Summary
Farelerde miyokard enfarktüsü bölgesi etrafında ultrason rehberliğinde hücre dağıtımı, hücre nakli için güvenli, etkili ve uygun bir yoldur.
Abstract
Miyokard enfarktüsü (MI) sonrası hücre tedavisinin temel amacı, hücre aşılama hızını etkili bir şekilde arttırmaktır ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), iskemik hasar sonrası kardiyak onarım için umut verici bir hücre kaynağıdır. Ancak düşük greft oranı, transplantasyon sonrası etkili kalp dokusu rejenerasyonu için önemli bir engeldir. Bu protokol, bir MI bölgesine çoklu hiPSC-CM ultrason rehberliğinde perkütan enjeksiyonların hücre transplantasyon oranlarını etkili bir şekilde artırdığını göstermektedir. Çalışma ayrıca tüm hiPSC-CM kültür sürecini, ön tedaviyi ve ultrason rehberliğinde perkütan dağıtım yöntemlerini tanımlamaktadır. Ek olarak, insan mitokondriyal DNA'sının kullanımı, diğer fare organlarında hiPSC-CM'lerin yokluğunu tespit etmeye yardımcı olur. Son olarak, bu yazıda hücre doğumundan 4 hafta sonra farelerde enfarktüslü sınır bölgesinde kardiyak fonksiyon, anjiyogenez, hücre büyüklüğü ve apoptozdaki değişiklikler açıklanmaktadır. Sol ventrikül miyokardının ekokardiyografi eşliğinde perkütan enjeksiyonunun uygulanabilir, nispeten invaziv, tatmin edici, tekrarlanabilir ve etkili bir hücresel tedavi olduğu sonucuna varılabilir.
Introduction
Akut MI meydana geldiğinde, enfarktüslü bölgedeki miyokard hücreleri iskemi ve hipoksi nedeniyle hızla ölür. Hücre ölümü ve rüptüründen sonra çeşitli enflamatuar faktörler salınırken, enflamatuar hücreler inflamasyona neden olmak için enfarktüs bölgesine sızar1. Önemli ölçüde, fibroblastlar ve kollajen, hem kontraktilitesi hem de elektriksel iletkenliği olmadan, enfarktüs bölgesindeki miyokard hücrelerini skar dokusu oluşturmak için değiştirir. Yetişkin memelilerde kardiyomiyositlerin sınırlı rejenerasyon kapasitesi nedeniyle, geniş bir enfarktüs alanından sonra oluşan canlı doku, yeterli kalp debisini korumak için genellikle yeterli değildir2. MI kalp yetmezliğine neden olur ve ciddi kalp yetmezliği vakalarında, hastalar normal kalp fonksiyonlarını korumak için sadece kalp nakillerine veya ventriküler destek cihazlarına güvenebilirler 3,4.
MI'den sonra ideal tedavi stratejisi, ölü kardiyomiyositlerin yeni oluşan kardiyomiyositlerle değiştirilmesi ve sağlıklı dokularla elektromekanik eşleşmenin oluşturulmasıdır. Bununla birlikte, tedavi seçenekleri tipik olarak replasman yerine miyokard kurtarmayı benimsemiştir. Günümüzde, kök hücre ve progenitör hücre bazlı tedaviler, MI5'ten sonra miyokard onarımını teşvik etmek için en umut verici stratejiler arasındadır. Bununla birlikte, bu hücrelerin transplantasyonunun, yetişkin kök hücrelerin kardiyomiyositlere farklılaşamaması ve kısa ömürleri6 olmak üzere çeşitli sorunları vardır.
Embriyonik kök (ES) hücrelerin kullanımı ile ilgili etik sorunlar, umut verici bir hücre kaynağı olan iPSC'ler tarafından atlatılabilir. Ek olarak, iPSC'ler güçlü kendini yenileme yeteneklerine sahiptir ve kardiyomiyositlere farklılaşabilir7. Çalışmalar, MI bölgesine nakledilen hiPSC-CM'lerin hayatta kalabildiğini ve konakçı hücrelerle boşluk kavşakları oluşturabildiğini göstermiştir8,9. Bununla birlikte, nakledilen bu hücreler iskemi ve inflamasyonun mikro ortamında bulunduğundan, hayatta kalma oranları son derece düşüktür10,11.
Nakledilen hücrelerin hayatta kalma oranını artırmak için, nakledilen hücrelerin hipoksi ve ısı şoku ön tedavisi12,13, genetik modifikasyon 14,15 ve hücrelerin ve kılcal damarların eşzamanlı nakli 16 gibi çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Ne yazık ki, çoğu yöntem karmaşıklık ve yüksek maliyet ile sınırlıdır. Bu nedenle, bu çalışma tekrarlanabilir, uygun, nispeten invaziv ve etkili bir hiPSC-CM dağıtım yöntemi önermektedir.
Ultrason rehberliğinde intramiyokardiyal hücre enjeksiyonu, bölgeden bağımsız olarak sadece yüksek çözünürlüklü küçük bir veteriner ultrason makinesi ve bir mikroenjektör ile gerçekleştirilebilir. Ultrason rehberliğinde, farelerde perikarddan miyokarda ksifoid süreç altındaki hücreleri doğrudan teslim etmek, karaciğer ve akciğer hasarını önleyen güvenli bir protokoldür. Bu yöntem, nakledilen hücrelerin hayatta kalma oranını önemli ölçüde artırmak için diğer teknolojilerle aynı anda birleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri, Central South Üniversitesi İkinci Xiangya Hastanesi etik komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız. Hücre enjeksiyonu, görüntüleme ve ötenazi için zaman çizelgeleri aşağıdaki gibidir: t0- enfarktüsü indüklemek, t1 hafta- görüntü ve implant hücreleri, t2 hafta- görüntü ve implant hücreleri, t4 hafta- son görüntüleme, ötenazi ve doku toplama.
