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मायोकार्डियल इन्फ्रैक्टेड चूहों में अल्ट्रासाउंड-निर्देशित प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स प्रत्यारोपण

Published: March 30, 2022 doi: 10.3791/63647
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 3, 1,2, 1,2,3
1Department of Cardiovascular Surgery, Second Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research, 3Hunan Fangsheng Pharmaceutical Co., Ltd.

Summary

चूहों में मायोकार्डियल रोधगलन की साइट के आसपास अल्ट्रासाउंड-निर्देशित सेल डिलीवरी सेल प्रत्यारोपण का एक सुरक्षित, प्रभावी और सुविधाजनक तरीका है।

Abstract

मायोकार्डियल रोधगलन (एमआई) के बाद सेल थेरेपी का मुख्य उद्देश्य सेल ग्राफ्टेड दर को प्रभावी ढंग से बढ़ाना है, और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (एचआईपीएससी-सीएम) इस्केमिक क्षति के बाद हृदय की मरम्मत के लिए एक आशाजनक सेल स्रोत हैं। हालांकि, प्रत्यारोपण के बाद प्रभावी हृदय ऊतक पुनर्जनन के लिए कम ग्राफ्टेड दर एक महत्वपूर्ण बाधा है। इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि एमआई क्षेत्र में कई एचआईपीएससी-सीएम अल्ट्रासाउंड-निर्देशित परक्यूटेनियस इंजेक्शन प्रभावी रूप से सेल प्रत्यारोपण दर में वृद्धि करते हैं। अध्ययन में पूरी एचआईपीएससी-सीएम संस्कृति प्रक्रिया, प्रथागत और अल्ट्रासाउंड-निर्देशित पर्क्यूटेनियस डिलीवरी विधियों का भी वर्णन किया गया है। इसके अलावा, मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए का उपयोग अन्य माउस अंगों में एचआईपीएससी-सीएम की अनुपस्थिति का पता लगाने में मदद करता है। अंत में, यह पेपर सेल डिलीवरी के 4 सप्ताह बाद चूहों में इन्फ्रैक्टेड बॉर्डर ज़ोन में कार्डियक फ़ंक्शन, एंजियोजेनेसिस, सेल आकार और एपोप्टोसिस में परिवर्तन का वर्णन करता है। यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि बाएं वेंट्रिकुलर मायोकार्डियम का इकोकार्डियोग्राफी-निर्देशित परक्यूटेनियस इंजेक्शन एक व्यवहार्य, अपेक्षाकृत आक्रामक, संतोषजनक, दोहराने योग्य और प्रभावी सेलुलर थेरेपी है।

Introduction

जब तीव्र एमआई होता है, तो रोधगलित क्षेत्र में मायोकार्डियल कोशिकाएं इस्किमिया और हाइपोक्सिया के कारण जल्दी मर जाती हैं। कोशिका मृत्यु और टूटने के बाद कई भड़काऊ कारक जारी किए जाते हैं, जबकि भड़काऊ कोशिकाएंसूजन का कारण बनने के लिए इन्फ्रैक्टेड साइट में घुसपैठ करती हैं। गौरतलब है कि फाइब्रोब्लास्ट और कोलेजन, दोनों सिकुड़न और विद्युत चालकता के बिना, निशान ऊतक बनाने के लिए इन्फ्रैक्टेड साइट में मायोकार्डियल कोशिकाओं को प्रतिस्थापित करते हैं। वयस्क स्तनधारियों में कार्डियोमायोसाइट्स की सीमित पुनर्जनन क्षमता के कारण, रोधगलन के एक बड़े क्षेत्र के बाद गठित व्यवहार्य ऊतक आमतौर पर पर्याप्त कार्डियक आउटपुट2 को बनाए रखने के लिए पर्याप्त नहीं होता है। एमआई दिल की विफलता का कारण बनता है, और दिल की विफलता के गंभीर मामलों में, रोगी केवल सामान्यहृदय कार्यों को बनाए रखने के लिए हृदय प्रत्यारोपण या वेंट्रिकुलर सहायता उपकरणों पर भरोसा कर सकते हैं।

एमआई के बाद, आदर्श उपचार रणनीति मृत कार्डियोमायोसाइट्स को नवगठित कार्डियोमायोसाइट्स के साथ बदलना है, जो स्वस्थ ऊतकों के साथ इलेक्ट्रोमैकेनिकल युग्मन बनाता है। हालांकि, उपचार विकल्पों ने आमतौर पर प्रतिस्थापन के बजाय मायोकार्डियल निस्तारण को अपनाया है। वर्तमान में, स्टेम सेल- और पूर्वज सेल-आधारित उपचार एमआई5 के बाद मायोकार्डियल मरम्मत को बढ़ावा देने के लिए सबसे आशाजनक रणनीतियों में से हैं। हालांकि, इन कोशिकाओं के प्रत्यारोपण में कई मुद्दे हैं, मुख्य रूप से कार्डियोमायोसाइट्स में अंतर करने के लिए वयस्क स्टेम कोशिकाओं की अक्षमता और उनके छोटे जीवन काल6।

भ्रूण स्टेम (ईएस) कोशिकाओं के उपयोग से संबंधित नैतिक मुद्दों को आईपीएससी द्वारा दरकिनार किया जा सकता है, जो कोशिकाओं का एक आशाजनक स्रोत हैं। इसके अलावा, आईपीएससी में मजबूत आत्म-नवीकरण क्षमताएं होती हैं और कार्डियोमायोसाइट्स7 में अंतर कर सकती हैं। अध्ययनों से पता चला है कि एमआई साइट में प्रत्यारोपित एचआईपीएससी-सीएम जीवित रह सकते हैं और मेजबान कोशिकाओं 8,9 के साथ अंतराल जंक्शन बना सकते हैं। हालांकि, क्योंकि ये प्रत्यारोपित कोशिकाएं इस्किमिया और सूजन के माइक्रोएन्वायरमेंट में स्थित हैं, इसलिए उनकी जीवित रहने की दरबेहद कम 10,11 है।

प्रत्यारोपित कोशिकाओं की जीवित रहने की दर में सुधार करने के लिए कई तरीके स्थापित किए गए हैं, जैसे हाइपोक्सिया और प्रत्यारोपित कोशिकाओं के गर्मी के झटके पूर्वउपचार12,13, आनुवंशिक संशोधन14,15, और कोशिकाओं और केशिकाओं के एक साथ प्रत्यारोपण16। दुर्भाग्य से, अधिकांश विधियां जटिलता और उच्च लागत से सीमित हैं। इसलिए, वर्तमान अध्ययन एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सुविधाजनक, अपेक्षाकृत आक्रामक और प्रभावी HIPSC-CM वितरण विधि का प्रस्ताव करता है।

