Summary
Доставка клеток под контролем УЗИ вокруг места инфаркта миокарда у мышей является безопасным, эффективным и удобным способом трансплантации клеток.
Abstract
Основной целью клеточной терапии после инфаркта миокарда (ИМ) является эффективное повышение скорости пересадки клеток, а индуцированные плюрипотентными стволовыми клетками человека кардиомиоциты (hiPSC-CM) являются перспективным источником клеток для восстановления сердца после ишемического повреждения. Однако низкая скорость пересадки является существенным препятствием для эффективной регенерации сердечной ткани после трансплантации. Этот протокол показывает, что многократные чрескожные инъекции hiPSC-CM под ультразвуковым контролем в область ИМ эффективно увеличивают частоту трансплантации клеток. В исследовании также описывается весь процесс культивирования hiPSC-CM, предварительная обработка и методы чрескожной доставки под ультразвуковым контролем. Кроме того, использование митохондриальной ДНК человека помогает обнаружить отсутствие hiPSC-CM в других органах мыши. Наконец, в этой статье описываются изменения сердечной функции, ангиогенеза, размера клеток и апоптоза в инфарктной пограничной зоне у мышей через 4 недели после доставки клеток. Можно сделать вывод, что чрескожная инъекция миокарда левого желудочка под контролем эхокардиографии является осуществимой, относительно инвазивной, удовлетворительной, воспроизводимой и эффективной клеточной терапией.
Introduction
При возникновении острого ИМ клетки миокарда в области инфаркта быстро погибают из-за ишемии и гипоксии. Несколько воспалительных факторов высвобождаются после гибели и разрыва клеток, в то время как воспалительные клетки проникают в место инфаркта, вызывая воспаление1. Примечательно, что фибробласты и коллаген, не обладающие сократительной способностью и электропроводностью, заменяют клетки миокарда в месте инфаркта с образованием рубцовой ткани. Из-за ограниченной способности к регенерации кардиомиоцитов у взрослых млекопитающих жизнеспособная ткань, образовавшаяся после большой площади инфаркта, обычно недостаточна для поддержания достаточного сердечного выброса2. Инфаркт миокарда вызывает сердечную недостаточность, и в тяжелых случаях сердечной недостаточности пациенты могут полагаться только на трансплантацию сердца или вспомогательные желудочковые устройства для поддержания нормальных функций сердца 3,4.
После инфаркта миокарда идеальной стратегией лечения является замена мертвых кардиомиоцитов новообразованными кардиомиоцитами, образующими электромеханическую связь со здоровыми тканями. Тем не менее, варианты лечения, как правило, предусматривают спасение миокарда, а не замену. В настоящее время терапия на основе стволовых клеток и клеток-предшественников является одной из наиболее перспективных стратегий для содействия восстановлению миокарда после ИМ5. Однако трансплантация этих клеток имеет несколько проблем, в первую очередь неспособность взрослых стволовых клеток дифференцироваться в кардиомиоциты и их короткую продолжительность жизни6.
Этические проблемы, связанные с использованием эмбриональных стволовых клеток (ES), могут быть обойдены с помощью ИПСК, которые являются многообещающим источником клеток. Кроме того, ИПСК обладают сильными способностями к самообновлению и могут дифференцироваться в кардиомиоциты7. Исследования показали, что hiPSC-CM, трансплантированные в сайт ИМ, могут выживать и образовывать щелевые соединения с клетками-хозяевами 8,9. Однако, поскольку эти трансплантированные клетки находятся в микроокружении ишемии и воспаления, их выживаемость крайне низка10,11.
Было установлено несколько методов для повышения выживаемости трансплантированных клеток, таких как предварительная обработка трансплантированных клеток при гипоксии и тепловом шоке12,13, генетическая модификация 14,15 и одновременная трансплантация клеток и капилляров 16. К сожалению, большинство методов ограничены сложностью и дороговизной. Таким образом, в настоящем исследовании предлагается воспроизводимый, удобный, относительно инвазивный и эффективный метод доставки hiPSC-CM.
Инъекция клеток интрамиокарда под ультразвуковым контролем может быть выполнена только с помощью небольшого ветеринарного ультразвукового аппарата высокого разрешения и микроинжектора, независимо от места. Под ультразвуковым контролем непосредственная доставка клеток под мечевидным отростком из перикарда в миокард у мышей является безопасным протоколом, позволяющим избежать повреждения печени и легких. Этот метод можно комбинировать одновременно с другими технологиями, чтобы значительно улучшить выживаемость трансплантированных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных в этом исследовании были рассмотрены и одобрены комитетом по этике Второй больницы Сянъя Центрального Южного университета. Подробную информацию обо всех материалах и оборудовании, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов . Сроки инъекции клеток, визуализации и эвтаназии следующие: t0 - индуцировать инфаркт, t1 неделя - изображение и имплантационные клетки, t2 недели - изображение и имплантационные клетки, t4 недели - окончательная визуализация, эвтаназия и сбор тканей.
