Summary
A entrega celular guiada por ultrassom ao redor do local do infarto do miocárdio em camundongos é uma maneira segura, eficaz e conveniente de transplante de células.
Abstract
O principal objetivo da terapia celular após o infarto do miocárdio (IM) é aumentar efetivamente a taxa de enxertos celulares, e os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) são uma fonte promissora de células para reparo cardíaco após dano isquêmico. No entanto, uma baixa taxa de enxertos é um obstáculo significativo para a regeneração efetiva do tecido cardíaco após o transplante. Esse protocolo mostra que múltiplas injeções percutâneas guiadas por ultrassom hiPSC-CM em uma área de IM efetivamente aumentam as taxas de transplante celular. O estudo também descreve todo o processo de cultura de hiPSC-CM, pré-tratamento e métodos de parto percutâneo guiados por ultrassom. Além disso, o uso de DNA mitocondrial humano ajuda a detectar a ausência de hiPSC-CMs em outros órgãos de camundongos. Finalmente, este trabalho descreve as alterações na função cardíaca, angiogênese, tamanho celular e apoptose na zona borda infartada em camundongos 4 semanas após a entrega celular. Pode-se concluir que a injeção percutânea do miocárdio ventricular esquerdo guiada por ecocardiografia é uma terapia celular factível, relativamente invasiva, satisfatória, repetível e eficaz.
Introduction
Quando ocorre IAM agudo, as células miocárdicas na área infartada morrem rapidamente devido à isquemia e hipóxia. Vários fatores inflamatórios são liberados após a morte e ruptura celular, enquanto as células inflamatórias infiltram o local do infarto para causar inflamação1. Significativamente, fibroblastos e colágeno, ambos sem contratilidade e condutividade elétrica, substituem as células miocárdicas no local infartado para formar tecido cicatricial. Devido à limitada capacidade de regeneração dos cardiomiócitos em mamíferos adultos, o tecido viável formado após uma grande área de infarto geralmente não é adequado para manter débito cardíaco suficiente2. O IM causa insuficiência cardíaca e, em casos graves de insuficiência cardíaca, os pacientes só podem contar com transplantes cardíacos ou dispositivos de assistência ventricular para manter as funções cardíacas normais 3,4.
Após o IM, a estratégia ideal de tratamento é substituir os cardiomiócitos mortos por cardiomiócitos neoformados, formando acoplamento eletromecânico com tecidos normais. No entanto, as opções de tratamento têm tipicamente adotado o salvamento miocárdico em vez da reposição. Atualmente, as terapias baseadas em células-tronco e células progenitoras estão entre as estratégias mais promissoras para promover o reparo miocárdico após oIM5. Entretanto, o transplante dessas células apresenta vários problemas, principalmente a incapacidade das células-tronco adultas de se diferenciarem em cardiomiócitos e seu curto tempo de vida6.
As questões éticas relacionadas ao uso de células-tronco embrionárias (ES) podem ser contornadas pelas iPSCs, que são uma fonte promissora de células. Além disso, as iPSCs possuem forte capacidade de autorrenovação e podem se diferenciar em cardiomiócitos7. Estudos têm demonstrado que os MC-hiPSC transplantados para o sítio do IM podem sobreviver e formar junções comunicantes com as células do hospedeiro 8,9. Entretanto, como essas células transplantadas estão localizadas no microambiente de isquemia e inflamação, sua taxa de sobrevida é extremamentebaixa10,11.
Vários métodos têm sido estabelecidos para melhorar a sobrevida das células transplantadas, como o pré-tratamento com hipóxia e choque térmico das células transplantadas12,13, a modificação genética 14,15 e o transplante simultâneo de células e capilares 16. Infelizmente, a maioria dos métodos é limitada pela complexidade e alto custo. Assim, o presente estudo propõe um método de administração de hiPSC-CM reprodutível, conveniente, relativamente invasivo e eficaz.
A injeção intramiocárdica de células intramiocárdicas guiada por ultrassom pode ser realizada apenas com um pequeno aparelho de ultrassom veterinário de alta resolução e um microinjetor, independentemente do local. Sob orientação ultrassonográfica, a entrega direta de células sob o processo xifoide do pericárdio para o miocárdio em camundongos é um protocolo seguro que evita danos hepáticos e pulmonares. Este método pode ser combinado simultaneamente com outras tecnologias para melhorar significativamente a taxa de sobrevivência das células transplantadas.
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Protocol
Todos os experimentos com animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo comitê de ética do Segundo Hospital Xiangya da Universidade Central Sul. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo. Os prazos para injeção celular, imagem e eutanásia são os seguintes: t0- induzir infarto, t1 semana- imagem e implante de células, t2 semanas- imagem e implante de células, t4 semanas- imagem final, eutanásia e coleta de tecido.
