Summary
La administración de células guiadas por ultrasonido alrededor del sitio del infarto de miocardio en ratones es una forma segura, efectiva y conveniente de trasplante de células.
Abstract
El objetivo clave de la terapia celular después del infarto de miocardio (IM) es mejorar eficazmente la tasa de injerto celular, y los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) son una fuente celular prometedora para la reparación cardíaca después del daño isquémico. Sin embargo, una tasa baja de injertos es un obstáculo significativo para la regeneración efectiva del tejido cardíaco después del trasplante. Este protocolo muestra que múltiples inyecciones percutáneas guiadas por ultrasonido hiPSC-CM en un área de IM aumentan efectivamente las tasas de trasplante celular. El estudio también describe todo el proceso de cultivo de hiPSC-CM, el pretratamiento y los métodos de administración percutánea guiados por ultrasonido. Además, el uso de ADN mitocondrial humano ayuda a detectar la ausencia de hiPSC-CMs en otros órganos de ratón. Por último, este artículo describe los cambios en la función cardíaca, la angiogénesis, el tamaño celular y la apoptosis en la zona fronteriza infartada en ratones 4 semanas después de la entrega celular. Se puede concluir que la inyección percutánea guiada por ecocardiografía del miocardio ventricular izquierdo es una terapia celular factible, relativamente invasiva, satisfactoria, repetible y efectiva.
Introduction
Cuando se produce un infarto agudo de miocardio, las células del miocardio en el área infartada mueren rápidamente debido a la isquemia y la hipoxia. Varios factores inflamatorios se liberan después de la muerte celular y la ruptura, mientras que las células inflamatorias se infiltran en el sitio infartado para causar inflamación1. Significativamente, los fibroblastos y el colágeno, ambos sin contractilidad y conductividad eléctrica, reemplazan las células miocárdicas en el sitio infartado para formar tejido cicatricial. Debido a la limitada capacidad de regeneración de los cardiomiocitos en mamíferos adultos, el tejido viable formado después de una gran área de infarto generalmente no es adecuado para mantener un gasto cardíaco suficiente2. El IM causa insuficiencia cardíaca, y en casos severos de insuficiencia cardíaca, los pacientes solo pueden confiar en trasplantes cardíacos o dispositivos de asistencia ventricular para mantener las funciones cardíacas normales 3,4.
Después del IM, la estrategia de tratamiento ideal es reemplazar los cardiomiocitos muertos con cardiomiocitos recién formados, formando acoplamiento electromecánico con tejidos sanos. Sin embargo, las opciones de tratamiento generalmente han adoptado el rescate miocárdico en lugar del reemplazo. Actualmente, las terapias basadas en células madre y células progenitoras se encuentran entre las estrategias más prometedoras para promover la reparación del miocardio después de la MI5. Sin embargo, el trasplante de estas células tiene varios problemas, principalmente la incapacidad de las células madre adultas para diferenciarse en cardiomiocitos y su corta vidaútil 6.
Las cuestiones éticas relacionadas con el uso de células madre embrionarias (ES) pueden ser eludidas por las iPSC, que son una fuente prometedora de células. Además, las iPSCs poseen fuertes capacidades de auto-renovación y pueden diferenciarse en cardiomiocitos7. Los estudios han demostrado que los hiPSC-CM trasplantados en el sitio IM pueden sobrevivir y formar uniones de brecha con las células huésped 8,9. Sin embargo, debido a que estas células trasplantadas se encuentran en el microambiente de la isquemia y la inflamación, su tasa de supervivencia es extremadamente baja10,11.
Se han establecido varios métodos para mejorar la tasa de supervivencia de las células trasplantadas, como el pretratamiento de hipoxia y choque térmico de células trasplantadas12,13, la modificación genética 14,15 y el trasplante simultáneo de células y capilares 16. Desafortunadamente, la mayoría de los métodos están limitados por la complejidad y el alto costo. Por lo tanto, el presente estudio propone un método de administración de hiPSC-CM reproducible, conveniente, relativamente invasivo y efectivo.
La inyección de células intramiocárdicas guiada por ultrasonido se puede llevar a cabo solo con una pequeña máquina de ultrasonido veterinario de alta resolución y un microinyector, independientemente del sitio. Bajo la guía de ultrasonido, la entrega directa de células bajo el proceso xifoide desde el pericardio al miocardio en ratones es un protocolo seguro que evita el daño hepático y pulmonar. Este método se puede combinar simultáneamente con otras tecnologías para mejorar significativamente la tasa de supervivencia de las células trasplantadas.
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Protocol
Todos los experimentos con animales en este estudio fueron revisados y aprobados por el comité de ética del Segundo Hospital Xiangya de la Universidad Central del Sur. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo. Los plazos para la inyección celular, la imagen y la eutanasia son los siguientes: t0- inducir infarto, t1 semana- imagen y células de implante, t2 semanas- imagen y células de implante, t4 semanas- imagen final, eutanasia y recolección de tejido.