1. hiPSC kültürü, kardiyomiyosit farklılaşması ve hücre saflaştırması
- DMEM/F12 ve bazal membran matris stok solüsyonunu 4 °C'de buzla 1,5:1 oranında alikot ile karıştırın ve elde edilen karışımı (matris seyreltici) -20 °C'de saklayın. 25 mL DMEM/F12 kültür ortamını 4 °C'de ve 1 mL matris seyrelticiyi buzla iyice karıştırın ve 6 delikli bir plakada 1 mL/kuyucuk yayın. Plakayı 37 ° C'de bir inkübatörde 1 saat dik tutun ve DMEM / F12 süpernatantını kuyucuklardan aspire edin. İşlemi gerçekleştirirken 6 delikli plakanın tabanına dokunmayın.
- HiPSC'leri içeren kriyoprezervasyon tüpünü sıvı azottan çıkarın ve 37 °C'lik bir su banyosunda hızla çözün. Kriyoprezervasyon tüpünün dış yüzeyini %75 alkol ile sterilize edin, alkolü silin ve tüpü steril ultra temiz bir masaya aktarın.
- HiPSC'ler içeren kriyoprezervasyon solüsyonunu nazikçe 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın, 5 mL besleyicisiz ES ortamı ekleyin ve süspansiyonu oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin. Süpernatantı atın ve besleyicisiz ES ortamının 6 mL'sindeki hücreleri yavaşça askıya alın. Hücreleri sayın ve hücre konsantrasyonunu kültür ortamı ile 5 × 105 hücre / mL'ye ayarlayın.
- HiPSC'lere 5 μM'lik son konsantrasyona kadar ROCK inhibitörü (Y27632) ekleyin. Y27632 ile hiPSC'leri bazal membran matrisi ile önceden işlenmiş 6 delikli plakaya aktarın ve hiPSC'leri eşit olarak dağıtmak için "8" sayısının şeklini izleyerek 6 delikli plakayı yavaşça döndürün. HiPSC'leri 37 °C, %5 CO2 içeren nemli bir inkübatöre 24 saat boyunca dik konumda yerleştirin. Supernatant'ı Y27632 olmadan besleyicisiz ES ortamıyla değiştirin.
- HiPSC'ler %80 birleşme derecesine ulaştığında, kültür süpernatanını aspire edin, hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın, 10 μM CHIR99021 (GSK3-β inhibitörü) içeren insülinsiz RPMI1640 + B27 ekleyin ve hiPSC'leri 24 saat boyunca 37 ° C'de nemli bir CO2 inkübatörüne yerleştirin.
- Süpernatantın yarısını insülin olmadan RPMI1640 + B27 ortamı ile değiştirin ve hücreleri 24 saat daha inkübe edin.
- Kültür ortamını RPMI1640 + B27 (insülin olmadan) ile tamamen değiştirin. Plakaları 37 ° C'de nemli bir inkübatöre% 5 CO2 ile 24 saat boyunca dik konumda yerleştirin.
- 3 gün sonra kültür ortamını tamamen insülinsiz RPMI1640 + B27 + 5 μM IWR1 (Wnt sinyal yolu inhibitörü) ile değiştirin ve plakaları 48 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemli bir inkübatöre yerleştirin.
- 5 gün sonra kültür ortamını insülin içermeyen RPMI1640 + B27 ile değiştirin ve 37 ° C'de nemli bir CO2 inkübatörde 48 saat inkübe etmeye devam edin.
- Kültür ortamını 7 gün sonra RPMI + B27 (insülin dahil) ortamı ile değiştirin ve plakaları 37 ° C'de 3 gün boyunca nemlendirilmiş bir CO2 inkübatörüne yerleştirin. Ortamı her 3 günde bir RPMI + B27 ortamıyla değiştirin. 9-12 günlük farklılaşmada hücrelerin kendiliğinden atımını arayın.
- Titreşen hücreleri gözlemledikten sonra, RPMI + B27 ortamını laktik asit içeren glikozsuz RPMI 1640 ortamı ile değiştirin (500 mL glikozsuz RPMI 1640 ortamına 1 mL laktik asit eklendi). Hücreleri nemli bir inkübatörde 72 saat boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
- 72 saat sonra, süpernatantı RPMI + B27 ortamı ile değiştirin ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemli bir inkübatörde 48 saat inkübe edin.
- Kültür süpernatantını negatif basınç altında aspire edin ve kültür ortamının izlerini gidermek için hücreleri PBS ile 3 kat yıkayın. HiPSC-CM'leri 37 ° C'de tek tek hücrelere ayırmak için hücre ayrılma enzim karışımını kullanın. Elde edilen hücreleri 3 mL kardiyomiyosit destek çözeltisi içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
- Hücreleri RPMI + B27 ortamı ile yeniden askıya alın, bazal membran matris kaplı 6 delikli plakalara tohumlayın ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemli bir inkübatörde 48 saat boyunca inkübe edin.
- Saflaştırma için kültür süpernatantını laktik asit içeren glikozsuz RPMI 1640 ortamı ile değiştirin ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemli bir inkübatörde 72 saat boyunca inkübe edin.
- Kültür süpernatantını RPMI + B27 ortamı ile değiştirin ve ortamı her 3 günde bir değiştirin.