1. cultura de hiPSC, diferenciação de cardiomiócitos e purificação celular
- Misturar DMEM/F12 e solução-mãe de matriz de membrana basal com gelo a 4 °C numa proporção de 1,5:1, alíquota, e armazenar a mistura resultante (diluente de matriz) a -20 °C. Misturar 25 mL de meio de cultura DMEM/F12 a 4 °C e 1 mL de diluente de matriz completamente com gelo e espalhar 1 mL/poço em uma placa de 6 poços. Manter a placa na posição vertical por 1 h em estufa a 37 °C e aspirar o sobrenadante DMEM/F12 dos poços. Não toque no fundo da placa de 6 poços ao realizar o procedimento.
- Remover o tubo de criopreservação que contém as hiPSC do azoto líquido e descongelá-las rapidamente num banho-maria a 37 °C. Esterilize a superfície externa do tubo de criopreservação com álcool 75%, limpe o álcool e transfira o tubo para uma mesa estéril ultralimpa.
- Use uma pipeta para transferir suavemente a solução de criopreservação contendo hiPSCs para um tubo de centrífuga de 15 mL, adicionar 5 mL de meio ES sem alimentador e centrifugar a suspensão a 300 × g por 3 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células em 6 mL do meio ES livre do alimentador. Contar as células e ajustar a concentração celular para 5 × 105 células/mL com o meio de cultura.
- Adicione o inibidor de ROCK (Y27632) às hiPSCs até uma concentração final de 5 μM. Transfira as hiPSCs com Y27632 para a placa de 6 poços pré-tratada com matriz de membrana basal e gire suavemente a placa de 6 poços, traçando a forma do número "8" para distribuir uniformemente as hiPSCs. Colocar as hiPSCs em estufa úmida a 37 °C com 5% de CO2 na posição vertical por 24 horas. Substitua o sobrenadante pelo meio ES sem alimentador sem o Y27632.
- Quando as hiPSCs atingirem 80% de confluência, aspirar o sobrenadante da cultura, lavar as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), adicionar RPMI1640 + B27 sem insulina contendo 10 μM CHIR99021 (inibidor da GSK3-β) e colocar as hiPSCs em uma incubadora úmida de CO2 a 37 °C por 24 h.
- Substitua metade do sobrenadante pelo meio RPMI1640 + B27 sem insulina e incube as células por mais 24 h.
- Substitua completamente o meio de cultura por RPMI1640 + B27 (sem insulina). Colocar as placas numa estufa húmida a 37 °C com 5% de CO2 na posição vertical durante 24 horas.
- Substituir completamente o meio de cultura após 3 dias por RPMI1640 + B27 + 5 μM IWR1 (inibidor da via de sinalização Wnt) e colocar as placas em estufa úmida a 37 °C com 5% de CO2 por 48 h.
- Substitua o meio de cultura após 5 dias por RPMI1640 + B27 sem insulina e continue incubando por 48 h em estufa úmida de CO2 a 37 °C.
- Substitua o meio de cultura pelo meio RPMI + B27 (incluindo insulina) após 7 dias e coloque as placas em uma incubadora de CO2 umidificada por 3 dias a 37 °C. Substitua o meio pelo meio RPMI + B27 a cada 3 dias. Procure o batimento espontâneo das células aos 9-12 dias de diferenciação.
- Após a observação das células pulsáteis, substituir o meio RPMI + B27 por meio RPMI 1640 livre de glicose contendo ácido lático (1 mL de ácido láctico adicionado a 500 mL de meio RPMI 1640 livre de glicose). Incubar as células durante 72 h numa estufa húmida a 37 °C com 5% de CO2.
- Após 72 h, substituir o sobrenadante por meio RPMI + B27 e incubar por 48 h em estufa úmida a 37 °C com 5% de CO2.
- Aspirar o sobrenadante da cultura sob pressão negativa e lavar as células 3x com PBS para remover vestígios do meio de cultura. Use a mistura de enzimas de desprendimento celular para dissociar os hiPSC-CMs em células individuais a 37 °C. Coletar as células obtidas em um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 3 mL de solução suporte de cardiomiócitos, centrifugar a 300 × g por 2 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células com meio RPMI + B27, semeá-las em placas de 6 poços revestidas com matriz de membrana basal e incubá-las por 48 h em estufa úmida a 37 °C com 5% de CO2.
- Substitua o sobrenadante da cultura para purificação por meio RPMI 1640 livre de glicose contendo ácido lático e incube por 72 h em estufa úmida a 37 °C com 5% de CO2.
- Substitua o sobrenadante da cultura pelo meio RPMI + B27 e troque o meio a cada 3 dias.
