Summary
Ultraljudstyrd cellleverans runt platsen för hjärtinfarkt hos möss är ett säkert, effektivt och bekvämt sätt att celltransplantation.
Abstract
Huvudsyftet med cellterapi efter hjärtinfarkt (MI) är att effektivt förbättra den celltransplanterade hastigheten, och humaninducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter (hiPSC-CM) är en lovande cellkälla för hjärtreparation efter ischemisk skada. En låg ympad hastighet är emellertid ett signifikant hinder för effektiv hjärtvävnadsregenerering efter transplantation. Detta protokoll visar att flera hiPSC-CM ultraljudsstyrda perkutana injektioner i ett MI-område effektivt ökar celltransplantationshastigheten. Studien beskriver också hela hiPSC-CM-odlingsprocessen, förbehandling och ultraljudsstyrda perkutana leveransmetoder. Dessutom hjälper användningen av humant mitokondriellt DNA att upptäcka frånvaron av hiPSC-CM i andra musorgan. Slutligen beskriver detta dokument förändringarna i hjärtfunktion, angiogenes, cellstorlek och apoptos vid den infarkterade gränszonen hos möss 4 veckor efter cellleverans. Man kan dra slutsatsen att ekokardiografistyrd perkutan injektion av vänster ventrikulär myokardium är en genomförbar, relativt invasiv, tillfredsställande, repeterbar och effektiv cellterapi.
Introduction
När akut MI inträffar dör myokardceller i infarktområdet snabbt på grund av ischemi och hypoxi. Flera inflammatoriska faktorer frigörs efter celldöd och bristning, medan inflammatoriska celler infiltrerar den infarkterade platsen för att orsaka inflammation1. Signifikant ersätter fibroblaster och kollagen, båda utan kontraktilitet och elektrisk ledningsförmåga, myokardcellerna i infarktplatsen för att bilda ärrvävnad. På grund av den begränsade regenereringskapaciteten hos kardiomyocyter hos vuxna däggdjur är livskraftig vävnad som bildas efter ett stort infarktområde vanligtvis inte tillräcklig för att upprätthålla tillräcklig hjärtminutvolym2. MI orsakar hjärtsvikt, och i svåra fall av hjärtsvikt kan patienter endast förlita sig på hjärttransplantationer eller ventrikulära hjälpmedel för att upprätthålla normala hjärtfunktioner 3,4.
Efter MI är den ideala behandlingsstrategin att ersätta de döda kardiomyocyterna med nybildade kardiomyocyter, som bildar elektromekanisk koppling med friska vävnader. Behandlingsalternativ har dock vanligtvis antagit myokardiell räddning snarare än ersättning. För närvarande är stamcells- och stamcellsbaserade terapier bland de mest lovande strategierna för att främja myokardiell reparation efter MI5. Transplantationen av dessa celler har dock flera problem, främst oförmågan hos vuxna stamceller att differentiera till kardiomyocyter och deras korta livslängd6.
De etiska frågorna i samband med användningen av embryonala stamceller (ES) kan kringgås av iPSC, som är en lovande källa till celler. Dessutom har iPSC starka självförnyelsefunktioner och kan differentieras till kardiomyocyter7. Studier har visat att hiPSC-CMs transplanterade till MI-platsen kan överleva och bilda gapkorsningar med värdceller 8,9. Men eftersom dessa transplanterade celler är belägna i mikromiljön av ischemi och inflammation är deras överlevnad extremt låg10,11.
Flera metoder har etablerats för att förbättra överlevnaden av transplanterade celler, såsom hypoxi och värmechockförbehandling av transplanterade celler12,13, genetisk modifiering 14,15 och samtidig transplantation av celler och kapillärer 16. Tyvärr är de flesta metoder begränsade av komplexitet och höga kostnader. Därför föreslår den aktuella studien en reproducerbar, bekväm, relativt invasiv och effektiv hiPSC-CM-leveransmetod.
