Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

השתלת קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אולטרסאונד בעכברים עם אוטם שריר הלב

Published: March 30, 2022 doi: 10.3791/63647
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 2, 3, 1,2, 1,2,3
1Department of Cardiovascular Surgery, Second Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research, 3Hunan Fangsheng Pharmaceutical Co., Ltd.

Summary

העברת תאים מונחית אולטרסאונד סביב האתר של אוטם שריר הלב בעכברים היא דרך בטוחה, יעילה ונוחה להשתלת תאים.

Abstract

המטרה העיקרית של טיפול תאי לאחר אוטם שריר הלב (MI) היא לשפר ביעילות את קצב השתלת התא, וקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) הם מקור תאים מבטיח לתיקון לב לאחר נזק איסכמי. עם זאת, שיעור השתלות נמוך מהווה מכשול משמעותי להתחדשות יעילה של רקמת הלב לאחר ההשתלה. פרוטוקול זה מראה כי מספר זריקות מלעוריות מונחות אולטרסאונד hiPSC-CM לאזור MI מגדילות ביעילות את שיעורי השתלת התאים. המחקר מתאר גם את כל תהליך תרבית hiPSC-CM, טיפול מקדים ושיטות לידה מלעורית מונחות אולטרסאונד. בנוסף, השימוש בדנ"א מיטוכונדריאלי אנושי עוזר לזהות היעדר hiPSC-CMs באיברי עכבר אחרים. לבסוף, מאמר זה מתאר את השינויים בתפקוד הלב, אנגיוגנזה, גודל התא ואפופטוזיס באזור הגבול האוטם בעכברים 4 שבועות לאחר מסירת התא. ניתן להסיק כי הזרקה מלעורית מונחית אקוקרדיוגרפיה של שריר הלב של החדר השמאלי היא טיפול תאי אפשרי, פולשני יחסית, משביע רצון, חוזר ויעיל.

Introduction

כאשר MI חריפה מתרחשת, תאי שריר הלב באזור אוטם למות במהירות עקב איסכמיה היפוקסיה. מספר גורמים דלקתיים משתחררים לאחר מוות וקרע של תאים, בעוד שתאי דלקת חודרים לאתר האוטם וגורמים לדלקת1. באופן משמעותי, פיברובלסטים וקולגן, הן ללא התכווצות והן מוליכות חשמלית, מחליפים את תאי שריר הלב באתר האוטם ויוצרים רקמת צלקת. בשל יכולת ההתחדשות המוגבלת של קרדיומיוציטים ביונקים בוגרים, רקמה בת קיימא הנוצרת לאחר שטח גדול של אוטם אינה מספקת בדרך כלל לשמירה על תפוקת לב מספקת2. MI גורם לאי ספיקת לב, ובמקרים חמורים של אי ספיקת לב, חולים יכולים להסתמך רק על השתלות לב או מכשירי סיוע חדריים כדי לשמור על תפקודי לב תקינים 3,4.

לאחר MI, אסטרטגיית הטיפול האידיאלית היא להחליף את cardiomyocytes מת עם cardiomyocytes שזה עתה נוצרו, יצירת צימוד אלקטרומכני עם רקמות בריאות. עם זאת, אפשרויות הטיפול אימצו בדרך כלל הצלת שריר הלב ולא החלפה. נכון לעכשיו, טיפולים מבוססי תאי גזע ותאי אב הם בין האסטרטגיות המבטיחות ביותר לקידום תיקון שריר הלב לאחר MI5. עם זאת, להשתלה של תאים אלה יש מספר בעיות, בעיקר חוסר היכולת של תאי גזע בוגרים להתמיין לקרדיומיוציטים ותוחלת החיים הקצרה שלהם6.

ניתן לעקוף את הסוגיות האתיות הקשורות לשימוש בתאי גזע עובריים (ES) על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים מוגנים, שהם מקור מבטיח לתאים. בנוסף, iPSCs הם בעלי יכולות התחדשות עצמית חזקות ויכולים להתמיין לקרדיומיוציטים7. מחקרים הראו כי hiPSC-CMs המושתלים באתר MI יכולים לשרוד וליצור צמתים מרווחים עם תאים מארחים 8,9. עם זאת, מכיוון שתאים מושתלים אלה ממוקמים במיקרו-סביבה של איסכמיה ודלקת, שיעור ההישרדות שלהם נמוך ביותר10,11.

מספר שיטות הוקמו כדי לשפר את שיעור ההישרדות של תאים מושתלים, כגון היפוקסיה והלם חום טיפול מקדים של תאים מושתלים 12,13, שינוי גנטי 14,15, והשתלה בו זמנית של תאים ונימים 16. למרבה הצער, רוב השיטות מוגבלות על ידי מורכבות ועלות גבוהה. לפיכך, המחקר הנוכחי מציע שיטת מתן hiPSC-CM ניתנת לשחזור, נוחה, פולשנית יחסית ויעילה.

הזרקת תאים תוך שריר הלב מונחה אולטרסאונד יכולה להתבצע רק עם מכשיר אולטרסאונד וטרינרי קטן ברזולוציה גבוהה ומיקרו-מזרק, ללא קשר לאתר. בהנחיית אולטרסאונד, העברה ישירה של תאים בתהליך הקסיפואיד מקרום הלב אל שריר הלב בעכברים היא פרוטוקול בטוח המונע נזק לכבד ולריאות. שיטה זו יכולה להיות משולבת בו זמנית עם טכנולוגיות אחרות כדי לשפר באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של תאים מושתלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים השני שיאנגיה באוניברסיטת מרכז דרום. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות כל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה. לוחות הזמנים להזרקת תאים, הדמיה והמתת חסד הם כדלקמן: t0- לגרום אוטם, t1 שבוע- תמונה ותאי שתל, t2 שבועות - תמונה ותאי שתל, t4 שבועות - הדמיה סופית, המתת חסד ואיסוף רקמות.