- Continuar o processo acima por 30 dias, substituindo o sobrenadante da cultura por meio livre de glicose contendo ácido lático para posterior purificação. Incubar as células por 3 dias com este meio e substituir o sobrenadante por RPMI + B27. Cultivar as células continuamente por 30 dias até que os MC-hiPSC batam de forma estável e usar essas células para injeção intramiocárdica em camundongos.
2. Preparação de MC-hiPSC e o estabelecimento do modelo de infarto agudo do miocárdio em camundongos
- Aspirar a vácuo o sobrenadante da cultura de hiPSC-CMs cultivados por 60 dias, lavar as células 3x com PBS e dissociar as hiPSC-CMs em células individuais a 37 °C com a mistura de enzimas de desprendimento celular (~3-5 min). Coletar as células em um tubo centrífugo de 15 mL contendo 5 mL de meio RPMI + B27 e misturar bem antes de contar as células para calcular o número total de células. Centrifugar a suspensão da célula a 300 × g durante 2 minutos à temperatura ambiente. Eliminar o sobrenadante e adicionar o meio de suporte dos cardiomiócitos para ressuspender até uma concentração de 0,6 × 105 células/μL.
- Manter o tubo centrífugo contendo os hiPSC-CMs ressuspendidos pronto a 37 °C para injeção 14,17,18,19,20.
- Coloque os ratos em uma caixa de anestesia conectada com isoflurano para induzir a inalação anestésica seguida do uso de pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
OBS: A concentração de isoflurano foi de 5%. Preste atenção à ventilação do laboratório durante o experimento. - Procure perda de reflexos na região dos pés e cauda após beliscar quando o mouse é colocado na mesa de cirurgia, indicando anestesia suficiente. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) por via intraperitoneal.
- Esfregue o cabelo no meio do pescoço e no peito esquerdo dos ratos com um creme depilatório e limpe o creme aplicado e o cabelo com gaze após 5 min.
- Fixe os membros e a cauda do rato com fita adesiva. Fixe os incisivos do mouse com um fio de seda 2-0 e fita. Esterilizar a área cirúrgica (pescoço mediano e tórax esquerdo) com três rodadas alternadas de betadina seguidas de álcool.
- Coloque um pano cirúrgico ao redor da área cirúrgica esterilizada. Em seguida, realizar incisão cervical mediana com tesoura anatômica fina e pinça dissecante fina para expor totalmente a traqueia. Se necessário, corte alguns músculos cervicais anteriores para estabilização.
NOTA: Os operadores foram cegados para os grupos de animais. - Insira um tubo traqueal (agulha de punção de cateter 20 G) pela boca.
- Conecte o tubo traqueal ao ventilador e verifique se há movimento torácico para garantir que ambos os pulmões estejam bem ventilados.
- Ajustar os parâmetros respiratórios (frequência respiratória: 100-150 bpm, volume corrente 250-300 μL). Em seguida, refixe o membro posterior esquerdo para o lado inferior direito, solte a fita ao redor do membro superior esquerdo e realize uma toracotomia no espaço intercostal 3-4 do tórax esquerdo usando tesoura e pinça dissecante fina para máxima exposição cardíaca.
- Com pinças, descascar o pericárdio ao microscópio para visualizar a artéria coronária descendente anterior (DA) na borda inferior do apêndice atrial esquerdo.
- Use um fio de seda 6-0 para ligar a extremidade proximal da DAD. Após garantir que o modelo de IM agudo esteja adequadamente estabelecido (quando a DA distal no local da ligadura muda de vermelho para branco), feche o tórax camada por camada e suture a pele com pontos intermitentes rosqueados 4-0. Realizar todos os procedimentos cirúrgicos acima mencionados para indução de IM para o grupo simulado de animais, exceto para ligadura.
- Desligue a anestesia inalatória, remova a cânula depois que o camundongo retomar a respiração espontânea e devolva-a à gaiola. Monitorar o animal até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não o devolva à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Administrar injeções intraperitoneais de buprenorfina (0,1 mg/kg x 3 dias) e carprofeno (5 mg/kg x 1 dia) a cada 12 h de pós-operatório.
- Injetar ciclosporina A (10 mg·kg-1·dia-1) na cavidade intraperitoneal de camundongos 3 dias antes de administrar hiPSC-CMs para evitar a rejeição das células transplantadas. Injetar ciclosporina A continuamente por 1 mês após o transplante.
