Summary
Ultralydveiledet cellelevering rundt stedet for hjerteinfarkt hos mus er en trygg, effektiv og praktisk måte å celletransplantere på.
Abstract
Hovedmålet med celleterapi etter hjerteinfarkt (MI) er å effektivt forbedre celletransplantasjonshastigheten, og humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) er en lovende cellekilde for hjertereparasjon etter iskemisk skade. Imidlertid er en lav transplantert hastighet et betydelig hinder for effektiv regenerering av hjertevev etter transplantasjon. Denne protokollen viser at flere hiPSC-CM ultralydveiledede perkutane injeksjoner i et MI-område effektivt øker celletransplantasjonshastigheten. Studien beskriver også hele hiPSC-CM-dyrkningsprosessen, forbehandling og ultralydveiledede perkutane forløsningsmetoder. I tillegg bidrar bruken av humant mitokondrielt DNA til å oppdage fraværet av hiPSC-CM i andre museorganer. Til slutt beskriver dette papiret endringene i hjertefunksjon, angiogenese, cellestørrelse og apoptose ved infarktgrensesonen hos mus 4 uker etter cellelevering. Det kan konkluderes med at ekkokardiografiveiledet perkutan injeksjon av venstre ventrikkelmyokard er en gjennomførbar, relativt invasiv, tilfredsstillende, repeterbar og effektiv cellulær terapi.
Introduction
Når akutt MI oppstår, dør myokardceller i det infarkterte området raskt på grunn av iskemi og hypoksi. Flere betennelsesfaktorer frigjøres etter celledød og ruptur, mens betennelsesceller infiltrerer infarktstedet for å forårsake betennelse1. Det er signifikant at fibroblaster og kollagen, både uten kontraktilitet og elektrisk ledningsevne, erstatter myokardcellene i det infarkterte stedet for å danne arrvæv. På grunn av den begrensede regenereringskapasiteten til kardiomyocytter hos voksne pattedyr, er levedyktig vev dannet etter et stort infarktområde vanligvis ikke tilstrekkelig for å opprettholde tilstrekkelig hjerteutgang2. MI forårsaker hjertesvikt, og i alvorlige tilfeller av hjertesvikt kan pasienter bare stole på hjertetransplantasjoner eller ventrikkelhjelpemidler for å opprettholde normale hjertefunksjoner 3,4.
Etter MI er den ideelle behandlingsstrategien å erstatte de døde kardiomyocyttene med nydannede kardiomyocytter, og danne elektromekanisk kobling med sunt vev. Imidlertid har behandlingstilbud vanligvis vedtatt myokardberging i stedet for erstatning. For tiden er stamcelle- og stamcellebaserte terapier blant de mest lovende strategiene for å fremme myokardreparasjon etter MI5. Imidlertid har transplantasjonen av disse cellene flere problemer, først og fremst manglende evne til voksne stamceller til å differensiere til kardiomyocytter og deres korte levetid6.
De etiske problemene knyttet til bruk av embryonale stammeceller (ES) kan omgås av iPSCs, som er en lovende kilde til celler. I tillegg har iPSCs sterke selvfornyelsesevner og kan differensiere til kardiomyocytter7. Studier har vist at hiPSC-CMs transplantert inn i MI-området kan overleve og danne gapkryss med vertsceller 8,9. Men fordi disse transplanterte cellene befinner seg i mikromiljøet av iskemi og betennelse, er deres overlevelsesrate ekstremt lav10,11.
Flere metoder er etablert for å forbedre overlevelsesraten til transplanterte celler, for eksempel hypoksi og varmesjokkforbehandling av transplanterte celler12,13, genetisk modifikasjon 14,15 og samtidig transplantasjon av celler og kapillærer 16. Dessverre er de fleste metoder begrenset av kompleksitet og høye kostnader. Derfor foreslår denne studien en reproduserbar, praktisk, relativt invasiv og effektiv hiPSC-CM leveringsmetode.
Ultralydveiledet intramyokardcelleinjeksjon kan utføres med bare en høyoppløselig liten veterinær ultralydmaskin og en mikroinjektor, uavhengig av stedet. Under ultralydveiledning er direkte levering av celler under xiphoidprosessen fra perikardiet til myokardiet hos mus en sikker protokoll som unngår lever- og lungeskader. Denne metoden kan kombineres samtidig med andre teknologier for å forbedre overlevelsesgraden av transplanterte celler betydelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk i denne studien ble gjennomgått og godkjent av etikkomiteen ved Second Xiangya Hospital of Central South University. Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer og utstyr som brukes i denne protokollen. Tidslinjene for celleinjeksjon, bildediagnostikk og euthansi er som følger: t0- indusere infarkt, t1 uke- bilde- og implantatceller, t2 uker- bilde- og implantatceller, t4 uker- endelig bildebehandling, eutanasi og vevsinnsamling.
