Summary
Ultralydstyret cellelevering omkring stedet for myokardieinfarkt hos mus er en sikker, effektiv og bekvem måde at celletransplantation på.
Abstract
Hovedformålet med celleterapi efter myokardieinfarkt (MI) er effektivt at forbedre cellepodets podningshastighed, og humant inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) er en lovende cellekilde til hjertereparation efter iskæmisk skade. Imidlertid er en lav podet hastighed en væsentlig hindring for effektiv regenerering af hjertevæv efter transplantation. Denne protokol viser, at flere hiPSC-CM ultralydsguidede perkutane injektioner i et MI-område effektivt øger celletransplantationshastighederne. Undersøgelsen beskriver også hele hiPSC-CM-kulturprocessen, forbehandling og ultralydsstyrede perkutane leveringsmetoder. Derudover hjælper brugen af humant mitokondrie-DNA med at detektere fraværet af hiPSC-CM'er i andre museorganer. Endelig beskriver dette papir ændringerne i hjertefunktion, angiogenese, cellestørrelse og apoptose i den infarkterede grænsezone hos mus 4 uger efter cellelevering. Det kan konkluderes, at ekkokardiografi-guidet perkutan injektion af venstre ventrikulær myokardium er en mulig, relativt invasiv, tilfredsstillende, gentagelig og effektiv cellulær terapi.
Introduction
Når akut MI opstår, dør myokardceller i det infarkterede område hurtigt på grund af iskæmi og hypoxi. Flere inflammatoriske faktorer frigives efter celledød og brud, mens inflammatoriske celler infiltrerer infarktstedet for at forårsage betændelse1. Signifikant erstatter fibroblaster og kollagen, begge uden kontraktilitet og elektrisk ledningsevne, myokardceller i infarktstedet for at danne arvæv. På grund af kardiomyocytters begrænsede regenereringskapacitet hos voksne pattedyr er levedygtigt væv dannet efter et stort infarktområde normalt ikke tilstrækkeligt til at opretholde tilstrækkelig hjerteudgang2. MI forårsager hjertesvigt, og i alvorlige tilfælde af hjertesvigt kan patienter kun stole på hjertetransplantationer eller ventrikulære hjælpemidler for at opretholde normale hjertefunktioner 3,4.
Efter MI er den ideelle behandlingsstrategi at erstatte de døde kardiomyocytter med nydannede kardiomyocytter, der danner elektromekanisk kobling med sunde væv. Imidlertid har behandlingsmuligheder typisk vedtaget myokardieredning snarere end udskiftning. I øjeblikket er stamcelle- og stamcellebaserede terapier blandt de mest lovende strategier til at fremme myokardiereparation efter MI5. Imidlertid har transplantationen af disse celler flere problemer, primært voksne stamcellers manglende evne til at differentiere sig til kardiomyocytter og deres korte levetid6.
De etiske spørgsmål i forbindelse med brugen af embryonale stamceller (ES) kan omgås af iPSC'er, som er en lovende kilde til celler. Derudover har iPSC'er stærke selvfornyelsesevner og kan differentiere sig til kardiomyocytter7. Undersøgelser har vist, at hiPSC-CM'er, der transplanteres til MI-stedet, kan overleve og danne mellemrumskryds med værtsceller 8,9. Men fordi disse transplanterede celler er placeret i mikromiljøet af iskæmi og betændelse, er deres overlevelsesrate ekstremt lav10,11.
Flere metoder er blevet etableret for at forbedre overlevelsesraten for transplanterede celler, såsom hypoxi og varmechok forbehandling af transplanterede celler12,13, genetisk modifikation 14,15 og samtidig transplantation af celler og kapillærer 16. Desværre er de fleste metoder begrænset af kompleksitet og høje omkostninger. Derfor foreslår denne undersøgelse en reproducerbar, praktisk, relativt invasiv og effektiv hiPSC-CM-leveringsmetode.
Ultralydstyret intramyokardiecelleinjektion kan udføres med kun en lille veterinær ultralydsmaskine med høj opløsning og en mikroinjektor, uanset stedet. Under ultralydsvejledning er direkte levering af celler under xiphoidprocessen fra perikardiet til myokardiet hos mus en sikker protokol, der undgår lever- og lungeskader. Denne metode kan kombineres samtidigt med andre teknologier for signifikant at forbedre overlevelsesraten for transplanterede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg i denne undersøgelse blev gennemgået og godkendt af den etiske komité på Second Xiangya Hospital of Central South University. Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer og udstyr, der anvendes i denne protokol. Tidslinjerne for celleinjektion, billeddannelse og eutansi er som følger: t0- inducere infarkt, t1 uge- billed- og implantatceller, t2 uger- billed- og implantatceller, t4 uger- endelig billeddannelse, eutanasi og vævsindsamling.