अल्ट्रासाउंड-निर्देशित इंट्रामायोकार्डियल सेल इंजेक्शन साइट की परवाह किए बिना केवल एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छोटी पशु चिकित्सा अल्ट्रासाउंड मशीन और एक माइक्रोइंजेक्टर के साथ किया जा सकता है। अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन के तहत, चूहों में पेरिकार्डियम से मायोकार्डियम में एक्सिफॉइड प्रक्रिया के तहत कोशिकाओं को सीधे पहुंचाना एक सुरक्षित प्रोटोकॉल है जो यकृत और फेफड़ों की क्षति से बचाता है। इस विधि को अन्य तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि प्रत्यारोपित कोशिकाओं की जीवित रहने की दर में काफी सुधार हो सके।

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Protocol

इस अध्ययन में सभी पशु प्रयोगों की समीक्षा की गई और सेंट्रल साउथ यूनिवर्सिटी के दूसरे जियांग्या अस्पताल की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और उपकरणों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। सेल इंजेक्शन, इमेजिंग और यूथेन्सिया के लिए समय सीमा इस प्रकार है: टी 0- इंड्यूस रोधगलन, टी 1 सप्ताह- छवि और प्रत्यारोपण कोशिकाएं, टी 2 सप्ताह- छवि और प्रत्यारोपण कोशिकाएं, टी 4 सप्ताह- अंतिम इमेजिंग, इच्छामृत्यु और ऊतक संग्रह।

1. एचआईपीएससी संस्कृति, कार्डियोमायोसाइट भेदभाव, और सेल शुद्धिकरण

  1. डीएमईएम/एफ12 और बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स स्टॉक सॉल्यूशन को 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ के साथ 1.5:1 के अनुपात में मिलाएं, एलिकोट करें, और परिणामी मिश्रण (मैट्रिक्स डिल्यूएंट) को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 25 एमएल डीएमईएम/एफ12 कल्चर मीडियम को 4 डिग्री सेल्सियस पर और 1 एमएल मैट्रिक्स को बर्फ के साथ अच्छी तरह से मिलाएं, और 6-वेल प्लेट में 1 एमएल / अच्छी तरह से फैलाएं। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए सीधा रखें, और कुओं से डीएमईएम / एफ 12 सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें। प्रक्रिया करते समय 6-वेल प्लेट के निचले हिस्से को न छुएं।
  2. तरल नाइट्रोजन से एचआईपीएससी युक्त क्रायोप्रिजर्वेशन ट्यूब को हटा दें और जल्दी से उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलाएं। 75% अल्कोहल के साथ क्रायोप्रिजर्वेशन ट्यूब की बाहरी सतह को निष्फल करें, शराब को मिटा दें, और ट्यूब को एक बाँझ अल्ट्रा-क्लीन टेबल में स्थानांतरित करें।
  3. एचआईपीएससी युक्त क्रायोप्रिजर्वेशन समाधान को धीरे-धीरे 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें, फीडर-मुक्त ईएस माध्यम के 5 एमएल जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें और धीरे से फीडर-मुक्त ईएस माध्यम के 6 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं की गणना करें और संस्कृति माध्यम के साथ सेल एकाग्रता को 5 × 105 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें।
  4. एचआईपीएससी में रॉक इनहिबिटर (वाई 27632) को 5 μM की अंतिम सांद्रता में जोड़ें। Y27632 के साथ HIPSCs को बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के साथ पूर्व-उपचारित 6-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें, और धीरे से 6-वेल प्लेट को घुमाएं, संख्या "8" के आकार का पता लगाते हुए समान रूप से वितरित करें। एचआईपीएससी को 37 डिग्री सेल्सियस, आर्द्र इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ24 घंटे के लिए सीधी स्थिति में रखें। Y27632 के बिना सुपरनैटेंट को फीडर-मुक्त ईएस माध्यम से बदलें।
  5. जब एचआईपीएससी संगम की 80% डिग्री तक पहुंच जाता है, तो कल्चर सुपरनैटेंट को उत्तेजित करें, कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ दो बार धोएं, इंसुलिन मुक्त आरपीएमआई 1640 + बी 27 जोड़ें जिसमें 10 μM CHIR99021 (GSK3-β अवरोधक) हो, और एचआईपीएससी को24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें।
  6. सुपरनैटेंट के आधे हिस्से को इंसुलिन के बिना आरपीएमआई 1640 + बी 27 माध्यम से बदलें और कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. पूरी तरह से संस्कृति माध्यम को RPMI1640 + B27 (इंसुलिन के बिना) के साथ बदलें। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ24 घंटे के लिए सीधी स्थिति में रखें।
  8. 3 दिनों के बाद कल्चर माध्यम को पूरी तरह से इंसुलिन मुक्त RPMI1640 + B27 + 5 μM IWR1 (WNT सिग्नलिंग पाथवे इनहिबिटर) के साथ बदलें और प्लेटों को 48 घंटे के लिए 5%CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में रखें।
  9. 5 दिनों के बाद कल्चर माध्यम को इंसुलिन के बिना RPMI1640 + B27 के साथ बदलें और 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रCO2 इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करना जारी रखें।
  10. कल्चर माध्यम को 7 दिनों के बाद आरपीएमआई + बी 27 (इंसुलिन सहित) माध्यम से बदलें और प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए ह्यूमिडिफाइड सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें। माध्यम को हर 3 दिनों में RPMI + B27 माध्यम से बदलें। विभेदन के 9-12 दिनों में कोशिकाओं की सहज धड़कन की तलाश करें।
  11. स्पंदित कोशिकाओं को देखने के बाद, आरपीएमआई + बी 27 माध्यम को ग्लूकोज मुक्त आरपीएमआई 1640 माध्यम से प्रतिस्थापित करें जिसमें लैक्टिक एसिड होता है (लैक्टिक एसिड का 1 एमएल ग्लूकोज-मुक्त आरपीएमआई 1640 माध्यम के 500 एमएल में जोड़ा जाता है)। कोशिकाओं को 5% CO2 के साथ 37 °C पर आर्द्र इनक्यूबेटर में72 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  12. 72 घंटे के बाद, सतह पर तैरने वाले को आरपीएमआई + बी 27 माध्यम से बदलें और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  13. नकारात्मक दबाव के तहत कल्चर सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें और संस्कृति माध्यम के निशान को हटाने के लिए पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 3 एक्स धोएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर व्यक्तिगत कोशिकाओं में एचआईपीएससी-सीएम को अलग करने के लिए सेल डिटेचमेंट एंजाइम मिश्रण का उपयोग करें। प्राप्त कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें जिसमें 3 एमएल कार्डियोमायोसाइट सपोर्ट सॉल्यूशन होता है, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, और सुपरनैटेंट को त्याग दें।
  14. आरपीएमआई + बी 27 माध्यम के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, उन्हें तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 6-वेल प्लेटों पर बीज दें, और उन्हें 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  15. शुद्धिकरण के लिए कल्चर सुपरनैटेंट को ग्लूकोज-मुक्त आरपीएमआई 1640 माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें लैक्टिक एसिड होता है और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में72 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  16. कल्चर सुपरनैटेंट को आरपीएमआई + बी 27 माध्यम से बदलें और हर 3 दिनों में माध्यम बदलें।
  17. उपरोक्त प्रक्रिया को 30 दिनों के लिए जारी रखें, आगे के शुद्धिकरण के लिए लैक्टिक एसिड युक्त ग्लूकोज मुक्त माध्यम के साथ कल्चर सुपरनैटेंट को प्रतिस्थापित करें। इस माध्यम के साथ 3 दिनों के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और सुपरनैटेंट को आरपीएमआई + बी 27 के साथ बदलें। कोशिकाओं को लगातार 30 दिनों तक कल्चर करें जब तक कि एचआईपीएससी-सीएम स्थिर रूप से नहीं धड़कते, और चूहों में इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करते हैं।