1. hiPSC-kultur, kardiomyocytdifferensiering og cellerensing
- Bland DMEM/F12 og matriksløsningen i kjellermembranen med is ved 4 °C i forholdet 1,5:1, alikot, og oppbevar den resulterende blandingen (matriksfortynningsmiddel) ved -20 °C. Bland 25 ml DMEM/F12 dyrkningsmedium ved 4 °C og 1 ml matriksfortynningsmiddel grundig med is, og fordel 1 ml/brønn i en 6-brønns plate. Hold platen stående i 1 time i en inkubator ved 37 °C, og aspirer DMEM/F12-supernatanten fra brønnene. Ikke berør bunnen av 6-brønnsplaten når du utfører prosedyren.
- Fjern kryopreserveringsslangen som inneholder hiPSCene fra flytende nitrogen og tine dem raskt i et vannbad på 37 °C. Steriliser den ytre overflaten av kryopreserveringsrøret med 75% alkohol, tørk av alkoholen og overfør røret til et sterilt ultrarent bord.
- Bruk en pipette til å forsiktig overføre kryopreserveringsløsningen som inneholder hissc til et 15 ml sentrifugerør, tilsett 5 ml materfritt ES-medium og sentrifuger suspensjonen ved 300 × g i 3 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og resuspender cellene forsiktig i 6 ml av det materfrie ES-mediet. Tell cellene og juster cellekonsentrasjonen til 5 × 105 celler / ml med kulturmediet.
- Legg til ROCK-hemmeren (Y27632) til hiPSCene til en endelig konsentrasjon på 5 μM. Overfør hiPSCene med Y27632 til 6-brønnsplaten som er forbehandlet med kjellermembranmatrise, og virvle forsiktig 6-brønnsplaten, og spore formen på tallet "8" for jevnt fordelt hiPSCene. Plasser hiPSCene i en 37 °C, fuktig inkubator med 5 % CO2 i oppreist stilling i 24 timer. Erstatt supernatanten med det materfrie ES-mediet uten Y27632.
- Når hissc når 80 % samløpsgrad, aspirerer dyrkningssupernatanten, vasker cellene to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS), tilsett insulinfritt RPMI1640 + B27 inneholdende 10 μM CHIR99021 (GSK3-β-hemmer), og plasser hiPSCene i en fuktig CO2 -inkubator ved 37 °C i 24 timer.
- Bytt ut halvparten av supernatanten med RPMI1640 + B27 medium uten insulin og inkuber cellene i ytterligere 24 timer.
- Erstatt kulturmediet helt med RPMI1640 + B27 (uten insulin). Plasser platene i en fuktig inkubator ved 37 °C med 5% CO2 i oppreist stilling i 24 timer.
- Bytt ut kulturmediet helt etter 3 dager med insulinfri RPMI1640 + B27 + 5 μM IWR1 (Wnt signalveihemmer) og plasser platene i en fuktig inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i 48 timer.
- Erstatt dyrkningsmediet etter 5 dager med RPMI1640 + B27 uten insulin og fortsett å inkubere i 48 timer i en fuktig CO2 -inkubator ved 37 ° C.
- Erstatt kulturmediet med RPMI + B27 (inkludert insulin) medium etter 7 dager og legg platene i en fuktet CO2 -inkubator i 3 dager ved 37 ° C. Bytt ut mediet med RPMI + B27 medium hver 3. Se etter spontan juling av celler ved 9-12 dager med differensiering.
- Etter å ha observert de pulserende cellene, erstatt RPMI + B27-mediet med glukosefritt RPMI 1640-medium som inneholder melkesyre (1 ml melkesyre tilsatt til 500 ml glukosefri RPMI 1640 medium). Inkuber cellene i 72 timer i en fuktig inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
- Etter 72 timer, erstatt supernatanten med RPMI + B27 medium og inkuber i 48 timer i en fuktig inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
- Aspirer kultursupernatanten under undertrykk og vask cellene 3x med PBS for å fjerne spor av kulturmediet. Bruk celledetachment-enzymblandingen til å dissosiere hiPSC-CMene til individuelle celler ved 37 °C. Samle de oppnådde cellene i et 15 ml sentrifugerør inneholdende 3 ml kardiomyocyttstøtteløsning, sentrifuge ved 300 × g i 2 minutter ved romtemperatur, og kast supernatanten.
- Resuspender cellene med RPMI + B27 medium, frø dem på kjellermembranmatrisebelagte 6-brønnsplater, og inkuber dem i 48 timer i en fuktig inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
- Erstatt dyrkningssupernatanten for rensing med glukosefritt RPMI 1640-medium inneholdende melkesyre og inkuber i 72 timer i en fuktig inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Bytt ut kultursupernatanten med RPMI + B27 medium og bytt medium hver 3.