1. hiPSC-kultur, kardiomyocytdifferentiering og celleoprensning
- DMEM/F12 og stamopløsning af kældermembranmatrix blandes med is ved 4 °C i et alikvoteforhold på 1,5:1, og den resulterende blanding (matrixfortyndingsmiddel) opbevares ved -20 °C. 25 ml DMEM/F12-dyrkningssubstrat blandes grundigt ved 4 °C og 1 ml matrixfortyndingsmiddel med is, og 1 ml/hul spredes i en plade med 6 huller. Pladen holdes lodret i 1 time i en rugemaskine ved 37 °C, og DMEM/F12-supernatanten suges ud af hullerne. Rør ikke ved bunden af 6-brøndpladen, når du udfører proceduren.
- Kryopræserveringsrøret indeholdende hiPSC'erne fjernes fra flydende nitrogen, og de tøs hurtigt op i et 37 °C vandbad. Steriliser den ydre overflade af kryopræserveringsrøret med 75% alkohol, tør alkoholen af og overfør røret til et sterilt ultrarent bord.
- Brug en pipette til forsigtigt at overføre kryopræserveringsopløsningen, der indeholder hiPSC'er, til et 15 ml centrifugeglas, tilsæt 5 ml føderfrit ES-medium, og centrifuger suspensionen ved 300 × g i 3 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes forsigtigt i 6 ml af det føderfrie ES-substrat. Cellerne tælles, og cellekoncentrationen justeres til 5 × 105 celler/ml med dyrkningsmediet.
- Der tilsættes ROCK-hæmmer (Y27632) til hiPSC'erne til en slutkoncentration på 5 μM. HiPSC'erne overføres med Y27632 til 6-brøndspladen, der er forbehandlet med kældermembranmatrix, og hvirvler forsigtigt 6-brøndspladen rundt, idet formen på tallet "8" spores for at fordele hiPSC'erne jævnt. HiPSC'erne anbringes i en fugtig inkubator på 37 °C med 5 % CO2 i lodret stilling i 24 timer. Supernatanten erstattes med det føderfrie ES-substrat uden Y27632.
- Når hiPSC'er når 80 % sammenløbsgrad, aspireres kultursupernatanten, cellerne vaskes to gange med fosfatbufret saltvand (PBS), der tilsættes insulinfri RPMI1640 + B27 indeholdende 10 μM CHIR99021 (GSK3-β-hæmmer), og hiPSC'erne anbringes i en fugtig CO2 -inkubator ved 37 °C i 24 timer.
- Halvdelen af supernatanten erstattes med RPMI1640 + B27-substrat uden insulin, og cellerne inkuberes i yderligere 24 timer.
- Udskift dyrkningsmediet fuldstændigt med RPMI1640 + B27 (uden insulin). Pladerne anbringes i en fugtig inkubator ved 37 °C med 5% CO2 i lodret stilling i 24 timer.
- Efter 3 dage udskiftes dyrkningsmediet fuldstændigt med insulinfrit RPMI1640 + B27 + 5 μM IWR1 (Wnt-signalvejshæmmer), og pladerne anbringes i en fugtig inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 i 48 timer.
- Efter 5 dage erstattes dyrkningsmediet med RPMI1640 + B27 uden insulin og inkuberes fortsat i 48 timer i en fugtig CO2 -inkubator ved 37 °C.
- Udskift dyrkningsmediet med RPMI + B27 (inklusive insulin) substrat efter 7 dage, og pladerne anbringes i en befugtet CO2 -inkubator i 3 dage ved 37 °C. Udskift mediet med RPMI + B27-mediet hver 3. dag. Se efter spontan slag af celler ved 9-12 dages differentiering.
- Efter observation af de pulserende celler udskiftes RPMI + B27-mediet med glucosefrit RPMI 1640-medium indeholdende mælkesyre (1 ml mælkesyre tilsat til 500 ml glucosefrit RPMI 1640-medium). Cellerne inkuberes i 72 timer i en fugtig inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
- Efter 72 timer erstattes supernatanten med RPMI + B27-medium og inkuberes i 48 timer i en fugtig inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Opsug kultursupernatanten under undertryk, og vask cellerne 3x med PBS for at fjerne spor af dyrkningsmediet. Brug celleløsrevelsesenzymblandingen til at dissociere hiPSC-CM'erne i individuelle celler ved 37 °C. De udtagne celler samles i et 15 ml centrifugeglas indeholdende 3 ml kardiomyocytstøtteopløsning, centrifugeres ved 300 × g i 2 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten kasseres.
- Resuspender cellerne med RPMI + B27-medium, frø dem på kældermembranmatrixbelagte 6-brøndsplader og inkuber dem i 48 timer i en fugtig inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
- Kultursupernatanten til rensning erstattes med glucosefrit RPMI 1640-medium indeholdende mælkesyre og inkuberes i 72 timer i en fugtig inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Kultursupernatanten erstattes med RPMI + B27-substrat, og substratet udskiftes hver 3. dag.