1. Культура ИПСК, дифференцировка кардиомиоцитов и очистка клеток
- Смешайте ДМЭМ/F12 и исходный раствор матричной основы базальной мембраны со льдом при температуре 4 °C в соотношении 1,5:1, аликвота, и храните полученную смесь (разбавитель матрицы) при -20 °C. Тщательно смешайте 25 мл питательной среды DMEM/F12 при 4 °C и 1 мл матричного разбавителя со льдом и распределите 1 мл на лунку в 6-луночном планшете. Держите пластину в вертикальном положении в течение 1 часа в инкубаторе при температуре 37 °C и аспирируйте надосадочную жидкость DMEM/F12 из лунок. Не прикасайтесь к дну 6-луночной пластины при выполнении процедуры.
- Извлеките криоконсервационную трубку, содержащую ИПСК, из жидкого азота и быстро разморозьте их на водяной бане с температурой 37 °C. Стерилизуйте внешнюю поверхность пробирки для криоконсервации 75% спиртом, вытрите спирт и перенесите пробирку на стерильный ультрачистый стол.
- С помощью пипетки осторожно перенесите раствор криоконсервации, содержащий ИПСК, в центрифужную пробирку объемом 15 мл, добавьте 5 мл среды ES, не содержащей питателя, и центрифугируйте суспензию при 300 × г в течение 3 мин при комнатной температуре. Откажитесь от надосадочной жидкости и осторожно ресуспендируйте клетки в 6 мл среды ES, не содержащей фидера. Подсчитайте клетки и отрегулируйте концентрацию клеток до 5 × 105 клеток/мл с питательной средой.
- Добавьте ингибитор ROCK (Y27632) к ИПСК до конечной концентрации 5 мкМ. Перенесите ИПСК с Y27632 на 6-луночную пластину, предварительно обработанную матрицей базальной мембраны, и осторожно закрутите 6-луночную пластину, прослеживая форму числа «8», чтобы равномерно распределить ИПСК. Поместите ИПСК во влажный инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO2 в вертикальном положении на 24 часа. Замените надосадочную жидкость средой ES, не содержащей питателя, без Y27632.
- Когда hiPSC достигают 80% степени слияния, аспирируйте супернатант культуры, дважды промойте клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), добавьте безинсулиновый RPMI1640 + B27, содержащий 10 мкМ CHIR99021 (ингибитор GSK3-β), и поместите hiPSC во влажный инкубатор CO2 при 37 ° C на 24 часа.
- Замените половину надосадочной жидкости средой RPMI1640 + B27 без инсулина и инкубируйте клетки еще 24 ч.
- Полностью замените питательную среду на RPMI1640 + B27 (без инсулина). Поместите планшеты во влажный инкубатор при температуре 37 °C с 5% CO2 в вертикальном положении на 24 часа.
- Через 3 дня полностью замените питательную среду безинсулиновым RPMI1640 + B27 + 5 мкМ IWR1 (ингибитор сигнального пути Wnt) и поместите планшеты во влажный инкубатор при 37 °C с 5%CO2 на 48 ч.
- Замените питательную среду через 5 дней на RPMI1640 + B27 без инсулина и продолжайте инкубацию в течение 48 ч во влажном инкубаторе CO2 при 37 °C.
- Замените питательную среду средой RPMI + B27 (включая инсулин) через 7 дней и поместите планшеты в увлажненный инкубатор CO2 на 3 дня при 37 ° C. Заменяйте носитель на носитель RPMI + B27 каждые 3 дня. Ищите самопроизвольное биение клеток на 9-12 день дифференцировки.
- После наблюдения за пульсирующими клетками замените среду RPMI + B27 на безглюкозную среду RPMI 1640, содержащую молочную кислоту (1 мл молочной кислоты добавляют к 500 мл среды RPMI 1640 без глюкозы). Инкубируйте клетки в течение 72 ч во влажном инкубаторе при 37 °C с 5%CO2.
- Через 72 ч замените надосадочную жидкость средой RPMI + B27 и инкубируйте в течение 48 ч во влажном инкубаторе при 37 °C с 5%CO2.
- Аспирируйте надосадочную жидкость культуры под отрицательным давлением и промойте клетки 3 раза PBS, чтобы удалить следы питательной среды. Используйте смесь ферментов для отсоединения клеток для диссоциации hiPSC-CM в отдельные клетки при 37 ° C. Собранные клетки соберите в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 3 мл поддерживающего раствора кардиомиоцитов, центрифугу при 300 × г в течение 2 мин при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
- Ресуспендируют клетки средой RPMI + B27, высевают их на 6-луночные планшеты с матричным покрытием базальной мембраны и инкубируют в течение 48 ч во влажном инкубаторе при 37 °C с 5%CO2.