1. תרבית hiPSC, התמיינות קרדיומיוציטים וטיהור תאים

  1. ערבב DMEM/F12 ותמיסת מלאי מטריצת קרום מרתף עם קרח ב -4 ° C ביחס של 1.5: 1, aliquot, ואחסן את התערובת המתקבלת (מדלל מטריצה) ב -20 ° C. יש לערבב 25 מ"ל של מדיום תרבית DMEM/F12 בטמפרטורה של 4°C ו-1 מ"ל של מדלל מטריצה ביסודיות עם קרח, ולפזר 1 מ"ל/באר בצלחת בעלת 6 בארות. שמור את הצלחת זקופה במשך שעה אחת באינקובטור ב 37 ° C, ושאפו את הסופרנאטנט DMEM/F12 מהבארות. אין לגעת בתחתית הצלחת בעלת 6 הבארות בעת ביצוע ההליך.
  2. הסר את צינור השימור הקריוגני המכיל את hiPSCs מחנקן נוזלי והפשיר אותם במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. יש לעקר את המשטח החיצוני של צינור ההקפאה ב-75% אלכוהול, לנגב את האלכוהול ולהעביר את הצינור לשולחן סטרילי נקי במיוחד.
  3. השתמש פיפטה כדי להעביר בעדינות את פתרון ההקפאה המכיל hiPSCs לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל, להוסיף 5 מ"ל של תווך ES ללא מזין, ולצנטריפוגה את המתלה ב 300 × גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש בעדינות את התאים ב-6 מ"ל של מדיום ES נטול הזנה. ספור את התאים והתאם את ריכוז התא ל 5 × 105 תאים / מ"ל עם מדיום התרבית.
  4. הוסף מעכב ROCK (Y27632) ל- hiPSCs לריכוז סופי של 5 מיקרומטר. העבר את hiPSCs עם Y27632 לצלחת 6 בארות שטופלה במטריצת קרום מרתף, וסובב בעדינות את הצלחת בעלת 6 הקידוחים, תוך התחקות אחר צורת המספר "8" כדי לפזר באופן שווה את hiPSCs. מקם את hiPSCs באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 במצב זקוף למשך 24 שעות. החלף את הסופרנאטנט בתווך ES ללא מזין ללא Y27632.
  5. כאשר hiPSCs מגיעים לדרגת מפגש של 80%, שאפו את תרבית העל, שטפו את התאים פעמיים במי מלח חוצצי פוספט (PBS), הוסיפו RPMI1640 + B27 ללא אינסולין המכיל 10 מיקרומטר CHIR99021 (מעכב GSK3-β), והניחו את hiPSCs באינקובטור CO2 לח בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות.
  6. החליפו מחצית מהסופרנאטנט במדיום RPMI1640 + B27 ללא אינסולין ודגרו על התאים למשך 24 שעות נוספות.
  7. להחליף לחלוטין את המדיום תרבית עם RPMI1640 + B27 (ללא אינסולין). הניחו את הצלחות באינקובטור לח ב 37 °C עם 5% CO2 במצב זקוף במשך 24 שעות.
  8. החלף לחלוטין את מדיום התרבית לאחר 3 ימים עם RPMI1640 ללא אינסולין + B27 + 5 מיקרומטר IWR1 (מעכב מסלול איתות Wnt) ומקם את הלוחות באינקובטור לח ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות.
  9. החלף את מדיום התרבית לאחר 5 ימים עם RPMI1640 + B27 ללא אינסולין והמשך לדגור במשך 48 שעות באינקובטור CO2 לח ב 37 מעלות צלזיוס.
  10. החלף את מדיום התרבית בתווך RPMI + B27 (כולל אינסולין) לאחר 7 ימים והנח את הצלחות באינקובטור CO2 לח למשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס. החלף את המדיום בתווך RPMI + B27 כל 3 ימים. חפש את המכות הספונטניות של תאים ב 9-12 ימים של התמיינות.
  11. לאחר התבוננות בתאים הפועמים, החלף את מדיום RPMI + B27 בתווך RPMI 1640 ללא גלוקוז המכיל חומצה לקטית (1 מ"ל חומצה לקטית נוסף ל 500 מ"ל של מדיום RPMI 1640 ללא גלוקוז). לדגור על התאים במשך 72 שעות באינקובטור לח ב 37 ° C עם 5% CO2.
  12. לאחר 72 שעות, להחליף את supernatant עם RPMI + B27 בינוני לדגור במשך 48 שעות באינקובטור לח ב 37 ° C עם 5% CO2.
  13. שאפו את תרבית העל תחת לחץ שלילי ושטפו את התאים 3x עם PBS כדי להסיר עקבות של מדיום התרבית. השתמש בתערובת אנזימי ניתוק התאים כדי לנתק את hiPSC-CMs לתאים בודדים ב 37 ° C. לאסוף את התאים המתקבלים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של תמיסת תמיכה cardiomyocyte, צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשליך את supernatant.
  14. להשעות מחדש את התאים עם RPMI + B27 בינוני, זרע אותם על ממברנת מרתף מטריקס מצופה 6 צלחות באר, לדגור אותם במשך 48 שעות באינקובטור לח ב 37 ° C עם 5% CO2.
  15. יש להחליף את הסופרנאטנט התרבית לטיהור בתווך RPMI 1640 ללא גלוקוז המכיל חומצה לקטית ולדגור במשך 72 שעות באינקובטור לח ב-37°C עם 5%CO2.
  16. החליפו את הסופרנאטנט התרבית במדיום RPMI + B27 והחליפו את המדיום כל 3 ימים.
  17. המשך בתהליך הנ"ל במשך 30 יום, החלפת supernatant תרבית עם מדיום ללא גלוקוז המכיל חומצה לקטית לטיהור נוסף. לדגור את התאים במשך 3 ימים עם מדיום זה ולהחליף את supernatant עם RPMI + B27. תרבית את התאים ברציפות במשך 30 יום עד hiPSC-CMs לפעום ביציבות, ולהשתמש בתאים אלה להזרקה תוך שריר הלב בעכברים.