- Fremgangsmåden fortsættes i 30 dage, idet kultursupernatanten erstattes med glucosefrit substrat indeholdende mælkesyre til yderligere rensning. Cellerne inkuberes i 3 dage med dette substrat og supernatanten erstattes med RPMI + B27. Dyrk cellerne kontinuerligt i 30 dage, indtil hiPSC-CM'erne slår stabilt, og brug disse celler til intramyokardieinjektion hos mus.
2. Forberedelse af hiPSC-CM'er og etablering af musemodel for akut myokardieinfarkt
- Vakuumaspirer kultursupernatanten fra hiPSC-CM'er, der er dyrket i 60 dage, vask cellerne 3x med PBS, og dissocier hiPSC-CM'erne i individuelle celler ved 37 °C med celleløsrivelsesenzymblandingen (~3-5 min). Saml cellerne i et 15 ml centrifugerør indeholdende 5 ml RPMI + B27-medium og bland godt, før cellerne tælles for at beregne det samlede antal celler. Centrifuger cellesuspensionen ved 300 × g i 2 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og der tilsættes kardiomyocytstøttemedium for at resuspendere til en koncentration på 0,6 × 105 celler/μl.
- Hold centrifugeglasset med de resuspenderede hiPSC-CM'er klar ved 37 °C til injektion 14,17,18,19,20.
- Anbring musene i en anæstesiboks forbundet med isofluran for at fremkalde anæstetisk indånding efterfulgt af brug af dyrlægesalve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
BEMÆRK: Isoflurankoncentrationen var 5%. Vær opmærksom på laboratorieventilation under eksperimentet. - Se efter tab af reflekser i fødder og haleområdet efter klemning, når musen lægges fladt på operationsbordet, hvilket indikerer tilstrækkelig bedøvelse. Administrer buprenorphin (0,1 mg/kg) intraperitonealt.
- Smør håret på midten af nakken og musens venstre bryst med en hårfjerningscreme, og tør den påførte creme og hår af med gasbind efter 5 min.
- Fastgør lemmerne og musehalen med tape. Fastgør musens snit med en 2-0 silketråd og tape. Steriliser det kirurgiske område (medianhals og venstre bryst) med tre vekslende runder betadin efterfulgt af alkohol.
- Placer en kirurgisk drapering omkring det steriliserede kirurgiske område. Lav derefter et median halssnit ved hjælp af fin anatomisk saks og fint dissekerende tang for at udsætte luftrøret fuldt ud. Afskær om nødvendigt et par forreste livmoderhalsmuskler til stabilisering.
BEMÆRK: Operatørerne blev blindet for dyregrupperne. - Indsæt et trakealrør (20 G kateterpunkteringsnål) gennem munden.
- Tilslut trakealrøret til ventilatoren og kontroller for thoraxbevægelse for at sikre, at begge lunger er godt ventilerede.
- Juster vejrtrækningsparametrene (vejrtrækning: 100-150 bpm, tidevandsvolumen 250-300 μL). Derefter fastgøres venstre bagben til nederste højre side, løsner båndet omkring venstre overekstremitet og udfører en thoracotomi ved venstre thoraxs 3-4 interkostale rum ved hjælp af fin dissekering saks og tang for maksimal hjerteeksponering.
- Brug tang til at skrælle perikardiet af under et mikroskop for at visualisere den venstre forreste nedadgående koronararterie (LAD) ved den nederste kant af venstre atriale vedhæng.
- Brug en 6-0 silketråd til at ligere den proksimale ende af LAD. Efter at have sikret, at den akutte MI-model er tilstrækkeligt etableret (når den distale LAD på ligeringsstedet skifter fra rød til hvid), skal du lukke brystet lag for lag og sutur huden med 4-0 gevindskårne intermitterende sting. Udfør alle ovennævnte kirurgiske procedurer for MI-induktion for sham-gruppen af dyr undtagen ligering.
- Sluk for inhalationsbedøvelsen, fjern kanylen, efter at musen genoptager spontan vejrtrækning, og returner den til buret. Overvåg dyret, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. Returner det ikke til andre dyrs selskab, før det er helt genoprettet. Administrer intraperitoneale injektioner af buprenorphin (0,1 mg/kg x 3 dage) og carprofen (5 mg/kg x 1 dag) hver 12. time postoperativt.
- Injicer ciclosporin A (10 mg·kg-1·dag-1) i det intraperitoneale hulrum hos mus 3 dage før administration af hiPSC-CM'er for at forhindre afstødning af de transplanterede celler. Injicer ciclosporin A kontinuerligt i 1 måned efter transplantation.
3. hiPSC-CM injektion under ultralyd vejledning
- Efter opsætning af MI-modellen tildeles MI-modelmusene (12 uger gamle C57BL/6-mus; 22 g til 24 g i vægt, 50 % hanner og 50 % hunner) til enkeltdosis- (SD, n = 8 i denne undersøgelse) og flerdosis- (MD, n = 8 i denne undersøgelse) grupper den første dag efter MI og placeres i den første og anden uge efter MI i en anæstesiboks forbundet med 5 % isofluran til induktion af inhalationsanæstesi efterfulgt af trakeal intubation.