1. cultivo de hiPSC, diferenciación de cardiomiocitos y purificación celular
- Mezclar DMEM/F12 y la solución madre de matriz de membrana basal con hielo a 4 °C en una proporción de 1,5:1, alícuota, y almacenar la mezcla resultante (diluyente de matriz) a -20 °C. Mezclar 25 ml de medio de cultivo DMEM/F12 a 4 °C y 1 ml de diluyente de matriz a fondo con hielo, y esparcir 1 ml/pocillo en una placa de 6 pocillos. Mantener la placa en posición vertical durante 1 h en una incubadora a 37 °C y aspirar el sobrenadante DMEM/F12 de los pocillos. No toque la parte inferior de la placa de 6 pocillos cuando realice el procedimiento.
- Retirar el tubo de criopreservación que contiene las hiPSC del nitrógeno líquido y descongelarlas rápidamente en un baño maría a 37 °C. Esterilice la superficie externa del tubo de criopreservación con alcohol al 75%, limpie el alcohol y transfiera el tubo a una mesa estéril ultralimpia.
- Use una pipeta para transferir suavemente la solución de criopreservación que contiene hiPSC a un tubo de centrífuga de 15 ml, agregue 5 ml de medio ES sin alimentador y centrifugue la suspensión a 300 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda suavemente las células en 6 ml del medio ES sin alimentador. Contar las células y ajustar la concentración celular a 5 × 105 células/ml con el medio de cultivo.
- Añadir el inhibidor de ROCK (Y27632) a las hiPSC hasta una concentración final de 5 μM. Transfiera las hiPSC con Y27632 a la placa de 6 pocillos pretratada con matriz de membrana basal, y agite suavemente la placa de 6 pocillos, trazando la forma del número "8" para distribuir uniformemente las hiPSC. Colocar las hiPSCs en una incubadora húmeda a 37 °C con un 5% deCO2 en posición vertical durante 24 h. Reemplace el sobrenadante con el medio ES sin alimentador sin el Y27632.
- Cuando las hiPSC alcancen el 80% de grado de confluencia, aspirar el sobrenadante de cultivo, lavar las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), añadir RPMI1640 + B27 libre de insulina que contenga 10 μM CHIR99021 (inhibidor de GSK3-β) y colocar las hiPSCs en una incubadora húmeda deCO2 a 37 °C durante 24 h.
- Reemplace la mitad del sobrenadante con RPMI1640 + B27 medio sin insulina e incube las células durante otras 24 h.
- Reemplace completamente el medio de cultivo con RPMI1640 + B27 (sin insulina). Colocar las placas en una incubadora húmeda a 37 °C con un 5% deCO2 en posición vertical durante 24 h.
- Reemplazar completamente el medio de cultivo después de 3 días con RPMI1640 + B27 + 5 μM IWR1 (inhibidor de la vía de señalización Wnt) libre de insulina y colocar las placas en una incubadora húmeda a 37 °C con 5% deCO2 durante 48 h.
- Sustituir el medio de cultivo después de 5 días por RPMI1640 + B27 sin insulina y continuar incubando durante 48 h en una incubadora húmeda deCO2 a 37 °C.
- Reemplace el medio de cultivo con el medio RPMI + B27 (incluida la insulina) después de 7 días y coloque las placas en una incubadora humidificada deCO2 durante 3 días a 37 °C. Reemplace el medio con el medio RPMI + B27 cada 3 días. Busque el latido espontáneo de las células a los 9-12 días de diferenciación.
- Después de observar las células pulsantes, reemplace el medio RPMI + B27 con un medio RPMI 1640 libre de glucosa que contenga ácido láctico (1 ml de ácido láctico agregado a 500 ml de medio RPMI 1640 libre de glucosa). Incubar las células durante 72 h en una incubadora húmeda a 37 °C con 5% deCO2.
- Después de 72 h, sustituir el sobrenadante por RPMI + B27 medio e incubar durante 48 h en una incubadora húmeda a 37 °C con 5% deCO2.
- Aspirar el sobrenadante de cultivo bajo presión negativa y lavar las células 3 veces con PBS para eliminar los restos del medio de cultivo. Utilice la mezcla de enzimas de desprendimiento celular para disociar los hiPSC-CM en células individuales a 37 °C. Recoger las células obtenidas en un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 3 ml de solución de soporte de cardiomiocitos, centrifugar a 300 × g durante 2 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
- Resuspender las células con medio RPMI + B27, sembrarlas en placas de 6 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal e incubarlas durante 48 h en una incubadora húmeda a 37 °C con 5% deCO2.