- Замените культуральную надосадочную жидкость для очистки безглюкозной средой RPMI 1640, содержащей молочную кислоту, и инкубируйте в течение 72 ч во влажном инкубаторе при 37 °C с 5%CO2.
- Замените надосадочную жидкость культуры средой RPMI + B27 и меняйте среду каждые 3 дня.
- Продолжайте вышеописанный процесс в течение 30 дней, заменив культуру надосадочной жидкостью на безглюкозную среду, содержащую молочную кислоту для дальнейшей очистки. Инкубируйте клетки в течение 3 дней с этой средой и замените надосадочную жидкость на RPMI + B27. Культивируйте клетки непрерывно в течение 30 дней, пока hiPSC-CM не будут стабильно биться, и используйте эти клетки для интрамиокардиальной инъекции мышам.
2. Подготовка hiPSC-CM и создание модели острого инфаркта миокарда у мышей
- Вакуум-аспирируют супернатант культуры из культивируемых hiPSC-CM в течение 60 дней, промывают клетки 3 раза PBS и диссоциируют hiPSC-CM на отдельные клетки при 37 ° C с помощью смеси ферментов отсоединения клеток (~ 3-5 мин). Соберите клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл среды RPMI + B27, и хорошо перемешайте перед подсчетом клеток, чтобы рассчитать общее количество клеток. Центрифугируют клеточную суспензию при 300 × г в течение 2 мин при комнатной температуре. Откажитесь от надосадочной жидкости и добавьте поддерживающую среду кардиомиоцитов для ресуспендирования до концентрации 0,6 ×10,5 клеток/мкл.
- Держите центрифужную пробирку, содержащую ресуспендированные hiPSC-CM, наготове при 37 °C для впрыска 14,17,18,19,20.
- Поместите мышей в анестезиологическую коробку, связанную с изофлураном, чтобы вызвать ингаляцию анестетика с последующим использованием ветеринарной мази на глазах, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация изофлурана составляла 5%. Обратите внимание на лабораторную вентиляцию во время эксперимента. - Обратите внимание на потерю рефлексов в области ног и хвоста после ущипывания, когда мышь лежит плашмя на операционном столе, что указывает на достаточную анестезию. Вводят бупренорфин (0,1 мг/кг) внутрибрюшинно.
- Смажьте волосы на середине шеи и левой груди мышей кремом для депиляции, а нанесенный крем и волосы сотрите марлей через 5 минут.
- Зафиксируйте конечности и мышиный хвост скотчем. Зафиксируйте резцы мыши шелковой нитью 2-0 и скотчем. Стерилизуйте операционную область (срединную шею и левую грудную клетку) тремя чередующимися раундами бетадина с последующим добавлением алкоголя.
- Поместите хирургическую простыню вокруг стерилизованной хирургической области. Затем сделайте срединный разрез шеи, используя тонкие анатомические ножницы и тонкие рассекающие щипцы, чтобы полностью обнажить трахею. При необходимости отрежьте несколько передних шейных мышц для стабилизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Операторы были слепы к группам животных. - Вставьте трахеальную трубку (иглу для пункции катетера 20 г) через рот.
- Подключите трахеальную трубку к аппарату искусственной вентиляции легких и проверьте движение грудной клетки, чтобы убедиться, что оба легких хорошо вентилируются.
- Отрегулируйте параметры дыхания (частота дыхания: 100-150 уд/мин, дыхательный объем 250-300 мкл). После этого зафиксируйте левую заднюю конечность на нижней правой стороне, ослабьте ленту вокруг левой верхней конечности и выполните торакотомию в 3-4 межреберных промежутках левой грудной клетки с использованием тонких рассекающих ножниц и щипцов для максимального воздействия на сердце.
- Используя щипцы, снимите перикард под микроскопом, чтобы визуализировать левую переднюю нисходящую коронарную артерию (LAD) на нижнем краю ушка левого предсердия.
- Используйте шелковую нить 6-0, чтобы перевязать проксимальный конец LAD. Убедившись, что модель острого инфаркта миокарда адекватно установлена (когда дистальный LAD в месте перевязки меняется с красного на белый), закройте грудную клетку слой за слоем и зашите кожу прерывистыми швами 4-0. Выполните все вышеупомянутые хирургические процедуры для индукции индукции ИМ для фиктивной группы животных, за исключением перевязки.
- Отключите ингаляционную анестезию, удалите канюлю после того, как мышь возобновит спонтанное дыхание, и верните ее в клетку. Наблюдайте за животным до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Не возвращайте его в компанию других животных, пока он полностью не выздоровеет. Внутрибрюшинные инъекции бупренорфина (0,1 мг/кг х 3 дня) и карпрофена (5 мг/кг х 1 день) каждые 12 ч после операции.
- Вводят циклоспорин А (10 мг·кг-1·день-1) во внутрибрюшинную полость мышей за 3 дня до введения hiPSC-CM, чтобы предотвратить отторжение трансплантированных клеток. Вводите циклоспорин А непрерывно в течение 1 месяца после трансплантации.