- Smør håret på musens bryst og øvre del af maven med hårfjerningscreme og tør cremen af med gasbind 5 minutter senere. Overvåg musens puls på operationskortet, og administrer inhalationsisofluran, indtil pulsen holdes på 400-500 slag i minuttet.
- Fastgør musens lemmer og hale med tape på detekteringskonsollen, og indstil platformens temperatur til 37 °C.
- Påfør en speciel ultralydgelé på overlivet og brug en mindre veterinær ultralydssonde med høj opløsning til at opnå museleverbilleder.
- Sænk ventilatorhastigheden til 50 bpm. Brug en 5 μL mikrosprøjte til at trække ~3 × 105 celler (fra trin 2.1). Hold sprøjten med en mikromanipulator, og indsæt en 3 mm kanyle ved venstre paraxiphoid-proces (figur 1A). Følg membranens øverste kant under ultralydsvejledning (figur 1B), observer åndedrætsrytmen og området (figur 1C, D), og indtast perikardiet i slutningen af ekspiratorisk cyklus og undgå skade på lever og lunge (figur 1D).
- Når mikroinjektornålen kommer ind i perikardiehulen, skal du justere vejrtrækningshastigheden til den oprindelige parameter (150 bpm). Få det parasternale langaksebillede af musehjertet ved M-skimmel ekkokardiografi i henhold til producentens anvisninger17 (figur 1E). Under ultralydsvejledning injiceres 3 × 10 5 celler (figur 1F) i tre marginale områder (1 × 105 celler pr. Injiceret sted) på infarktstedet.
- Fjern den specielle ultralydssonde og skyl geléen af. Afvæn musen fra inhalationsbedøvelsen, og sæt den tilbage i buret efter fuld bevidsthed.
- Gentag ovenstående ultralydsguidede celleinjektionsprocedurer 1 og 2 uger efter etablering af MI for MD-gruppemus.
4. Evaluering af hjertefunktion, fluorescensmærkning, transplanteret celletal, myokardieinfarkt område og organhuman mitokondriedetektion hos mus 30 dage efter venstre forreste nedadgående grenligering
- Vurdering af hjertefunktion
- Placer musen i en isofluranforbundet anæstesiboks til induktion-inhalationsanæstesi efterfulgt af brug af dyrlægesalve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi. Fjern håret på musens venstre bryst med hårfjerningscreme. Læg musen på betjeningspanelet for at overvåge pulsen og justere indåndingen af isofluran. Hold musens puls ved 400-500 bpm. Det eksperimentelle endepunkt er dag 30 (efter MI-induktionen).
- Fastgør musens lemmer og hale med tape på detekteringskonsollen, og indstil platformens temperatur til 37 °C.
- Efter påføring af en speciel ultralydgel på det forreste hjerteområde skal du bruge en (veterinær) hjerte-ultralydssonde med høj opløsning til at erhverve parasternale langakse- og todimensionelle kortaksebilleder under ekkokardiografi af M-skimmel og B-skimmel i henhold til producentens anvisninger17.
- Når ultralyddetekteringen er afsluttet, skylles den specielle ultralydgel, sluk for inhalationsbedøvelsen og returner musen til buret separat efter fuld bevidsthed.
- Analyser de opnåede data og beregn venstre ventrikulær udstødningsfraktion (EF) og fraktioneret forkortelse (FS) ved hjælp af analysesoftwaren. Sørg for, at operatøren er blind for forsøgsgrupperne17.
- Fluorescens mærkning af sektioner
- Det isolerede hjerte vaskes med PBS, nedsænkes i 4% paraformaldehyd ved 4 °C i 12 timer. Tag hjertet ud og nedsænk det i 30% saccharose i 24 timer for at dehydrere.
- Integrer det dehydrerede hjerte med den optimale skæretemperaturforbindelse (OCT) på tøris. Skær hjertet fra bunden til toppen med en kryostattykkelse på 10 μm og placer sektionerne på dias og opbevar diasene ved -20 °C.
- Vask lysbillederne med hjertevævet med PBS i 3 min.
- Permeabiliser vævet på dias med 0,5% Triton X-100 ved stuetemperatur i 8 min og vask dem 3x med PBS i 5 min pr. vask.
- Efter at have dækket vævet med 10% æselserum og 90% PBS (blokerende opløsning), bloker sektionerne i 1 time ved stuetemperatur.
- Efter fjernelse af blokeringsopløsningen inkuberes sektionerne med det primære antistof (fortyndet til 1:100 med blokeringsopløsningen) natten over ved 4 °C. Vask dem 3x med PBS i 5 min pr. vask.