3. injeção de hiPSC-CM sob orientação ultrassonográfica
- Após a configuração do modelo de IM, atribuir os camundongos modelo MI (camundongos C57BL/6 com 12 semanas de idade; 22g a 24g de peso, 50% machos e 50% fêmeas) aos grupos de dose única (DP, n = 8 neste estudo) e dose múltipla (DM, n = 8 neste estudo) no primeiro dia pós-IM e colocá-los na primeira e segunda semanas após o IM em uma caixa de anestesia conectada com isoflurano a 5% para a indução da anestesia inalatória seguida de intubação traqueal.
- Esfregue o cabelo no peito e abdômen superior dos ratos com creme depilatório e limpe o creme com gaze 5 minutos depois. Monitorar a frequência cardíaca do mouse na placa de operação e administrar isoflurano inalatório até que a frequência cardíaca seja mantida em 400-500 bpm.
- Fixe os membros e a cauda do mouse com fita adesiva no console de detecção e ajuste a temperatura da plataforma em 37 °C.
- Aplique uma geleia de ultrassom especial no abdômen superior e use uma sonda de ultrassom veterinário de alta resolução menor para obter imagens do fígado de camundongo.
- Diminua a frequência ventilatória para 50 bpm. Use uma microseringa de 5 μL para extrair ~3 × 105 células (a partir da etapa 2.1). Segurando a seringa com um micromanipulador, insira uma agulha de 3 mm no processo paraxifóide esquerdo (Figura 1A). Seguir a borda superior do diafragma sob orientação ultrassonográfica (Figura 1B), observar o ritmo e a amplitude respiratória (Figura 1C,D) e entrar no pericárdio no final do ciclo expiratório, evitando danos ao fígado e ao pulmão (Figura 1D).
- Após a entrada da agulha do microinjetor na cavidade pericárdica, ajuste a frequência respiratória para o parâmetro original (150 bpm). Adquirir a imagem paraesternal de eixo longo do coração de camundongos por ecocardiografia em molde em M, de acordo com as instruções dofabricante17 (Figura 1E). Sob orientação ultra-sônica, injetar 3 × 10 5 células (Figura 1F) em três áreas marginais (1 × 105 células por local injetado) do local do infarto.
- Remova a sonda de ultrassom especial e enxágue a geleia. Desmame o rato da anestesia inalatória e devolva-o à sua gaiola após a plena consciência.
- Repita os procedimentos de injeção celular guiada por ultrassom acima 1 e 2 semanas após o estabelecimento do IM para os camundongos do grupo DM.
4. Avaliação da função cardíaca, marcação por fluorescência, contagem de células transplantadas, área de infarto do miocárdio e detecção de mitocôndrias humanas de órgãos em camundongos 30 dias após ligadura do ramo descendente anterior
- Avaliação da função cardíaca
- Coloque o rato numa caixa de anestesia ligada ao isoflurano para anestesia por indução-inalação, seguida do uso de pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia. Retire o pelo no peito esquerdo do rato com creme depilatório. Coloque o mouse no painel de operação para monitorar a frequência cardíaca e ajustar a inalação de isoflurano. Mantenha a frequência cardíaca do rato em 400-500 bpm. O desfecho experimental é o dia 30 (após a indução do IM).
- Fixe os membros e a cauda do mouse com fita adesiva no console de detecção e ajuste a temperatura da plataforma em 37 °C.
- Após a aplicação de um gel de ultrassom especial na área anterior do coração, utilizar uma sonda de ultrassom cardíaco de alta resolução (veterinária) para obter imagens paraesternais de eixo longo e eixo curto bidimensionais sob ecocardiografia de molde M e molde B de acordo com as instruções do fabricante17.
- Depois que a detecção ultra-sônica for concluída, enxágue o gel ultrassônico especial, desligue a anestesia inalatória e devolva o mouse à sua gaiola separadamente após a consciência total.
- Analisar os dados obtidos e calcular a fração de ejeção (FE) e fração de encurtamento (EF) do ventrículo esquerdo utilizando o software de análise. Certifique-se de que o operador esteja cego para os grupos experimentais17.
- Marcação por fluorescência de cortes
- Lave o coração isolado com PBS, mergulhe-o em paraformaldeído a 4% a 4 °C por 12 h. Retire o coração e mergulhe-o em sacarose a 30% por 24 h para desidratar.
- Incorpore o coração desidratado com o composto de temperatura de corte ideal (OCT) no gelo seco. Cortar o coração do fundo ao ápice com uma espessura de criostato de 10 μm e colocar as secções em lâminas e armazenar as lâminas a -20 °C.
- Lave as lâminas com o tecido cardíaco com PBS por 3 min.
- Permeabilizar o tecido em lâminas com Triton X-100 a 0,5% à temperatura ambiente por 8 min e lavá-las 3x com PBS por 5 min por lavagem.