- Yukarıdaki işleme 30 gün boyunca devam edin, kültür süpernatantını daha fazla saflaştırma için laktik asit içeren glikozsuz ortam ile değiştirin. Hücreleri bu ortamla 3 gün boyunca inkübe edin ve süpernatantı RPMI + B27 ile değiştirin. HiPSC-CM'ler kararlı bir şekilde atana kadar hücreleri 30 gün boyunca sürekli olarak kültürleyin ve bu hücreleri farelerde intramiyokard enjeksiyonu için kullanın.
2. HiPSC-CM'lerin hazırlanması ve fare akut miyokard enfarktüsü modelinin oluşturulması
- 60 gün boyunca kültürlenmiş hiPSC-CM'lerden kültür süpernatantını vakumla aspire edin, hücreleri PBS ile 3 kat yıkayın ve hiPSC-CM'leri hücre ayrılma enzim karışımı (~ 3-5 dakika) ile 37 ° C'de bireysel hücrelere ayırın. Hücreleri 5 mL RPMI + B27 ortamı içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve toplam hücre sayısını hesaplamak için hücreleri saymadan önce iyice karıştırın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin. Süpernatantı atın ve 0.6 × 105 hücre / μL'lik bir konsantrasyona yeniden askıya almak için kardiyomiyosit destek ortamı ekleyin.
- Yeniden askıya alınmış hiPSC-CM'leri içeren santrifüj tüpünü 14,17,18,19,20 enjeksiyonu için 37 °C'de hazır tutun.
- Anestezik inhalasyonu indüklemek için fareleri izofluran ile bağlantılı bir anestezi kutusuna yerleştirin ve ardından anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner merhem kullanın.
NOT: İzofluran konsantrasyonu %5 idi. Deney sırasında laboratuvar havalandırmasına dikkat edin. - Fare ameliyat masasına düz bir şekilde yatırıldığında sıkıştıktan sonra ayak ve kuyruk bölgesinde refleks kaybı olup olmadığına bakın, bu da yeterli anesteziyi gösterir. Buprenorfin (0.1 mg/kg) intraperitoneal olarak uygulanır.
- Boynun ortasındaki ve farelerin sol göğsündeki saçları tüy dökücü bir kremle sürün ve uygulanan kremi ve saçları 5 dakika sonra gazlı bezle silin.
- Uzuvları ve fare kuyruğunu bantla sabitleyin. Fare kesici dişlerini 2-0 ipek iplik ve bantla sabitleyin. Cerrahi bölgeyi (medyan boyun ve sol göğüs) üç alternatif betadin turu ve ardından alkol ile sterilize edin.
- Sterilize edilmiş cerrahi alanın etrafına cerrahi bir örtü yerleştirin. Daha sonra, trakeayı tamamen açığa çıkarmak için ince anatomik makas ve ince diseksiyon forsepsleri kullanarak medyan boyun insizyonu yapın. Gerekirse, stabilizasyon için birkaç ön servikal kası kesin.
NOT: Operatörler hayvan gruplarına kör edildi. - Ağızdan bir trakea tüpü (20 G kateter delinme iğnesi) yerleştirin.
- Trakea tüpünü ventilatöre bağlayın ve her iki akciğerin de iyi havalandırıldığından emin olmak için torasik hareketi kontrol edin.
- Solunum parametrelerini ayarlayın (solunum hızı: 100-150 bpm, gelgit hacmi 250-300 μL). Bundan sonra, sol arka bacağı sağ alt tarafa sabitleyin, sol üst ekstremitenin etrafındaki bandı gevşetin ve maksimum kalp maruziyeti için ince diseksiyon makası ve forseps kullanarak sol toraksın 3-4 interkostal boşluğunda bir torakotomi yapın.
- Forseps kullanarak, sol atriyal apendiksin alt kenarındaki sol ön inen koroner arteri (LAD) görselleştirmek için mikroskop altında perikarddan soyun.
- LAD'nin proksimal ucunu bağlamak için 6-0'lık bir ipek iplik kullanın. Akut MI modelinin yeterince kurulduğundan emin olduktan sonra (ligasyon bölgesindeki distal LAD kırmızıdan beyaza değiştiğinde), göğüs tabakasını katman katman kapatın ve cildi 4-0 dişli aralıklı dikişlerle dikin. Ligasyon hariç sahte hayvan grubu için MI indüksiyonu için yukarıda belirtilen tüm cerrahi prosedürleri uygulayın.
- İnhalasyon anestezisini kapatın, fare kendiliğinden nefes almaya devam ettikten sonra kanülü çıkarın ve kafesine geri getirin. Sternal yatmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı izleyin. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade etmeyin. Postoperatif her 12 saatte bir intraperitoneal buprenorfin (0.1 mg/kg x 3 gün) ve karprofen (5 mg/kg x 1 gün) enjeksiyonları uygulayın.
- Nakledilen hücrelerin reddedilmesini önlemek için hiPSC-CM'leri uygulamadan 3 gün önce siklosporin A'yı (10 mg · kg-1 · gün-1) farelerin intraperitoneal boşluğuna enjekte edin. Transplantasyondan sonra 1 ay boyunca sürekli olarak siklosporin A enjekte edin.
3. ultrason rehberliğinde hiPSC-CM enjeksiyonu
- MI modelini kurduktan sonra, MI model fareleri (12 haftalık C57BL / 6 fareler; 22g ila 24g ağırlıkta,% 50 erkek ve% 50 dişi) tek dozlu (bu çalışmada SD, n = 8) ve çoklu doz (bu çalışmada MD, n = 8) gruplarına atayın ve MI'yi takip eden birinci ve ikinci haftalarda, inhalasyon anestezisinin indüksiyonu için% 5 izofluran ile bağlantılı bir anestezi kutusuna yerleştirin. trakeal entübasyon.