Ultraljudstyrd intramyokardiell cellinjektion kan utföras med endast en högupplöst liten veterinärultraljudsmaskin och en mikroinjektor, oavsett plats. Under ultraljudsvägledning är direkt leverans av celler under xiphoidprocessen från perikardiet till myokardiet hos möss ett säkert protokoll som undviker lever- och lungskador. Denna metod kan kombineras samtidigt med annan teknik för att avsevärt förbättra överlevnadsgraden för transplanterade celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök i denna studie granskades och godkändes av etikkommittén vid Second Xiangya Hospital of Central South University. Se materialförteckningen för detaljer om alla material och utrustning som används i detta protokoll. Tidslinjerna för cellinjektion, avbildning och eutansi är följande: t0- inducera infarkt, t1 vecka- bild- och implantatceller, t2 veckor- bild- och implantatceller, t4 veckor- slutlig avbildning, eutanasi och vävnadsinsamling.
1. hiPSC-odling, kardiomyocytdifferentiering och cellrening
- Blanda DMEM/F12 och stamlösning av basalmembranmatris med is vid 4 °C i förhållandet 1,5:1, och förvara den resulterande blandningen (matrisspädningsvätska) vid -20 °C. Blanda 25 ml DMEM/F12-odlingsmedium vid 4 °C och 1 ml matrisspädningsvätska noggrant med is och fördela 1 ml/brunn i en 6-brunnsplatta. Håll plattan upprätt i 1 timme i en inkubator vid 37 °C och aspirera DMEM/F12-supernatanten från brunnarna. Rör inte botten av 6-brunnsplattan när du utför proceduren.
- Ta bort kryokonserveringsröret som innehåller hiPSC från flytande kväve och tina dem snabbt i ett 37 °C vattenbad. Sterilisera den yttre ytan på kryokonserveringsröret med 75% alkohol, torka av alkoholen och överför röret till ett sterilt ultrarent bord.
- Använd en pipett för att försiktigt överföra kryokonserveringslösningen innehållande hiPSC till ett 15 ml centrifugrör, tillsätt 5 ml matarfritt ES-medium och centrifugera suspensionen vid 300 × g i 3 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och suspendera försiktigt cellerna i 6 ml av det matarfria ES-mediet. Räkna cellerna och justera cellkoncentrationen till 5 × 105 celler/ml med odlingsmediet.
- Tillsätt ROCK-hämmare (Y27632) till hiPSC till en slutlig koncentration på 5 μM. Överför hiPSC:erna med Y27632 till 6-brunnsplattan som förbehandlats med basalmembranmatris och snurra försiktigt 6-brunnsplattan och spåra formen på siffran "8" för att jämnt fördela hiPSC:erna. Placera hiPSC:erna i en fuktig inkubator med 5 % CO2 på 37 °C i upprätt läge i 24 timmar. Byt ut supernatanten mot det matarfria ES-mediet utan Y27632.
- När hiPSC når 80% grad av sammanflöde, aspirera odlingssupernatanten, tvätta cellerna två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), tillsätt insulinfri RPMI1640 + B27 innehållande 10 μM CHIR99021 (GSK3-β-hämmare) och placera hiPSC i en fuktig CO2-inkubator vid 37 ° C i 24 timmar.
- Byt ut hälften av supernatanten mot RPMI1640 + B27-medium utan insulin och inkubera cellerna i ytterligare 24 timmar.
- Byt ut odlingsmediet helt med RPMI1640 + B27 (utan insulin). Placera plattorna i en fuktig inkubator vid 37 °C med 5% CO2 i upprätt läge i 24 timmar.
- Byt ut odlingsmediet helt efter 3 dagar med insulinfritt RPMI1640 + B27 + 5 μM IWR1 (Wnt-signalvägshämmare) och placera plattorna i en fuktig inkubator vid 37 °C med 5%CO2 i 48 timmar.