3. Инъекция hiPSC-CM под ультразвуковым контролем
- После настройки модели инфаркта миокарда назначьте мышей модели инфаркта миокарда (12-недельные мыши C57BL/6; вес от 22 г до 24 г, 50% самцов и 50% женщин) в группы однократной дозы (SD, n = 8 в этом исследовании) и многократной дозы (MD, n = 8 в этом исследовании) в первый день после инфаркта миокарда и поместите их в первую и вторую недели после инфаркта миокарда в анестезиологическую коробку, соединенную с 5% изофлураном, для индукции ингаляционной анестезии с последующим интубация трахеи.
- Смажьте волосы на груди и верхней части живота мышей кремом для депиляции и сотрите крем марлей через 5 минут. Контролируйте частоту сердечных сокращений мыши на операционной панели и вводите ингаляционный изофлуран до тех пор, пока частота сердечных сокращений не будет поддерживаться на уровне 400-500 ударов в минуту.
- Закрепите конечности и хвост мыши лентой на консоли обнаружения и установите температуру платформы на 37 °C.
- Нанесите специальное ультразвуковое желе на верхнюю часть живота и используйте меньший ветеринарный ультразвуковой зонд высокого разрешения для получения изображений печени мыши.
- Уменьшите частоту вращения вентилятора до 50 ударов в минуту. Используйте микрошприц объемом 5 мкл для забора ~ 3 × 10клеток 5 (из шага 2.1). Держа шприц с микроманипулятором, введите иглу диаметром 3 мм в левый пара-мечевидный отросток (рис. 1А). Следуйте за верхним краем диафрагмы под ультразвуковым контролем (рис. 1B), наблюдайте за ритмом и диапазоном дыхания (рис. 1C, D) и входите в перикард в конце цикла выдоха, избегая повреждения печени и легких (рис. 1D).
- После того, как игла микроинжектора попадет в полость перикарда, отрегулируйте частоту дыхания до исходного параметра (150 уд/мин). Получите парастернальное длинноосное изображение сердца мыши с помощью эхокардиографии M-плесени в соответствии с инструкциямипроизводителя 17 (рис. 1E). Под ультразвуковым контролем вводят 3 × 10 5 клеток (рис. 1F) в три крайние области (1 × 105 клеток на место инъекции) места инфаркта.
- Снимите специальный ультразвуковой датчик и смойте желе. Отучите мышь от ингаляционной анестезии и верните ее в клетку после полного сознания.
- Повторите вышеуказанные процедуры инъекции клеток под ультразвуковым контролем через 1 и 2 недели после установления инфаркта миокарда для мышей группы МД.
4. Оценка функции сердца, флуоресцентная маркировка, количество трансплантированных клеток, область инфаркта миокарда и обнаружение митохондрий органа человека у мышей через 30 дней после перевязки левой передней нисходящей ветви
- Оценка функции сердца
- Поместите мышь в анестезиологическую коробку, подключенную к изофлурану, для индукционно-ингаляционной анестезии с последующим использованием ветеринарной мази на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Удалите волосы на левой груди мыши с помощью крема для депиляции. Положите мышь на панель управления, чтобы контролировать частоту сердечных сокращений и регулировать ингаляцию изофлурана. Поддерживайте частоту сердечных сокращений мыши на уровне 400-500 ударов в минуту. Экспериментальная конечная точка - 30-й день (после индукции ИМ).
- Закрепите конечности и хвост мыши лентой на консоли обнаружения и установите температуру платформы на 37 °C.
- После нанесения специального ультразвукового геля на переднюю область сердца используйте (ветеринарный) ультразвуковой датчик сердца высокого разрешения для получения парастернальных длинноосных и двумерных короткоосевых изображений при эхокардиографии М-формы и В-формы в соответствии с инструкциями производителя17.
- После того, как ультразвуковое обнаружение будет завершено, смойте специальный ультразвуковой гель, отключите ингаляционную анестезию и верните мышь в клетку отдельно после полного сознания.
- Проанализируйте полученные данные и рассчитайте фракцию выброса левого желудочка (EF) и фракционное укорочение (FS) с помощью программного обеспечения для анализа. Убедитесь, что оператор слеп к экспериментальным группам17.
- Флуоресцентная маркировка срезов
- Изолированное сердце промыть PBS, погрузить его в 4% параформальдегид при 4 °C на 12 ч. Выньте сердце и погрузите его в 30% сахарозу на 24 часа для обезвоживания.
- Поместите обезвоженное сердце с составом оптимальной температуры резки (OCT) на сухой лед. Нарежьте сердце снизу до вершины криостатом толщиной 10 мкм, поместите срезы на предметные стекла и храните предметные стекла при температуре -20 °C.
- Промойте предметные стекла сердечной тканью с помощью PBS в течение 3 минут.