- Farelerin göğsündeki ve üst karnındaki kılları tüy dökücü kremle sürün ve kremayı 5 dakika sonra gazlı bezle silin. Ameliyat panosundaki farenin kalp atış hızını izleyin ve kalp atış hızı 400-500 bpm'de kalana kadar inhalasyon izofluran uygulayın.
- Fare uzuvlarını ve kuyruğunu algılama konsolundaki bantla sabitleyin ve platform sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
- Üst karın bölgesine özel bir ultrason jölesi uygulayın ve fare karaciğeri görüntüleri elde etmek için daha küçük bir yüksek çözünürlüklü veteriner ultrason probu kullanın.
- Ventilatör hızını 50 bpm'ye düşürün. ~ 3 × 105 hücre çizmek için 5 μL mikro şırınga kullanın (adım 2.1'den itibaren). Şırıngayı bir mikromanipülatörle tutarak, sol para-ksifoid işlemde 3 mm'lik bir iğne yerleştirin (Şekil 1A). Ultrason rehberliğinde diyaframın üst kenarını takip edin (Şekil 1B), solunum ritmini ve aralığını gözlemleyin (Şekil 1C, D) ve ekspiratuar siklusun sonunda karaciğer ve akciğere zarar vermeden perikarda girin (Şekil 1D).
- Mikroenjektör iğnesi perikardiyal boşluğa girdikten sonra, solunum hızını orijinal parametreye (150 bpm) ayarlayın. Fare kalbinin parasternal uzun eksenli görüntüsünü, üreticinin talimatlarına göre M-kalıp ekokardiyografisi ile elde edin17 (Şekil 1E). Ultrasonik rehberlik altında, enfarktüs bölgesinin üç marjinal alanına (enjekte edilen bölge başına 1 × 10 5 hücre) 3 ×10 5 hücre (Şekil 1F) enjekte edin.
- Özel ultrason probunu çıkarın ve jöleyi durulayın. Fareyi inhalasyon anestezisinden ayırın ve tam bilinçliliği takiben kafesine geri döndürün.
- Yukarıdaki ultrason rehberliğinde hücre enjeksiyon prosedürlerini, MD grubu fareler için MI oluşturduktan 1 ve 2 hafta sonra tekrarlayın.
4. Sol ön inen dal ligasyonundan 30 gün sonra farelerde kalp fonksiyonu, floresan etiketleme, nakledilen hücre sayısı, miyokard enfarktüsü alanı ve organ insan mitokondri tespitinin değerlendirilmesi
- Kalp fonksiyon değerlendirmesi
- İndüksiyon-inhalasyon anestezisi için fareyi izofluran bağlantılı bir anestezi kutusuna yerleştirin ve ardından anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlerde veteriner merhemi kullanın. Farenin sol göğsündeki tüyleri tüy dökücü kremle çıkarın. Kalp atış hızını izlemek ve izofluran inhalasyonunu ayarlamak için fareyi işletim panelinin üzerine yerleştirin. Fare kalp atış hızını 400-500 bpm'de tutun. Deneysel sonlanım noktası 30. gündür (MI indüksiyonundan sonra).
- Fare uzuvlarını ve kuyruğunu algılama konsolundaki bantla sabitleyin ve platform sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın.
- Ön kalp bölgesine özel bir ultrason jeli uyguladıktan sonra, üreticinin talimatlarına göre M-kalıp ve B-kalıbın ekokardiyografisi altında parasternal uzun eksenli ve iki boyutlu kısa eksenli görüntüler elde etmek için (veteriner) yüksek çözünürlüklü bir kardiyak ultrason probu kullanın17.
- Ultrasonik algılama tamamlandıktan sonra, özel ultrasonik jeli durulayın, inhalasyon anestezisini kapatın ve fareyi tam bilinçliliği takiben ayrı ayrı kafesine geri getirin.
- Elde edilen verileri analiz edin ve analiz yazılımını kullanarak sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonunu (EF) ve fraksiyonel kısalmayı (FS) hesaplayın. Operatörün deney gruplarına kör olmasını sağlamak17.
- Bölümlerin floresan etiketlemesi
- İzole kalbi PBS ile yıkayın, 12 saat boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehit içine batırın. Kalbi çıkarın ve dehidrate etmek için 24 saat boyunca% 30 sakkaroza batırın.
- Susuz kalmış kalbi kuru buz üzerine optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile gömün. Kalbi alttan tepeye doğru 10 μm kriyostat kalınlığında dilimleyin ve bölümleri slaytlara yerleştirin ve slaytları -20 ° C'de saklayın.
- Slaytları kalp dokusu ile PBS ile 3 dakika boyunca yıkayın.
- Slaytlardaki dokuyu oda sıcaklığında %0,5 Triton X-100 ile 8 dakika geçirgenleştirin ve yıkama başına 5 dakika boyunca PBS ile 3 kez yıkayın.
- Dokuyu %10 eşek serumu ve %90 PBS (bloke edici solüsyon) ile kapladıktan sonra, bölümleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edin.
- Blokaj çözeltisini çıkardıktan sonra, bölümleri 4 ° C'de gece boyunca birincil antikor (bloke edici çözelti ile 1:100'e seyreltilmiş) ile inkübe edin. Yıkama başına 5 dakika boyunca PBS ile 3 kez yıkayın.
- Dokuyu oda sıcaklığında 1 saat boyunca florofor konjuge ikincil antikor (bloke edici çözelti ile 1:100'e seyreltilmiş) ile slaytlar üzerinde inkübe edin.