2. הכנת hiPSC-CMs והקמת מודל אוטם חריף של שריר הלב בעכבר

  1. שאפו ואקום את תרבית העל מ-hiPSC-CMs בתרבית במשך 60 יום, שטפו את התאים 3x עם PBS, ונתקו את hiPSC-CMs לתאים בודדים ב-37°C עם תערובת אנזימי ניתוק התא (~3-5 דקות). לאסוף את התאים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של RPMI + B27 בינוני ולערבב היטב לפני ספירת התאים כדי לחשב את מספר התאים הכולל. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 × גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהוסיף מדיום תמיכה קרדיומיוציטים להשעיה מחדש לריכוז של 0.6 × 105 תאים/μL.
  2. שמור את צינור הצנטריפוגה המכיל את hiPSC-CMs התלויים מחדש מוכן ב 37 ° C להזרקה 14,17,18,19,20.
  3. הניחו את העכברים בקופסת הרדמה המחוברת לאיזופלורן כדי לגרום לשאיפת הרדמה ולאחריה השתמשו במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
    הערה: ריכוז האיזופלורן היה 5%. שימו לב לאוורור המעבדה במהלך הניסוי.
  4. חפש אובדן רפלקסים באזור הרגליים והזנב לאחר צביטה כאשר העכבר מונח שטוח על שולחן הניתוחים, מה שמצביע על הרדמה מספקת. מתן buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally.
  5. מרחו את השיער על אמצע הצוואר ואת החזה השמאלי של העכברים עם קרם depilatory, ונגבו את הקרם והשיער עם גזה לאחר 5 דקות.
  6. תקן את הגפיים ואת זנב העכבר עם קלטת. תקן את חותכות העכבר עם חוט משי 2-0 קלטת. יש לעקר את אזור הניתוח (הצוואר החציוני והחזה השמאלי) עם שלושה סבבים לסירוגין של בטאדין ואחריו אלכוהול.
  7. מניחים וילון כירורגי סביב אזור הניתוח המעוקר. לאחר מכן, בצע חתך צוואר חציוני באמצעות מספריים אנטומיים עדינים ומלקחיים מנתחים עדינים כדי לחשוף את קנה הנשימה במלואו. במידת הצורך, יש לחתוך מספר שרירי צוואר הרחם הקדמיים לצורך ייצוב.
    הערה: המפעילים היו עיוורים לקבוצות בעלי החיים.
  8. החדרת צינור קנה הנשימה (מחט ניקוב קטטר 20 גרם) דרך הפה.
  9. חבר את צינור קנה הנשימה למכונת ההנשמה ובדוק את תנועת בית החזה כדי לוודא ששתי הריאות מאווררות היטב.
  10. התאם את פרמטרי הנשימה (קצב נשימה: 100-150 פעימות לדקה, נפח גאות ושפל 250-300 מיקרוליטר). לאחר מכן, מקבעים את הגפה האחורית השמאלית לצד ימין תחתון, משחררים את הסרט סביב הגפה השמאלית העליונה, ומבצעים כריתת בית החזה בחלל הבין-קוסטלי 3-4 של בית החזה השמאלי באמצעות מספריים ומלקחיים מנתחים עדינים לחשיפה מקסימלית ללב.
  11. באמצעות מלקחיים, לקלף את קרום הלב תחת מיקרוסקופ כדי לדמיין את העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי (LAD) בקצה התחתון של תוספתן פרוזדורים שמאל.
  12. השתמש בחוט משי 6-0 כדי לקשור את הקצה הפרוקסימלי של ה- LAD. לאחר שווידאתם שמודל MI החריף מבוסס כראוי (כאשר ה-LAD הדיסטלי באתר הקשירה משתנה מאדום ללבן), סגרו את החזה שכבה אחר שכבה ותפרו את העור ב-4-0 תפרים מושחלים לסירוגין. לבצע את כל ההליכים הכירורגיים הנ"ל להשראת MI לקבוצת בעלי החיים המזויפים למעט קשירה.
  13. כבו את חומר ההרדמה בשאיפה, הסירו את הצינורית לאחר שהעכבר חזר לנשימה ספונטנית, והחזירו אותה לכלוב. עקוב אחר בעל החיים עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה. אל תחזירו אותו לחברתם של בעלי חיים אחרים עד שיחלים לחלוטין. מתן זריקות intraperitoneal של buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג x 3 ימים) ו carprofen (5 מ"ג / ק"ג x 1 יום) כל 12 שעות לאחר הניתוח.
  14. הזריקו ציקלוספורין A (10 מ"ג·kg-1·day-1) לחלל התוך צפקי של עכברים 3 ימים לפני מתן hiPSC-CMs כדי למנוע דחייה של התאים המושתלים. להזריק cyclosporin A ברציפות במשך חודש לאחר ההשתלה.