- Пронизывайте ткань на предметных стеклах 0,5% Triton X-100 при комнатной температуре в течение 8 минут и стирайте их 3 раза с PBS в течение 5 минут за стирку.
- Покрыв ткань 10% ослиной сывороткой и 90% PBS (блокирующим раствором), заблокируйте срезы на 1 ч при комнатной температуре.
- После удаления блокирующего раствора инкубировать срезы с первичным антителом (разбавленным до 1:100 блокирующим раствором) в течение ночи при 4 °C. Стирайте их 3 раза с PBS в течение 5 минут на стирку.
- Инкубируют ткань на предметных стеклах с флуорофор-конъюгированным вторичным антителом (разбавленным до 1:100 блокирующим раствором) в течение 1 ч при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента избегайте воздействия света на ткани с флуорофор-конъюгированным вторичным антителом. - Стирайте предметные стекла 3 раза с помощью PBS в течение 5 минут на стирку.
- Установите предметные стекла с использованием 4',6-диамидино-2-фенилиндола, содержащего (DAPI)-содержащую монтажную среду, и сфотографируйте под флуоресцентным микроскопом17.
- Количество трансплантированных hiPSC-CM17
- Проведите тканевое иммунофлуоресцентное окрашивание замороженных участков сердца для пешеход-специфического тропонина Т (hcTnT), ядерного антигена человека (HNA) и неспецифического саркомерного альфа-актинина.
- После того, как все сердце было последовательно разделено, возьмите один срез на каждые 50 срезов для флуоресцентной маркировки.
- Случайным образом захватывайте пять изображений с большим увеличением на срез. Подсчитайте количество привитых полей зрения, рассчитайте среднее количество привитых клеток на единицу площади и установите их как A1/мкм 2. Рассчитайте общую привитую площадь среза с помощью ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) и установите ее как B1мкм 2 так, чтобы привитое число в этом срезе = A1 × B121,22.
- Рассчитайте общее количество пересаженных клеток на сердце мыши с помощью Eq (1) и процентную частоту приживления с помощью Eq (2), учитывая, что из каждых 50 секций был выбран один срез21,22.
- Общее количество привитых клеток на сердце мыши = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ An × Bn) × 50 (1)
Коэффициент приживления =
(2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество поставок составило 3 × 10 5 для группы СД и 3 × 3 × 105 для группы МД.
- Оценка площади инфаркта миокарда
- Вырезают поперечный замороженный срез (короткую ось) изолированного сердца, от верхушки до основания сердца толщиной 10 мкм.
- После того, как все сердце будет последовательно разделено, возьмите одно предметное стекло для каждых 30 секций и зафиксируйте его в предварительно подогретом растворе Буэна при 58 ° C. Окрасьте срез 0,04% пятнами от коллагена Direct Red и 0,1% Fast Green (разбавленными в PBS) в соответствии с инструкциями производителя17.
- Используйте программное обеспечение (например, ImageJ) для анализа изображений после поперечного среза всего тела сердца под микроскопом с использованием эквалайзера (3):14,17
Площадь инфаркта % =
× 100% (3)
- Обнаружение митохондриальной ДНК человека в различных органах
- Обезболивают мышей 5% изофлураном и приносят их в жертву при вывихе задней шейки матки. Препарируют мышей через 4 недели после трансплантации клеток. Заготавливают органы (печень, легкие, мозг, почки, селезенка) и часть миокарда (n = 3 в этом разрезе).
- Измельчите каждую ткань органа в жидком азоте и извлеките ДНК из ткани, используя указанный набор (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
- Следуйте инструкциям производителя, чтобы использовать указанный набор и праймеры (см. Таблицу материалов) для обнаружения митохондриальной ДНК человека в вышеупомянутых тканях (из шага 4.5.1).
(2)
× 100% (3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эхокардиография для оценки функции левого желудочка мышей в каждой группе показала, что травмы ИМ были эффективно обращены вспять в группе МД (рис. 2А). По сравнению с группой ИМ в группе СД наблюдалась повышенная фракция выброса (ФВ) (с 30% до 35%; Рисунок 2В) и укорачивание фракций (FS) (с 18% до 22%; Рисунок 2В) после ИМ. Тем не менее, еще более важно отметить, что многократные инъекции hiPSC-CM у мышей группы MD чрескожно увеличивали EF (с 30% до 42%; Рисунок 2В) и ФС (с 18% до 28%; Рисунок 2В) сердца мыши после инфаркта миокарда.
Флуоресцентная маркировка неспецифических α-актина (αSA), DAPI, человеческого специфического тропонина Т (hcTnT) и человеческого ядерного антигена (HNA) срезов тканей показала, что количество трансплантированных клеток в группе МД было значительно выше, чем в группе SD (рис. 3A). Хотя в группе МД было всего на две инъекции больше, чем в группе СД, количество трансплантированных клеток в группе МД было в ~ 10 раз больше, чем в группе СД (рис. 3B). Кроме того, процент трансплантированных кардиомиоцитов в группе МД также был достоверно выше, чем в группе СД (рис. 3В). Это исследование также показало, что трансплантированные клетки в группе МД были распределены в области инфаркта и области краевого инфаркта, в то время как трансплантированные клетки в группе SD были распределены только в области инфаркта (рис. 3А).