- Depois de cobrir o tecido com soro de burro a 10% e PBS a 90% (solução de bloqueio), bloquear os cortes por 1 h à temperatura ambiente.
- Depois de remover a solução de bloqueio, incubar as secções com o anticorpo primário (diluído a 1:100 com a solução de bloqueio) durante a noite a 4 °C. Lave-os 3x com PBS por 5 min por lavagem.
- Incubar o tecido em lâminas com anticorpo secundário conjugado a fluoróforos (diluído a 1:100 com a solução bloqueadora) durante 1 h à temperatura ambiente.
NOTA: Evite expor os tecidos com o anticorpo secundário conjugado a fluoróforos à luz a partir deste ponto. - Lave as lâminas 3x com PBS por 5 min por lavagem.
- Montar as lâminas com meio de montagem contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e fotografar em microscópio de fluorescência17.
- Contagem de HIPSC-CMs transplantados17
- Realizar coloração de imunofluorescência tecidual em seções congeladas do coração para troponina T específica para pedestres (hcTnT), antígeno nuclear humano (HNA) e alfa actinina sarcomérica inespecífica.
- Depois que todo o coração foi seccionado em série, faça uma seção para cada 50 cortes para marcação por fluorescência.
- Capture aleatoriamente cinco imagens de alta ampliação por fatia. Conte o número enxertado de campos de visão, calcule o número médio de células enxertadas por unidade de área e defina-as como A1/μm2. Calcular a área total enxertada do corte utilizando ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) e fixá-la como B1μm2 de modo que o número enxertado neste corte = A1 × B121,22.
- Calcular o número total de células enxertadas por coração de camundongo usando Eq (1) e a taxa percentual de enxertia usando Eq (2), uma vez que um corte foi escolhido a cada 50 cortes21,22.
- Número total de células enxertadas por coração de camundongo = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ An × Bn) × 50 (1)
taxa de enxertia =
(2)
OBS: O número de partos foi de 3 × 10 5 para o grupo SD e 3 × 3 × 105 para o grupo DM.
- Avaliação da área de infarto do miocárdio
- Cortar uma seção transversa congelada (eixo curto) do coração isolado, do ápice à base do coração, com espessura de 10 μm.
- Depois que todo o coração tiver sido seccionado em série, pegue uma lâmina de seção para cada 30 seções e fixe-a em solução de Bouin pré-aquecida a 58 °C. Corar o corte com as colorações de colágeno Vermelho Direto 0,04% e Colágeno Verde Rápido 0,1% (diluído em PBS) de acordo com as instruções do fabricante17.
- Utilizar software (por exemplo, ImageJ) para analisar as imagens após fotografia transversal de corpo inteiro do coração ao microscópio usando Eq (3):14,17
Área de infarto % =
× 100% (3)
- Detecção de DNA mitocondrial humano em vários órgãos
- Anestesiar os camundongos com isoflurano a 5% e sacrificá-los por luxação cervical posterior. Dissecar os camundongos 4 semanas após o transplante celular. Retirar os órgãos (fígado, pulmão, cérebro, rim, baço) e parte do miocárdio (n = 3 nesta seção).
- Triture cada tecido do órgão em nitrogênio líquido e extraia o DNA do tecido usando o kit referenciado (consulte a Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
- Siga as instruções do fabricante para utilizar o kit e os primers referenciados (ver Tabela de Materiais) para detectar o ADN mitocondrial humano nos tecidos acima mencionados (a partir do passo 4.5.1).
(2)
× 100% (3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O ecocardiograma para avaliação da função ventricular esquerda dos camundongos de cada grupo revelou que as lesões do IM foram efetivamente revertidas no grupo DM (Figura 2A). Em comparação com o grupo IM, o grupo SD apresentou aumento da fração de ejeção (FE) (de 30% para 35%; Figura 2B) e fração de encurtamento (EF) (de 18% para 22%; Figura 2C) após IM. No entanto, é ainda mais crucial notar que múltiplas injeções de hiPSC-CMs nos camundongos do grupo DM aumentaram percutaneamente a FE (de 30% para 42%; Figura 2B) e FS (de 18% para 28%; Figura 2C) do coração de camundongo após IM.
A marcação por fluorescência de α-actina inespecífica (αSA), DAPI, troponina T específica para humanos (hcTnT) e antígeno nuclear humano (HNA) de cortes teciduais mostrou que a contagem de células transplantadas no grupo DM foi significativamente maior do que no grupo SD (Figura 3A). Embora o grupo DM tenha recebido apenas duas injeções a mais que o grupo SD, a contagem de células transplantadas no grupo DM foi ~10x maior que a do grupo SD (Figura 3B). Além disso, a porcentagem de cardiomiócitos transplantados no grupo DM também foi significativamente maior do que no grupo SD (Figura 3C). Este estudo também mostrou que as células transplantadas no grupo DM estavam distribuídas na área do infarto e na área do infarto marginal, enquanto as células transplantadas no grupo SD estavam distribuídas apenas na área do infarto (Figura 3A).