3. הזרקת hiPSC-CM בהנחיית אולטרסאונד

  1. לאחר הגדרת מודל MI, הקצו את עכברי מודל MI (עכברי C57BL/6 בני 12 שבועות; משקל 22 גרם עד 24 גרם, 50% זכר ו-50% נקבה) לקבוצות מנה אחת (SD, n = 8 במחקר זה) ומנות מרובות (MD, n = 8 במחקר זה) ביום הראשון שלאחר MI והניחו אותם בשבוע הראשון והשני לאחר MI בקופסת הרדמה המחוברת עם 5% איזופלורן להשראת הרדמה באינהלציה ואחריה אינטובציה בקנה הנשימה.
  2. מורחים את השיער על החזה והבטן העליונה של העכברים עם קרם depilatory ולנגב את הקרם עם גזה 5 דקות מאוחר יותר. עקוב אחר קצב הלב של העכבר בלוח הניתוח ונהל איזופלורן שאיפה עד שקצב הלב נשמר ב 400-500 פעימות לדקה.
  3. תקן את גפיים העכבר ואת הזנב עם סרט על קונסולת האיתור ולהגדיר את טמפרטורת הפלטפורמה על 37 ° C.
  4. החל ג'לי אולטרסאונד מיוחד על הבטן העליונה והשתמש בבדיקת אולטרסאונד וטרינרית קטנה יותר ברזולוציה גבוהה כדי לקבל תמונות כבד עכבר.
  5. להקטין את קצב ההנשמה ל 50 פעימות לדקה. השתמש במיקרומזרק 5 μL כדי לצייר ~ 3 × 105 תאים (משלב 2.1). החזקת המזרק באמצעות מיקרומניפולטור, החדרת מחט בקוטר 3 מ"מ בתהליך הפארא-קסיפואיד השמאלי (איור 1A). עקבו אחר הקצה העליון של הסרעפת תחת הנחיית אולטרסאונד (איור 1B), התבוננו בקצב ובטווח הנשימה (איור 1C,D), והיכנסו לקרום הלב בסוף מחזור התפוגה תוך הימנעות מנזק לכבד ולריאות (איור 1D).
  6. לאחר שמחט המיקרו-מזרק נכנסת לחלל קרום הלב, התאם את קצב הנשימה לפרמטר המקורי (150 פעימות לדקה). רכשו את תמונת הציר הארוך של לב העכבר באמצעות אקוקרדיוגרפיה של M-mold בהתאם להוראות היצרן17 (איור 1E). תחת הנחיה על-קולית, הזריקו 3 × 105 תאים (איור 1F) לשלושה אזורים שוליים (1 × 105 תאים לכל אתר מוזרק) של אתר האוטם.
  7. הסר את בדיקת האולטרסאונד המיוחדת ושטוף את הג'לי. גמלו את העכבר מההרדמה באינהלציה, והחזירו אותו לכלוב לאחר הכרה מלאה.
  8. חזור על הליכי הזרקת התאים מונחי האולטרסאונד לעיל שבוע ושבועיים לאחר הקמת MI עבור עכברי קבוצת MD.

4. הערכת תפקוד הלב, תיוג פלואורסצנטי, ספירת תאים מושתלים, אזור אוטם שריר הלב וזיהוי מיטוכונדריה אנושית של איברים בעכברים 30 יום לאחר קשירת ענף יורד קדמי שמאלי