Площадь ИМ в группе лечения СД была меньше, чем в группе ИМ, а площадь ИМ в группе СД была значительно меньше, чем в группе МД (рис. 2Е). Кроме того, толщина передней стенки левого желудочка в группе МД была в 4 раза выше, чем в группе ИМ, в то время как толщина передней стенки левого желудочка в группе СД была в два раза выше, чем в группе ИМ (рис. 2F). Однако объемная доля коллагена в группе МД была на 50% ниже, чем в группе ИМ, в то время как объемная доля коллагена в группе СД была всего на 30% ниже, чем в группе ИМ (рис. 2G).
Общее количество клеток, экспрессирующих IB4 (маркер эндотелиальных клеток) и SM22α (маркер гладкомышечных клеток) через 28 дней после ИМ, значительно увеличилось в группе МД (рис. 3D, E) по сравнению с группой SD или MI. В этом исследовании также оценивали степень гипертрофии кардиомиоцитов в маргинальной зоне каждой группы. Флуоресцентное окрашивание агглютинина зародышей пшеницы (WGA) и саркомерного альфа-актинина показало, что минимальный диаметр волокна (MFD) у лигированных мышей во всех трех группах был значительно выше, чем у фиктивно перевязанных мышей. Однако МФД в группе МД был значительно меньше, чем в группах ИМ и СД (рис. 3F,G). В этом исследовании также использовалось иммуноокрашивание TUNEL (которое может отмечать ядро всех апоптотических клеток) для оценки апоптоза кардиомиоцитов. По сравнению с группой SD или группой MI распространенность TUNEL-положительных ядер кардиомиоцитов в группе MD была значительно снижена (рис. 3H,I). Митохондриальная ДНК человека не была обнаружена ни в одном органе в группах фиктивного и инфаркта миокарда (рис. 4A, B). Группы MD и SD показали только митохондриальную ДНК человека в сердце, и ни одна митохондриальная ДНК человека не была обнаружена ни в одном другом органе (рис. 4C, D).
Рисунок 1: Инъекция клеток интрамиокарда под ультразвуковым контролем у мышей. После того, как мышь обезболивается на операционном столе, конечности и хвост фиксируются лентой при постоянной температуре 37 °C, в то время как чрескожная интрамиокардиальная инъекция вводится в левый желудочек под контролем эхокардиографии. Мышей анестезировали и поддерживали путем вдыхания изофлурана (1,5%-2%). Удалите волосы на верхней части живота и груди мыши. Под контролем трансторакальной эхокардиографии вставьте кончик микрошприца ниже мечевидного отростка (А) (стрелка) и переместите его (стрелка) вдоль верхнего края диафрагмы (В), чтобы отрегулировать частоту дыхания мыши. Прижмите кончик иглы к стенке перикарда (С) в фазе вдоха. (Д,Е) Кончик иглы входит в полость перикарда в фазе выдоха и, наконец, проникает в переднюю стенку левого желудочка (F) для инъекции клеток. Эта цифра была изменена с17. Сокращения: ЛЖ = левый желудочек; АО = восходящая аорта; RL = правое легкое; LL = левое легкое. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оценка сердечной функции у мышей в каждой группе. (A) Используйте эхокардиографию высокого разрешения для оценки функции левого желудочка до инфаркта миокарда (до S) и через 4 недели после лечения (после S). Фракция выброса (B) и укорочение дроби (C) выражаются в абсолютных величинах. Данные выражены как среднее ± SE, 8 на группу. Оцените размер инфаркта, объем коллагена и морфологию левого желудочка. С помощью Сириуса измеряли красное / быстрое зеленое окрашивание (D), размер инфаркта (E), толщину передней стенки левого желудочка (F) и объемную долю коллагена (G). Данные показывают, что средний ± SE, 8 мышей в группе. Масштабная линейка = 1 мм. Односторонний дисперсионный анализ и тест множественного сравнения Данна. * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Эта цифра была изменена с17. Сокращения: pre-S = предоперационный; post-S = после операции; ИМ = инфаркт миокарда; SD = разовая доза; MD = многократная доза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Гистологическая оценка сердца мышей в каждой группе . (A) Серийные срезы инъецированных мышей с hiPSC-CM окрашивали на hcTnT, α-саркомерный актин (αSA) и DAPI. Количество (B) и процент (C) трансплантированных клеток были использованы для количественного определения. Серийные срезы из искусственно управляемых, обработанных ИМ, СД и МД сердец мышей, принесенных в жертву через 4 недели после индукции ИМ, были гистохимически окрашены на наличие IB4. (Д,Е) Капилляры количественно определяются как количество IB4-положительных сосудистых структур в каждой области сильного поля вокруг инфаркта. Кардиомиоциты окрашивали WGA и αSA в маргинальной зоне инфаркта миокарда, а ядра мечали DAPI. (Ф,Г) Площадь поперечного сечения кардиомиоцитов измеряется и отображается в виде абсолютной величины. Краевые срезы инфаркта миокарда окрашивали с помощью TUNEL, чтобы показать апоптотические кардиомиоциты (красный, TUNEL) и нормальные кардиомиоциты, экспрессирующие сердечный тропонин Т (зеленый, cTnT). (Х,И) Рассчитано отношение TUNEL-положительных клеток к общему количеству клеток. Масштабные линейки = 500 мкм (A), 20 мкм (D, H) или 10 мкм (F). Односторонний дисперсионный анализ и тест множественного сравнения Данна. * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Эта цифра была изменена с17. Сокращения: hcTnT = сердечный тропонин человека T; αSA = α-саркомерный актин; WGA = агглютинин зародышей пшеницы; DAPI = 4', 6-диамидино-2-фенилиндол; TUNEL = концевая маркировка конца dUTP терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы; ИМ = инфаркт миокарда; SD = разовая доза; MD = многократная доза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Обнаружение митохондриальной ДНК человека в органах мыши в каждой группе. На рисунке показано обнаружение митохондриальной ДНК человека в сердцах мышей и других органах в каждой группе через 1 месяц после трансплантации клеток ПЦР. ПЦР митохондриальной ДНК человека не обнаружила трансплантированных клеток (А, В) в сердцах и других органах мышей фиктивной (n = 3) и группы ИМ (n = 3). ПЦР митохондриальной ДНК человека обнаружила трансплантированные клетки в сердцах мышей в группе SD (n = 3) и MD (n = 3), но не в других органах, включая легкие, печень, почки, мозг и селезенку (C, D). Количественный анализ митохондриальной ДНК человека методом кПЦР показал, что митохондриальная ДНК человека в группе МД была примерно в восемь раз выше, чем в группе СД (Е). (+) указывает на положительный контроль iPSC-CM. (−) указывает на отрицательный контроль воды DEPC. Сокращения: н.с. = не значимый; ИМ = инфаркт миокарда; SD = разовая доза; MD = многократная доза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшие этапы этого исследования включают культивирование hiPSC, дифференцировку кардиомиоцитов, очистку hiPSC-CM и трансплантацию hiPSC-CM в место инфаркта миокарда мыши. Ключевым моментом является использование ультразвука сердца для чрескожного направления лечения к месту инфаркта на краю инфаркта, где в область были введены hiPSC-CM.
С увеличением времени культивирования фенотип hiPSC-CM изменяется в морфологии (больший размер клеток), структуре (мышцы, плотность фибрилл, расположение, микроскопические скопления клеток) и физиологии (обработка кальцием и β-адренергический ответ) с дифференцировкой с течением времени. В данном исследовании флуоресцентное мечение проводили на 10-е и60-е сутки дифференцировки hiPSC в кардиомиоциты для наблюдения морфологических и структурных изменений. Размер клеток и длина саркомера были достоверно увеличены в hiPSC-CM на 60-е сутки, чем на10-е сутки. В исследовании использовались hiPSC-CM, которые были относительно стабильны после 60 дней дифференцировки в кардиомиоциты для трансплантации. Кроме того, в течение 60 дней культивирования hiPSC-CM выполняли многократные замены молочнокислосодержащей глюкозосодержащей питательной среды для очистки кардиомиоцитов и увеличения содержания кардиомиоцитов во избежание побочных эффектов, вызванных некардиомиоцитами в трансплантированных клетках.
Ультразвуковой зонд был впервые помещен в верхнюю часть живота мыши во время инъекции клеток под ультразвуковым контролем, чтобы визуализировать ее печень. Игла микроинжектора вводится наискось под мечевидным отростком, минуя печень и входя в перикард под ультразвуковым контролем. В этом исследовании перикард не оценивался по вертикали от внутренних костей грудной стенки, поскольку этот путь к области инфаркта в миокарде значительно короткий, что создает высокий риск пункции сердца и неудачи трансплантации клеток. Однако косо доступ к перикарду от мечевидного отростка к миокарду представляет собой значительно более длинный путь с меньшим риском пункции сердца. Во время инъекции клеток под ультразвуковым контролем мышей интубировали, чтобы регулировать частоту дыхания во время пункции. Регулирование частоты дыхания мышей и продление времени вдоха и выдоха способствуют проколу во время выдоха, что также позволяет избежать повреждения легких. Во время этого эксперимента ни одна мышь не умерла от разрыва сердца и повреждения легких после инъекции клеток.