A área IM no grupo tratamento SD foi menor do que no grupo IM e a área IM no grupo SD foi significativamente menor do que no grupo DM (Figura 2E). Além disso, a espessura da parede anterior do ventrículo esquerdo no grupo DM foi 4x maior que a do grupo IM, enquanto a espessura da parede anterior do ventrículo esquerdo no grupo SD foi duas vezes maior que a do grupo IM (Figura 2F). Entretanto, a fração de volume de colágeno no grupo DM foi 50% menor do que no grupo IM, enquanto a fração de volume de colágeno no grupo SD foi apenas 30% menor do que no grupo IM (Figura 2G).
A contagem total de células expressando IB4 (um marcador de células endoteliais) e SM22α (um marcador de células musculares lisas) 28 dias após o IM aumentou significativamente no grupo DM (Figura 3D,E) em comparação com o grupo SD ou IM. Este estudo também avaliou o grau de hipertrofia dos cardiomiócitos na zona marginal de cada grupo. A coloração por fluorescência da aglutinina do germe de trigo (WGA) e alfa-actinina sarcomérica mostrou que o diâmetro mínimo da fibra (DMF) nos camundongos ligados em todos os três grupos foi significativamente maior do que o dos camundongos ligados simuladamente. No entanto, a DMF do grupo DM foi significativamente menor do que a dos grupos IM e SD (Figura 3F,G). Este estudo ainda utilizou a imunomarcação TUNEL (que pode marcar o núcleo de todas as células apoptóticas) para avaliar a apoptose dos cardiomiócitos. Em comparação com o grupo SD ou o grupo IM, a prevalência de núcleos de cardiomiócitos positivos para TUNEL no grupo DM foi significativamente reduzida (Figura 3H,I). Não foi detectado DNA mitocondrial humano em nenhum órgão dos grupos sham e MI (Figura 4A,B). Os grupos MD e SD apresentaram apenas DNA mitocondrial humano no coração, e nenhum DNA mitocondrial humano foi detectado em nenhum outro órgão (Figura 4C,D).
Figura 1: Injeção intramiocárdica de células guiada por ultrassom em camundongos. Após o camundongo ser anestesiado em uma mesa cirúrgica, os membros e a cauda são fixados com fita adesiva a uma temperatura constante de 37 °C, enquanto a injeção intramiocárdica percutânea é administrada no ventrículo esquerdo, guiada por ecocardiografia. Os camundongos foram anestesiados e mantidos por inalação de isoflurano (1,5%-2%). Remova os pelos na parte superior do abdômen e no peito do rato. Sob orientação ecocardiográfica transtorácica, insira a ponta da microseringa abaixo do processo xifoide (A) (seta) e mova-a (seta) ao longo da borda superior do diafragma (B) para ajustar a frequência respiratória do camundongo. Pressionar a ponta da agulha contra a parede do pericárdio (C) na fase inspiratória. (D,E) A ponta da agulha entra na cavidade pericárdica na fase expiratória e, finalmente, penetra na parede anterior do ventrículo esquerdo (F) para injetar células. Esse número foi modificado de17. Abreviações: VE = ventrículo esquerdo; OA = aorta ascendente; RL = pulmão direito; LL = pulmão esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação da função cardíaca em camundongos de cada grupo. (A) Utilizar ecocardiografia de alta resolução para avaliar a função ventricular esquerda antes de induzir infarto do miocárdio (pré-S) e 4 semanas após o tratamento (pós-S). A fração de ejeção (B) e a fração de encurtamento (C) são expressas em valores absolutos. Os dados estão expressos como média ± EP, 8 por grupo. Avaliar o tamanho do infarto, o volume de colágeno e a morfologia do ventrículo esquerdo. Através da coloração Sirius vermelho/verde rápido (D), foram mensurados o tamanho do infarto (E), a espessura da parede anterior do ventrículo esquerdo (F) e a fração de volume de colágeno (G). Os dados mostram média ± SE, 8 camundongos por grupo. Barra de escala = 1 mm. Análise de variância one-way e teste de comparações múltiplas de Dunn. * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Esse número foi modificado de17. Abreviações: pré-S = pré-operatório; pós-S = pós-operatório; IM = infarto do miocárdio; DP = dose única; DM = dose múltipla. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação histológica dos corações dos camundongos de cada grupo . (A) Cortes seriados dos camundongos cardíacos injetados com hiPSC-CM foram corados para hcTnT, actina α-sarcomérica (αSA) e DAPI. O número (B) e a porcentagem (C) das células transplantadas foram utilizados para quantificação. Cortes seriados de corações de camundongos operados com simulação, MI, SD e MD sacrificados 4 semanas após a indução do IM foram histoquimicamente corados para a presença de IB4. (D,E) Os capilares são quantificados como o número de estruturas vasculares positivas para IB4 em cada área de campo de alta potência ao redor do infarto. Os cardiomiócitos foram corados com WGA e αSA na zona marginal do infarto do miocárdio, e os núcleos foram marcados com DAPI. (F,G) A área de secção transversa dos cardiomiócitos é medida e apresentada como um valor absoluto. Os cortes marginais do infarto do miocárdio foram corados com TUNEL para mostrar cardiomiócitos apoptóticos (vermelho, TUNEL) e cardiomiócitos normais expressando troponina T cardíaca (verde, cTnT). (H,I) A razão entre células positivas para TUNEL e células totais foi calculada. Barras de escala = 500 μm (A), 20 μm (D,H) ou 10 μm (F). Análise de variância one-way e teste de comparações múltiplas de Dunn. * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Esse número foi modificado de17. Abreviações: hcTnT = troponina T cardíaca humana; αSA = actina α-sarcomérica; WGA = aglutinina do gérmen de trigo; DAPI = 4', 6-diamidino-2-fenilindol; TUNEL = desoxinucleotidiltransferase terminal dUTP nick end labeling; IM = infarto do miocárdio; DP = dose única; DM = dose múltipla. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Detecção de DNA mitocondrial humano em órgãos de camundongos em cada grupo. A figura mostra a detecção de DNA mitocondrial humano em corações de camundongos e outro(s) órgão(s) em cada grupo 1 mês após a PCR do transplante de células. A PCR do DNA mitocondrial humano não encontrou células transplantadas (A,B) nos corações e outros órgãos de camundongos nos grupos sham (n = 3) e MI (n = 3). A PCR do DNA mitocondrial humano encontrou células transplantadas no coração de camundongos nos grupos SD (n = 3) e MD (n = 3), mas não em outros órgãos, incluindo pulmão, fígado, rim, cérebro e baço (C,D). A análise quantitativa por qPCR do DNA mitocondrial humano mostrou que o DNA mitocondrial humano do grupo DM era aproximadamente oito vezes maior que o do grupo SD (E). (+) indica controle positivo de iPSC-CMs. (−) indica controle negativo da água DEPC. Abreviaturas: n.s. = não significante; IM = infarto do miocárdio; DP = dose única; DM = dose múltipla. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As etapas críticas deste estudo incluem cultura de hiPSC, diferenciação de cardiomiócitos, purificação de hiPSC-CM e transplante de hiPSC-CM no local do infarto do miocárdio de camundongos. A chave é usar o ultrassom cardíaco para guiar transcutaneamente o tratamento em direção ao local do infarto na borda do infarto, onde os MC-hiPSC foram injetados na área.
Com o prolongamento do tempo de cultura, o fenótipo hiPSC-CM muda na morfologia (maior tamanho celular), estrutura (músculo, densidade fibrilar, arranjo, aglomerados celulares microscópicos) e fisiologia (tratamento com cálcio e resposta β-adrenérgica) com diferenciação ao longo do tempo. Neste estudo, a marcação por fluorescência foi realizada no10º e 60ºdias de diferenciação da hiPSC em cardiomiócitos para observar alterações morfológicas e estruturais. O tamanho celular e o comprimento dos sarcômeros aumentaram significativamente nos MC-hiPSC no60º dia do que no10º dia. O estudo utilizou hiPSC-CMs que se mantiveram relativamente estáveis após 60 dias de diferenciação em cardiomiócitos para transplante. Além disso, durante os 60 dias de cultura de hiPSC-CMs, múltiplas substituições de meio de cultura sem glicose contendo ácido lático foram realizadas para purificar os cardiomiócitos e aumentar o conteúdo de cardiomiócitos para evitar efeitos colaterais causados por não cardiomiócitos nas células transplantadas.
Uma sonda de ultrassom foi colocada pela primeira vez no abdome superior do camundongo durante a injeção de células guiadas por ultrassom para visualizar seu fígado. A agulha do microinjetor entrava obliquamente sob o processo xifoide, evitando o fígado e entrando no pericárdio sob orientação ultrassonográfica. Neste estudo, o pericárdio não foi avaliado verticalmente a partir dos ossos internos da parede torácica, pois esse trajeto em direção à área de infarto no miocárdio é significativamente curto, representando um alto risco de punção cardíaca e falha no transplante de células. No entanto, o acesso obliquo ao pericárdio a partir do processo xifoide em direção ao miocárdio constitui um trajeto consideravelmente mais longo e com menor risco de punção cardíaca. Durante a injeção de células guiadas por ultrassom, os camundongos foram intubados para regular a frequência respiratória durante a punção. Regular a frequência respiratória dos ratos e prolongar os tempos de inalação e expiração são propícios à punção durante a expiração, o que também evita danificar os pulmões. Durante este experimento, nenhum camundongo morreu de ruptura cardíaca e lesão pulmonar após a injeção de células.