NOT: Florofor konjuge sekonder antikoru olan dokuları bu noktadan itibaren ışığa maruz bırakmaktan kaçının. - Slaytları yıkama başına 5 dakika boyunca PBS ile 3 kez yıkayın.
- Slaytları 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren montaj ortamı kullanarak monte edin ve floresan mikroskobu altında fotoğraf çekin17.
- Nakledilen hiPSC-CM'lerin sayısı17
- Yayalara özgü troponin T (hcTnT), insan nükleer antijeni (HNA) ve spesifik olmayan Sarkomerik Alfa Aktinin için kalbin donmuş bölümlerinde doku immünofloresan boyaması yapın.
- Tüm kalp seri olarak bölümlere ayrıldıktan sonra, floresan etiketleme için her 50 bölüm için bir bölüm alın.
- Dilim başına rastgele beş yüksek büyütmeli görüntü yakalayın. Aşılanmış görüş alanı sayısını sayın, birim alan başına ortalama aşılanmış hücre sayısını hesaplayın ve bunları A1/μm2 olarak ayarlayın. ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) kullanarak dilimin toplam aşılanmış alanını hesaplayın ve B1μm2 olarak ayarlayın, böylece bu dilimdeki aşılanmış sayı = A1 × B121,22 olur.
- Her 50 bölümden bir bölümün seçildiği göz önüne alındığında, Eq (1) kullanarak fare kalbi başına toplam aşılanmış hücre sayısını ve Eq (2) kullanarak yüzde engraftman oranını hesaplayın21,22.
- Fare kalbi başına toplam aşılanmış hücre sayısı = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ An × Bn) × 50 (1)
engraftman oranı =
(2)
NOT: Teslimat sayısı SD grubu için 3 × 10 5 ve MD grubu için 3 × 3 × 105 idi.
- Miyokard enfarktüslü alanının değerlendirilmesi
- İzole kalbin kesitsel donmuş bir bölümünü (kısa eksen), tepeden kalbin tabanına kadar 10 μm kalınlığında kesin.
- Tüm kalp seri olarak bölümlere ayrıldıktan sonra, her 30 bölüm için bir bölüm slaytı alın ve 58 ° C'de önceden ısıtılmış Bouin çözeltisine sabitleyin. Bölümü, üreticinin talimatlarına göre %0,04 Doğrudan Kırmızı ve %0,1 Hızlı Yeşil kollajen lekeleriyle (PBS'de seyreltilmiş) lekeleyin17.
- Eq (3):14,17 kullanarak mikroskop altında kalbin kesitsel tüm vücut fotoğrafından sonra görüntüleri analiz etmek için yazılım (örneğin, ImageJ) kullanın
Enfarktüs alanı % =
× %100 (3)
- Çeşitli organlarda insan mitokondriyal DNA'sının tespiti
- Fareleri %5 izofluran ile uyuşturun ve posterior servikal çıkık ile kurban edin. Hücre naklinden 4 hafta sonra fareleri diseke edin. Organları (karaciğer, akciğer, beyin, böbrek, dalak) ve miyokardın bir kısmını (bu bölümde n = 3) toplayın.
- Her organ dokusunu sıvı azotta öğütün ve üreticinin talimatlarına göre referans kiti kullanarak dokudan DNA çıkarın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Yukarıda belirtilen dokularda insan mitokondriyal DNA'sını tespit etmek için referans verilen kiti ve primerleri kullanmak için üreticinin talimatlarını izleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) (adım 4.5.1'den itibaren).
(2)
× %100 (3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her gruptaki farelerin sol ventrikül fonksiyonlarının değerlendirilmesi için yapılan ekokardiyografi, MD grubunda MI yaralanmalarının etkili bir şekilde tersine çevrildiğini ortaya koymuştur (Şekil 2A). MI grubu ile karşılaştırıldığında, SD grubu artmış ejeksiyon fraksiyonu (EF) gösterdi (% 30'dan% 35'e; Şekil 2B) ve fraksiyon kısalması (FS) (%18'den %22'ye; Şekil 2C) MI'den sonra. Bununla birlikte, MD grubu farelerde hiPSC-CM'lerin çoklu enjeksiyonlarının EF'yi perkütan olarak arttırdığını (% 30'dan% 42'ye; Şekil 2B) ve FS (%18'den %28'e; Şekil 2C) MI'den sonra fare kalbinin.
Doku kesitlerinin spesifik olmayan α-aktin (αSA), DAPI, insana özgü troponin T (hcTnT) ve insan nükleer antijeninin (HNA) floresan etiketlemesi, MD grubunda nakledilen hücre sayısının SD grubundakinden anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 3A). MD grubunun SD grubundan sadece iki enjeksiyon daha fazla olmasına rağmen, MD grubundaki nakledilen hücre sayısı SD grubunun ~ 10 katıydı (Şekil 3B). Ek olarak, MD grubunda nakledilen kardiyomiyositlerin yüzdesi de SD grubundakinden anlamlı olarak daha yüksekti (Şekil 3C). Bu çalışma aynı zamanda MD grubunda nakledilen hücrelerin enfarkt bölgesinde ve marjinal enfarktüs bölgesinde dağıldığını, SD grubunda nakledilen hücrelerin ise sadece enfarkt bölgesinde dağıldığını göstermiştir (Şekil 3A).