  1. הערכת תפקודי לב
    1. הכניסו את העכבר לקופסת הרדמה המחוברת לאיזופלורן לצורך הרדמה אינדוקציה-אינהלציה ואחריה שימוש במשחה וטרינרית על העיניים למניעת יובש בזמן הרדמה. הסר את השיער על החזה השמאלי של העכבר עם קרם depilatory. הנח את העכבר על לוח ההפעלה כדי לפקח על קצב הלב ולהתאים את שאיפת האיזופלורן. שמור על קצב הלב של העכבר על 400-500 פעימות לדקה. נקודת הסיום של הניסוי היא היום ה-30 (לאחר האינדוקציה של אמ"ן).
    2. תקן את גפיים העכבר ואת הזנב עם סרט על קונסולת האיתור ולהגדיר את טמפרטורת הפלטפורמה על 37 ° C.
    3. לאחר מריחת ג'ל אולטרסאונד מיוחד על אזור הלב הקדמי, יש להשתמש בבדיקת אולטרסאונד לב (וטרינרית) ברזולוציה גבוהה כדי לקבל תמונות פרסטרנליות ארוכות ציר ודו מימדי בציר קצר תחת אקוקרדיוגרפיה של M-mold ו- B-mold בהתאם להוראות היצרן17.
    4. לאחר השלמת הזיהוי האולטרסוני, יש לשטוף את הג'ל האולטרסוני המיוחד, לכבות את חומר ההרדמה בשאיפה, ולהחזיר את העכבר לכלוב בנפרד כשהוא בהכרה מלאה.
    5. נתח את הנתונים המתקבלים וחשב את מקטע פליטת החדר השמאלי (EF) ואת קיצור השבר (FS) באמצעות תוכנת הניתוח. ודא שהמפעיל עיוור לקבוצות הניסוי17.
  2. תיוג פלואורסצנטי של מקטעים
    1. לשטוף את הלב המבודד עם PBS, לטבול אותו 4% paraformaldehyde ב 4 ° C במשך 12 שעות. הוציאו את הלב וטבלו אותו ב-30% סוכרוז למשך 24 שעות כדי להתייבש.
    2. הטמע את הלב המיובש בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT) על קרח יבש. פורסים את הלב מלמטה לקודקוד בעובי קריוסטט של 10 מיקרומטר ומניחים את החלקים על שקופיות ומאחסנים את המגלשות ב -20 מעלות צלזיוס.
    3. שטפו את המגלשות עם רקמת הלב עם PBS למשך 3 דקות.
    4. יש להחדיר את הרקמה במגלשות עם 0.5% Triton X-100 בטמפרטורת החדר למשך 8 דקות ולשטוף אותן 3 פעמים עם PBS למשך 5 דקות לכל כביסה.
    5. לאחר כיסוי הרקמה עם 10% נסיוב חמור ו 90% PBS (פתרון חוסם), לחסום את החלקים במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    6. לאחר הסרת תמיסת החסימה, יש לדגור על החלקים עם הנוגדן הראשוני (מדולל ל-1:100 עם תמיסת החסימה) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. שטפו אותם 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות לכל כביסה.
    7. לדגור את הרקמה על שקופיות עם נוגדן משני מצומד פלואורופור (מדולל ל 1:100 עם הפתרון חוסם) במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
      הערה: הימנע מחשיפת הרקמות עם הנוגדן המשני המצומד פלואורופור לאור מנקודה זו ואילך.
    8. שטפו את המגלשות 3 פעמים עם PBS למשך 5 דקות לכל כביסה.
    9. הרכיבו את השקופיות באמצעות מדיום הרכבה 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) המכיל וצילום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי17.
  3. מספר ה-hiPSC-CMs המושתלים17
    1. בצע צביעה אימונופלואורסצנטית של רקמות על חלקים קפואים של הלב עבור טרופונין T ספציפי להולכי רגל (hcTnT), אנטיגן גרעיני אנושי (HNA), ואלפא אקטינין סרקומרי לא ספציפי.
    2. לאחר שכל הלב נחתך באופן סדרתי, קח קטע אחד לכל 50 חלקים לתיוג פלואורסצנטי.
    3. צלמו באופן אקראי חמש תמונות בהגדלה גבוהה לכל פרוסה. ספור את מספר שדות הראייה המושתלים, חשב את מספרי התאים המושתלים הממוצעים ליחידת שטח והגדר אותם כ- A1/μm2. חשב את השטח המושתל הכולל של הפרוסה באמצעות ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) והגדר אותו כ- B1μm2 כך שהמספר המושתל בפרוסה זו = A1 ×- B121,22.
    4. חשב את המספר הכולל של תאים מושתלים לכל לב עכבר באמצעות Eq (1) ואת שיעור הקליטה באחוזים באמצעות Eq (2), בהינתן שנבחר קטע אחד מכל 50 מקטעים21,22.
    5. המספר הכולל של תאים מושתלים לכל לב עכבר = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ An × Bn) × 50 (1)
      קצב קליטה = Equation 1 (2)
      הערה: מספר המסירות היה 3 × 10 5 עבור קבוצת SD ו- 3 × 3 × 105 עבור קבוצת MD.
  4. הערכת אזור אוטם שריר הלב
    1. חותכים חתך קפוא (ציר קצר) של הלב המבודד, מהקודקוד לבסיס הלב בעובי של 10 מיקרומטר.
    2. לאחר שכל הלב נחתך באופן סדרתי, קח שקופית קטע אחת לכל 30 חלקים ותקן אותה בתמיסת Bouin שחוממה מראש ב 58 ° C. צבעו את החלק בכתמי קולגן 0.04% אדום ישיר ו-0.1% ירוק מהיר (מדולל ב-PBS) בהתאם להוראות היצרן17.
    3. השתמש בתוכנה (למשל, ImageJ) כדי לנתח את התמונות לאחר צילום חתך של כל הגוף של הלב תחת מיקרוסקופ באמצעות Eq (3):14,17
      שטח אינפרקט % = Equation 2 × 100% (3)
  5. איתור DNA מיטוכונדריאלי אנושי באיברים שונים
    1. מרדימים את העכברים עם איזופלורן 5% ומקריבים אותם על ידי נקע צוואר הרחם האחורי. נתחו את העכברים 4 שבועות לאחר השתלת התא. קצור את האיברים (כבד, ריאות, מוח, כליות, טחול) וחלק משריר הלב (n = 3 בסעיף זה).
    2. טוחנים כל רקמת איבר בחנקן נוזלי ומפיקים DNA מהרקמה באמצעות ערכת ההפניה (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
    3. פעל בהתאם להוראות היצרן כדי להשתמש בערכה ובפריימרים שהוזכרו לעיל (ראה טבלת חומרים) כדי לזהות DNA מיטוכונדריאלי אנושי ברקמות שהוזכרו לעיל (משלב 4.5.1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אקוקרדיוגרפיה להערכת תפקוד החדר השמאלי של העכברים בכל קבוצה גילתה שפציעות MI התהפכו ביעילות בקבוצת MD (איור 2A). בהשוואה לקבוצת MI, קבוצת SD הראתה מקטע פליטה מוגבר (EF) (מ -30% ל -35%; איור 2B) וקיצור שברים (FS) (מ-18% ל-22%; איור 2C) אחרי MI. עם זאת, חשוב עוד יותר לציין כי זריקות מרובות של hiPSC-CMs בעכברי קבוצת MD הגדילו את EF באופן מלעורי (מ -30% ל -42%; איור 2B) ו- FS (מ -18% ל -28%; איור 2C) של לב העכבר אחרי MI.

תיוג פלואורסצנטי של α-אקטין לא ספציפי (αSA), DAPI, טרופונין T ספציפי לאדם (hcTnT) ואנטיגן גרעיני אנושי (HNA) של חלקי רקמות הראה שספירת התאים המושתלים בקבוצת MD הייתה גבוהה משמעותית מזו שבקבוצת SD (איור 3A). אף על פי שקבוצת ה-MD קיבלה רק שתי זריקות יותר מאשר קבוצת ה-SD, ספירת התאים המושתלים בקבוצת ה-MD הייתה ~פי 10 מזו של קבוצת ה-SD (איור 3B). נוסף על כך, אחוז הקרדיומיוציטים המושתלים בקבוצת MD היה גם הוא גבוה משמעותית מזה שבקבוצת SD (איור 3C). מחקר זה הראה גם שהתאים המושתלים בקבוצת MD פוזרו באזור האוטם ובאזור האוטם השולי, בעוד שהתאים המושתלים בקבוצת SD פוזרו רק באזור האוטם (איור 3A).

אזור ה-MI בקבוצת הטיפול ב-SD היה קטן יותר מזה שבקבוצת ה-MI, ואזור ה-MI בקבוצת ה-SD היה קטן משמעותית מזה שבקבוצת ה-MD (איור 2E). נוסף על כך, עובי הדופן הקדמית של החדר השמאלי בקבוצת MD היה פי 4 מזה של קבוצת MI של שריר הלב, בעוד שעובי הדופן הקדמית של החדר השמאלי בקבוצת SD היה כפול מזה של קבוצת MI (איור 2F). אולם מקטע נפח הקולגן בקבוצת MD היה נמוך ב-50% מזה שבקבוצת MI, בעוד שמקטע נפח הקולגן בקבוצת SD היה נמוך רק ב-30% מזה שבקבוצת MI (איור 2G).