- Fortsett prosessen ovenfor i 30 dager, og erstatt kultursupernatanten med glukosefritt medium inneholdende melkesyre for videre rensing. Inkuber cellene i 3 dager med dette mediet og erstatt supernatanten med RPMI + B27. Dyrk cellene kontinuerlig i 30 dager til hiPSC-CMs slår stabilt, og bruk disse cellene til intramyokardial injeksjon hos mus.
2. Fremstilling av hiPSC-CMs og etablering av muse akutt hjerteinfarktmodell
- Vakuum-aspirere kultursupernatanten fra hiPSC-CMs dyrket i 60 dager, vask cellene 3x med PBS, og dissosiere hiPSC-CMs i individuelle celler ved 37 ° C med celleavløsningsenzymblandingen (~ 3-5 min). Samle cellene i et 15 ml sentrifugerør som inneholder 5 ml RPMI + B27 medium og bland godt før du teller cellene for å beregne totalt antall celler. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 300 × g i 2 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og tilsett kardiomyocyttstøttemedium for å resuspendere til en konsentrasjon på 0,6 × 105 celler/μL.
- Oppbevar sentrifugerøret med resuspendert hisc-CM klar ved 37 °C til injeksjon 14,17,18,19,20.
- Plasser musene i en anestesiboks forbundet med isofluran for å indusere anestetisk innånding etterfulgt av bruk av veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet under anestesi.
MERK: Isofluran konsentrasjonen var 5 %. Vær oppmerksom på laboratorieventilasjon under forsøket. - Se etter tap av reflekser i føttene og haleområdet etter klemming når musen legges flatt på operasjonsbordet, noe som indikerer tilstrekkelig anestesi. Administrer buprenorfin (0,1 mg/kg) intraperitonealt.
- Smør håret på midten av nakken og musens venstre bryst med en hårfjerningskrem, og tørk av den påførte krem og hår med gasbind etter 5 minutter.
- Fest lemmer og musehalen med tape. Fest musefortennene med en 2-0 silketråd og tape. Steriliser operasjonsområdet (median nakke og venstre bryst) med tre alternerende runder med betadin etterfulgt av alkohol.
- Plasser et kirurgisk drap rundt det steriliserte kirurgiske området. Deretter gjør du et median nakkesnitt ved hjelp av fin anatomisk saks og fin dissekerende tang for å eksponere luftrøret fullt ut. Om nødvendig, kutt av noen fremre livmorhalsmuskler for stabilisering.
MERK: Operatørene ble blindet for dyregruppene. - Sett inn et luftrør (20 G kateter punkteringsnål) gjennom munnen.
- Koble trakealrøret til ventilatoren og kontroller for thorax bevegelse for å sikre at begge lungene er godt ventilert.
- Juster pusteparametrene (pustefrekvens: 100–150 bpm, tidevannsvolum 250–300 μL). Deretter fester du venstre baklem til nedre høyre side, løsner båndet rundt venstre øvre lem og utfører en torakotomi ved venstre thoraxs 3-4 interkostalrom ved hjelp av fin dissekerende saks og tang for maksimal hjerteeksponering.
- Bruk tang, riv av perikardiet under et mikroskop for å visualisere venstre fremre synkende koronararterie (LAD) i nedre kant av venstre atrievedheng.
- Bruk en 6-0 silketråd for å ligere den proksimale enden av LAD. Etter å ha sikret at den akutte MI-modellen er tilstrekkelig etablert (når den distale LAD på ligeringsstedet endres fra rød til hvit), lukk brystet lag for lag og sutur huden med 4-0 gjengede intermitterende masker. Utfør alle ovennevnte kirurgiske prosedyrer for MI-induksjon for sham-gruppen av dyr bortsett fra ligering.
- Slå av inhalasjonsbedøvelsen, fjern kanylen etter at musen gjenopptar spontan pust, og returner den til buret. Overvåk dyret til det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal hvile. Ikke returner den til selskap med andre dyr før den har fullstendig gjenopprettet. Intraperitoneale injeksjoner med buprenorfin (0,1 mg/kg x 3 dager) og karprofen (5 mg/kg x 1 dag) hver 12. time postoperativt.
- Injiser ciklosporin A (10 mg·kg-1·dag-1) i det intraperitoneale hulrommet hos mus 3 dager før administrering av hiPSC-CMs for å forhindre avstøtning av de transplanterte cellene. Injiser ciklosporin A kontinuerlig i 1 måned etter transplantasjon.
3. hiPSC-CM injeksjon under ultralydveiledning
- Etter å ha satt opp MI-modellen, tilordne MI-modellmusene (12 uker gamle C57BL/6-mus; 22g til 24g i vekt, 50% menn og 50% kvinner) til enkeltdose (SD, n = 8 i denne studien) og flerdosegrupper (MD, n = 8 i denne studien) på første post-MI-dag og plasser dem i den første og andre uken etter MI i en anestesiboks forbundet med 5% isofluran for induksjon av inhalasjonsanestesi etterfulgt av trakeal intubasjon.