- Sustituir el sobrenadante de cultivo para purificación por un medio RPMI 1640 libre de glucosa que contenga ácido láctico e incubar durante 72 h en una incubadora húmeda a 37 °C con 5% deCO2.
- Reemplace el sobrenadante de cultivo con RPMI + medio B27 y cambie el medio cada 3 días.
- Continuar el proceso anterior durante 30 días, reemplazando el sobrenadante de cultivo con un medio libre de glucosa que contenga ácido láctico para su posterior purificación. Incubar las células durante 3 días con este medio y reemplazar el sobrenadante con RPMI + B27. Cultive las células continuamente durante 30 días hasta que los hiPSC-CM latan de manera estable, y use estas células para inyección intramiocárdica en ratones.
2. Preparación de hiPSC-CMs y establecimiento de modelo de infarto agudo de miocardio en ratón
- Aspirar al vacío el sobrenadante de cultivo de hiPSC-CMs cultivados durante 60 días, lavar las células 3 veces con PBS y disociar los hiPSC-CMs en células individuales a 37 °C con la mezcla de enzimas de desprendimiento celular (~3-5 min). Recoja las células en un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 5 ml de medio RPMI + B27 y mezcle bien antes de contar las células para calcular el número total de células. Centrifugar la suspensión celular a 300 × g durante 2 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y añadir medio de soporte de cardiomiocitos para resuspender a una concentración de 0,6 × 105 células/μL.
- Mantener listo el tubo de centrífuga que contiene los hiPSC-CM resuspendidos a 37 °C para inyección 14,17,18,19,20.
- Coloque a los ratones en una caja de anestesia conectada con isoflurano para inducir la inhalación anestésica seguida del uso de ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
NOTA: La concentración de isoflurano fue del 5%. Preste atención a la ventilación del laboratorio durante el experimento. - Busque pérdida de reflejos en la región de los pies y la cola después de pellizcar cuando el mouse se coloca plano en la mesa de operaciones, lo que indica suficiente anestesia. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) por vía intraperitoneal.
- Unte el pelo en la mitad del cuello y el pecho izquierdo de los ratones con una crema depilatoria, y limpie la crema aplicada y el cabello con una gasa después de 5 minutos.
- Fije las extremidades y la cola del ratón con cinta adhesiva. Fije los incisivos del ratón con un hilo de seda 2-0 y cinta adhesiva. Esterilice el área quirúrgica (cuello mediano y tórax izquierdo) con tres rondas alternas de betadine seguidas de alcohol.
- Coloque una cortina quirúrgica alrededor del área quirúrgica esterilizada. Luego, haga una incisión mediana en el cuello con tijeras anatómicas finas y pinzas de disección finas para exponer completamente la tráquea. Si es necesario, corte algunos músculos cervicales anteriores para estabilizarlos.
NOTA: Los operadores estaban cegados a los grupos de animales. - Inserte un tubo traqueal (aguja de punción con catéter de 20 G) a través de la boca.
- Conecte el tubo traqueal al ventilador y verifique el movimiento torácico para asegurarse de que ambos pulmones estén bien ventilados.
- Ajustar los parámetros respiratorios (frecuencia respiratoria: 100-150 lpm, volumen corriente 250-300 μL). Después de eso, vuelva a fijar la extremidad posterior izquierda al lado inferior derecho, afloje la cinta alrededor de la extremidad superior izquierda y realice una toracotomía en el espacio intercostal 3-4 del tórax izquierdo utilizando tijeras de disección fina y fórceps para una exposición cardíaca máxima.
- Usando fórceps, despegue el pericardio bajo un microscopio para visualizar la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) en el borde inferior del apéndice auricular izquierdo.
- Use un hilo de seda 6-0 para ligar el extremo proximal del LAD. Después de asegurarse de que el modelo de IM agudo está adecuadamente establecido (cuando la LAD distal en el sitio de ligadura cambia de rojo a blanco), cierre el pecho capa por capa y suture la piel con puntos intermitentes de 4-0 roscas. Realizar todos los procedimientos quirúrgicos mencionados anteriormente para la inducción de IM para el grupo simulado de animales, excepto para la ligadura.
- Apague la anestesia por inhalación, retire la cánula después de que el ratón reanude la respiración espontánea y devuélvala a su jaula. Vigile al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. No lo devuelva a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. Administrar inyecciones intraperitoneales de buprenorfina (0,1 mg/kg x 3 días) y carprofeno (5 mg/kg x 1 día) cada 12 h después de la operación.
- Inyectar ciclosporina A (10 mg·kg-1·día-1) en la cavidad intraperitoneal de ratones 3 días antes de administrar hiPSC-CMs para evitar el rechazo de las células trasplantadas. Inyecte ciclosporina A continuamente durante 1 mes después del trasplante.