Для стабильности трансплантированных клеток в исследовании учитывался момент времени инъекции hiPSC-CM и количество инъекций. На ранней стадии инфаркта миокарда возникло сильное воспаление в областиинфаркта 23. Раннее подавление воспалительной реакции в месте инфаркта может улучшить ремоделирование миокарда и ограничить летальные возможности для испытуемого24. Кроме того, тяжелая воспалительная реакция является причиной гибели трансплантированных клеток. Предыдущие исследования показали, что трансплантация ЭС-дифференцированных кардиомиоцитов в место инфаркта может ингибировать воспалительную реакцию в месте инфаркта миокарда25.
После того, как модель инфаркта миокарда мыши была установлена, hiPSC-CM вводили в место инфаркта и инфарктную маргинальную зону под прямым зрением; выжила только одна десятая часть hiPSC-CM. Тем не менее, исследование предполагает, что первоначально трансплантированные hiPSC-CM могут улучшить микроокружение в месте инфаркта миокарда у мышей и улучшить выживаемость пересаженных клеток. Результаты показали, что количество клеток, выживших после трех инъекций hiPSC-CM, было в 10 раз больше, чем у одной инъекции hiPSC-CM (рис. 3C). УЗИ показало, что толщина передней стенки левого желудочка в группах МД и СД была значительно тоньше на третьей и четвертой неделях после установления модели ИМ, чем на первой и второй неделях. Таким образом, мышам в группе МД вводили клетки сразу после установления модели ИМ, а затем через одну и две недели после инфаркта, чтобы избежать смерти из-за разрыва сердца.
Это исследование показывает, что количество трансплантированных клеток значительно выше в группе МД, чем в группе СД. Эхокардиография мышей показала, что значения EF и SF в группе MD были выше, чем в группе SD. Паракринную функцию трансплантированных hiPSC-CM также следует рассматривать вместе с трансплантированными кардиомиоцитами для улучшения функции сердца. В исследовании, проведенном Iwanaga et al.26 , сообщалось, что паракринные факторы, секретируемые hiPSC-CM, могут способствовать ангиогенезу путем активации Akt1. Исследование выявило очень мало изолектин-В4-положительных клеток в области краевого инфаркта в группе ИМ. Напротив, в группах SD и MD было больше изолектин-В4-положительных клеток, чем в группе MI; Примечательно, что больше всего было в группе MD. Таким образом, эти результаты показывают, что чем больше привитых hiPSC-CM, тем сильнее будут новые кровеносные сосуды на участке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Крупным планом исследований Национального фонда естественных наук Китая (No 91539111 до JY), Ключевым проектом по науке и технологиям провинции Хунань (No 2020SK53420 до JY) и Программой научно-технических инноваций провинции Хунань (2021RC2106 до CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Cardiac troponin T | Abcam | ab8295 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150105 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150110 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150062 | |
| Human cardiac troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Isolectin B4 | Vector | FL-1201 | |
| Sarcomeric alpha actinin | Abcam | ab9465 | |
| Wheat germ agglutinin | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| Reagent | |||
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | |
| B27 Supplement(minus insulin) | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement(serum free) | Thermo Fisher Scientific | 17–504-044 | |
| Bouin's solution | Thermo Fisher Scientific | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| cyclosporin A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| DIRECT RED | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| FAST GREEN FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| lactic acid | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356234 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix kit | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| RPMI1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff | Stem Cell Technologies | 5030 | |
| STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium | Stem Cell Technologies | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| ultrasound coupling agent | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Applied Biosystems | Thermo Fisher Scientific | 7500 Real-Time PCR | |
| cryostat | Leica | CM1950 | |
| fluoresence microscope | Olympus | IX83 | |
| fine anatomical scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro syringe | Hamilton | 7633 | |
| Small animal anesthesia machine | MATRX | VMR | |
| Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Software | |||
| Statistical Product and Service Solutions | IBM | 21 | |
| Image J | NIH | 1.48 | |
| Human mitochondrial DNA primers | |||
| the forward primer sequence | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| the reverse primer sequence | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
References
- Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
- Lázár, E., et al. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Davis, M. K., et al. State of the art: cardiac transplantation. Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).
- Mancini, D., Colombo, P. C. Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant. Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).
- Zimmermann, W. H. Translating myocardial remuscularization. Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).
- Hu, X., et al. A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization. Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).
- Kempf, H., et al. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
- Nguyen, P. K., et al. Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review. JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).
- Zimmermann, W. H. Remuscularization of the failing heart. The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).
- Hu, X., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).
- Feng, Y., et al. Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway. Stem Cells. 32 (2), Dayton, Ohio. 462-472 (2014).
- Fan, C., et al. Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Sun, X., et al. Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats. Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).
- Wu, X., et al. Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873 (2021).
- Kannappan, R., et al. Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair. Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Zhao, M., et al. Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice. Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).
- Zhao, M., et al. Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452 (2019).
- O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Rainer, P. P., et al. Cardiomyocyte-specific transforming growth factor β suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction. Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).
- Yu, Y., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 167 (2019).
- Iwanaga, K., et al. Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).