Para a estabilidade das células transplantadas, o estudo considerou o momento da injeção de hiPSC-CM e o número de injeções. Na fase inicial do infarto, inflamação grave ocorreu na área infartada23. A supressão precoce da resposta inflamatória no local do infarto pode melhorar o remodelamento miocárdico e limitar as possibilidades fatais para o sujeito experimental24. Além disso, uma resposta inflamatória grave é uma razão para a morte celular transplantada. Estudos prévios demonstraram que o transplante de cardiomiócitos ES com células diferenciadas para o local do infarto pode inibir a resposta inflamatória no local do infarto do miocárdio25.
Após o estabelecimento do modelo de MI em camundongos, os MC-hiPSC foram injetados no local do infarto e na zona marginal do infarto sob visão direta; apenas um décimo dos MC-hiPSC sobreviveu. No entanto, o estudo sugere que os hiPSC-CMs inicialmente transplantados podem melhorar o microambiente no local do infarto do miocárdio em camundongos e melhorar a taxa de sobrevida das células retransplantadas. Os resultados mostraram que o número de células que sobreviveram após três injeções de hiPSC-CM foi 10x maior do que o de uma única injeção de hiPSC-CM (Figura 3C). A ultrassonografia mostrou que a espessura da parede anterior do ventrículo esquerdo nos grupos DM e SD foi muito mais fina na terceira e quarta semanas após o estabelecimento do modelo MI do que na primeira e segunda semanas. Assim, os camundongos do grupo DM foram injetados com células imediatamente após o estabelecimento do modelo MI e, em seguida, uma e duas semanas após o infarto para evitar a morte por ruptura cardíaca.
Este estudo mostra que o número de células enxertadas é significativamente maior no grupo DM do que no grupo DS. O ecocardiograma do camundongo mostrou que os valores de FE e DC do grupo DM foram maiores que os do grupo DS. A função parácrina dos HIPSC-CMs transplantados também deve ser considerada em conjunto com os cardiomiócitos transplantados para melhorar a função cardíaca. Um estudo de Iwanaga et al.26 relatou que os fatores parácrinos secretados por hiPSC-CMs poderiam promover angiogênese por ativação da Akt1. O estudo encontrou pouquíssimas células positivas para isoretina B4 na área de infarto marginal no grupo IM. Em contraste, houve mais células positivas para isomectina B4 nos grupos SD e DM do que no grupo MI; notadamente, o grupo DM foi o que mais teve. Assim, esses resultados mostram que quanto mais enxertadas as HIPSC-CMs, mais fortes serão os novos vasos sanguíneos no local.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Plano de Pesquisa Principal da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 91539111to JY), Projeto Chave de Ciência e Tecnologia da Província de Hunan (No. 2020SK53420 para JY) e pelo Programa de Inovação em Ciência e Tecnologia da Província de Hunan (2021RC2106 para CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Cardiac troponin T | Abcam | ab8295 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150105 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150110 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150062 | |
| Human cardiac troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Isolectin B4 | Vector | FL-1201 | |
| Sarcomeric alpha actinin | Abcam | ab9465 | |
| Wheat germ agglutinin | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| Reagent | |||
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | |
| B27 Supplement(minus insulin) | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement(serum free) | Thermo Fisher Scientific | 17–504-044 | |
| Bouin's solution | Thermo Fisher Scientific | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| cyclosporin A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| DIRECT RED | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| FAST GREEN FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| lactic acid | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356234 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix kit | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| RPMI1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff | Stem Cell Technologies | 5030 | |
| STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium | Stem Cell Technologies | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| ultrasound coupling agent | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Applied Biosystems | Thermo Fisher Scientific | 7500 Real-Time PCR | |
| cryostat | Leica | CM1950 | |
| fluoresence microscope | Olympus | IX83 | |
| fine anatomical scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro syringe | Hamilton | 7633 | |
| Small animal anesthesia machine | MATRX | VMR | |
| Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Software | |||
| Statistical Product and Service Solutions | IBM | 21 | |
| Image J | NIH | 1.48 | |
| Human mitochondrial DNA primers | |||
| the forward primer sequence | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| the reverse primer sequence | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
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