3. Inyección de hiPSC-CM bajo guía ecográfica
- Después de configurar el modelo IM, asigne los ratones modelo MI (ratones C57BL / 6 de 12 semanas de edad; 22 g a 24 g de peso, 50% machos y 50% hembras) a grupos de dosis única (DE, n = 8 en este estudio) y dosis múltiples (DM, n = 8 en este estudio) en el primer día posterior al IM y colóquelos en la primera y segunda semana después del IM en una caja de anestesia conectada con isoflurano al 5% para la inducción de anestesia por inhalación seguida de Intubación traqueal.
- Unte el pelo en el pecho y la parte superior del abdomen de los ratones con crema depilatoria y limpie la crema con una gasa 5 minutos más tarde. Controle la frecuencia cardíaca del ratón en la placa de operaciones y administre isoflurano por inhalación hasta que la frecuencia cardíaca se mantenga en 400-500 lpm.
- Fije las extremidades y la cola del ratón con cinta adhesiva en la consola de detección y ajuste la temperatura de la plataforma a 37 °C.
- Aplique una jalea de ultrasonido especial en la parte superior del abdomen y use una sonda de ultrasonido veterinaria de alta resolución más pequeña para obtener imágenes del hígado del ratón.
- Disminuya la frecuencia del ventilador a 50 lpm. Utilice una microjeringa de 5 μL para extraer ~3 × 105 células (del paso 2.1). Sosteniendo la jeringa con un micromanipulador, inserte una aguja de 3 mm en el proceso paraxifoide izquierdo (Figura 1A). Siga el borde superior del diafragma bajo guía ecográfica (Figura 1B), observe el ritmo respiratorio y el rango (Figura 1C, D) y entre en el pericardio al final del ciclo espiratorio evitando daños en el hígado y el pulmón (Figura 1D).
- Después de que la aguja del microinyector ingrese a la cavidad pericárdica, ajuste la frecuencia respiratoria al parámetro original (150 lpm). Adquirir la imagen paraesternal de eje largo del corazón del ratón mediante ecocardiografía de molde M de acuerdo con las instrucciones del fabricante17 (Figura 1E). Bajo guía ultrasónica, inyecte 3 × 10 5 células (Figura 1F) en tres áreas marginales (1 × 105 células por sitio inyectado) del sitio del infarto.
- Retire la sonda de ultrasonido especial y enjuague la gelatina. Destete al ratón de la anestesia por inhalación y devuélvalo a su jaula después de la plena conciencia.
- Repita los procedimientos anteriores de inyección de células guiadas por ultrasonido 1 y 2 semanas después de establecer el IM para los ratones del grupo MD.
4. Evaluación de la función cardíaca, marcado de fluorescencia, recuento de células trasplantadas, área infartada de miocardio y detección de mitocondrias humanas de órganos en ratones 30 días después de la ligadura de la rama descendente anterior izquierda
- Evaluación de la función cardíaca
- Coloque el ratón en una caja de anestesia conectada con isoflurano para anestesia por inducción-inhalación seguida del uso de ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia. Retire el vello del pecho izquierdo del ratón con crema depilatoria. Coloque el ratón en el panel de control para controlar la frecuencia cardíaca y ajustar la inhalación de isoflurano. Mantenga la frecuencia cardíaca del ratón a 400-500 lpm. El criterio de valoración experimental es el día 30 (después de la inducción del IM).
- Fije las extremidades y la cola del ratón con cinta adhesiva en la consola de detección y ajuste la temperatura de la plataforma a 37 °C.
- Después de aplicar un gel especial de ultrasonido en el área anterior del corazón, use una sonda de ultrasonido cardíaco de alta resolución (veterinaria) para adquirir imágenes paraesternales de eje largo y bidimensionales de eje corto bajo ecocardiografía de molde M y molde B de acuerdo con las instrucciones del fabricante17.
- Una vez completada la detección ultrasónica, enjuague el gel ultrasónico especial, apague la anestesia por inhalación y devuelva el ratón a su jaula por separado después de la plena conciencia.
- Analizar los datos obtenidos y calcular la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FE) y el acortamiento fraccional (FS) utilizando el software de análisis. Asegúrese de que el operador esté cegado a los grupos experimentales17.
- Etiquetado fluorescente de secciones
- Lavar el corazón aislado con PBS, sumergirlo en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 12 h. Saca el corazón y sumérgelo en sacarosa al 30% durante 24 h para deshidratarte.
- Incruste el corazón deshidratado con el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) en hielo seco. Cortar el corazón desde la parte inferior hasta el ápice con un grosor de criostato de 10 μm y colocar las secciones en portaobjetos y almacenar los portaobjetos a -20 °C.
- Lave los portaobjetos con el tejido cardíaco con PBS durante 3 minutos.
- Permeabilizar el tejido en portaobjetos con Triton X-100 al 0,5% a temperatura ambiente durante 8 min y lavarlos 3 veces con PBS durante 5 min por lavado.