הספירה הכוללת של תאים המבטאים IB4 (סמן תאי אנדותל) ו-SM22α (סמן תאי שריר חלק) 28 ימים לאחר MI עלתה באופן משמעותי בקבוצת MD (איור 3D,E) בהשוואה לקבוצת SD או MI. מחקר זה העריך גם את מידת ההיפרטרופיה של קרדיומיוציטים באזור השוליים של כל קבוצה. צביעה פלואורסצנטית של נבט חיטה (WGA) ואלפא אקטינין סרקומרי הראו כי קוטר הסיבים המינימלי (MFD) בעכברים קשורים בכל שלוש הקבוצות היה גבוה משמעותית מזה של העכברים שקיבלו קשירת דמה. אולם ה-MFD של קבוצת MD היה קטן משמעותית מזה של קבוצות MI ו-SD (איור 3F,G). מחקר זה השתמש גם ב- TUNEL immunostaining (שיכול לסמן את הגרעין של כל התאים האפופטוטיים) כדי להעריך את האפופטוזיס של קרדיומיוציטים. בהשוואה לקבוצת SD או MI, השכיחות של גרעיני קרדיומיוציטים חיוביים לטונל בקבוצת MD ירדה באופן משמעותי (איור 3H,I). דנ"א מיטוכונדריאלי אנושי לא זוהה בשום איבר בקבוצות הדמה וה-MI (איור 4A,B). קבוצות MD ו-SD הראו רק דנ"א מיטוכונדריאלי אנושי בלב, ולא זוהה דנ"א מיטוכונדריאלי אנושי בשום איבר אחר (איור 4C,D).

Figure 1
איור 1: הזרקת תאים תוך שריר הלב מונחה אולטרסאונד בעכברים. לאחר שהעכבר מורדם על שולחן ניתוחים, הגפיים והזנב קבועים בסרט בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס, בעוד הזרקת תוך שריר הלב המלעורית ניתנת בחדר השמאלי, מונחה על ידי אקוקרדיוגרפיה. העכברים הורדמו והוחזקו בשאיפת איזופלורן (1.5%-2%). הסר את השיער על הבטן העליונה והחזה של העכבר. בהנחיית אקוקרדיוגרפיה טרנס-חזה, הכנס את קצה המיקרו-מזרק מתחת לתהליך הקסיפואיד (A) (חץ) והזז אותו (חץ) לאורך הקצה העליון של הסרעפת (B) כדי להתאים את קצב הנשימה של העכבר. לחץ על קצה המחט כנגד דופן קרום הלב (C) בשלב ההשראה. (ד,ה) קצה המחט נכנס לחלל קרום הלב בשלב התפוגה ולבסוף חודר לדופן החדר השמאלי הקדמי (F) כדי להזריק תאים. נתון זה שונהמ-17. קיצורים: LV = החדר השמאלי; AO = אבי העורקים העולה; RL = ריאה ימנית; LL = ריאה שמאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הערכת תפקוד הלב בעכברים בכל קבוצה. (A) השתמש באקוקרדיוגרפיה ברזולוציה גבוהה כדי להעריך את תפקוד החדר השמאלי לפני גרימת אוטם שריר הלב (pre-S) ו-4 שבועות לאחר הטיפול (post-S). שבר הפליטה (B) וקיצור השבר (C) מבוטאים כערכים מוחלטים. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SE, 8 לכל קבוצה. יש להעריך את גודל האוטם, נפח הקולגן ומורפולוגיה של החדר השמאלי. באמצעות צביעה אדומה/ירוקה מהירה של סיריוס (D), גודל אוטם (E), עובי דופן החדר הקדמי השמאלי (F) ומקטע נפח הקולגן (G). הנתונים מראים ממוצע ± SE, 8 עכברים לקבוצה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. ניתוח חד-כיווני של שונות ומבחן ההשוואה המרובה של דאן. * * עמ' < 0.01; * * * עמ' < 0.001; * * * * p < 0.0001. נתון זה שונהמ-17. קיצורים: pre-S = טרום ניתוח; post-S = לאחר ניתוח; MI = אוטם שריר הלב; SD = מנה אחת; MD = מינון מרובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הערכה היסטולוגית של לבבות עכברים בכל קבוצה . (A) חלקים סדרתיים של עכברי הלב שהוזרקו עם hiPSC-CM הוכתמו עבור hcTnT, אקטין α-סרקומרי (αSA) ו-DAPI. מספר (B) ואחוז (C) של התאים המושתלים שימשו לכימות. קטעים טוריים מלבבות עכברים המופעלים על ידי דמה, MI, SD ו-MD שהוקרבו 4 שבועות לאחר השראת MI הוכתמו היסטוכימית בשל נוכחותו של IB4. (ד,ה) נימים מכומתים כמספר מבני כלי הדם החיוביים ל-IB4 בכל אזור שדה בעל עוצמה גבוהה סביב האינפרקט. הקרדיומיוציטים הוכתמו ב-WGA וב-αSA באזור השולי של אוטם שריר הלב, והגרעינים סומנו ב-DAPI. (ו,ז) שטח החתך של קרדיומיוציטים נמדד ומוצג כערך מוחלט. החלקים השוליים של אוטם שריר הלב הוכתמו ב-TUNEL כדי להראות קרדיומיוציטים אפופטוטיים (אדום, TUNEL) וקרדיומיוציטים רגילים המבטאים טרופונין T לבבי (ירוק, cTnT). (ח,ט) חושב היחס בין תאים חיוביים לסך כל התאים. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר (A), 20 מיקרומטר (D,H) או 10 מיקרומטר (F). ניתוח חד-כיווני של שונות ומבחן ההשוואה המרובה של דאן. * עמ' < 0.05; * * עמ' < 0.01; * * * עמ' < 0.001; * * * * p < 0.0001. נתון זה שונהמ-17. קיצורים: hcTnT = טרופונין לב אנושי T; αSA = α-אקטין סרקומרי; WGA = נבט חיטה agglutinin; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; TUNEL = מסוף deoxynucleotidyl transferase dUTP ניק סוף תיוג; MI = אוטם שריר הלב; SD = מנה אחת; MD = מינון מרובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: זיהוי דנ"א מיטוכונדריאלי אנושי באיברי עכבר בכל קבוצה. האיור מראה את זיהוי הדנ"א המיטוכונדריאלי האנושי בלבבות עכברים ואיברים אחרים בכל קבוצה חודש לאחר השתלת תאים PCR. PCR של דנ"א מיטוכונדריאלי אנושי לא מצא תאים מושתלים (A,B) בלבבות ובאיברים אחרים של עכברים בקבוצת דמה (n = 3) ו- MI (n = 3). PCR של DNA מיטוכונדריאלי אנושי מצא תאים מושתלים בלבבות עכברים בקבוצת SD (n = 3) ו- MD (n = 3) אך לא באיברים אחרים, כולל הריאות, הכבד, הכליות, המוח והטחול (C,D). ניתוח כמותי qPCR של דנ"א מיטוכונדריאלי אנושי הראה כי הדנ"א המיטוכונדריאלי האנושי של קבוצת MD היה בערך פי שמונה מזה של קבוצת SD (E). (+) מציין שליטה חיובית ב- iPSC-CMs. (−) מציין בקרת מים שלילית של DEPC. קיצורים: n.s. = לא משמעותי; MI = אוטם שריר הלב; SD = מנה אחת; MD = מינון מרובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלבים הקריטיים של מחקר זה כוללים תרבית hiPSC, התמיינות קרדיומיוציטים, טיהור hiPSC-CM והשתלת hiPSC-CM באתר אוטם שריר הלב של עכבר. המפתח הוא להשתמש באולטרסאונד לב כדי לכוון את הטיפול באופן טרנסעורי לכיוון אתר האוטם בקצה האוטם שבו הוזרקו לאזור hiPSC-CMs.