2. एचआईपीएससी-सीएम की तैयारी और माउस तीव्र मायोकार्डियल रोधगलन मॉडल की स्थापना

  1. 60 दिनों के लिए सुसंस्कृत एचआईपीएससी-सीएम से कल्चर सुपरनैटेंट को वैक्यूम-एस्पिरेट करें, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ 3x धोएं, और सेल डिटेचमेंट एंजाइम मिश्रण (~ 3-5 मिनट) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एचआईपीएससी-सीएम को अलग-अलग कोशिकाओं में अलग करें। कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें जिसमें 5 एमएल आरपीएमआई + बी 27 माध्यम होता है और कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करने के लिए कोशिकाओं की गणना करने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को त्याग दें और कार्डियोमायोसाइट समर्थन माध्यम को 0.6 × 105 कोशिकाओं /
  2. इंजेक्शन 14,17,18,19,20 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पुन: निलंबित एचआईपीएससी-सीएम युक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार रखें।
  3. एनेस्थेटिक इनहेलेशन को प्रेरित करने के लिए आइसोफ्लुरेन से जुड़े एनेस्थीसिया बॉक्स में चूहों को रखें, इसके बाद एनेस्थीसिया के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मलहम का उपयोग करें।
    नोट: आइसोफ्लुरेन एकाग्रता 5% थी। प्रयोग के दौरान प्रयोगशाला वेंटिलेशन पर ध्यान दें।
  4. माउस को ऑपरेटिंग टेबल पर सपाट रखने पर चुटकी लेने के बाद पैरों और पूंछ क्षेत्र में सजगता के नुकसान की तलाश करें, जो पर्याप्त संज्ञाहरण का संकेत देता है। ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करें।
  5. चूहों की गर्दन के बीच और बाईं छाती पर बालों को एक डिपिलेटरी क्रीम के साथ मलें, और 5 मिनट के बाद लागू क्रीम और बालों को धुंध से पोंछ दें।
  6. टेप के साथ अंगों और माउस पूंछ को ठीक करें। माउस छेदक को 2-0 रेशम धागे और टेप के साथ ठीक करें। सर्जिकल क्षेत्र (औसत गर्दन और बाईं छाती) को बीटाडीन के तीन वैकल्पिक राउंड के साथ निष्फल करें, जिसके बाद शराब होती है।
  7. निष्फल सर्जिकल क्षेत्र के चारों ओर एक सर्जिकल ड्रेप रखें। फिर, श्वासनली को पूरी तरह से उजागर करने के लिए ठीक शारीरिक कैंची और ठीक विच्छेदन बल का उपयोग करके एक औसत गर्दन चीरा लगाएं। यदि आवश्यक हो, तो स्थिरीकरण के लिए कुछ पूर्ववर्ती ग्रीवा मांसपेशियों को काट दें।
    नोट: ऑपरेटरों को पशु समूहों के लिए अंधा कर दिया गया था।
  8. मुंह के माध्यम से एक श्वासनली ट्यूब (20 ग्राम कैथेटर पंचर सुई) डालें।
  9. श्वासनली ट्यूब को वेंटिलेटर से कनेक्ट करें और यह सुनिश्चित करने के लिए वक्ष आंदोलन की जांच करें कि दोनों फेफड़े अच्छी तरह से हवादार हैं।
  10. श्वास मापदंडों को समायोजित करें (श्वास दर: 100-150 बीपीएम, ज्वारीय मात्रा 250-300 μL)। उसके बाद, बाएं पिछले अंग को निचले दाईं ओर फिर से रखें, बाएं ऊपरी अंग के चारों ओर टेप को ढीला करें, और अधिकतम हृदय जोखिम के लिए ठीक विच्छेदन कैंची और बल का उपयोग करके बाएं वक्ष के 3-4 इंटरकोस्टल स्पेस पर थोराकोटॉमी करें।
  11. बल का उपयोग करके, बाएं एट्रियल उपांग के निचले किनारे पर बाएं पूर्ववर्ती अवरोही कोरोनरी धमनी (एलएडी) की कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत पेरिकार्डियम को छील लें।
  12. एलएडी के समीपस्थ छोर को हटाने के लिए 6-0 रेशम धागे का उपयोग करें। यह सुनिश्चित करने के बाद कि तीव्र एमआई मॉडल पर्याप्त रूप से स्थापित है (जब बंधाव स्थल पर डिस्टल एलएडी लाल से सफेद हो जाता है), छाती की परत को परत दर परत बंद करें और त्वचा को 4-0 थ्रेडेड आंतरायिक टांके के साथ सीवन करें। बंधाव को छोड़कर जानवरों के शाम समूह के लिए एमआई प्रेरण के लिए उपर्युक्त सभी शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें।
  13. इनहेलेशन एनेस्थीसिया को बंद करें, माउस के सहज श्वास को फिर से शुरू करने के बाद कैनुला को हटा दें, और इसे अपने पिंजरे में वापस कर दें। जानवर की निगरानी तब तक करें जब तक कि वह उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। इसे अन्य जानवरों की कंपनी को वापस न करें जब तक कि यह पूरी तरह से ठीक न हो जाए। ब्यूप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा x 3 दिन) और कारप्रोफेन (5 मिलीग्राम / किग्रा x 1 दिन) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन को हर 12 घंटे बाद प्रशासित करें।
  14. प्रत्यारोपित कोशिकाओं की अस्वीकृति को रोकने के लिए एचआईपीएससी-सीएम को प्रशासित करने से 3 दिन पहले चूहों के इंट्रापरिटोनियल गुहा में साइक्लोस्पोरिन ए (10 मिलीग्राम-1-दिन -1) इंजेक्ट करें। प्रत्यारोपण के बाद 1 महीने तक लगातार साइक्लोस्पोरिन ए इंजेक्ट करें।

3. अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन के तहत एचआईपीएस-सीएम इंजेक्शन