- Después de cubrir el tejido con suero de burro al 10% y PBS al 90% (solución de bloqueo), bloquee las secciones durante 1 h a temperatura ambiente.
- Después de retirar la solución bloqueante, incubar las secciones con el anticuerpo primario (diluido a 1:100 con la solución bloqueante) durante la noche a 4 °C. Lávelos 3 veces con PBS durante 5 minutos por lavado.
- Incubar el tejido en portaobjetos con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (diluido a 1:100 con la solución de bloqueo) durante 1 h a temperatura ambiente.
NOTA: Evite exponer los tejidos con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos a la luz a partir de este momento. - Lave las diapositivas 3 veces con PBS durante 5 minutos por lavado.
- Monte los portaobjetos utilizando un medio de montaje que contiene 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y fotografíelos bajo un microscopio de fluorescencia17.
- Recuento de17 hiPSC-CMs trasplantados
- Realizar tinción de inmunofluorescencia tisular en secciones congeladas del corazón para detectar troponina T específica para peatones (hcTnT), antígeno nuclear humano (HNA) y alfa actinina sarcomérica inespecífica.
- Después de seccionar todo el corazón en serie, tome una sección por cada 50 secciones para el etiquetado de fluorescencia.
- Capture aleatoriamente cinco imágenes de gran aumento por sector. Cuente el número injertado de campos de visión, calcule el número promedio de células injertadas por unidad de área y configúrelos como A1/μm2. Calcule el área total injertada del sector utilizando ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) y establézcalo como B1μm2 de modo que el número injertado en este sector = A1 × B121,22.
- Calcular el número total de células injertadas por corazón de ratón utilizando Eq (1) y la tasa porcentual de injerto utilizando Eq (2), dado que se eligió una sección de cada 50 secciones21,22.
- Número total de células injertadas por corazón de ratón = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ Un × Bn) × 50 (1)
Tasa de injerto =
(2)
NOTA: El número de partos fue de 3 × 10 5 para el grupo SD y de 3 × 3 × 105 para el grupo DM.
- Evaluación del área infartada de miocardio
- Corte una sección transversal congelada (eje corto) del corazón aislado, desde el ápice hasta la base del corazón con un grosor de 10 μm.
- Después de seccionar en serie todo el corazón, tomar un portaobjetos de sección por cada 30 secciones y fijarlo en una solución de Bouin precalentada a 58 °C. Manchar la sección con tinciones de colágeno al 0,04% de Direct Red y 0,1% Fast Green (diluidas en PBS) según las instrucciones del fabricante17.
- Usar software (p. ej., ImageJ) para analizar las imágenes después de la fotografía transversal de cuerpo entero del corazón bajo un microscopio usando Eq (3):14,17
Área de infarto % =
× 100% (3)
- Detección de ADN mitocondrial humano en diversos órganos
- Anestesiar a los ratones con isoflurano al 5% y sacrificarlos por luxación cervical posterior. Diseccionar los ratones 4 semanas después del trasplante de células. Extraer los órganos (hígado, pulmón, cerebro, riñón, bazo) y parte del miocardio (n = 3 en esta sección).
- Moler cada tejido de órgano en nitrógeno líquido y extraer ADN del tejido utilizando el kit de referencia (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Siga las instrucciones del fabricante para utilizar el kit y los cebadores de referencia (consulte la Tabla de materiales) para detectar ADN mitocondrial humano en los tejidos mencionados anteriormente (a partir del paso 4.5.1).
(2)
× 100% (3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La ecocardiografía para la evaluación de la función ventricular izquierda de los ratones en cada grupo reveló que las lesiones de IM se revirtieron efectivamente en el grupo de DM (Figura 2A). En comparación con el grupo IM, el grupo SD mostró un aumento de la fracción de eyección (FE) (del 30% al 35%; Figura 2B) y acortamiento de fracciones (FS) (del 18% al 22%; Figura 2C) después de MI. Sin embargo, es aún más crucial tener en cuenta que las inyecciones múltiples de los hiPSC-CM en los ratones del grupo MD aumentaron percutáneamente la FE (del 30% al 42%; Figura 2B) y FS (del 18% al 28%; Figura 2C) del corazón del ratón después de IM.
El marcado de fluorescencia de α-actina inespecífica (αSA), DAPI, troponina T específica humana (hcTnT) y antígeno nuclear humano (HNA) de secciones de tejido mostró que el recuento de células trasplantadas en el grupo de DM fue significativamente mayor que en el grupo SD (Figura 3A). Aunque el grupo de DM solo recibió dos inyecciones más que el grupo de SD, el recuento de células trasplantadas en el grupo de DM fue ~ 10 veces mayor que el del grupo SD (Figura 3B). Además, el porcentaje de cardiomiocitos trasplantados en el grupo DM también fue significativamente mayor que en el grupo SD (Figura 3C). Este estudio también mostró que las células trasplantadas en el grupo DM se distribuyeron en el área del infarto y el área marginal del infarto, mientras que las células trasplantadas en el grupo SD solo se distribuyeron en el área del infarto (Figura 3A).