SD tedavi grubundaki MI alanı MI grubundakinden daha küçüktü ve SD grubundaki MI alanı MD grubundakinden anlamlı olarak daha küçüktü (Şekil 2E). Ek olarak, MD grubunun sol ventrikül ön duvarının kalınlığı miyokard MI grubunun 4 katı, SD grubunda sol ventrikül ön duvarının kalınlığı MI grubunun iki katı idi (Şekil 2F). Bununla birlikte, MD grubundaki kollajen hacim fraksiyonu MI grubundakinden %50 daha düşükken, SD grubundaki kollajen hacim fraksiyonu MI grubundakinden sadece %30 daha düşüktü (Şekil 2G).
MI'den 28 gün sonra IB4 (endotel hücre belirteci) ve SM22α (düz kas hücresi belirteci) eksprese eden hücrelerin toplam sayısı, MD grubunda (Şekil 3D, E) SD veya MI grubuna kıyasla anlamlı olarak artmıştır. Bu çalışma aynı zamanda her grubun marjinal bölgesindeki kardiyomiyositlerin hipertrofi derecesini de değerlendirdi. Buğday tohumu aglutinin (WGA) ve Sarkomerik Alpha Actinin floresan boyaması, her üç grupta da bağlanmış farelerde minimum lif çapının (MFD), sahte bağlanmış farelerinkinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, MD grubunun MFD'si MI ve SD gruplarından anlamlı olarak daha küçüktü (Şekil 3F, G). Bu çalışma ayrıca kardiyomiyositlerin apoptozunu değerlendirmek için TUNEL immün boyamasını (tüm apoptotik hücrelerin çekirdeğini işaretleyebilen) kullandı. SD grubu veya MI grubu ile karşılaştırıldığında, MD grubunda TUNEL-pozitif kardiyomiyosit çekirdeklerinin prevalansı anlamlı olarak azalmıştır (Şekil 3H, I). Sahte ve MI gruplarındaki hiçbir organda insan mitokondriyal DNA'sı tespit edilmedi (Şekil 4A, B). MD ve SD grupları sadece kalpte insan mitokondriyal DNA'sını gösterdi ve başka hiçbir organda insan mitokondriyal DNA'sı tespit edilmedi (Şekil 4C, D).
Resim 1: Farelerde ultrason eşliğinde intramiyokard hücre enjeksiyonu. Fare bir ameliyat masasında uyuşturulduktan sonra, uzuvlar ve kuyruk 37 ° C'lik sabit bir sıcaklıkta bantla sabitlenirken, perkütan intramiyokardiyal enjeksiyon ekokardiyografi ile yönlendirilen sol ventriküle uygulanır. Fareler anestezi altına alındı ve izofluranın solunması ile sürdürüldü (%1.5-%2). Üst karın bölgesindeki ve farenin göğsündeki kılları çıkarın. Transtorasik ekokardiyografi rehberliğinde, mikroşırınganın ucunu ksifoid işlemin (A) (ok) altına yerleştirin ve farenin solunum hızını ayarlamak için diyaframın (B) üst kenarı boyunca hareket ettirin (ok). İğne ucunu inspiratuar fazda perikardiyal duvara (C) bastırın. (D,E) İğne ucu ekspiratuar fazda perikardiyal boşluğa girer ve son olarak hücreleri enjekte etmek için sol ventrikül ön duvarına (F) nüfuz eder. Bu rakam17'den değiştirildi. Kısaltmalar: LV = sol ventrikül; AO = yükselen aort; RL = sağ akciğer; LL = sol akciğer. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Her gruptaki farelerde kardiyak fonksiyonun değerlendirilmesi . (A) Miyokard enfarktüsünü indüklemeden önce (S öncesi) ve tedaviden 4 hafta sonra (S sonrası) sol ventrikül fonksiyonunu değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü ekokardiyografi kullanın. Ejeksiyon fraksiyonu (B) ve fraksiyon kısalması (C) mutlak değerler olarak ifade edilir. Veriler ortalama ± SE, grup başına 8 olarak ifade edilir. Enfarktüs boyutunu, kollajen hacmini ve sol ventrikül morfolojisini değerlendirin. Sirius ile kırmızı/hızlı yeşil boyama (D), enfarkt boyutu (E), sol ventrikül ön duvar kalınlığı (F) ve kollajen hacim fraksiyonu (G) ölçüldü. Veriler, ortalama ± SE, grup başına 8 fare göstermektedir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Varyansın tek yönlü analizi ve Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi. * * p < 0.01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0.0001. Bu rakam17'den değiştirildi. Kısaltmalar: pre-S = presurgery; post-S = ameliyat sonrası; MI = miyokard enfarktüsü; SD = tek doz; MD = çoklu doz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Her gruptaki farelerin kalplerinin histolojik değerlendirmesi . (A) HiPSC-CM enjekte edilen kalp farelerinin seri kesitleri hcTnT, α-sarkomerik aktin (αSA) ve DAPI için boyandı. Transplante edilen hücrelerin sayısı (B) ve yüzdesi (C) niceleme için kullanıldı. MI indüksiyonundan 4 hafta sonra feda edilen sahte operasyonlu, MI, SD ve MD ile tedavi edilen fare kalplerinden seri kesitler, IB4'ün varlığı için histokimyasal olarak boyandı. (D,E) Kılcal damarlar, enfarktüs çevresindeki her bir yüksek güç alanı alanındaki IB4-pozitif vasküler yapıların sayısı olarak