  1. एमआई मॉडल स्थापित करने के बाद, एमआई मॉडल चूहों (12 सप्ताह के सी 57बीएल /6 चूहे; वजन में 22 ग्राम से 24 ग्राम, इस अध्ययन में 50% पुरुष और 50% महिला) को एकल खुराक (एसडी, एन = 8) और मल्टीपल-डोज (एमडी, एन = 8 इस अध्ययन में) समूहों में पहले पोस्ट-एमआई दिन पर असाइन करें और उन्हें एमआई के बाद पहले और दूसरे सप्ताह में एनेस्थीसिया बॉक्स में रखें। श्वासनली इंटुबैशन।
  2. चूहों की छाती और ऊपरी पेट पर बालों को डिपिलेटरी क्रीम के साथ मलें और 5 मिनट बाद धुंध के साथ क्रीम को पोंछ दें। ऑपरेशन बोर्ड पर माउस की हृदय गति की निगरानी करें और जब तक हृदय गति 400-500 बीपीएम पर बनाए नहीं रखी जाती है, तब तक साँस लेना आइसोफ्लुरेन का प्रबंधन करें।
  3. डिटेक्शन कंसोल पर टेप के साथ माउस अंगों और पूंछ को ठीक करें और प्लेटफॉर्म तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  4. ऊपरी पेट पर एक विशेष अल्ट्रासाउंड जेली लागू करें और माउस यकृत छवियों को प्राप्त करने के लिए एक छोटी उच्च-रिज़ॉल्यूशन पशु चिकित्सा अल्ट्रासाउंड जांच का उपयोग करें।
  5. वेंटिलेटर दर को 50 बीपीएम तक कम करें। ~ 3 × 10 5 कोशिकाओं (चरण 2.1 से) को खींचने के लिए5 μL माइक्रोसिरिंज का उपयोग करें। एक माइक्रोमैनिपुलेटर के साथ सिरिंज को पकड़ते हुए, बाईं पैरा-ज़िफॉइड प्रक्रिया (चित्रा 1 ए) पर 3 मिमी की सुई डालें। अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन (चित्रा 1 बी) के तहत डायाफ्राम के ऊपरी किनारे का पालन करें, श्वसन ताल और सीमा (चित्रा 1 सी, डी) का निरीक्षण करें, और यकृत और फेफड़ों को नुकसान से बचने के लिए समाप्ति चक्र के अंत में पेरिकार्डियम में प्रवेश करें (चित्रा 1 डी)।
  6. माइक्रोइंजेक्टर सुई के पेरिकार्डियल गुहा में प्रवेश करने के बाद, श्वास दर को मूल पैरामीटर (150 बीपीएम) में समायोजित करें। निर्माता के निर्देशों17 (चित्रा 1 ई) के अनुसार एम-मोल्ड इकोकार्डियोग्राफी द्वारा माउस हृदय की पैरास्टर्नल लॉन्ग-एक्सिस छवि प्राप्त करें। अल्ट्रासोनिक मार्गदर्शन के तहत, इन्फ्रैक्ट साइट के तीन सीमांत क्षेत्रों (1 × 10 5 कोशिकाओं प्रति इंजेक्शन साइट) में 3 × 105 कोशिकाओं (चित्रा 1 एफ) इंजेक्ट करें।
  7. विशेष अल्ट्रासाउंड जांच को हटा दें और जेली से कुल्ला करें। इनहेलेशन एनेस्थीसिया से माउस को दूर करें, और पूर्ण चेतना के बाद इसे अपने पिंजरे में वापस कर दें।
  8. एमडी समूह के चूहों के लिए एमआई स्थापित करने के 1 और 2 सप्ताह बाद उपरोक्त अल्ट्रासाउंड-निर्देशित सेल इंजेक्शन प्रक्रियाओं को दोहराएं।

4. बाएं पूर्ववर्ती अवरोही शाखा बंधाव के 30 दिनों के बाद चूहों में हृदय समारोह, प्रतिदीप्ति लेबलिंग, प्रत्यारोपित सेल गिनती, मायोकार्डियल इन्फ्रैक्टेड क्षेत्र और अंग मानव माइटोकॉन्ड्रिया का पता लगाने का मूल्यांकन

  1. हृदय समारोह मूल्यांकन
    1. एनेस्थीसिया के तहत सूखापन को रोकने के लिए माउस को इंडक्शन-इनहेलेशन एनेस्थीसिया के लिए एक आइसोफ्लुरेन-कनेक्टेड एनेस्थीसिया बॉक्स में रखें, इसके बाद आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का उपयोग करें। डीपिलेटरी क्रीम के साथ माउस की बाईं छाती पर बालों को हटा दें। हृदय गति की निगरानी करने और आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन को समायोजित करने के लिए ऑपरेटिंग पैनल पर माउस रखें। माउस हृदय गति को 400-500 बीपीएम पर बनाए रखें। प्रायोगिक समापन बिंदु दिन 30 (एमआई प्रेरण के बाद) है।
    2. डिटेक्शन कंसोल पर टेप के साथ माउस अंगों और पूंछ को ठीक करें और प्लेटफॉर्म तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    3. पूर्वकाल हृदय क्षेत्र में एक विशेष अल्ट्रासाउंड जेल लागू करने के बाद, निर्माता केनिर्देशों 17 के अनुसार एम-मोल्ड और बी-मोल्ड के इकोकार्डियोग्राफी के तहत पैरास्टर्नल लॉन्ग-एक्सिस और दो-आयामी लघु-अक्ष छवियों को प्राप्त करने के लिए एक (पशु चिकित्सा) उच्च-रिज़ॉल्यूशन कार्डियक अल्ट्रासाउंड जांच का उपयोग करें।
    4. अल्ट्रासोनिक डिटेक्शन पूरा होने के बाद, विशेष अल्ट्रासोनिक जेल को कुल्ला करें, इनहेलेशन एनेस्थीसिया बंद करें, और माउस को पूर्ण चेतना के बाद अलग से अपने पिंजरे में वापस कर दें।
    5. प्राप्त डेटा का विश्लेषण करें और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बाएं वेंट्रिकुलर इजेक्शन अंश (ईएफ) और फ्रैक्शनल शॉर्टनिंग (एफएस) की गणना करें। सुनिश्चित करें कि ऑपरेटर प्रयोगात्मक समूहों17 में अंधा है।
  2. अनुभागों की प्रतिदीप्ति लेबलिंग
    1. अलग किए गए दिल को पीबीएस के साथ धोएं, इसे 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में डुबोएं। दिल को बाहर निकालें और निर्जलित करने के लिए इसे 24 घंटे के लिए 30% सुक्रोज में डुबोदें।
    2. सूखी बर्फ पर इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक के साथ निर्जलित हृदय को एम्बेड करें। 10 μm की क्रायोस्टेट मोटाई के साथ दिल को नीचे से शीर्ष तक स्लाइस करें और अनुभागों को स्लाइड पर रखें और स्लाइड को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. 3 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दिल के ऊतकों के साथ स्लाइड्स धोएं।
    4. 8 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.5% ट्राइटन एक्स -100 के साथ स्लाइड पर ऊतक को स्थिर करें और उन्हें 5 मिनट प्रति धोने के लिए पीबीएस के साथ 3 गुना धोएं।
    5. ऊतक को 10% गधे के सीरम और 90% पीबीएस (ब्लॉकिंग समाधान) के साथ कवर करने के बाद, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए खंडों को अवरुद्ध करें।
    6. ब्लॉकिंग समाधान को हटाने के बाद, प्राथमिक एंटीबॉडी (ब्लॉकिंग समाधान के साथ 1:100 तक पतला) के साथ वर्गों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। उन्हें 5 मिनट प्रति धोने के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं।
    7. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए फ्लोरोफोरे-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (ब्लॉकिंग समाधान के साथ 1:100 तक पतला) के साथ स्लाइड पर ऊतक को इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस बिंदु से फ्लोरोफोरे-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ऊतकों को प्रकाश में उजागर करने से बचें।
    8. प्रति धोने के लिए 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड्स को 3x धो लें।
    9. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप 17 के तहत 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई) युक्त माउंटिंग माध्यम और तस्वीर का उपयोग करकेस्लाइड्स को माउंट करें।
  3. प्रत्यारोपित HIPSC-मुख्यमंत्रियों की संख्या17
    1. पैदल यात्री-विशिष्ट ट्रोपोनिन टी (एचसीटीएनटी), मानव परमाणु एंटीजन (एचएनए), और गैर-विशिष्ट सरकोमेरिक अल्फा एक्टिनिन के लिए हृदय के जमे हुए वर्गों पर ऊतक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करें।
    2. पूरे दिल को क्रमबद्ध रूप से विभाजित करने के बाद, फ्लोरेसेंस लेबलिंग के लिए प्रत्येक 50 खंडों के लिए एक अनुभाग लें।
    3. यादृच्छिक रूप से प्रति स्लाइस पांच उच्च-आवर्धन छवियों को कैप्चर करें। फ़ील्ड-ऑफ-व्यू की ग्राफ्टेड संख्या की गणना करें, प्रति यूनिट क्षेत्र में औसत ग्राफ्टेड सेल संख्याओं की गणना करें, और उन्हें ए 1 / μm2 के रूप में सेट करें। ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) का उपयोग करके स्लाइस के कुल ग्राफ्टेड क्षेत्र की गणना करें और इसे B1μm2 के रूप में सेट करें ताकि इस स्लाइस में ग्राफ्टेड संख्या = A1 × B121,22 हो।
    4. समीकरण (1) का उपयोग करके प्रति माउस हृदय ग्राफ्टेड कोशिकाओं की कुल संख्या और समीकरण (2) का उपयोग करके प्रतिशत एनग्राफमेंट दर की गणना करें, यह देखते हुए कि प्रत्येक 50 खंडों21,22 से एक खंड चुना गया था।
    5. प्रति माउस हृदय ग्राफ्टेड कोशिकाओं की कुल संख्या = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ एक × Bn) × 50 (1)
      एनग्राफमेंट दर = Equation 1 (2)
      नोट: एसडी समूह के लिए डिलीवरी की संख्या 3 × 105 और एमडी समूह के लिए 3 × 3 × 105 थी।
  4. मायोकार्डियल इन्फ्रैक्टेड क्षेत्र का आकलन
    1. अलग-थलग दिल के एक क्रॉस-सेक्शनल जमे हुए खंड (लघु अक्ष) को 10 μm की मोटाई के साथ शीर्ष से हृदय के आधार तक काटें।
    2. पूरे दिल को क्रमबद्ध रूप से विभाजित करने के बाद, प्रत्येक 30 खंडों के लिए एक अनुभाग स्लाइड लें और इसे 58 डिग्री सेल्सियस पर पूर्वनिर्मित बौइन समाधान में ठीक करें। निर्माता के निर्देशों17 के अनुसार 0.04% प्रत्यक्ष लाल और 0.1% फास्ट ग्रीन कोलेजन दाग (पीबीएस में पतला) के साथ अनुभाग को दाग दें।
    3. Eq (3): 14,17 का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत दिल के क्रॉस-अनुभागीय पूरे शरीर की फोटोग्राफी के बाद छवियों का विश्लेषण करने के लिए सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJ) का उपयोग करें
      इन्फ्रैक्ट क्षेत्र % = Equation 2 × 100% (3)
  5. विभिन्न अंगों में मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए का पता लगाना
    1. चूहों को 5% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें और उन्हें पीछे ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा बलिदान करें। सेल प्रत्यारोपण के 4 सप्ताह बाद चूहों को विच्छेदित करें। अंगों (यकृत, फेफड़े, मस्तिष्क, गुर्दे, प्लीहा) और मायोकार्डियम के हिस्से (इस खंड में एन = 3) की कटाई करें।
    2. तरल नाइट्रोजन में प्रत्येक अंग ऊतक को पीसें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार संदर्भित किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके ऊतक से डीएनए निकालें।
    3. उपर्युक्त ऊतकों (चरण 4.5.1 से) में मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए का पता लगाने के लिए संदर्भित किट और प्राइमरों ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

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Representative Results

प्रत्येक समूह में चूहों के बाएं वेंट्रिकुलर फ़ंक्शन के मूल्यांकन के लिए इकोकार्डियोग्राफी से पता चला कि एमडी समूह (चित्रा 2 ए) में एमआई चोटों को प्रभावी ढंग से उलट दिया गया था। एमआई समूह की तुलना में, एसडी समूह ने इजेक्शन अंश (ईएफ) में वृद्धि देखी (30% से 35%; चित्र 2B) और अंश छोटा होना (एफएस) (18% से 22% तक; चित्र 2C) एमआई के बाद। हालांकि, यह ध्यान रखना और भी महत्वपूर्ण है कि एमडी समूह चूहों में एचआईपीएससी-सीएम के कई इंजेक्शन ने ईएफ में वृद्धि की (30% से 42%; चित्र 2B) और एफएस (18% से 28% तक; चित्र 2C) एमआई के बाद माउस दिल।

ऊतक वर्गों के गैर-विशिष्ट α-एक्टिन (_SA), DAPI, मानव-विशिष्ट ट्रोपोनिन T (hcTnT), और मानव परमाणु एंटीजन (HNA) के प्रतिदीप्ति लेबलिंग से पता चला कि एमडी समूह में प्रत्यारोपित सेल गिनती एसडी समूह की तुलना में काफी अधिक थी (चित्रा 3 ए)। यद्यपि एमडी समूह में एसडी समूह की तुलना में केवल दो और इंजेक्शन थे, एमडी समूह में प्रत्यारोपित सेल गिनती एसडी समूह (चित्रा 3 बी) की ~ 10 गुना थी। इसके अलावा, एमडी समूह में प्रत्यारोपित कार्डियोमायोसाइट्स का प्रतिशत एसडी समूह (चित्रा 3 सी) की तुलना में काफी अधिक था। इस अध्ययन से यह भी पता चला है कि एमडी समूह में प्रत्यारोपित कोशिकाओं को इन्फ्रैक्ट क्षेत्र और सीमांत इन्फ्रैक्ट क्षेत्र में वितरित किया गया था, जबकि एसडी समूह में प्रत्यारोपित कोशिकाओं को केवल इन्फ्रैक्ट क्षेत्र (चित्रा 3 ए) में वितरित किया गया था।

एसडी उपचार समूह में एमआई क्षेत्र एमआई समूह की तुलना में छोटा था और एसडी समूह में एमआई क्षेत्र एमडी समूह (चित्रा 2 ई) की तुलना में काफी छोटा था। इसके अलावा, एमडी समूह के बाएं वेंट्रिकुलर पूर्ववर्ती दीवार की मोटाई मायोकार्डियल एमआई समूह की तुलना में 4 गुना थी, जबकि एसडी समूह में बाएं वेंट्रिकुलर पूर्ववर्ती दीवार की मोटाई एमआई समूह (चित्रा 2 एफ) से दोगुनी थी। हालांकि, एमडी समूह में कोलेजन वॉल्यूम अंश एमआई समूह की तुलना में 50% कम था, जबकि एसडी समूह में कोलेजन वॉल्यूम अंश एमआई समूह (चित्रा 2 जी) की तुलना में केवल 30% कम था।

एमआई के 28 दिनों बाद आईबी 4 (एक एंडोथेलियल सेल मार्कर) और एसएम 22 (एक चिकनी मांसपेशी कोशिका मार्कर) को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की कुल गिनती एसडी या एमआई समूह की तुलना में एमडी समूह (चित्रा 3 डी, ई) में काफी बढ़ गई। इस अध्ययन ने प्रत्येक समूह के सीमांत क्षेत्र में कार्डियोमायोसाइट्स की हाइपरट्रॉफी की डिग्री का भी आकलन किया। गेहूं के रोगाणु एग्लूटीनिन (डब्ल्यूजीए) और सरकोमेरिक अल्फा एक्टिनिन फ्लोरेसेंस स्टेनिंग से पता चला है कि सभी तीन समूहों में लिगेटेड चूहों में न्यूनतम फाइबर व्यास (एमएफडी) शाम-लिगेटेड चूहों की तुलना में काफी अधिक था। हालांकि, एमडी समूह का एमएफडी एमआई और एसडी समूहों (चित्रा 3 एफ, जी) की तुलना में काफी छोटा था। इस अध्ययन ने कार्डियोमायोसाइट्स के एपोप्टोसिस का मूल्यांकन करने के लिए ट्यूनल इम्यूनोस्टेनिंग (जो सभी एपोप्टोटिक कोशिकाओं के नाभिक को चिह्नित कर सकता है) का उपयोग किया। एसडी समूह या एमआई समूह की तुलना में, एमडी समूह में ट्यूनल-पॉजिटिव कार्डियोमायोसाइट्स नाभिक की व्यापकता काफी कम हो गई थी (चित्रा 3 एच, आई)। शाम और एमआई समूहों (चित्रा 4 ए, बी) में किसी भी अंग में कोई मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए नहीं पाया गया था। एमडी और एसडी समूहों ने केवल हृदय में मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए दिखाया, और किसी अन्य अंग (चित्रा 4 सी, डी) में कोई मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए नहीं पाया गया।

Figure 1
चित्रा 1: चूहों में अल्ट्रासाउंड-निर्देशित इंट्रामायोकार्डियल सेल इंजेक्शन। एक ऑपरेटिंग टेबल पर माउस को एनेस्थेटाइज करने के बाद, अंगों और पूंछ को 37 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर टेप के साथ तय किया जाता है, जबकि पर्क्यूटेनियस इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन को इकोकार्डियोग्राफी द्वारा निर्देशित बाएं वेंट्रिकल में प्रशासित किया जाता है। चूहों को एनेस्थेटाइज किया गया और आइसोफ्लुरेन (1.5% -2%) के साँस द्वारा बनाए रखा गया। माउस के ऊपरी पेट और छाती पर बालों को हटा दें। ट्रांसथोरेसिक इकोकार्डियोग्राफी मार्गदर्शन के तहत, माइक्रोसिरिंज की नोक को xiphoid प्रक्रिया (A) (तीर) के नीचे डालें और माउस की श्वसन दर को समायोजित करने के लिए डायाफ्राम (B) के ऊपरी किनारे के साथ इसे (तीर) स्थानांतरित करें। इंस्पिरेटरी चरण में पेरिकार्डियल दीवार (सी) के खिलाफ सुई की नोक दबाएं। (D, E) सुई की नोक समाप्ति चरण में पेरिकार्डियल गुहा में प्रवेश करती है और अंत में कोशिकाओं को इंजेक्ट करने के लिए बाएं वेंट्रिकुलर पूर्ववर्ती दीवार (एफ) में प्रवेश करती है। इस आंकड़े को17 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्तरूप: एलवी = बाएं वेंट्रिकल; एओ = आरोही महाधमनी; आरएल = दाहिना फेफड़ा; एलएल = बायां फेफड़ा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रत्येक समूह में चूहों में हृदय समारोह का मूल्यांकन। (ए) मायोकार्डियल रोधगलन (प्री-एस) को प्रेरित करने से पहले और उपचार के 4 सप्ताह बाद (पोस्ट-एस) बाएं वेंट्रिकुलर फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग करें। इजेक्शन अंश (बी) और अंश छोटा (सी) को पूर्ण मूल्यों के रूप में व्यक्त किया जाता है। डेटा को एसई ± औसत के रूप में व्यक्त किया जाता है, प्रति समूह 8। इन्फ्रैक्ट आकार, कोलेजन की मात्रा और बाएं वेंट्रिकुलर आकृति विज्ञान का आकलन करें। सीरियस लाल/तेज हरे रंग के धुंधलापन (डी), इन्फ्रैक्ट आकार (ई), बाएं वेंट्रिकुलर पूर्ववर्ती दीवार मोटाई (एफ), और कोलेजन वॉल्यूम अंश (जी) के माध्यम से मापा गया था। डेटा एसई ±, प्रति समूह 8 चूहों को दिखाता है। स्केल बार = 1 मिमी। विचरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण और डन का एकाधिक तुलना परीक्षण। * पी < 0.01; * * पी < 0.001; * * * पी < 0.0001. इस आंकड़े को17 से संशोधित किया गया था। संक्षिप्तरूप: पूर्व-एस = प्रीसर्जरी; पोस्ट-एस = पोस्ट सर्जरी; एमआई = मायोकार्डियल रोधगलन; एसडी = एकल खुराक; एमडी = एकाधिक खुराक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: प्रत्येक समूह में चूहों के दिल का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन। (ए) एचआईपीएस-सीएम के साथ इंजेक्शन वाले हृदय चूहों के सीरियल वर्गों को एचसीटीएनटी, α-सरकोमेरिक एक्टिन (एसएसए), और डीएपीआई के लिए दाग दिया गया था। प्रतिरोपित कोशिकाओं की संख्या (बी) और प्रतिशत (सी) का उपयोग परिमाणीकरण के लिए किया गया था। आईबी 4 की उपस्थिति के लिए एमआई प्रेरण के 4 सप्ताह बाद शाम-संचालित, एमआई, एसडी और एमडी-उपचारित माउस दिलों के सीरियल सेक्शन का त्याग किया गया था। (D, E) केशिकाओं को इन्फ्रैक्ट के आसपास प्रत्येक उच्च शक्ति वाले क्षेत्र क्षेत्र में आईबी 4-पॉजिटिव संवहनी संरचनाओं की संख्या के रूप में निर्धारित किया जाता है। कार्डियोमायोसाइट्स को मायोकार्डियल रोधगलन के सीमांत क्षेत्र में डब्ल्यूजीए और बीएसए के साथ दाग दिया गया था, और नाभिक को डीएपीआई के साथ लेबल किया गया था। (F, G) कार्डियोमायोसाइट्स के क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र को मापा जाता है और एक पूर्ण मूल्य के रूप में प्रदर्शित किया जाता है। मायोकार्डियल रोधगलन के सीमांत वर्गों को एपोप्टोटिक कार्डियोमायोसाइट्स (लाल, ट्यूनल) और कार्डियक ट्रोपोनिन टी (हरा, सीटीएनटी) व्यक्त करने वाले सामान्य कार्डियोमायोसाइट्स दिखाने के लिए ट्यूनल के साथ दाग दिया गया था। (एच, आई) कुल कोशिकाओं के लिए ट्यूनल-पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुपात की गणना की गई थी। स्केल सलाखों = 500 μm (A), 20 μm (D, H), या 10 μm (F)। विचरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण और डन का एकाधिक तुलना परीक्षण। * पी < 0.05; * पी < 0.01; * * पी < 0.001; * * * पी < 0.0001. इस आंकड़े को17 से संशोधित किया गया था। संक्षेप: एचसीटीएनटी = मानव कार्डियक ट्रोपोनिन टी; एसए = α-सरकोमेरिक एक्टिन; डब्ल्यूजीए = गेहूं के रोगाणु एग्लूटीनिन; DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल; ट्यूनल = टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लिओटिडिल ट्रांसफेरेज़ डीयूटीपी निक एंड लेबलिंग; एमआई = मायोकार्डियल रोधगलन; एसडी = एकल खुराक; एमडी = एकाधिक खुराक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्रत्येक समूह में माउस अंगों में मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए का पता लगाना। यह आंकड़ा सेल प्रत्यारोपण पीसीआर के 1 महीने बाद प्रत्येक समूह में माउस दिल और अन्य अंगों में मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए का पता लगाता है। मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के पीसीआर को शाम (एन = 3) और एमआई समूह (एन = 3) में चूहों के दिल और अन्य अंगों में प्रत्यारोपित कोशिकाएं (ए, बी) नहीं मिलीं। मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के पीसीआर ने एसडी (एन = 3) और एमडी समूह (एन = 3) में चूहों के दिल में प्रत्यारोपित कोशिकाओं को पाया, लेकिन फेफड़े, यकृत, गुर्दे, मस्तिष्क और प्लीहा (सी, डी) सहित अन्य अंगों में नहीं। मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के क्यूपीसीआर मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला है कि एमडी समूह का मानव माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए एसडी समूह (ई) से लगभग आठ गुना था। (+) आईपीएससी-सीएम सकारात्मक नियंत्रण को इंगित करता है। (−) डीईपीसी जल नकारात्मक नियंत्रण को इंगित करता है। संक्षेप: एनएस = महत्वपूर्ण नहीं; एमआई = मायोकार्डियल रोधगलन; एसडी = एकल खुराक; एमडी = एकाधिक खुराक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन के महत्वपूर्ण चरणों में एचआईपीएस संस्कृति, कार्डियोमायोसाइट्स भेदभाव, एचआईपीएस-सीएम शुद्धिकरण, और माउस मायोकार्डियल रोधगलन साइट में एचआईपीएससी-सीएम प्रत्यारोपण शामिल हैं। कुंजी कार्डियक अल्ट्रासाउंड का उपयोग करना है ताकि रोधगलन के किनारे पर इन्फ्रैक्ट साइट की ओर उपचार को ट्रांसक्यूटेनियस रूप से निर्देशित किया जा सके, जहां एचआईपीएससी-सीएम को क्षेत्र में इंजेक्ट किया गया था।