El área de IM en el grupo de tratamiento con SD fue menor que la del grupo de IM y el área de IM en el grupo de SD fue significativamente menor que en el grupo de DM (Figura 2E). Además, el grosor de la pared anterior del ventrículo izquierdo del grupo DM fue 4 veces mayor que el del grupo de IM miocárdico, mientras que el grosor de la pared anterior del ventrículo izquierdo en el grupo SD fue el doble que el del grupo IM (Figura 2F). Sin embargo, la fracción de volumen de colágeno en el grupo de DM fue 50% menor que en el grupo de IM, mientras que la fracción de volumen de colágeno en el grupo SD fue solo un 30% menor que en el grupo de IM (Figura 2G).
El recuento total de células que expresan IB4 (un marcador de células endoteliales) y SM22α (un marcador de células musculares lisas) 28 días después del IM aumentó significativamente en el grupo de DM (Figura 3D, E) en comparación con el grupo SD o MI. Este estudio también evaluó el grado de hipertrofia de los cardiomiocitos en la zona marginal de cada grupo. La tinción de fluorescencia de aglutinina de germen de trigo (WGA) y alfa actinina sarcomérica mostró que el diámetro mínimo de fibra (MFD) en ratones ligados en los tres grupos fue significativamente mayor que el de los ratones ligados simuladamente. Sin embargo, el MFD del grupo DM fue significativamente menor que el de los grupos IM y SD (Figura 3F, G). Este estudio utilizó además la inmunotinción TUNEL (que puede marcar el núcleo de todas las células apoptóticas) para evaluar la apoptosis de los cardiomiocitos. En comparación con el grupo SD o el grupo IM, la prevalencia de núcleos de cardiomiocitos TUNEL-positivos en el grupo DM se redujo significativamente (Figura 3H, I). No se detectó ADN mitocondrial humano en ningún órgano de los grupos simulado e IM (Figura 4A, B). Los grupos MD y SD solo mostraron ADN mitocondrial humano en el corazón, y no se detectó ADN mitocondrial humano en ningún otro órgano (Figura 4C, D).
Figura 1: Inyección de células intramiocárdicas guiadas por ultrasonido en ratones. Después de anestesiar al ratón en una mesa de operaciones, las extremidades y la cola se fijan con cinta adhesiva a una temperatura constante de 37 °C, mientras que la inyección intramiocárdica percutánea se administra en el ventrículo izquierdo, guiada por ecocardiografía. Los ratones fueron anestesiados y mantenidos por inhalación de isoflurano (1,5%-2%). Retire el vello en la parte superior del abdomen y el pecho del ratón. Bajo la guía de ecocardiografía transtorácica, inserte la punta de la microjeringa debajo del proceso xifoide (A) (flecha) y muévala (flecha) a lo largo del borde superior del diafragma (B) para ajustar la frecuencia respiratoria del ratón. Presione la punta de la aguja contra la pared pericárdica (C) en la fase inspiratoria. (D,E) La punta de la aguja entra en la cavidad pericárdica en la fase espiratoria y finalmente penetra en la pared anterior del ventrículo izquierdo (F) para inyectar células. Esta cifra se modificó de17. Abreviaturas: VI = ventrículo izquierdo; AO = aorta ascendente; RL = pulmón derecho; LL = pulmón izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la función cardíaca en ratones de cada grupo. (A) Utilizar ecocardiografía de alta resolución para evaluar la función ventricular izquierda antes de inducir el infarto de miocardio (pre-S) y 4 semanas después del tratamiento (post-S). La fracción de eyección (B) y el acortamiento de la fracción (C) se expresan como valores absolutos. Los datos se expresan como media ± EE, 8 por grupo. Evaluar el tamaño del infarto, el volumen de colágeno y la morfología del ventrículo izquierdo. A través de la tinción roja / verde rápido de Sirius (D), se midió el tamaño del infarto (E), el grosor de la pared anterior del ventrículo izquierdo (F) y la fracción de volumen de colágeno (G). Los datos muestran una media ± SE, 8 ratones por grupo. Barra de escala = 1 mm. Análisis unidireccional de varianza y prueba de comparación múltiple de Dunn. * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Esta cifra se modificó de17. Abreviaturas: pre-S = precirugía; post-S = post cirugía; IM = infarto de miocardio; DE = dosis única; DM = dosis múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación histológica de los corazones de ratones de cada grupo. (A) Las secciones seriadas de los ratones cardíacos inyectados con hiPSC-CM se tiñeron para hcTnT, actina α-sarcomérica (αSA) y DAPI. El número (B) y el porcentaje (C) de las células trasplantadas se utilizaron para la cuantificación. Las secciones seriadas de corazones de ratón operados con simulacro, MI, SD y MD sacrificados 4 semanas después de la inducción de IM se tiñeron histoquímicamente para detectar la presencia de IB4. (D,E) Los capilares se cuantifican como el número de estructuras