ölçülür. Kardiyomiyositler miyokard enfarktüsünün marjinal bölgesinde WGA ve αSA ile boyandı ve çekirdekler DAPI ile etiketlendi. (F,G) Kardiyomiyositlerin kesit alanı ölçülür ve mutlak bir değer olarak görüntülenir. Miyokard infarktüsünün marjinal kesitleri, apoptotik kardiyomiyositleri (kırmızı, TUNEL) ve kardiyak troponin T eksprese eden normal kardiyomiyositleri (yeşil, cTnT) göstermek için TUNEL ile boyandı. (H,I) TUNEL-pozitif hücrelerin toplam hücrelere oranı hesaplandı. Ölçek çubukları = 500 μm (A), 20 μm (D,H) veya 10 μm (F). Varyansın tek yönlü analizi ve Dunn'ın çoklu karşılaştırma testi. * p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0.0001. Bu rakam17'den değiştirildi. Kısaltmalar: hcTnT = insan kardiyak troponin T; αSA = α-sarkomerik aktin; WGA = buğday tohumu aglutinin; DAPI = 4', 6-diamidino-2-fenilindol; TUNEL = terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick end etiketleme; MI = miyokard enfarktüsü; SD = tek doz; MD = çoklu doz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Her gruptaki fare organlarında insan mitokondriyal DNA'sının tespiti. Şekil, hücre nakli PCR'sinden 1 ay sonra fare kalplerinde ve her gruptaki diğer organlarda insan mitokondriyal DNA'sının saptanmasını göstermektedir. İnsan mitokondriyal DNA'sının PCR'si, sahte (n = 3) ve MI grubunda (n = 3) kalplerde ve farelerin diğer organlarında nakledilen hücreleri (A, B) bulamamıştır. İnsan mitokondriyal DNA'sının PCR'si, SD (n = 3) ve MD grubundaki (n = 3) farelerin kalplerinde nakledilen hücreler buldu, ancak akciğer, karaciğer, böbrek, beyin ve dalak (C, D) dahil olmak üzere diğer organlarda bulunmadı. İnsan mitokondriyal DNA'sının qPCR kantitatif analizi, MD grubunun insan mitokondriyal DNA'sının SD grubunun (E) yaklaşık sekiz katı olduğunu göstermiştir. (+) iPSC-CM'lerin pozitif kontrolünü gösterir. (−) DEPC su negatif kontrolünü gösterir. Kısaltmalar: n.s. = önemli değil; MI = miyokard enfarktüsü; SD = tek doz; MD = çoklu doz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmanın kritik adımları arasında hiPSC kültürü, kardiyomiyosit farklılaşması, hiPSC-CM saflaştırma ve fare miyokard enfarktüsü bölgesine hiPSC-CM transplantasyonu yer almaktadır. Anahtar, hiPSC-CM'lerin bölgeye enjekte edildiği enfarktüsün kenarındaki enfarktüs bölgesine doğru tedaviyi transkutanöz olarak yönlendirmek için kardiyak ultrason kullanmaktır.
Kültür süresinin uzamasıyla birlikte, hiPSC-CM fenotipi morfolojide (daha büyük hücre boyutu), yapıda (kas, fibril yoğunluğu, düzenleme, mikroskobik hücre kümeleri) ve fizyolojide (kalsiyum tedavisi ve β-adrenerjik yanıt) zamanla farklılaşarak değişir. Bu çalışmada, morfolojik ve yapısal değişiklikleri gözlemlemek için kardiyomiyositlere hiPSC farklılaşmasının 10. ve 60. günlerinde floresan etiketlemesi yapıldı. HiPSC-CM'lerde hücre büyüklüğü ve sarkomer uzunluğu 60. günde 10. güne göre anlamlı olarak artmıştır. Çalışma, transplantasyon için kardiyomiyositlere 60 günlük farklılaşmadan sonra nispeten stabil olan hiPSC-CM'leri kullandı. Ek olarak, hiPSC-CM'lerin 60 günlük kültürü sırasında, kardiyomiyositleri saflaştırmak ve nakledilen hücrelerde kardiyomiyosit olmayanların neden olduğu yan etkileri önlemek için kardiyomiyosit içeriğini arttırmak için laktik asit içeren glikozsuz kültür ortamının çoklu replasmanları gerçekleştirilmiştir.
Karaciğerini görselleştirmek için ultrason rehberliğinde hücre enjeksiyonu sırasında farenin üst karnına ilk önce bir ultrason probu yerleştirildi. Mikroenjektör iğnesi, ksifoid işlem altında eğik olarak girmiş, karaciğerden kaçınmış ve ultrason rehberliğinde perikarda girmiştir. Bu çalışmada, perikard, göğüs duvarının iç kemiklerinden dikey olarak değerlendirilmemiştir, çünkü miyokarddaki enfarktüs bölgesine giden bu yol önemli ölçüde kısadır ve yüksek bir kardiyak ponksiyon ve hücre nakli başarısızlığı riski oluşturmaktadır. Bununla birlikte, perikardın ksifoid süreçten miyokarda doğru eğik olarak erişmesi, daha düşük kardiyak ponksiyon riski ile oldukça uzun bir yol oluşturur. Ultrason rehberliğinde hücre enjeksiyonu sırasında, delinme sırasında solunum hızını düzenlemek için fareler entübe edildi. Farelerin solunum hızını düzenlemek ve inhalasyon ve son kullanma sürelerini uzatmak, son kullanma sırasında delinmeye elverişlidir ve bu da akciğerlere zarar vermekten kaçınır. Bu deney sırasında, hücre enjeksiyonunu takiben hiçbir fare kalp rüptürü ve akciğer hasarından ölmedi.