संस्कृति समय की लंबाई के साथ, HIPSC-CM फेनोटाइप आकृति विज्ञान (बड़े सेल आकार), संरचना (मांसपेशी, फाइब्रिल घनत्व, व्यवस्था, सूक्ष्म कोशिका समूहों), और शरीर विज्ञान (कैल्शियम उपचार और β-एड्रीनर्जिक प्रतिक्रिया) में समय के साथ भेदभाव के साथ बदलता है। इस अध्ययन में, रूपात्मक और संरचनात्मक परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए कार्डियोमायोसाइट्स में एचआईपीएससी भेदभाव के 10वें और 60वें दिनों में फ्लोरेसेंस लेबलिंग की गई थी। 10 वें दिन की तुलना में 60वें दिन एचआईपीएससी-सीएम में सेल आकार और सार्कोमेरे की लंबाई में काफी वृद्धि हुई थी। अध्ययन में एचआईपीएससी-सीएम का उपयोग किया गया जो प्रत्यारोपण के लिए कार्डियोमायोसाइट्स में भेदभाव के 60 दिनों के बाद अपेक्षाकृत स्थिर थे। इसके अलावा, एचआईपीएससी-सीएम की संस्कृति के 60 दिनों के दौरान, कार्डियोमायोसाइट्स को शुद्ध करने और प्रत्यारोपित कोशिकाओं में नॉनकार्डियोमायोसाइट्स के कारण होने वाले दुष्प्रभावों से बचने के लिए कार्डियोमायोसाइट्स सामग्री को बढ़ाने के लिए लैक्टिक एसिड युक्त ग्लूकोज-मुक्त संस्कृति माध्यम के कई प्रतिस्थापन किए गए थे।

एक अल्ट्रासाउंड जांच को पहली बार माउस के ऊपरी पेट पर अल्ट्रासाउंड-निर्देशित सेल इंजेक्शन के दौरान रखा गया था ताकि इसके जिगर की कल्पना की जा सके। माइक्रोइंजेक्टर सुई ने एक्सिफॉइड प्रक्रिया के तहत तिरछा रूप से प्रवेश किया, यकृत से बचा और अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन के तहत पेरिकार्डियम में प्रवेश किया। इस अध्ययन में, पेरिकार्डियम को छाती की दीवार की आंतरिक हड्डियों से लंबवत रूप से मूल्यांकन नहीं किया गया था क्योंकि मायोकार्डियम में रोधगलन क्षेत्र की ओर यह मार्ग काफी छोटा है, जिससे कार्डियक पंचर और सेल प्रत्यारोपण विफलता का उच्च जोखिम होता है। हालांकि, मायोकार्डियम की ओर xiphoid प्रक्रिया से पेरिकार्डियम तक अप्रत्यक्ष रूप से पहुंचने से कार्डियक पंचर का खतरा कम होता है। अल्ट्रासाउंड-निर्देशित सेल इंजेक्शन के दौरान, चूहों को पंचर के दौरान श्वसन दर को विनियमित करने के लिए इंजेक्शन दिया गया था। चूहों की श्वसन दर को विनियमित करना और साँस लेना और समाप्ति के समय को लम्बा करना समाप्ति के दौरान पंचर के लिए अनुकूल है, जो फेफड़ों को नुकसान पहुंचाने से भी बचाता है। इस प्रयोग के दौरान, सेल इंजेक्शन के बाद दिल के टूटने और फेफड़ों की चोट से किसी भी चूहे की मृत्यु नहीं हुई।