- Inkuber vævet på dias med fluoroforkonjugeret sekundært antistof (fortyndet til 1:100 med blokeringsopløsningen) i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Undgå at udsætte vævene med det fluoroforkonjugerede sekundære antistof for lys fra dette tidspunkt og fremefter. - Vask rutsjebanerne 3x med PBS i 5 min pr. vask.
- Objektglassene monteres med et monteringsmedium, der indeholder 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), og fotograferes under et fluorescensmikroskop17.
- Transplanterede hiPSC-CM'er tæller17
- Udfør vævsimmunofluorescensfarvning på frosne dele af hjertet for fodgængerspecifik troponin T (hcTnT), humant nukleært antigen (HNA) og uspecifikt sarkomerisk alfa-actinin.
- Når hele hjertet var serielt sektioneret, skal du tage et afsnit for hver 50 sektioner til fluorescensmærkning.
- Tag tilfældigt fem billeder med høj forstørrelse pr. udsnit. Tæl det podede antal synsfelter, beregn det gennemsnitlige podede celleantal pr. arealenhed, og indstil dem som A1/μm2. Beregn det samlede podede areal af skiven ved hjælp af ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/), og indstil det som B1μm2, så det podede tal i dette udsnit = A1 × B121,22.
- Beregn det samlede antal podede celler pr. musehjerte ved hjælp af Eq (1) og den procentvise engraftmentrate ved hjælp af Eq (2), forudsat at der blev valgt en sektion blandt hver 50 sektioner21,22.
- Samlet antal podede celler pr. musehjerte = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ Et × Bn) × 50 (1)
engraftment rate =
(2)
BEMÆRK: Antallet af leverancer var 3 × 10 5 for SD-gruppen og 3 × 3 × 105 for MD-gruppen.
- Vurdering af myokardieinfarktområdet
- Skær et tværsnitsfrosset snit (kort akse) af det isolerede hjerte fra toppen til bunden af hjertet med en tykkelse på 10 μm.
- Når hele hjertet er blevet serielt sektioneret, skal du tage et sektionsglas for hver 30 sektioner og fastgøre det i forvarmet Bouin-opløsning ved 58 ° C. Plet sektionen med 0,04% Direct Red og 0,1% Fast Green kollagenpletter (fortyndet i PBS) i henhold til producentens anvisninger17.
- Brug software (f.eks. ImageJ) til at analysere billederne efter tværsnitshelkropsfotografering af hjertet under et mikroskop ved hjælp af Eq (3):14,17
Infarktareal % =
× 100% (3)
- Påvisning af humant mitokondrie-DNA i forskellige organer
- Bedøv musene med 5% isofluran og ofr dem ved posterior cervikal dislokation. Disseker musene 4 uger efter celletransplantation. Høst organerne (lever, lunge, hjerne, nyre, milt) og en del af myokardiet (n = 3 i dette afsnit).
- Hvert organvæv slibes i flydende nitrogen og ekstraheres DNA fra vævet ved hjælp af referencesættet (se materialetabellen) i henhold til producentens anvisninger.
- Følg producentens anvisninger for at bruge referencesættet og primerne (se materialetabellen) til at detektere humant mitokondrie-DNA i ovennævnte væv (fra trin 4.5.1).
(2)
× 100% (3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekkokardiografi til evaluering af musenes venstre ventrikelfunktion i hver gruppe afslørede, at MI-skaderne effektivt blev vendt i MD-gruppen (figur 2A). Sammenlignet med MI-gruppen viste SD-gruppen øget udstødningsfraktion (EF) (fra 30% til 35%; Figur 2B) og fraktionsforkortelse (FS) (fra 18% til 22%; Figur 2C) efter MI. Det er imidlertid endnu mere afgørende at bemærke, at flere injektioner af hiPSC-CM'erne i mus i MD-gruppen perkutant øgede EF (fra 30% til 42%; Figur 2B) og FS (fra 18% til 28%; Figur 2C) af musehjertet efter MI.
Fluorescensmærkning af uspecifik α-actin (αSA), DAPI, human-specifik troponin T (hcTnT) og humant nukleært antigen (HNA) af vævssektioner viste, at det transplanterede celletal i MD-gruppen var signifikant højere end i SD-gruppen (figur 3A). Selvom MD-gruppen kun havde to injektioner mere end SD-gruppen, var det transplanterede celletal i MD-gruppen ~ 10x SD-gruppen (figur 3B). Derudover var procentdelen af transplanterede kardiomyocytter i MD-gruppen også signifikant højere end i SD-gruppen (figur 3C). Denne undersøgelse viste også, at de transplanterede celler i MD-gruppen var fordelt i infarktområdet og det marginale infarktområde, mens de transplanterede celler i SD-gruppen kun blev fordelt i infarktområdet (figur 3A).