vasculares positivas para IB4 en cada área de campo de alta potencia alrededor del infarto. Los cardiomiocitos fueron teñidos con WGA y αSA en la zona marginal del infarto de miocardio, y los núcleos fueron marcados con DAPI. (F,G) El área transversal de los cardiomiocitos se mide y se muestra como un valor absoluto. Las secciones marginales del infarto de miocardio se tiñeron con TUNEL para mostrar cardiomiocitos apoptóticos (rojo, TUNEL) y cardiomiocitos normales que expresan troponina T cardíaca (verde, cTnT). (H,I) Se calculó la proporción de células TUNEL-positivas a células totales. Barras de escala = 500 μm (A), 20 μm (D,H) o 10 μm (F). Análisis unidireccional de varianza y prueba de comparación múltiple de Dunn. * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Esta cifra se modificó de17. Abreviaturas: hcTnT = troponina T cardíaca humana; αSA = actina α-sarcomérica; WGA = aglutinina de germen de trigo; DAPI = 4', 6-diamidino-2-fenilindol; TUNEL = desoxinucleotidiltransferasa terminal dUTP nick end labeling; IM = infarto de miocardio; DE = dosis única; DM = dosis múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Detección de ADN mitocondrial humano en órganos de ratón de cada grupo. La figura muestra la detección de ADN mitocondrial humano en corazones de ratón y otros órganos en cada grupo 1 mes después de la PCR de trasplante celular. La PCR del ADN mitocondrial humano no encontró células trasplantadas (A, B) en los corazones y otros órganos de ratones en el grupo simulado (n = 3) y MI (n = 3). La PCR del ADN mitocondrial humano encontró células trasplantadas en los corazones de ratones en el grupo SD (n = 3) y MD (n = 3) pero no en otros órganos, incluidos el pulmón, el hígado, el riñón, el cerebro y el bazo (C, D). El análisis cuantitativo de qPCR del ADN mitocondrial humano mostró que el ADN mitocondrial humano del grupo MD era aproximadamente ocho veces mayor que el del grupo SD (E). (+) indica el control positivo de iPSC-CM. (−) indica el control negativo del agua DEPC. Abreviaturas: n.s. = no significativo; IM = infarto de miocardio; DE = dosis única; DM = dosis múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos críticos de este estudio incluyen cultivo de hiPSC, diferenciación de cardiomiocitos, purificación de hiPSC-CM y trasplante de hiPSC-CM en el sitio de infarto de miocardio de ratón. La clave es usar ultrasonido cardíaco para guiar transcutáneamente el tratamiento hacia el sitio del infarto en el borde del infarto donde se inyectaron hiPSC-CM en el área.
Con la prolongación del tiempo de cultivo, el fenotipo hiPSC-CM cambia en morfología (mayor tamaño celular), estructura (músculo, densidad de fibrillas, disposición, grupos de células microscópicas) y fisiología (tratamiento con calcio y respuesta β-adrenérgica) con diferenciación a lo largo del tiempo. En este estudio, el marcado de fluorescencia se realizó enlos días 10 y 60 de la diferenciación de hiPSC en cardiomiocitos para observar cambios morfológicosy estructurales. El tamaño de la célula y la longitud del sarcómero aumentaron significativamente en los hiPSC-CM en el día 60 que enel día 10. El estudio utilizó hiPSC-CMs que fueron relativamente estables después de 60 días de diferenciación en cardiomiocitos para trasplante. Además, durante los 60 días de cultivo de hiPSC-CMs, se realizaron múltiples reemplazos de medio de cultivo libre de glucosa que contiene ácido láctico para purificar cardiomiocitos y aumentar el contenido de cardiomiocitos para evitar efectos secundarios causados por no cardiomiocitos en las células trasplantadas.
Primero se colocó una sonda de ultrasonido en la parte superior del abdomen del ratón durante la inyección de células guiadas por ultrasonido para visualizar su hígado. La aguja microinyectora entró oblicuamente bajo el proceso xifoides, evitando el hígado y entrando en el pericardio bajo guía ecográfica. En este estudio, el pericardio no se evaluó verticalmente desde los huesos internos de la pared torácica, ya que esta vía hacia el área del infarto en el miocardio es significativamente corta, lo que representa un alto riesgo de punción cardíaca y fracaso del trasplante celular. Sin embargo, el acceso oblicuo al pericardio desde el proceso xifoideo hacia el miocardio constituye una vía considerablemente más larga con un menor riesgo de punción cardíaca. Durante la inyección celular guiada por ultrasonido, los ratones fueron intubados para regular la frecuencia respiratoria durante la punción. Regular la frecuencia respiratoria de los ratones y prolongar los tiempos de inhalación y espiración son propicios para la punción durante la espiración, lo que también evita dañar los pulmones. Durante este experimento, ningún ratón murió de ruptura cardíaca y lesión pulmonar después de la inyección celular.