- Smør håret på brystet og overlivet til musene med hårfjerningskrem og tørk kremet av med gasbind 5 minutter senere. Overvåk musens hjertefrekvens på operasjonstavlen og administrer inhalasjonsisofluran til hjertefrekvensen opprettholdes på 400-500 bpm.
- Fest muselemmer og hale med tape på deteksjonskonsollen og sett plattformtemperaturen på 37 °C.
- Påfør en spesiell ultralydgelé på overlivet og bruk en mindre høyoppløselig veterinær ultralydssonde for å oppnå museleverbilder.
- Reduser ventilatorfrekvensen til 50 bpm. Bruk en 5 μL mikrosprøyte til å tegne ~3 × 105 celler (fra trinn 2.1). Mens sprøyten holdes med en mikromanipulator, stikker du inn en 3 mm kanyle i venstre paraksiphoidprosess (figur 1A). Følg øvre kant av diafragma under ultralydveiledning (figur 1B), observer respirasjonsrytme og -område (figur 1C,D) og gå inn i perikard i slutten av ekspiratorisk syklus for å unngå skade på lever og lunge (figur 1D).
- Etter at mikroinjektornålen kommer inn i perikardialhulen, juster pustefrekvensen til den opprinnelige parameteren (150 bpm). Skaff deg det parasternale langaksebildet av musehjertet ved M-mold ekkokardiografi i henhold til produsentens instruksjoner17 (figur 1E). Under ultralydveiledning, injiser 3 × 10 5 celler (figur 1F) i tre marginale områder (1 × 105 celler per injisert sted) av infarktstedet.
- Fjern den spesielle ultralydssonden og skyll av geléen. Avvenne musen fra inhalasjonsbedøvelsen, og returner den til buret etter full bevissthet.
- Gjenta ovennevnte ultralydveiledede celleinjeksjonsprosedyrer 1 og 2 uker etter etablering av MI for MD-gruppen mus.
4. Evaluering av hjertefunksjon, fluorescensmerking, transplantert celletall, hjerteinfarktområde og påvisning av organhumane mitokondrier hos mus 30 dager etter venstre fremre synkende grenligering
- Vurdering av hjertefunksjon
- Plasser musen i en isofluran-tilkoblet anestesiboks for induksjon-inhalasjonsanestesi etterfulgt av bruk av veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet under anestesi. Fjern håret på venstre bryst av musen med hårfjerningskrem. Legg musen på betjeningspanelet for å overvåke hjertefrekvensen og justere inhalasjonen av isofluran . Oppretthold musens hjertefrekvens på 400-500 bpm. Det eksperimentelle endepunktet er dag 30 (etter MI-induksjonen).
- Fest muselemmer og hale med tape på deteksjonskonsollen og sett plattformtemperaturen på 37 °C.
- Etter å ha påført en spesiell ultralydgel på det fremre hjerteområdet, bruk en (veterinær) høyoppløselig hjerteultralydsonde for å skaffe parasternale langakse og todimensjonale kortaksebilder under ekkokardiografi av M-form og B-form i henhold til produsentens instruksjoner17.
- Etter at ultralydsdeteksjonen er fullført, skyll av den spesielle ultralydgelen, slå av innåndingsbedøvelsen og returner musen til buret separat etter full bevissthet.
- Analyser de oppnådde dataene og beregne venstre ventrikulær ejeksjonsfraksjon (EF) og fraksjonell forkortelse (FS) ved hjelp av analyseprogramvaren. Sørg for at operatøren er blindet for forsøksgruppene17.
- Fluorescensmerking av seksjoner
- Vask det isolerte hjertet med PBS, senk det i 4 % paraformaldehyd ved 4 °C i 12 timer. Ta hjertet ut og dypp det i 30% sukrose i 24 timer for å dehydrere.
- Legg inn det dehydrerte hjertet med den optimale skjæretemperaturen (OCT) på tørris. Skjær hjertet fra bunnen til toppunktet med en kryostattykkelse på 10 μm og legg seksjonene på lysbilder og oppbevar lysbildene ved -20 °C.
- Vask lysbildene med hjertevevet med PBS i 3 minutter.
- Permeabiliser vevet på lysbilder med 0,5% Triton X-100 ved romtemperatur i 8 min og vask dem 3x med PBS i 5 min per vask.
- Etter å ha dekket vevet med 10% eselserum og 90% PBS (blokkeringsløsning), blokker seksjonene i 1 time ved romtemperatur.
- Etter at blokkeringsoppløsningen er fjernet, inkuberes seksjonene med det primære antistoffet (fortynnet til 1:100 med blokkeringsoppløsningen) over natten ved 4 °C. Vask dem 3x med PBS i 5 min per vask.