MI-området i SD-behandlingsgruppen var mindre end MI-gruppen, og MI-området i SD-gruppen var signifikant mindre end i MS-gruppen (figur 2E). Derudover var tykkelsen af MD-gruppens venstre ventrikulære forreste væg 4x tykkelsen af myokardie-MI-gruppen, mens tykkelsen af venstre ventrikulær forreste væg i SD-gruppen var dobbelt så stor som MI-gruppen (figur 2F). Imidlertid var kollagenvolumenfraktionen i MD-gruppen 50% lavere end i MI-gruppen, mens kollagenvolumenfraktionen i SD-gruppen kun var 30% lavere end i MI-gruppen (figur 2G).
Det samlede antal celler, der udtrykker IB4 (en endotelcellemarkør) og SM22α (en glat muskelcellemarkør) 28 dage efter MI, steg signifikant i MD-gruppen (figur 3D,E) sammenlignet med SD- eller MI-gruppen. Denne undersøgelse vurderede også graden af hypertrofi af kardiomyocytter i marginalzonen i hver gruppe. Hvedekimagglutinin (WGA) og Sarcomeric Alpha Actinin fluorescensfarvning viste, at den mindste fiberdiameter (MFD) i ligerede mus i alle de tre grupper var signifikant højere end for de skamligerede mus. MFD for MD-gruppen var imidlertid signifikant mindre end MFD for MI- og SD-grupperne (figur 3F,G). Denne undersøgelse anvendte yderligere TUNEL-immunfarvning (som kan markere kernen i alle apoptotiske celler) til at evaluere apoptose af kardiomyocytter. Sammenlignet med SD- eller MI-gruppen blev forekomsten af TUNEL-positive kardiomyocytkerner i MD-gruppen signifikant reduceret (figur 3H,I). Intet humant mitokondrie-DNA blev påvist i noget organ i skin- og MI-grupperne (figur 4A, B). MD- og SD-grupperne viste kun humant mitokondrie-DNA i hjertet, og der blev ikke påvist noget humant mitokondrie-DNA i noget andet organ (figur 4C, D).
Figur 1: Ultralydsvejledt intramyokardiecelleinjektion hos mus. Efter at musen er bedøvet på et operationsbord, fastgøres lemmerne og halen med tape ved en konstant temperatur på 37 ° C, mens den perkutane intramyokardieinjektion administreres i venstre ventrikel, styret af ekkokardiografi. Musene blev bedøvet og vedligeholdt ved inhalation af isofluran (1,5%-2%). Fjern håret på musens øvre del og bryst. Under transthorax ekkokardiografi vejledning indsættes spidsen af mikrosprøjten under xiphoidprocessen (A) (pil) og flyttes (pilen) langs membranens øverste kant (B) for at justere musens respirationsfrekvens. Tryk nålespidsen mod hjertevæggen (C) i inspiratorfasen. (D,E) Nålespidsen kommer ind i perikardiehulen i ekspiratorisk fase og trænger til sidst ind i venstre ventrikulære forreste væg (F) for at injicere celler. Dette tal blev ændret fra17. Forkortelser: LV = venstre ventrikel; AO = stigende aorta; RL = højre lunge; LL = venstre lunge. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Evaluering af hjertefunktion hos mus i hver gruppe. (A) Brug ekkokardiografi med høj opløsning til at vurdere venstre ventrikelfunktion før inducering af myokardieinfarkt (præ-S) og 4 uger efter behandling (post-S). Uddrivningsfraktionen (B) og brøkforkortelsen (C) udtrykkes som absolutte værdier. Dataene udtrykkes som gennemsnit ± SE, 8 pr. gruppe. Vurder infarktstørrelse, kollagenvolumen og venstre ventrikulær morfologi. Gennem Sirius blev rød/hurtig grøn farvning (D) målt infarktstørrelse (E), venstre ventrikels forreste vægtykkelse (F) og kollagenvolumenfraktion (G). Dataene viser gennemsnit ± SE, 8 mus pr. Gruppe. Vægtstang = 1 mm. Envejsanalyse af varians og Dunns multiple sammenligningstest. * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Dette tal blev ændret fra17. Forkortelser: præ-S = prækirurgi; post-S = postoperation; MI = myokardieinfarkt; SD = enkeltdosis; MD = flere doser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Histologisk vurdering af mus' hjerter i hver gruppe . (A) Serielle sektioner af de injicerede hjertemus med hiPSC-CM blev farvet for hcTnT, α-sarkomerisk actin (αSA) og DAPI. Antallet (B) og procentdelen (C) af de transplanterede celler blev anvendt til kvantificering. Serielle sektioner fra skamopererede, MI-, SD- og MD-behandlede musehjerter, der blev ofret 4 uger efter MI-induktion, blev histokemisk farvet for tilstedeværelsen af IB4. (D,E) Kapillærer kvantificeres som antallet af IB4-positive vaskulære strukturer i hvert højeffektfeltområde omkring infarktet. Kardiomyocytterne blev farvet med WGA og αSA i den marginale zone af myokardieinfarkt, og kernerne blev mærket med DAPI. (F,G) Tværsnitsarealet af kardiomyocytter måles og vises som en absolut værdi. De marginale sektioner af myokardieinfarkt blev farvet med TUNEL for at vise apoptotiske kardiomyocytter (rød, TUNEL) og normale kardiomyocytter, der udtrykte hjertetroponin T (grøn, cTnT). (H,I) Forholdet mellem TUNEL-positive celler og samlede celler blev beregnet. Skalastænger = 500 μm (A), 20 μm (D,H) eller 10 μm (F). Envejsanalyse af varians og Dunns multiple sammenligningstest. * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Dette tal blev ændret fra17. Forkortelser: hcTnT = humant hjertetroponin T; αSA = α-sarkomerisk actin; WGA = hvedekimagglutinin; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindol; TUNEL = terminal deoxynukleotidyltransferase dUTP nick end mærkning; MI = myokardieinfarkt; SD = enkeltdosis; MD = flere doser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Påvisning af humant mitokondrie-DNA i museorganer i hver gruppe. Figuren viser påvisning af humant mitokondrie-DNA i musehjerter og andre organer i hver gruppe 1 måned efter celletransplantation PCR. PCR af humant mitokondrie-DNA fandt ikke transplanterede celler (A,B) i hjerter og andre organer hos mus i sham (n = 3) og MI-gruppen (n = 3). PCR af humant mitokondrie-DNA fandt transplanterede celler i musenes hjerter i SD (n = 3) og MD-gruppen (n = 3), men ikke i andre organer, herunder lunge, lever, nyre, hjerne og milt (C, D). Den kvantitative qPCR-analyse af humant mitokondrie-DNA viste, at MD-gruppens humane mitokondrie-DNA var cirka otte gange SD-gruppens (E). (+) angiver iPSC-CMs positive kontrol. (−) angiver DEPC-vandnegativ kontrol. Forkortelser: n.s. = ikke signifikant; MI = myokardieinfarkt; SD = enkeltdosis; MD = flere doser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trin i denne undersøgelse inkluderer hiPSC-kultur, kardiomyocytdifferentiering, hiPSC-CM-oprensning og hiPSC-CM-transplantation til musens myokardieinfarktsted. Nøglen er at bruge hjerte-ultralyd til transkutant at lede behandlingen mod infarktstedet ved kanten af infarkt, hvor hiPSC-CM'er blev injiceret i området.
Med forlængelsen af dyrkningstiden ændres hiPSC-CM-fænotypen i morfologi (større cellestørrelse), struktur (muskel, fibrildensitet, arrangement, mikroskopiske celleklynger) og fysiologi (calciumbehandling og β-adrenerg respons) med differentiering over tid. I denne undersøgelse blev fluorescensmærkning udført på den 10. og 60. dag med hiPSC-differentiering i kardiomyocytter for at observere morfologiske og strukturelle ændringer. Cellestørrelse og sarkomerlængde blev signifikant øget i hiPSC-CM'er på den 60. dag end på den 10. dag. Undersøgelsen anvendte hiPSC-CM'er, der var relativt stabile efter 60 dages differentiering i kardiomyocytter til transplantation. Derudover blev der i løbet af de 60 dages dyrkning af hiPSC-CM'er udført flere udskiftninger af mælkesyreholdigt glucosefrit dyrkningsmedium for at rense kardiomyocytter og øge kardiomyocytindholdet for at undgå bivirkninger forårsaget af ikke-kardiomyocytter i de transplanterede celler.
En ultralydssonde blev først placeret på musens øvre del af maven under ultralydstyret celleinjektion for at visualisere leveren. Mikroinjektornålen kom skråt ind under xiphoidprocessen, undgik leveren og kom ind i perikardiet under ultralydsvejledning. I denne undersøgelse blev perikardiet ikke lodret vurderet fra brystvæggens indre knogler, da denne vej mod infarktområdet i myokardiet er signifikant kort, hvilket udgør en høj risiko for hjertepunktur og celletransplantationssvigt. Imidlertid udgør skrå adgang til perikardiet fra xiphoidprocessen mod myokardiet en betydeligt længere vej med en lavere risiko for hjertepunktering. Under ultralydsvejledt celleinjektion blev musene intuberet for at regulere respirationsfrekvensen under punktering. Regulering af musenes respirationsfrekvens og forlængelse af indåndings- og udløbstiderne bidrager til punktering under udløb, hvilket også undgår at beskadige lungerne. Under dette eksperiment døde ingen mus af hjertebrud og lungeskade efter celleinjektion.
For stabiliteten af transplanterede celler overvejede undersøgelsen tidspunktet for hiPSC-CM-injektion og antallet af injektioner. I den tidlige fase af MI opstod der alvorlig betændelse i det infarkterede område23. Tidlig undertrykkelse af det inflammatoriske respons på infarktstedet kan forbedre myokardiemodellering og begrænse fatale muligheder for forsøgspersonen24. Derudover er et alvorligt inflammatorisk respons en grund til transplanteret celledød. Tidligere undersøgelser har vist, at transplantation af ES-celledifferentierede kardiomyocytter til infarktstedet kan hæmme det inflammatoriske respons på myokardieinfarktstedet25.