עם התארכות זמן התרבית, הפנוטיפ hiPSC-CM משתנה במורפולוגיה (גודל תא גדול יותר), מבנה (שריר, צפיפות סיבים, סידור, אשכולות תאים מיקרוסקופיים) ופיזיולוגיה (טיפול בסידן ותגובה β-אדרנרגית) עם התמיינות לאורך זמן. במחקר זה, תיוג פלואורסצנטי בוצע בימים ה -10 וה-60 של התמיינות hiPSC לקרדיומיוציטים כדי לצפות בשינויים מורפולוגיים ומבניים. גודל התא ואורך הסרקומר גדלו באופן משמעותי ב-hiPSC-CMs ביום ה-60 מאשר ביוםה-10. המחקר השתמש ב- hiPSC-CMs שהיו יציבים יחסית לאחר 60 יום של התמיינות לקרדיומיוציטים להשתלה. בנוסף, במהלך 60 הימים של תרבית hiPSC-CMs, החלפות מרובות של מדיום תרבית ללא גלוקוז המכיל חומצה לקטית בוצעו כדי לטהר cardiomyocytes ולהגדיל את התוכן cardiomyocyte כדי למנוע תופעות לוואי הנגרמות על ידי noncardiomyocytes בתאים המושתלים.

בדיקת אולטרסאונד הונחה לראשונה על בטנו העליונה של העכבר במהלך הזרקת תאים מונחי אולטרסאונד כדי לדמיין את הכבד שלו. מחט המיקרו-מזרק נכנסה בצורה אלכסונית תחת תהליך הקסיפואיד, נמנעה מהכבד ונכנסה לקרום הלב בהנחיית אולטרסאונד. במחקר זה, קרום הלב לא הוערך אנכית מהעצמות הפנימיות של דופן החזה מכיוון שמסלול זה לכיוון אזור האוטם בשריר הלב קצר באופן משמעותי, ומהווה סיכון גבוה לניקוב לב וכישלון השתלת תאים. עם זאת, גישה אלכסונית לקרום הלב מתהליך הקסיפואיד לכיוון שריר הלב מהווה מסלול ארוך משמעותית עם סיכון נמוך יותר לניקוב לבבי. במהלך הזרקת התאים מונחה האולטרסאונד, העכברים עברו אינטובציה כדי לווסת את קצב הנשימה במהלך הניקוב. ויסות קצב הנשימה של העכברים והארכת זמני השאיפה והתפוגה תורמים לניקוב במהלך התפוגה, אשר גם מונע פגיעה בריאות. במהלך ניסוי זה, אף עכבר לא מת מקרע בלב ומפגיעה בריאה לאחר הזרקת תאים.

עבור יציבות התאים המושתלים, המחקר לקח בחשבון את נקודת הזמן של הזרקת hiPSC-CM ואת מספר הזריקות. בשלב המוקדם של MI, דלקת חמורה התרחשה באזור אוטם23. דיכוי מוקדם של התגובה הדלקתית באתר האוטם יכול לשפר את עיצוב שריר הלב ולהגביל את האפשרויות הקטלניות עבור נבדק הניסוי24. בנוסף, תגובה דלקתית חמורה היא סיבה למוות תאי מושתל. מחקרים קודמים הראו כי השתלת קרדיומיוציטים ממוינים של תאי ES באתר האוטם יכולה לעכב את התגובה הדלקתית באתר אוטם שריר הלב25.

לאחר הקמת מודל MI של העכבר, הוזרקו hiPSC-CMs לאתר האוטם ולאזור השוליים האוטם תחת ראייה ישירה; רק עשירית מה-hiPSC-CMs שרדו. עם זאת, המחקר מציע כי hiPSC-CMs שהושתלו בתחילה עשויים לשפר את המיקרו-סביבה באתר אוטם שריר הלב בעכברים ולשפר את שיעור ההישרדות של תאים מושתלים מחדש. התוצאות הראו שמספר התאים ששרדו לאחר שלוש זריקות hiPSC-CM היה פי 10 מזה של הזרקת hiPSC-CM אחת (איור 3C). אולטרסאונד הראה כי עובי הדופן הקדמית של החדר השמאלי בקבוצות MD ו- SD היה דק בהרבה בשבוע השלישי והרביעי לאחר הקמת מודל MI מאשר בשבוע הראשון והשני. לפיכך, לעכברים בקבוצת MD הוזרקו תאים מיד לאחר הקמת מודל MI, ולאחר מכן שבוע ושבועיים לאחר אוטם כדי למנוע מוות עקב קרע לבבי.