- Inkuber vevet på lysbilder med fluoroforkonjugert sekundært antistoff (fortynnet til 1:100 med blokkeringsoppløsningen) i 1 time ved romtemperatur.
MERK: Unngå å utsette vevet med det fluoroforkonjugerte sekundære antistoffet for lys fra dette punktet og fremover. - Vask lysbildene 3x med PBS i 5 min per vask.
- Monter lysbildene med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)-holdig monteringsmedium og fotografer under et fluorescensmikroskop17.
- Transplanterte hiPSC-CMs teller17
- Utfør vevsimmunfluorescensfarging på frosne deler av hjertet for fotgjengerspesifikt troponin T (hcTnT), humant nukleært antigen (HNA) og ikke-spesifikt sarkomerisk alfaaktinin.
- Etter at hele hjertet var serielt seksjonert, ta en seksjon for hver 50 seksjoner for fluorescensmerking.
- Ta tilfeldig fem bilder med høy forstørrelse per stykke. Tell antall podede synsfelt, beregn gjennomsnittlig antall podede celler per arealenhet, og angi dem som A1/μm2. Beregn det totale podede arealet av stykket ved hjelp av ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) og sett det som B1μm2 slik at det podede tallet i dette stykket = A1 × B121,22.
- Beregn totalt antall podede celler per musehjerte ved hjelp av Eq (1) og prosentandel av transplantasjon ved hjelp av Eq (2), gitt at ett snitt ble valgt fra hver 50 seksjon21,22.
- Totalt antall podede celler per musehjerte = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ En × Bn) × 50 (1)
engraftment rate =
(2)
MERK: Antall fødsler var 3 × 10 5 for SD-gruppen og 3 × 3 × 105 for MD-gruppen.
- Vurdering av hjerteinfarktområdet
- Klipp en tverrsnittsfrossen seksjon (kort akse) av det isolerte hjertet, fra toppunktet til bunnen av hjertet med en tykkelse på 10 μm.
- Etter at hele hjertet er serielt seksjonert, ta en seksjon lysbilde for hver 30 seksjoner og fest den i forvarmet Bouin løsning ved 58 ° C. Beis seksjonen med 0,04% direkte rød og 0,1% rask grønn kollagen flekker (fortynnet i PBS) i henhold til produsentens instruksjoner17.
- Bruk programvare (f.eks. ImageJ) til å analysere bildene etter tverrsnittsfotografering av hjertet under et mikroskop ved hjelp av Eq (3):14,17
Infarktområde % =
× 100% (3)
- Påvisning av humant mitokondrielt DNA i forskjellige organer
- Bedøv musene med 5% isofluran og ofre dem ved bakre cervikal dislokasjon. Dissekere musene 4 uker etter celletransplantasjon. Høst organene (lever, lunge, hjerne, nyre, milt) og deler av myokard (n = 3 i dette avsnittet).
- Mal hvert organvev i flytende nitrogen og trekk ut DNA fra vevet ved hjelp av det refererte settet (se materialfortegnelsen) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Følg produsentens instruksjoner for å bruke det refererte settet og primere (se materialfortegnelsen) for å oppdage humant mitokondrielt DNA i ovennevnte vev (fra trinn 4.5.1).
(2)
× 100% (3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekkokardiografi for evaluering av musens venstre ventrikkelfunksjon i hver gruppe viste at MI-skadene effektivt ble reversert i MD-gruppen (figur 2A). Sammenlignet med MI-gruppen viste SD-gruppen økt ejeksjonsfraksjon (EF) (fra 30% til 35%; Figur 2B) og fraksjonsforkortelse (FS) (fra 18% til 22%; Figur 2C) etter MI. Det er imidlertid enda viktigere å merke seg at flere injeksjoner av hiPSC-CM i MD-gruppen mus perkutant økte EF (fra 30% til 42%; Figur 2B) og FS (fra 18% til 28%; Figur 2C) av musehjertet etter MI.
Fluorescensmerking av uspesifikk α-aktin (αSA), DAPI, humanspesifikt troponin T (hcTnT) og humant nukleært antigen (HNA) av vevssnitt viste at det transplanterte celletallet i MD-gruppen var signifikant høyere enn i SD-gruppen (figur 3A). Selv om MD-gruppen bare hadde to flere injeksjoner enn SD-gruppen, var det transplanterte celletallet i MD-gruppen ~ 10x det for SD-gruppen (figur 3B). I tillegg var andelen transplanterte kardiomyocytter i MD-gruppen også signifikant høyere enn i SD-gruppen (figur 3C). Denne studien viste også at de transplanterte cellene i MD-gruppen var fordelt i infarktområdet og det marginale infarktområdet, mens de transplanterte cellene i SD-gruppen kun var fordelt i infarktområdet (figur 3A).
MI-arealet i SD-gruppen var mindre enn MI-gruppen, og MI-området i SD-gruppen var signifikant mindre enn i MD-gruppen (figur 2E). I tillegg var tykkelsen på venstre ventrikkels fremre vegg i MD-gruppen 4x tykkelsen på myokardial MI-gruppen, mens tykkelsen på venstre ventrikkels fremre vegg i SD-gruppen var dobbelt så tykk som MI-gruppen (figur 2F). Imidlertid var kollagenvolumfraksjonen i MD-gruppen 50% lavere enn i MI-gruppen, mens kollagenvolumfraksjonen i SD-gruppen bare var 30% lavere enn i MI-gruppen (figur 2G).
Det totale antallet celler som uttrykker IB4 (en endotelcellemarkør) og SM22α (en markør for glatte muskelceller) 28 dager etter MI økte signifikant i MD-gruppen (figur 3D,E) sammenlignet med SD- eller MI-gruppen. Denne studien vurderte også graden av hypertrofi av kardiomyocytter i marginalsonen i hver gruppe. Hvetekimagglutinin (WGA) og sarkomerisk alfaaktininfluorescensfarging viste at minste fiberdiameter (MFD) i ligerte mus i alle de tre gruppene var signifikant høyere enn hos de humbugligerte musene. Imidlertid var MFD i MD-gruppen signifikant mindre enn MI- og SD-gruppene (figur 3F,G). Denne studien brukte videre TUNEL immunostaining (som kan markere kjernen til alle apoptotiske celler) for å evaluere apoptose av kardiomyocytter. Sammenliknet med SD-gruppen eller MI-gruppen var forekomsten av TUNEL-positive kardiomyocyttkjerner i MD-gruppen signifikant redusert (figur 3H,I). Det ble ikke påvist humant mitokondrielt DNA i noe organ i narre- og MI-gruppene (figur 4A,B). MD- og SD-gruppene viste bare humant mitokondrielt DNA i hjertet, og det ble ikke påvist humant mitokondrielt DNA i noe annet organ (figur 4C,D).
Figur 1 Ultralydveiledet intramyokardcelleinjeksjon hos mus. Etter at musen er bedøvet på et operasjonsbord, festes lemmer og hale med tape ved en konstant temperatur på 37 °C, mens den perkutane intramyokardiale injeksjonen administreres i venstre ventrikkel, styrt av ekkokardiografi. Musene ble bedøvet og vedlikeholdt ved inhalasjon av isofluran (1,5 %-2 %). Fjern håret på overlivet og brystet på musen. Under transtorakal ekkokardiografiveiledning, sett spissen av mikrosprøyten under xiphoidprosessen (A) (pil) og flytt den (pilen) langs den øvre kanten av membranen (B) for å justere musens respirasjonsfrekvens. Trykk nålespissen mot perikardveggen (C) i inspirasjonsfasen. (D,E) Nålespissen kommer inn i perikardialhulen i ekspiratorisk fase og trenger til slutt inn i venstre ventrikkels fremre vegg (F) for å injisere celler. Dette tallet ble endret fra17. Forkortelser: LV = venstre ventrikkel; AO = stigende aorta; RL = høyre lunge; LL = venstre lunge. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Evaluering av hjertefunksjon hos mus i hver gruppe. (A) Bruk høyoppløselig ekkokardiografi for å vurdere venstre ventrikkelfunksjon før infarkt induseres (pre-S) og 4 uker etter behandling (post-S). Ejeksjonsfraksjonen (B) og brøkforkortelsen (C) uttrykkes som absolutte verdier. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE, 8 per gruppe. Vurder infarktstørrelse, kollagenvolum og venstre ventrikulær morfologi. Gjennom Sirius rød/rask grønn farging (D), infarktstørrelse (E), venstre ventrikkels fremre veggtykkelse (F) og kollagenvolumfraksjon (G) ble målt. Dataene viser gjennomsnittlig ± SE, 8 mus per gruppe. Skala bar = 1 mm. Enveisanalyse av varians og Dunns multippel sammenligningstest. * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Dette tallet ble endret fra17. Forkortelser: pre-S = prekirurgi; post-S = etter operasjonen; MI = hjerteinfarkt; SD = enkeltdose; MD = gjentatt dose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Histologisk evaluering av hjerter hos mus i hver gruppe . (A) Serielle seksjoner av de injiserte hjertemusene med hiPSC-CM ble farget for hcTnT, α-sarkomerisk aktin (αSA) og DAPI. Antallet (B) og prosentandel (C) av de transplanterte cellene ble brukt til kvantifisering. Serielle seksjoner fra sham-opererte, MI, SD og MD-behandlede musehjerter ofret 4 uker etter MI-induksjon ble histokjemisk farget for tilstedeværelse av IB4. (D,E) Kapillærene kvantifiseres som antall IB4-positive vaskulære strukturer i