Efter at muse-MI-modellen blev etableret, blev hiPSC-CM'er injiceret i infarktstedet og den infarkte marginalzone under direkte syn; kun en tiendedel af hiPSC-CM'erne overlevede. Undersøgelsen antyder imidlertid, at de oprindeligt transplanterede hiPSC-CM'er kan forbedre mikromiljøet på myokardieinfarktstedet hos mus og forbedre overlevelsesraten for omtransplanterede celler. Resultaterne viste, at antallet af celler, der overlevede efter tre hiPSC-CM-injektioner, var 10 gange så stort som for en enkelt hiPSC-CM-injektion (figur 3C). Ultralyd viste, at den forreste vægtykkelse af venstre ventrikel i MD- og SD-grupperne var meget tyndere i tredje og fjerde uge efter, at MI-modellen blev etableret end i den første og anden uge. Således blev musene i MD-gruppen injiceret med celler umiddelbart efter MI-modellen blev etableret, og derefter en og to uger efter infarkt for at undgå død på grund af hjertebrud.
Denne undersøgelse viser, at antallet af podede celler er signifikant højere i MD-gruppen end i SD-gruppen. Musens ekkokardiografi viste, at MS- og SF-værdierne var højere end SD-gruppens. Den parakrin funktion af de transplanterede hiPSC-CM'er bør også overvejes sammen med transplanterede kardiomyocytter for at forbedre hjertefunktionen. En undersøgelse af Iwanaga et al.26 rapporterede, at de parakrinefaktorer, der udskilles af hiPSC-CM'er, kunne fremme angiogenese ved at aktivere Akt1. Undersøgelsen fandt meget få isolectin B4-positive celler i det marginale infarktområde i MI-gruppen. I modsætning hertil var der flere isolectin B4-positive celler i SD- og MD-grupperne end i MI-gruppen; Især MD-gruppen havde mest. Disse resultater viser således, at jo flere podede hiPSC-CM'er, jo stærkere bliver de nye blodkar på stedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den store forskningsplan fra National Natural Science Foundation of China (nr. 91539111til JY), nøgleprojekt for videnskab og teknologi i Hunan-provinsen (nr. 2020SK53420 til JY) og Science and Technology Innovation Program of Hunan-provinsen (2021RC2106 til CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Cardiac troponin T | Abcam | ab8295 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150105 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150110 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150062 | |
| Human cardiac troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Isolectin B4 | Vector | FL-1201 | |
| Sarcomeric alpha actinin | Abcam | ab9465 | |
| Wheat germ agglutinin | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| Reagent | |||
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | |
| B27 Supplement(minus insulin) | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement(serum free) | Thermo Fisher Scientific | 17–504-044 | |
| Bouin's solution | Thermo Fisher Scientific | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| cyclosporin A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| DIRECT RED | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| FAST GREEN FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| lactic acid | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356234 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix kit | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| RPMI1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff | Stem Cell Technologies | 5030 | |
| STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium | Stem Cell Technologies | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| ultrasound coupling agent | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Applied Biosystems | Thermo Fisher Scientific | 7500 Real-Time PCR | |
| cryostat | Leica | CM1950 | |
| fluoresence microscope | Olympus | IX83 | |
| fine anatomical scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro syringe | Hamilton | 7633 | |
| Small animal anesthesia machine | MATRX | VMR | |
| Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Software | |||
| Statistical Product and Service Solutions | IBM | 21 | |
| Image J | NIH | 1.48 | |
| Human mitochondrial DNA primers | |||
| the forward primer sequence | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| the reverse primer sequence | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
References
- Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
- Lázár, E., et al. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Davis, M. K., et al. State of the art: cardiac transplantation. Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).
- Mancini, D., Colombo, P. C. Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant. Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).
- Zimmermann, W. H. Translating myocardial remuscularization. Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).
- Hu, X., et al. A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization. Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).
- Kempf, H., et al. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
- Nguyen, P. K., et al. Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review. JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).
- Zimmermann, W. H. Remuscularization of the failing heart. The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).
- Hu, X., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).
- Feng, Y., et al. Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway. Stem Cells. 32 (2), Dayton, Ohio. 462-472 (2014).
- Fan, C., et al. Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Sun, X., et al. Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats. Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).
- Wu, X., et al. Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873 (2021).
- Kannappan, R., et al. Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair. Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Zhao, M., et al. Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice. Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).
- Zhao, M., et al. Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452 (2019).
- O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Rainer, P. P., et al. Cardiomyocyte-specific transforming growth factor β suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction. Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).
- Yu, Y., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 167 (2019).
- Iwanaga, K., et al. Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).