מחקר זה מראה כי מספר התאים המושתלים גבוה משמעותית בקבוצת MD מאשר בקבוצת SD. אקוקרדיוגרפיה של העכבר הראתה כי ערכי EF ו- SF של קבוצת MD היו גבוהים יותר מאלה של קבוצת SD. יש לשקול גם את הפונקציה הפרקרינית של hiPSC-CMs המושתלים יחד עם קרדיומיוציטים מושתלים כדי לשפר את תפקוד הלב. מחקר שנערך על ידי Iwanaga et al.26 דיווח כי הגורמים הפרקריניים המופרשים על ידי hiPSC-CMs יכולים לקדם אנגיוגנזה על ידי הפעלת Akt1. המחקר מצא מעט מאוד תאים חיוביים לאיזולקטין B4 באזור אוטם השולי בקבוצת MI. לעומת זאת, היו יותר תאים חיוביים לאיזולקטין B4 בקבוצות SD ו-MD מאשר בקבוצת MI; יש לציין כי לקבוצת MD היה הכי הרבה. לפיכך, תוצאות אלה מראות כי ככל שהושתלו יותר hiPSC-CMs מושתלים, כך יהיו חזקים יותר כלי הדם החדשים באתר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר העיקרית של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '91539111ל JY), פרויקט מפתח של מדע וטכנולוגיה של מחוז הונאן (מס '2020SK53420 ל- JY) ותוכנית החדשנות במדע וטכנולוגיה של מחוז הונאן (2021RC2106 עד CF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody
Cardiac troponin T Abcam ab8295
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150105
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) Abcam ab150110
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150073
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) Abcam ab150062
Human cardiac troponin T Abcam ab91605
Isolectin B4 Vector FL-1201
Sarcomeric alpha actinin Abcam ab9465
Wheat germ agglutinin Thermo Fisher Scientific W11261
Reagent
Accutase Thermo Fisher Scientific 00-4555-56
B27 Supplement(minus insulin) Thermo Fisher Scientific A1895601
B27 Supplement(serum free) Thermo Fisher Scientific 17–504-044
Bouin's solution Thermo Fisher Scientific SDHT10132
CHIR99021 Selleck CT99021
cyclosporin A Medchemexpress HY-B0579
DIRECT RED Sigma-Aldrich 365548-25G
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320033
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
FAST GREEN FCF Sigma-Aldrich  F7252-5G
Glucose-free RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific 11879020
IWR1 Selleck S7086
lactic acid Sigma-Aldrich L6661
Matrigel BD Biosciences BD356234
mTeSR1 Stem Cell Technologies 72562
O.C.T. Compound SAKURA 4583
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PowerUP SYBR Green MasterMix kit Thermo Fisher Scientific A25742
RPMI1640 Thermo Fisher Scientific 11875119
STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff Stem Cell Technologies 5030
STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium Stem Cell Technologies 5027
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
ultrasound coupling agent CARENT 22396269389
Y-27632 Selleck S6390
Equipment and Supplies
Applied Biosystems Thermo Fisher Scientific 7500 Real-Time PCR
cryostat Leica CM1950
fluoresence microscope Olympus IX83
fine anatomical scissors Fine Science Tools 15000-08
fine dissecting forceps Fine Science Tools 11255-20
Micro syringe Hamilton 7633
Small animal anesthesia machine MATRX VMR
Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system VisualSonics Vevo 2100
Software
Statistical Product and Service Solutions IBM 21
Image J NIH 1.48
Human mitochondrial DNA primers
the forward primer sequence CCGCTACCATAATCATCGCTAT
the reverse primer sequence TGCTAATACAATGCCAGTCAGG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
  2. Lázár, E., et al. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
  3. Davis, M. K., et al. State of the art: cardiac transplantation. Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).
  4. Mancini, D., Colombo, P. C. Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant. Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).
  5. Zimmermann, W. H. Translating myocardial remuscularization. Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).
  6. Hu, X., et al. A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization. Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).
  7. Kempf, H., et al. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).
  8. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
  9. Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
  10. Nguyen, P. K., et al. Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review. JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).
  11. Zimmermann, W. H. Remuscularization of the failing heart. The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).
  12. Hu, X., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).
  13. Feng, Y., et al. Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway. Stem Cells. 32 (2), Dayton, Ohio. 462-472 (2014).
  14. Fan, C., et al. Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).
  15. Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
  16. Sun, X., et al. Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats. Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).
  17. Wu, X., et al. Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873 (2021).
  18. Kannappan, R., et al. Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair. Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).
  19. Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
  20. Zhao, M., et al. Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice. Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).
  21. Zhao, M., et al. Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452 (2019).
  22. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
  23. Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
  24. Rainer, P. P., et al. Cardiomyocyte-specific transforming growth factor β suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction. Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).
  25. Yu, Y., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 167 (2019).
  26. Iwanaga, K., et al. Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).

Tags

רפואה גיליון 181 תרפיה תאית אקוקרדיוגרפיה מונחית הזרקה תוך שריר הלב תאי גזע פלוריפוטנטיים
השתלת קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אולטרסאונד בעכברים עם אוטם שריר הלב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, X., Qin, K., Wang, D., Xiang,… More

Wu, X., Qin, K., Wang, D., Xiang, K., Peng, J., Guo, J., Yang, J., Fan, C. Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice. J. Vis. Exp. (181), e63647, doi:10.3791/63647 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter