlich, die durch eine übermäßige Kollagenablagerung gekennzeichnet sind, wie in der vorliegenden Studie und anderswo20 zu sehen ist. TNBS-Instillation in Ethanol im distalen Dickdarm verletzt das lokale Schleimhautgewebe23 und führt zu einer transmuralen Entzündung in einem lokalisierten Bereich im Dickdarm. Die transmurale Entzündung mit entzündlicher Infiltration, Ödemen und Gewebedeformation 10,12,13 in der Instillationsstelle stellt eine Entzündung und mechanische Belastung 14 des lokalisierten Bereichs (Site I) dar. Darüber hinaus verursacht eine transmurale Entzündung auch eine luminale Stenose an der Stelle I10. Es wurde festgestellt, dass Stenose, ein teilweiser Darmverschluss, eine mechanische Dehnung im proximalen Segment (Ort P) verursacht. Der zur Instillationsstelle distale Teil ist jedoch nicht erweitert (Standort D). Wie in den makroskopischen und histologischen Scoring-Systemen zu finden ist, zeigen die Stellen P und D zwar sowohl eine Entzündung als auch eine mechanische Belastung, während die Stellen P und D keine Entzündung aufweisen. Weiterhin zeigt Ort P einen signifikant erhöhten Umfang (und damit mechanische Belastung, nach dem Gesetz von Laplace14), aber Ort D nicht. Daher wird eine Studie zu den ortsspezifischen Veränderungen, insbesondere der Stelle P, die pathogene Bedeutung von mechanischem Stress im Entzündungsmodell im Darm untersuchen.

Es wurde beobachtet, dass die Expression der Mechano-sensitiven Gene IL-6 und CTGF an Ort I und an der mechanisch gestreckten Stelle P erhöht war, aber nicht am benachbarten Standort D, wo es keine mechanische Dehnung gibt. Um die Hypothese zu untersuchen, dass mechanischer Stress zur Entwicklung von Fibrose und Hyperplasie der glatten Muskulatur beitragen kann, wurden Fibrose-Scores und gemessene glatte Muskelzellzahlen und Muskeldicke an den Stellen P, I und D separat bestimmt. Es wurde festgestellt, dass Fibrose und SMC-Hyperplasie an den Stellen I und P vorhanden sind. Fibrose und Hyperplasie der glatten Muskulatur werden jedoch an der Stelle D nicht nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mechanischer Stress eine unabhängige pathogene Rolle bei der Kollagensynthese und Zellproliferation bei Darmentzündungen spielen kann. Weitere Studien sind gerechtfertigt, um festzustellen, ob dieser Effekt durch mechanische stressinduzierte Expression von profibrotischen und Wachstumsfaktoren wie CTGF an den Stellen P und I vermittelt werden kann.

Obwohl das beschriebene Tiermodell selbst verwendet werden kann, um mechanischen Stress bei stenotischer CD-ähnlicher Kolitis anzugehen, hat es Einschränkungen in dem langfristigen Ziel, die pathogene Rolle von mechanischem Stress bei Entzündungen vollständig zu definieren. Beispielsweise können die Auswirkungen von mechanischer Beanspruchung und Entzündung an Ort I des beschriebenen Modells nicht unterschieden werden. Obwohl angenommen wird, dass mechanische Spannungen an Ort I aufgrund von entzündlicher Infiltration, Gewebeverformung, Stenose und Dehnung vorhanden sind, kann nicht bestimmt werden, wie viel mechanischer Stress zu den pathologischen Veränderungen dort beiträgt. Weitere umfassende Studien mit In-vitro-, In-vivo- und Ex-vivo-Ansätzen könnten erforderlich sein. Zum Beispiel kann die Verhinderung der mechanischen Dehnung durch Fütterung der Colitis-Tiere ausschließlich mit einer klaren flüssigen Diät25 dazu beitragen, einen Verlust des mechanischen Dehnungsstatus im Colitis-Modell zu erzeugen. Auf der anderen Seite kann die Induktion der rein mechanischen Dehnung durch Obstruktionsband15 dazu beitragen, ein Modell der mechanischen Verstärkung zu erzeugen. Darüber hinaus hilft das in vitro mechanische Dehnungsmodell in kultivierten Zellen14,15 bei der quantitativen Bestimmung der Auswirkungen von mechanischem Stress auf die Genexpression und -funktion, da der Modus und das Ausmaß des mechanischen Stresses im In-vitro-Setting fein kontrolliert werden können.

Um ein reproduzierbares Modell der transmuralen und stenotischen Entzündung bei CD-ähnlicher Colitis, wie in der Studie beschrieben, vorzubereiten, muss TNBS bei 65 mg/kg in 250 μL 40% Ethanol verwendet werden. Das Modell wurde hauptsächlich an Ratten getestet, männlich oder weiblich, 8-9 Wochen alt. Nach der Instillation von TNBS in der Dosis wird eine transmurale Entzündung konsequent an der lokalen Instillationsstelle entwickelt. Die Entzündung ist mit der Infiltration von Entzündungszellen, Ödemen und Darmwandverdickung verbunden, was zu einer Lumenverengung an der Instillationsstelle führt, die pathologischen Merkmalen von MorbusCrohn ähnelt 20. Pilotstudien im Labor zeigten, dass TNBS in Dosen von weniger als 50 mg/kg im gleichen Volumen von 40% Ethanol eine Darmentzündung, aber keine zuverlässige Stenose an Ort I verursachen kann. Somit gäbe es keine offensichtliche mechanische Dehnung am Standort P. Auf der anderen Seite kann TNBS in Dosen von mehr als 80 mg / kg schwere Entzündungen und Todesfälle verursachen. Das aktuelle Protokoll mit TNBS bei 65 mg/kg in 250 μL von 40% Ethanol verursacht kaum Todesfälle (1 von 16 Ratten von TNBS Colitis).

Es wurde festgestellt, dass die Darmreinigung am Tag vor der Instillation von TNBS ein wichtiger Schritt ist, um einen relativ sauberen Dickdarm für ein zuverlässiges Modell der stenotischen Kolitis zu gewährleisten. Dazu müssen Ratten vor der TNBS-Behandlung 24 Stunden lang fasten und über Nacht Darmreiniger geben. Es ist auch wichtig, die Ratten in Rückenlage und leicht mit dem Kopf nach unten zu halten, wobei der Anus nach dem Einträufeln von TNBS für 2 Minuten geschlossen ist. Dies trägt dazu bei, eine gute Verteilung von TNBS innerhalb des distalen Dickdarms zu gewährleisten.

Zusammenfassend wurde festgestellt, dass die intrakolonische Instillation von TNBS bei 65 mg/kg in 250 μL 40% Ethanol bei Ratten konsequent eine CD-ähnliche Kolitis induzierte. Die transmurale Entzündung im Modell ist mit einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle verbunden. Mechanische Dehnung, aber keine Entzündung, wird in dem Segment proximal zur Stenose beobachtet. Weder Entzündungen noch mechanische Belastungen sind in dem zur Stenose distalen Segment vorhanden. Mit diesen Veränderungen an verschiedenen Darmstellen bei einer Colitis-Ratte kann mechanischer Stress durch Entzündungen bei CD-ähnlicher Kolitis unterschieden werden.

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Disclosures

Die Autoren berichten von keinem Interessenkonflikt und haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird zum Teil durch Zuschüsse des NIH (R01 DK124611 bis XZS) und des US-Verteidigungsministeriums (W81XWH-20-1-0681 bis XZS) unterstützt. Die histologische Arbeit wurde mit Hilfe des UTMB Surgical Pathology Lab durchgeführt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

Ein TNBS-induziertes Nagetiermodell zur Untersuchung der pathogenen Rolle von mechanischem Stress bei Morbus Crohn
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Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

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