प्रत्यारोपित कोशिकाओं की स्थिरता के लिए, अध्ययन ने एचआईपीएससी-सीएम इंजेक्शन के समय बिंदु और इंजेक्शन की संख्या पर विचार किया। एमआई के प्रारंभिक चरण में, इन्फेक्टेड क्षेत्र23 में गंभीर सूजन हुई। इन्फ्रैक्ट साइट पर भड़काऊ प्रतिक्रिया का प्रारंभिक दमन मायोकार्डियल रीमॉडेलिंग में सुधार कर सकता है और प्रयोगात्मक विषय 24 के लिए घातक संभावनाओं को सीमित करसकता है। इसके अलावा, एक गंभीर भड़काऊ प्रतिक्रिया प्रत्यारोपित कोशिका मृत्यु का एक कारण है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इन्फ्रैक्ट साइट में ईएस सेल-विभेदित कार्डियोमायोसाइट्स का प्रत्यारोपण मायोकार्डियल रोधगलन साइट25 पर भड़काऊ प्रतिक्रिया को रोक सकता है।

माउस एमआई मॉडल स्थापित होने के बाद, एचआईपीएससी-सीएम को प्रत्यक्ष दृष्टि के तहत इन्फ्रैक्ट साइट और इन्फ्रैक्टेड मार्जिनल ज़ोन में इंजेक्ट किया गया था; एचआईपीएससी-सीएम का केवल दसवां हिस्सा बच गया। हालांकि, अध्ययन से पता चलता है कि शुरू में प्रत्यारोपित एचआईपीएससी-सीएम चूहों में मायोकार्डियल इन्फ्रैक्टेड साइट पर माइक्रोएन्वायरमेंट में सुधार कर सकते हैं और पुन: प्रत्यारोपित कोशिकाओं की जीवित रहने की दर में सुधार कर सकते हैं। परिणामों से पता चला कि तीन HIPSC-CM इंजेक्शन के बाद जीवित रहने वाली कोशिकाओं की संख्या एकल HIPSC-CM इंजेक्शन (चित्रा 3C) की तुलना में 10 गुना थी। अल्ट्रासाउंड से पता चला कि एमडी और एसडी समूहों में बाएं वेंट्रिकल की पूर्ववर्ती दीवार मोटाई पहले और दूसरे सप्ताह की तुलना में एमआई मॉडल स्थापित होने के बाद तीसरे और चौथे सप्ताह में बहुत पतली थी। इस प्रकार, एमडी समूह में चूहों को एमआई मॉडल स्थापित होने के तुरंत बाद कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया गया था, और फिर कार्डियक टूटने के कारण मृत्यु से बचने के लिए रोधगलन के एक और दो सप्ताह बाद।

इस अध्ययन से पता चलता है कि एसडी समूह की तुलना में एमडी समूह में ग्राफ्टेड कोशिकाओं की संख्या काफी अधिक है। माउस के इकोकार्डियोग्राफी से पता चला कि एमडी समूह के ईएफ और एसएफ मान एसडी समूह की तुलना में अधिक थे। हृदय समारोह में सुधार के लिए प्रत्यारोपित एचआईपीएससी-सीएम के पैराक्रिन फ़ंक्शन को प्रत्यारोपित कार्डियोमायोसाइट्स के साथ भी माना जाना चाहिए। इवानागा एट अल .26 के एक अध्ययन में बताया गया है कि एचआईपीएससी-सीएम द्वारा स्रावित पैराक्रिन कारक एकेटी 1 को सक्रिय करके एंजियोजेनेसिस को बढ़ावा दे सकते हैं। अध्ययन में एमआई समूह में सीमांत इन्फ्रैक्ट क्षेत्र में बहुत कम आइसोलेक्टिन बी 4-पॉजिटिव कोशिकाएं पाई गईं। इसके विपरीत, एमआई समूह की तुलना में एसडी और एमडी समूहों में अधिक आइसोलेक्टिन बी 4-पॉजिटिव कोशिकाएं थीं; विशेष रूप से, एमडी समूह के पास सबसे अधिक था। इस प्रकार, इन परिणामों से पता चलता है कि जितना अधिक ग्राफ्टेड एचआईपीएससी-सीएम होंगे, साइट पर नई रक्त वाहिकाएं उतनी ही मजबूत होंगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन की प्रमुख अनुसंधान योजना (संख्या 91539111 से जेवाई), हुनान प्रांत के विज्ञान और प्रौद्योगिकी की प्रमुख परियोजना (संख्या 2020एसके 53420 से जेवाई) और हुनान प्रांत के विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार कार्यक्रम (2021आरसी 2106 से सीएफ) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody
Cardiac troponin T Abcam ab8295
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150105
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) Abcam ab150110
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150073
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) Abcam ab150062
Human cardiac troponin T Abcam ab91605
Isolectin B4 Vector FL-1201
Sarcomeric alpha actinin Abcam ab9465
Wheat germ agglutinin Thermo Fisher Scientific W11261
Reagent
Accutase Thermo Fisher Scientific 00-4555-56
B27 Supplement(minus insulin) Thermo Fisher Scientific A1895601
B27 Supplement(serum free) Thermo Fisher Scientific 17–504-044
Bouin's solution Thermo Fisher Scientific SDHT10132
CHIR99021 Selleck CT99021
cyclosporin A Medchemexpress HY-B0579
DIRECT RED Sigma-Aldrich 365548-25G
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320033
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
FAST GREEN FCF Sigma-Aldrich  F7252-5G
Glucose-free RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11879020
IWR1 Selleck S7086
lactic acid Sigma-Aldrich L6661
Matrigel BD Biosciences BD356234
mTeSR1 Stem Cell Technologies 72562
O.C.T. Compound SAKURA 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PowerUP SYBR Green MasterMix kit Thermo Fisher Scientific A25742
RPMI1640 Thermo Fisher Scientific 11875119
STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff Stem Cell Technologies 5030
STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium Stem Cell Technologies 5027
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
ultrasound coupling agent CARENT 22396269389
Y-27632 Selleck S6390
Equipment and Supplies
Applied Biosystems Thermo Fisher Scientific 7500 Real-Time PCR
cryostat Leica CM1950
fluoresence microscope Olympus IX83
fine anatomical scissors Fine Science Tools 15000-08
fine dissecting forceps Fine Science Tools 11255-20
Micro syringe Hamilton 7633
Small animal anesthesia machine MATRX VMR
Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system VisualSonics Vevo 2100
Software
Statistical Product and Service Solutions IBM 21
Image J NIH 1.48
Human mitochondrial DNA primers
the forward primer sequence CCGCTACCATAATCATCGCTAT
the reverse primer sequence TGCTAATACAATGCCAGTCAGG

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References

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चिकित्सा अंक 181 सेल थेरेपी इकोकार्डियोग्राफी निर्देशित इंट्रामायोकार्डियल इंजेक्शन प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल
मायोकार्डियल इन्फ्रैक्टेड चूहों में अल्ट्रासाउंड-निर्देशित प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स प्रत्यारोपण
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Wu, X., Qin, K., Wang, D., Xiang, K., Peng, J., Guo, J., Yang, J., Fan, C. Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice. J. Vis. Exp. (181), e63647, doi:10.3791/63647 (2022).

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