hvert høyeffektfeltområde rundt infarktet. Kardiomyocyttene ble farget med WGA og αSA i marginalsonen av hjerteinfarkt, og kjernene ble merket med DAPI. (F,G) Tverrsnittsarealet av kardiomyocytter måles og vises som en absoluttverdi. De marginale delene av hjerteinfarkt ble farget med TUNEL for å vise apoptotiske kardiomyocytter (rød, TUNEL) og normale kardiomyocytter som uttrykker hjertetroponin T (grønn, cTnT). (H,I) Forholdet mellom TUNEL-positive celler og totale celler ble beregnet. Skalastenger = 500 μm (A), 20 μm (D,H) eller 10 μm (F). Enveisanalyse av varians og Dunns multippel sammenligningstest. * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Dette tallet ble endret fra17. Forkortelser: hcTnT = humant hjertetroponin T; αSA = α-sarkomerisk aktin; WGA = hvetekimagglutinin; DAPI = 4', 6-diamidino-2-fenylindol; TUNEL = terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick ende merking; MI = hjerteinfarkt; SD = enkeltdose; MD = gjentatt dose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Påvisning av humant mitokondrielt DNA i museorganer i hver gruppe. Figuren viser påvisning av humant mitokondrielt DNA i musehjerter og andre organ(er) i hver gruppe 1 måned etter celletransplantasjons-PCR. PCR av humant mitokondrielt DNA fant ikke transplanterte celler (A,B) i hjerter og andre organer hos mus i narre- (n = 3) og MI-gruppen (n = 3). PCR av humant mitokondrielt DNA fant transplanterte celler i hjertene til mus i SD (n = 3) og MD-gruppen (n = 3), men ikke i andre organer, inkludert lunge, lever, nyre, hjerne og milt (C,D). Den kvantitative qPCR-analysen av humant mitokondrielt DNA viste at det humane mitokondrielle DNA i MD-gruppen var omtrent åtte ganger det for SD-gruppen (E). (+) indikerer iPSC-CMs positive kontroll. (−) indikerer DEPC vannnegativ kontroll. Forkortelser: n.s. = ikke signifikant; MI = hjerteinfarkt; SD = enkeltdose; MD = gjentatt dose. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trinnene i denne studien inkluderer hiPSC-kultur, kardiomyocytdifferensiering, hiPSC-CM-rensing og hiPSC-CM-transplantasjon i museinfarktstedet. Nøkkelen er å bruke hjerteultralyd for å transkutant lede behandlingen mot infarktstedet ved kanten av infarktet der hiPSC-CM ble injisert i området.
Med forlengelsen av kulturtiden endres hiPSC-CM-fenotypen i morfologi (større cellestørrelse), struktur (muskel, fibriltetthet, arrangement, mikroskopiske celleklynger) og fysiologi (kalsiumbehandling og β-adrenerg respons) med differensiering over tid. I denne studien ble fluorescensmerking utført på 10. og 60. dag med hiPSC-differensiering i kardiomyocytter for å observere morfologiskeog strukturelle endringer. Cellestørrelse og sarkomerlengde ble signifikant økt i hiPSC-CMs på den 60. dagen enn på den 10. dagen. Studien brukte hiPSC-CMs som var relativt stabile etter 60 dagers differensiering til kardiomyocytter for transplantasjon. I tillegg ble det i løpet av 60 dager med kultur av hiPSC-CM utført flere erstatninger av melkesyreholdig glukosefritt kulturmedium for å rense kardiomyocytter og øke kardiomyocyttinnholdet for å unngå bivirkninger forårsaket av ikke-kardiomyocytter i de transplanterte cellene.
En ultralydsonde ble først plassert på musens øvre del av magen under ultralydstyrt celleinjeksjon for å visualisere leveren. Mikroinjektornålen kom skrått inn under xiphoidprosessen, unngikk leveren og kom inn i perikardiet under ultralydveiledning. I denne studien ble perikard ikke vurdert vertikalt fra indre knokler i brystveggen, da denne veien mot infarktområdet i myokard er signifikant kort, noe som gir høy risiko for hjertepunksjon og celletransplantasjonssvikt. Skrå tilgang til perikard fra xiphoidprosessen mot myokard utgjør imidlertid en betydelig lengre vei med lavere risiko for hjertepunksjon. Under ultralydveiledet celleinjeksjon ble musene intubert for å regulere respirasjonsfrekvensen under punktering. Regulering av musens respirasjonsfrekvens og forlengelse av innåndings- og utløpstider bidrar til punktering under utløpet, noe som også unngår å skade lungene. Under dette forsøket døde ingen mus av hjertebrudd og lungeskade etter celleinjeksjon.
For stabiliteten til transplanterte celler vurderte studien tidspunktet for hiPSC-CM-injeksjon og antall injeksjoner. I det tidlige stadiet av MI oppstod alvorlig betennelse i det infarkterte området23. Tidlig undertrykkelse av inflammatorisk respons på infarktstedet kan forbedre myokardial remodellering og begrense fatale muligheter for forsøkspersonen24. I tillegg er en alvorlig inflammatorisk respons en årsak til transplantert celledød. Tidligere studier har vist at transplantasjon av ES-celledifferensierte kardiomyocytter inn i infarktområdet kan hemme inflammatorisk respons på hjerteinfarktsted25.
Etter at musens MI-modell var etablert, ble hiPSC-CM injisert i infarktstedet og den infarkterte randsonen under direkte syn; bare en tiendedel av hiPSC-CMene overlevde. Studien antyder imidlertid at de opprinnelig transplanterte hiPSC-CMene kan forbedre mikromiljøet på hjerteinfarktstedet hos mus og forbedre overlevelsesraten for retransplanterte celler. Resultatene viste at antall celler som overlevde etter tre hiPSC-CM-injeksjoner var 10 ganger det for en enkelt hiPSC-CM-injeksjon (figur 3C). Ultralyd viste at fremre veggtykkelse av venstre ventrikkel i MD- og SD-gruppene var mye tynnere i tredje og fjerde uke etter at MI-modellen var etablert enn ved første og andre uke. Dermed ble musene i MD-gruppen injisert med celler umiddelbart etter at MI-modellen ble etablert, og deretter en og to uker etter infarkt for å unngå død på grunn av hjertebrudd.
Denne studien viser at antall podede celler er signifikant høyere i MD-gruppen enn i SD-gruppen. Musens ekkokardiografi viste at EF- og SF-verdiene i MD-gruppen var høyere enn i SD-gruppen. Den parakrine funksjonen til de transplanterte hiPSC-CMene bør også vurderes sammen med transplanterte kardiomyocytter for å forbedre hjertefunksjonen. En studie av Iwanaga et al.26 rapporterte at de parakrine faktorene utskilt av hiPSC-CMs kunne fremme angiogenese ved å aktivere Akt1. Studien fant svært få isolektin B4-positive celler i det marginale infarktområdet i MI-gruppen. Derimot var det flere isolektin B4-positive celler i SD- og MD-gruppene enn i MI-gruppen; Spesielt hadde MD-gruppen mest. Dermed viser disse resultatene at jo mer de podede hiPSC-CMene er, desto sterkere blir de nye blodkarene på stedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den store forskningsplanen til National Natural Science Foundation of China (nr. 91539111til JY), Key Project of Science and Technology i Hunan-provinsen (nr. 2020SK53420 til JY) og The Science and Technology Innovation Program of Hunan Province (2021RC2106 til CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Cardiac troponin T | Abcam | ab8295 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150105 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150110 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150062 | |
| Human cardiac troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Isolectin B4 | Vector | FL-1201 | |
| Sarcomeric alpha actinin | Abcam | ab9465 | |
| Wheat germ agglutinin | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| Reagent | |||
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | |
| B27 Supplement(minus insulin) | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement(serum free) | Thermo Fisher Scientific | 17–504-044 | |
| Bouin's solution | Thermo Fisher Scientific | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| cyclosporin A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| DIRECT RED | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| FAST GREEN FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| lactic acid | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356234 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix kit | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| RPMI1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff | Stem Cell Technologies | 5030 | |
| STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium | Stem Cell Technologies | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| ultrasound coupling agent | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Applied Biosystems | Thermo Fisher Scientific | 7500 Real-Time PCR | |
| cryostat | Leica | CM1950 | |
| fluoresence microscope | Olympus | IX83 | |
| fine anatomical scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro syringe | Hamilton | 7633 | |
| Small animal anesthesia machine | MATRX | VMR | |
| Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Software | |||
| Statistical Product and Service Solutions | IBM | 21 | |
| Image J | NIH | 1.48 | |
| Human mitochondrial DNA primers | |||
| the forward primer sequence | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| the reverse primer sequence | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
References
- Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
- Lázár, E., et al. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Davis, M. K., et al. State of the art: cardiac transplantation. Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).
- Mancini, D., Colombo, P. C. Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant. Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).
- Zimmermann, W. H. Translating myocardial remuscularization. Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).
- Hu, X., et al. A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization. Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).
- Kempf, H., et al. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
- Nguyen, P. K., et al. Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review. JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).
- Zimmermann, W. H. Remuscularization of the failing heart. The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).
- Hu, X., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).
- Feng, Y., et al. Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway. Stem Cells. 32 (2), Dayton, Ohio. 462-472 (2014).
- Fan, C., et al. Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Sun, X., et al. Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats. Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).
- Wu, X., et al. Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873 (2021).
- Kannappan, R., et al. Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair. Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Zhao, M., et al. Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice. Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).
- Zhao, M., et al. Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452 (2019).
- O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Rainer, P. P., et al. Cardiomyocyte-specific transforming growth factor β suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction. Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).
- Yu, Y., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 167 (2019).
- Iwanaga, K., et al. Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).