Nakledilen hücrelerin stabilitesi için, çalışma hiPSC-CM enjeksiyonunun zaman noktasını ve enjeksiyon sayısını dikkate aldı. MI'nin erken evresinde, enfarktüslü bölgede şiddetli inflamasyon meydana geldi23. Enfarktüs bölgesinde inflamatuar yanıtın erken baskılanması, miyokard yeniden şekillenmesini iyileştirebilir ve deney konusu için ölümcül olasılıkları sınırlayabilir24. Ek olarak, şiddetli bir enflamatuar yanıt, nakledilen hücre ölümünün bir nedenidir. Önceki çalışmalar, ES hücresi farklılaşmış kardiyomiyositlerin enfarktüs bölgesine transplantasyonunun, miyokard enfarktüsü bölgesindeki inflamatuar yanıtı inhibe edebileceğini göstermiştir25.
Fare MI modeli oluşturulduktan sonra, hiPSC-CM'ler enfarktüs bölgesine ve enfarktüslü marjinal bölgeye doğrudan görüş altında enjekte edildi; hiPSC-CM'lerin sadece onda biri hayatta kaldı. Bununla birlikte, çalışma, başlangıçta nakledilen hiPSC-CM'lerin, farelerde miyokard enfarktüs bölgesindeki mikro ortamı iyileştirebileceğini ve yeniden nakledilen hücrelerin hayatta kalma oranını artırabileceğini düşündürmektedir. Sonuçlar, üç hiPSC-CM enjeksiyonundan sonra hayatta kalan hücre sayısının, tek bir hiPSC-CM enjeksiyonunun 10 katı olduğunu göstermiştir (Şekil 3C). Ultrasonografi, MD ve SD gruplarında sol ventrikülün ön duvar kalınlığının, MI modelinin kurulmasından sonraki üçüncü ve dördüncü haftalarda birinci ve ikinci haftalara göre çok daha ince olduğunu gösterdi. Böylece, MD grubundaki farelere, MI modeli kurulduktan hemen sonra ve daha sonra kalp rüptürüne bağlı ölümü önlemek için enfarktüsten bir ve iki hafta sonra hücreler enjekte edildi.
Bu çalışma, aşılanmış hücrelerin sayısının MD grubunda SD grubundakinden anlamlı derecede daha yüksek olduğunu göstermektedir. Farenin ekokardiyografisi MD grubunun EF ve SF değerlerinin SD grubundan daha yüksek olduğunu gösterdi. Transplante edilen hiPSC-CM'lerin parakrin fonksiyonu, kalp fonksiyonunu iyileştirmek için nakledilen kardiyomiyositlerle birlikte düşünülmelidir. Iwanaga ve ark.26 tarafından yapılan bir çalışmada, hiPSC-CM'ler tarafından salgılanan parakrin faktörlerin Akt1'i aktive ederek anjiyogenezi destekleyebileceği bildirilmiştir. Çalışma, MI grubunda marjinal enfarktüs bölgesinde çok az sayıda izolektin B4-pozitif hücre buldu. Buna karşılık, SD ve MD gruplarında MI grubuna göre daha fazla izolektin B4-pozitif hücre vardı; Özellikle, MD grubu en fazlasına sahipti. Bu nedenle, bu sonuçlar aşılanmış hiPSC-CM'ler ne kadar fazla olursa, bölgedeki yeni kan damarlarının o kadar güçlü olacağını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Büyük Araştırma Planı (No. 91539111to JY), Hunan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Anahtar Projesi (No. 2020SK53420 - JY) ve Hunan Eyaleti Bilim ve Teknoloji İnovasyon Programı (2021RC2106 - CF) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Cardiac troponin T | Abcam | ab8295 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150105 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150110 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150062 | |
| Human cardiac troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Isolectin B4 | Vector | FL-1201 | |
| Sarcomeric alpha actinin | Abcam | ab9465 | |
| Wheat germ agglutinin | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| Reagent | |||
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | |
| B27 Supplement(minus insulin) | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement(serum free) | Thermo Fisher Scientific | 17–504-044 | |
| Bouin's solution | Thermo Fisher Scientific | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| cyclosporin A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| DIRECT RED | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| FAST GREEN FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| lactic acid | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356234 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix kit | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| RPMI1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff | Stem Cell Technologies | 5030 | |
| STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium | Stem Cell Technologies | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| ultrasound coupling agent | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Applied Biosystems | Thermo Fisher Scientific | 7500 Real-Time PCR | |
| cryostat | Leica | CM1950 | |
| fluoresence microscope | Olympus | IX83 | |
| fine anatomical scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro syringe | Hamilton | 7633 | |
| Small animal anesthesia machine | MATRX | VMR | |
| Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Software | |||
| Statistical Product and Service Solutions | IBM | 21 | |
| Image J | NIH | 1.48 | |
| Human mitochondrial DNA primers | |||
| the forward primer sequence | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| the reverse primer sequence | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
References
- Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
- Lázár, E., et al. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Davis, M. K., et al. State of the art: cardiac transplantation. Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).
- Mancini, D., Colombo, P. C. Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant. Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).
- Zimmermann, W. H. Translating myocardial remuscularization. Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).
- Hu, X., et al. A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization. Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).
- Kempf, H., et al. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
- Nguyen, P. K., et al. Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review. JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).
- Zimmermann, W. H. Remuscularization of the failing heart. The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).
- Hu, X., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).
- Feng, Y., et al. Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway. Stem Cells. 32 (2), Dayton, Ohio. 462-472 (2014).
- Fan, C., et al. Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Sun, X., et al. Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats. Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).
- Wu, X., et al. Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873 (2021).
- Kannappan, R., et al. Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair. Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Zhao, M., et al. Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice. Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).
- Zhao, M., et al. Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452 (2019).
- O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Rainer, P. P., et al. Cardiomyocyte-specific transforming growth factor β suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction. Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).
- Yu, Y., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 167 (2019).
- Iwanaga, K., et al. Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).