Para la estabilidad de las células trasplantadas, el estudio consideró el punto de tiempo de la inyección de hiPSC-CM y el número de inyecciones. En la etapa temprana del IM, la inflamación severa ocurrió en el área infartada23. La supresión temprana de la respuesta inflamatoria en el sitio del infarto puede mejorar la remodelación miocárdica y limitar las posibilidades fatales para el sujeto experimental24. Además, una respuesta inflamatoria severa es una razón para la muerte celular trasplantada. Estudios previos han demostrado que el trasplante de cardiomiocitos diferenciados por células madre embrionarias en el sitio del infarto puede inhibir la respuesta inflamatoria en el sitio del infarto de miocardio25.
Después de que se estableció el modelo de IM de ratón, se inyectaron hiPSC-CM en el sitio del infarto y en la zona marginal infartada bajo visión directa; sólo una décima parte de los hiPSC-CM sobrevivieron. Sin embargo, el estudio sugiere que los hiPSC-CM inicialmente trasplantados pueden mejorar el microambiente en el sitio infartado de miocardio en ratones y mejorar la tasa de supervivencia de las células retrasplantadas. Los resultados mostraron que el número de células que sobrevivieron después de tres inyecciones de hiPSC-CM fue 10 veces mayor que el de una sola inyección de hiPSC-CM (Figura 3C). La ecografía mostró que el grosor de la pared anterior del ventrículo izquierdo en los grupos DM y SD fue mucho más delgado en la tercera y cuarta semana después del establecimiento del modelo de IM que en la primera y segunda semana. Por lo tanto, los ratones en el grupo MD fueron inyectados con células inmediatamente después de que se estableció el modelo de IM, y luego una y dos semanas después del infarto para evitar la muerte debido a la ruptura cardíaca.
Este estudio muestra que el número de células injertadas es significativamente mayor en el grupo de DM que en el grupo SD. La ecocardiografía del ratón mostró que los valores de FE y SF del grupo DM fueron mayores que los del grupo DE. La función paracrina de los hiPSC-CM trasplantados también debe considerarse junto con los cardiomiocitos trasplantados para mejorar la función cardíaca. Un estudio de Iwanaga et al.26 informó que los factores paracrinos secretados por hiPSC-CMs podrían promover la angiogénesis mediante la activación de Akt1. El estudio encontró muy pocas células isolectina B4 positivas en el área marginal del infarto en el grupo de IM. Por el contrario, hubo más células isolectinas B4 positivas en los grupos SD y MD que en el grupo IM; en particular, el grupo de DM tuvo la mayoría. Por lo tanto, estos resultados muestran que cuanto más injertados sean los hiPSC-CM, más fuertes serán los nuevos vasos sanguíneos en el sitio.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Plan de Investigación Principal de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 91539111a JY), el Proyecto Clave de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Hunan (No. 2020SK53420 a JY) y el Programa de Innovación Científica y Tecnológica de la Provincia de Hunan (2021RC2106 a CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Cardiac troponin T | Abcam | ab8295 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150105 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150110 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150062 | |
| Human cardiac troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Isolectin B4 | Vector | FL-1201 | |
| Sarcomeric alpha actinin | Abcam | ab9465 | |
| Wheat germ agglutinin | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| Reagent | |||
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | |
| B27 Supplement(minus insulin) | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement(serum free) | Thermo Fisher Scientific | 17–504-044 | |
| Bouin's solution | Thermo Fisher Scientific | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| cyclosporin A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| DIRECT RED | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| FAST GREEN FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| lactic acid | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356234 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix kit | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| RPMI1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff | Stem Cell Technologies | 5030 | |
| STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium | Stem Cell Technologies | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| ultrasound coupling agent | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Applied Biosystems | Thermo Fisher Scientific | 7500 Real-Time PCR | |
| cryostat | Leica | CM1950 | |
| fluoresence microscope | Olympus | IX83 | |
| fine anatomical scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro syringe | Hamilton | 7633 | |
| Small animal anesthesia machine | MATRX | VMR | |
| Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Software | |||
| Statistical Product and Service Solutions | IBM | 21 | |
| Image J | NIH | 1.48 | |
| Human mitochondrial DNA primers | |||
| the forward primer sequence | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| the reverse primer sequence | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
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