- Byt ut odlingsmediet efter 5 dagar mot RPMI1640 + B27 utan insulin och fortsätt inkubera i 48 timmar i en fuktig CO2-inkubator vid 37 °C.
- Byt ut odlingsmediet mot RPMI + B27-mediet (inklusive insulin) efter 7 dagar och placera plattorna i en fuktad CO2-inkubator i 3 dagar vid 37 °C. Byt ut mediet med RPMI + B27-mediet var 3: e dag. Leta efter spontan slagning av celler vid 9-12 dagars differentiering.
- Efter att ha observerat de pulserande cellerna, ersätt RPMI + B27-mediet med glukosfritt RPMI 1640-medium innehållande mjölksyra (1 ml mjölksyra tillsatt till 500 ml glukosfritt RPMI 1640-medium). Inkubera cellerna i 72 timmar i en fuktig inkubator vid 37 °C med 5 %CO2.
- Efter 72 timmar ersätts supernatanten med RPMI + B27-medium och inkuberas i 48 timmar i en fuktig inkubator vid 37 °C med 5 %CO2.
- Aspirera odlingssupernatanten under negativt tryck och tvätta cellerna 3x med PBS för att avlägsna spår av odlingsmediet. Använd cellavskiljningsenzymblandningen för att dissociera hiPSC-CM till enskilda celler vid 37 °C. Samla upp de erhållna cellerna i ett 15 ml centrifugrör innehållande 3 ml kardiomyocytstödlösning, centrifugera vid 300 × g i 2 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Återsuspendera cellerna med RPMI + B27-medium, frö dem på matrisbelagda 6-brunnsplattor med basalmembran och inkubera dem i 48 timmar i en fuktig inkubator vid 37 °C med 5% CO2.
- Byt ut odlingssupernatanten för rening mot glukosfritt RPMI 1640-medium som innehåller mjölksyra och inkubera i 72 timmar i en fuktig inkubator vid 37 °C med 5 %CO2.
- Byt ut kultursupernatanten med RPMI + B27-medium och byt medium var 3: e dag.
- Fortsätt ovanstående process i 30 dagar, ersätt odlingssupernatanten med glukosfritt medium innehållande mjölksyra för ytterligare rening. Inkubera cellerna i 3 dagar med detta medium och ersätt supernatanten med RPMI + B27. Odla cellerna kontinuerligt i 30 dagar tills hiPSC-CMs slår stabilt och använd dessa celler för intramyokardiell injektion hos möss.
2. Beredning av hiPSC-CMs och etablering av musakut hjärtinfarktmodell
- Vakuumaspirera odlingssupernatanten från hiPSC-CMs odlade i 60 dagar, tvätta cellerna 3x med PBS och dissociera hiPSC-CMs i enskilda celler vid 37 °C med cellavskiljningsenzymblandningen (~3-5 min). Samla cellerna i ett 15 ml centrifugrör innehållande 5 ml RPMI + B27-medium och blanda väl innan du räknar cellerna för att beräkna det totala antalet celler. Centrifugera cellsuspensionen vid 300 × g i 2 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och tillsätt kardiomyocytstödmedium för att resuspendera till en koncentration av 0,6 × 105 celler/μl.
- Håll centrifugröret med de återsuspenderade hiPSC-CM klart vid 37 °C för injektion 14,17,18,19,20.
- Placera mössen i en anestesibox ansluten till isofluran för att inducera anestesiinhalation följt av användning av veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
OBS: Isoflurankoncentrationen var 5%. Var uppmärksam på laboratorieventilation under experimentet. - Leta efter förlust av reflexer i fötterna och svansregionen efter klämning när musen läggs platt på operationsbordet, vilket indikerar tillräcklig anestesi. Administrera buprenorfin (0,1 mg/kg) intraperitonealt.
- Smörj håret på mitten av nacken och mössens vänstra bröst med en hårborttagningskräm och torka av den applicerade krämen och håret med gasväv efter 5 minuter.
- Fixa lemmarna och mussvansen med tejp. Fäst mussnittarna med en 2-0 silketråd och tejp. Sterilisera det kirurgiska området (medianhals och vänster bröst) med tre alternerande omgångar betadin följt av alkohol.
- Placera ett kirurgiskt draperi runt det steriliserade kirurgiska området. Gör sedan ett medianhalssnitt med fin anatomisk sax och fina dissekerande pincett för att exponera luftstrupen helt. Om nödvändigt, skära av några främre livmoderhalsmuskler för stabilisering.
OBS: Operatörerna var blinda för djurgrupperna. - För in en trakealtub (20 G katetersticknål) genom munnen.
- Anslut trakealtuben till ventilatorn och kontrollera bröstkorgsrörelsen för att säkerställa att båda lungorna är väl ventilerade.
- Justera andningsparametrarna (andningsfrekvens: 100-150 slag per minut, tidalvolym 250-300 μL). Därefter fixerar du vänster bakben till nedre högra sidan, lossar tejpen runt vänster övre extremitet och utför en thorakotomi vid vänster bröstkorgs 3-4 interkostala utrymme med fin dissekeringssax och pincett för maximal hjärtexponering.
- Använd pincett, skala av perikardiet under ett mikroskop för att visualisera den vänstra främre nedåtgående kransartären (LAD) vid den nedre kanten av vänster förmaksbilaga.
- Använd en 6-0 silketråd för att ligera den proximala änden av LAD. Efter att ha säkerställt att den akuta MI-modellen är tillräckligt etablerad (när den distala LAD vid ligeringsstället ändras från rött till vitt), stäng bröstskiktet för lager och suturera huden med 4-0 gängade intermittenta stygn. Utför alla ovan nämnda kirurgiska ingrepp för MI-induktion för bluffgruppen av djur förutom ligering.
- Stäng av inhalationsanestesin, ta bort kanylen efter att musen återupptar spontan andning och återför den till buret. Övervaka djuret tills det har återfått tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal liggande. Lämna inte tillbaka den till andra djur förrän den har återhämtat sig helt. Administrera intraperitoneala injektioner av buprenorfin (0,1 mg/kg x 3 dagar) och karprofen (5 mg/kg x 1 dag) var 12:e timme postoperativt.
- Injicera ciklosporin A (10 mg · kg-1 · dag-1) i den intraperitoneala hålan hos möss 3 dagar före administrering av hiPSC-CMs för att förhindra avstötning av de transplanterade cellerna. Injicera cyklosporin A kontinuerligt i 1 månad efter transplantation.
3. hiPSC-CM-injektion under ultraljudsvägledning
- Efter att ha konfigurerat MI-modellen, tilldela MI-modellmössen (12 veckor gamla C57BL / 6-möss; 22 g till 24 g i vikt, 50% manliga och 50% kvinnliga) till endosgrupper (SD, n = 8 i denna studie) och multipeldos (MD, n = 8 i denna studie) den första dagen efter MI och placera dem under den första och andra veckan efter MI i en anestesibox ansluten till 5% isofluran för induktion av inhalationsanestesi följt av Trakeal intubation.
- Smörj håret på bröstet och övre buken på mössen med hårborttagningskräm och torka av grädden med gasväv 5 min senare. Övervaka musens puls på operationskortet och administrera inhalationsisofluran tills hjärtfrekvensen hålls på 400-500 slag per minut.
- Fäst musens lemmar och svans med tejp på detekteringskonsolen och ställ in plattformstemperaturen på 37 °C.
- Applicera en speciell ultraljudsgelé på övre buken och använd en mindre högupplöst veterinär ultraljudssond för att få musleverbilder.
- Minska ventilatorhastigheten till 50 slag per minut. Använd en 5 μL mikrospruta för att rita ~3 × 105 celler (från steg 2.1). Håll sprutan med en mikromanipulator, sätt in en 3 mm nål vid vänster para-xiphoidprocess (figur 1A). Följ membranets övre kant under ultraljudsvägledning (figur 1B), observera andningsrytmen och andningsområdet (figur 1C, D) och gå in i perikardiet i slutet av expiratorisk cykel och undvik skador på lever och lunga (figur 1D).
- När mikroinjektornålen kommer in i perikardhålan, justera andningsfrekvensen till den ursprungliga parametern (150 slag per minut). Skaffa den parasternala långaxelbilden av mushjärtat med M-mögelekokardiografi enligt tillverkarens instruktioner17 (figur 1E). Under ultraljudsvägledning, injicera 3 × 10 5 celler (figur 1F) i tre marginella områden (1 × 105 celler per injicerat ställe) på infarktstället.
- Ta bort den speciella ultraljudssonden och skölj av gelén. Avvänja musen från inhalationsanestesin och återför den till buren efter fullt medvetande.
- Upprepa ovanstående ultraljudsstyrda cellinjektionsprocedurer 1 och 2 veckor efter upprättandet av MI för MD-gruppmössen.
4. Utvärdering av hjärtfunktion, fluorescensmärkning, transplanterat cellantal, hjärtinfarkt och organ-human mitokondrier detektion hos möss 30 dagar efter vänster främre fallande grenligering
- Bedömning av hjärtfunktion
- Placera musen i en isofluranansluten anestesilåda för induktions-inhalationsanestesi följt av användning av veterinärsalva på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi. Ta bort håret på musens vänstra bröst med hårborttagningskräm. Lägg musen på manöverpanelen för att övervaka hjärtfrekvensen och justera isofluraninhalationen. Håll muspulsen på 400-500 slag per minut. Det experimentella effektmåttet är dag 30 (efter MI-induktionen).
- Fäst musens lemmar och svans med tejp på detekteringskonsolen och ställ in plattformstemperaturen på 37 °C.
- Efter applicering av en speciell ultraljudsgel på det främre hjärtområdet, använd en (veterinär) högupplöst hjärtultraljudssond för att förvärva parasternala långaxel- och tvådimensionella kortaxelbilder under ekokardiografi av M-mögel och B-mögel enligt tillverkarens instruktioner17.
- När ultraljudsdetekteringen är klar, skölj av den speciella ultraljudsgelen, stäng av inhalationsanestesin och sätt tillbaka musen till buret separat efter fullt medvetande.
- Analysera erhållna data och beräkna vänster ventrikulär ejektionsfraktion (EF) och fraktionerad förkortning (FS) med hjälp av analysprogramvaran. Se till att operatören är blind för experimentgrupperna17.
- Fluorescensmärkning av sektioner
- Tvätta det isolerade hjärtat med PBS, sänk ner det i 4% paraformaldehyd vid 4 °C i 12 timmar. Ta ut hjärtat och sänk ner det i 30% sackaros i 24 timmar för att torka ut.
- Bädda in det uttorkade hjärtat med den optimala skärtemperaturföreningen (OCT) på torris. Skär hjärtat från botten till toppen med en kryostattjocklek på 10 μm och placera sektionerna på objektglas och förvara objektglasen vid -20 °C.
- Tvätta objektglasen med hjärtvävnaden med PBS i 3 min.
- Permeabilisera vävnaden på objektglas med 0,5% Triton X-100 vid rumstemperatur i 8 minuter och tvätta dem 3x med PBS i 5 min per tvätt.
- Efter att ha täckt vävnaden med 10% åsneserum och 90% PBS (blockerande lösning), blockera sektionerna i 1 h vid rumstemperatur.
- Efter avlägsnande av blockeringslösningen, inkubera sektionerna med den primära antikroppen (utspädd till 1:100 med blockeringslösningen) över natten vid 4 °C. Tvätta dem 3x med PBS i 5 min per tvätt.
- Inkubera vävnaden på objektsglas med fluoroforkonjugerad sekundär antikropp (utspädd till 1:100 med blockeringslösningen) i 1 timme vid rumstemperatur.
OBS: Undvik att utsätta vävnaderna med den fluoroforkonjugerade sekundära antikroppen för ljus från denna punkt och framåt. - Tvätta bilderna 3x med PBS i 5 min per tvätt.
- Montera objektglasen med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)-innehållande monteringsmedium och fotografera under ett fluorescensmikroskop17.
- Transplanterade hiPSC-CM räknas17
- Utför vävnadsimmunofluorescensfärgning på frysta delar av hjärtat för fotgängarspecifikt troponin T (hcTnT), humant kärnantigen (HNA) och icke-specifikt sarkomeriskt alfaaktinin.
- Efter att hela hjärtat var seriellt, ta en sektion för varje 50 sektioner för fluorescensmärkning.
- Ta slumpmässigt fem bilder med hög förstoring per segment. Räkna det ympade antalet synfält, beräkna det genomsnittliga ympade cellantalet per ytenhet och ställ in dem som A1 / μm2. Beräkna segmentets totala ympade yta med ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) och ställ in den som B1μm2 så att det ympade numret i detta segment = A1 × B121,22.
- Beräkna det totala antalet ympade celler per mushjärta med Eq (1) och den procentuella engraftmenthastigheten med Eq (2), givet att en sektion valdes från var 50: e sektion21,22.
- Totalt antal ympade celler per mushjärta = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ En × Bn) × 50 (1)
engraftment hastighet =
(2)
OBS: Antalet leveranser var 3 × 10 5 för SD-gruppen och 3 × 3 × 105 för VD-gruppen.
- Bedömning av det myokardinfarkterade området
- Skär ett tvärsnittsfryst snitt (kort axel) av det isolerade hjärtat, från toppen till hjärtats bas med en tjocklek av 10 μm.
- Efter att hela hjärtat har snittats seriellt, ta en sektionsbild för varje 30 sektioner och fixera den i förvärmd Bouin-lösning vid 58 °C. Färga sektionen med 0,04% direkt röd och 0,1% snabb grön kollagenfläckar (utspädd i PBS) enligt tillverkarens instruktioner17.
- Använd programvara (t.ex. ImageJ) för att analysera bilderna efter tvärsnittsfotografering av hela kroppen av hjärtat under ett mikroskop med Eq (3):14,17
Infarktarea % =
× 100 % (3)
- Detektion av humant mitokondriellt DNA i olika organ
- Bedöva mössen med 5% isofluran och offra dem genom bakre cervikal dislokation. Dissekera mössen 4 veckor efter celltransplantation. Skörda organen (lever, lunga, hjärna, njure, mjälte) och en del av myokardiet (n = 3 i detta avsnitt).
- Mal varje organvävnad i flytande kväve och extrahera DNA från vävnaden med hjälp av det refererade kitet (se materialtabellen) enligt tillverkarens instruktioner.
- Följ tillverkarens instruktioner för att använda det refererade kitet och primers (se materialtabellen) för att detektera humant mitokondriellt DNA i ovan nämnda vävnader (från steg 4.5.1).
(2)
× 100 % (3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekokardiografi för utvärdering av vänster ventrikulär funktion hos mössen i varje grupp avslöjade att MI-skadorna effektivt reverserades i MD-gruppen (figur 2A). Jämfört med MI-gruppen visade SD-gruppen ökad ejektionsfraktion (EF) (från 30% till 35%; Figur 2B) och fraktionsförkortning (FS) (från 18% till 22%; Figur 2C) efter MI. Det är dock ännu viktigare att notera att flera injektioner av hiPSC-CM i MD-gruppmössen perkutant ökade EF (från 30% till 42%; Figur 2B) och FS (från 18% till 28%; Figur 2C) av mushjärtat efter MI.
Fluorescensmärkning av ospecifikt α-aktin (αSA), DAPI, humanspecifikt troponin T (hcTnT) och humant kärnantigen (HNA) i vävnadssnitt visade att det transplanterade cellantalet i MD-gruppen var signifikant högre än i SD-gruppen (figur 3A). Även om MD-gruppen bara hade två fler injektioner än SD-gruppen, var det transplanterade cellantalet i MD-gruppen ~ 10x det för SD-gruppen (figur 3B). Dessutom var andelen transplanterade kardiomyocyter i MD-gruppen också signifikant högre än i SD-gruppen (figur 3C). Denna studie visade också att de transplanterade cellerna i MD-gruppen fördelades i infarktområdet och marginalinfarktområdet, medan de transplanterade cellerna i SD-gruppen endast fördelades i infarktområdet (Figur 3A).
MI-området i SD-behandlingsgruppen var mindre än i MI-gruppen och MI-området i SD-gruppen var signifikant mindre än i MD-gruppen (Figur 2E). Dessutom var tjockleken på den vänstra ventrikulära främre väggen i MD-gruppen 4x den hos myokardiell MI-gruppen, medan tjockleken på den vänstra ventrikulära främre väggen i SD-gruppen var dubbelt så stor som MI-gruppen (figur 2F). Kollagenvolymfraktionen i MD-gruppen var dock 50% lägre än i MI-gruppen, medan kollagenvolymfraktionen i SD-gruppen endast var 30% lägre än i MI-gruppen (Figur 2G).
Det totala antalet celler som uttrycker IB4 (en endotelcellmarkör) och SM22α (en glatt muskelcellmarkör) 28 dagar efter MI ökade signifikant i MD-gruppen (figur 3D, E) jämfört med SD- eller MI-gruppen. Denna studie bedömde också graden av hypertrofi av kardiomyocyter i marginalzonen i varje grupp. Vetegroddsagglutinin (WGA) och Sarcomeric Alpha Actinin fluorescensfärgning visade att den minsta fiberdiametern (MFD) hos ligerade möss i alla tre grupperna var signifikant högre än hos de skamligerade mössen. MFD för MD-gruppen var dock signifikant mindre än för MI- och SD-grupperna (figur 3F,G). Denna studie använde vidare TUNEL immunostaining (som kan markera kärnan i alla apoptotiska celler) för att utvärdera apoptos av kardiomyocyter. Jämfört med SD-gruppen eller MI-gruppen var prevalensen av TUNEL-positiva kardiomyocytkärnor i MD-gruppen signifikant reducerad (figur 3H,I). Inget humant mitokondriellt DNA detekterades i något organ i sken- och MI-grupperna (figur 4A,B). MD- och SD-grupperna visade endast humant mitokondriellt DNA i hjärtat, och inget humant mitokondriellt DNA detekterades i något annat organ (figur 4C, D).
Figur 1: Ultraljudstyrd intramyokardiell cellinjektion hos möss. Efter att musen har bedövats på ett operationsbord fixeras lemmarna och svansen med tejp vid en konstant temperatur av 37 °C, medan den perkutana intramyokardinjektionen administreras i vänster kammare, styrd av ekokardiografi. Mössen bedövades och upprätthölls genom inhalation av isofluran (1,5%-2%). Ta bort håret på övre buken och musens bröst. Under transtorakal ekokardiografi vägledning, sätt in spetsen på mikrosprutan under xiphoidprocessen (A) (pil) och flytta den (pil) längs membranets övre kant (B) för att justera andningsfrekvensen på musen. Tryck nålspetsen mot hjärtväggen (C) i inandningsfasen. (D,E) Nålspetsen kommer in i perikardhålan i utandningsfasen och tränger slutligen in i vänster ventrikulär främre vägg (F) för att injicera celler. Denna siffra ändrades från17. Förkortningar: LV = vänster kammare; AO = stigande aorta; RL = höger lunga; LL = vänster lunga. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Utvärdering av hjärtfunktionen hos möss i varje grupp. (A) Använd högupplöst ekokardiografi för att bedöma vänsterkammarfunktionen innan hjärtinfarkt induceras (pre-S) och 4 veckor efter behandling (post-S). Ejektionsfraktionen (B) och fraktionsförkortningen (C) uttrycks som absoluta värden. Uppgifterna uttrycks som medelvärde ± SE, 8 per grupp. Bedöm infarktstorlek, kollagenvolym och vänster ventrikulär morfologi. Genom Sirius röd/snabb grön färgning (D), infarktstorlek (E), vänster ventrikulär främre väggtjocklek (F) och kollagenvolymfraktion (G) mättes. Data visar medelvärdet ± SE, 8 möss per grupp. Skalstång = 1 mm. Envägsanalys av varians och Dunns multipeljämförelsetest. * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Denna siffra ändrades från17. Förkortningar: pre-S = preoperation; post-S = efter operation; MI = hjärtinfarkt; SD = engångsdos; MD = multipel dos. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Histologisk utvärdering av mössens hjärtan i varje grupp . (A) Seriella sektioner av de injicerade hjärtmössen med hiPSC-CM färgades för hcTnT, α-sarkomeriskt aktin (αSA) och DAPI. Antalet (B) och procentuellt (C) av de transplanterade cellerna användes för kvantifiering. Seriella sektioner från bluffdrivna, MI-, SD- och MD-behandlade mushjärtan som offrades 4 veckor efter MI-induktion färgades histokemiskt för närvaro av IB4. (D,E) Kapillärer kvantifieras som antalet IB4-positiva vaskulära strukturer i varje högeffektfältområde runt infarkten. Kardiomyocyterna färgades med WGA och αSA i den marginella zonen av hjärtinfarkt, och kärnorna märktes med DAPI. (F,G) Tvärsnittsarean för kardiomyocyter mäts och visas som ett absolut värde. De marginella sektionerna av hjärtinfarkt färgades med TUNEL för att visa apoptotiska kardiomyocyter (röda, TUNEL) och normala kardiomyocyter som uttrycker hjärttroponin T (grön, cTnT). (H,I) Förhållandet mellan TUNEL-positiva celler och totala celler beräknades. Skalstänger = 500 μm (A), 20 μm (D,H) eller 10 μm (F). Envägsanalys av varians och Dunns multipeljämförelsetest. * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Denna siffra ändrades från17. Förkortningar: hcTnT = humant hjärttroponin T; αSA = α-sarkomeriskt aktin; WGA = agglutinin av vetegroddar, DAPI = 4', 6-diamidino-2-fenylindol; TUNEL = terminal deoxinukleotidyltransferas dUTP nick end märkning; MI = hjärtinfarkt; SD = engångsdos; MD = multipel dos. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Detektion av humant mitokondriellt DNA i musorgan i varje grupp. Figuren visar detektion av humant mitokondriellt DNA i mushjärtan och andra organ i varje grupp 1 månad efter celltransplantation PCR. PCR av humant mitokondriellt DNA hittade inte transplanterade celler (A,B) i hjärtan och andra organ hos möss i sham (n = 3) och MI-gruppen (n = 3). PCR av humant mitokondriellt DNA hittade transplanterade celler i hjärtat hos möss i SD (n = 3) och MD-gruppen (n = 3) men inte i andra organ, inklusive lunga, lever, njure, hjärna och mjälte (C, D). Den kvantitativa qPCR-analysen av humant mitokondriellt DNA visade att MD-gruppens humana mitokondriella DNA var ungefär åtta gånger högre än SD-gruppens (E). (+) indikerar iPSC-CMs positiva kontroll. (−) anger DEPC-vattennegativ kontroll. Förkortningar: n.s. = inte signifikant; MI = hjärtinfarkt; SD = engångsdos; MD = multipel dos. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska stegen i denna studie inkluderar hiPSC-odling, kardiomyocytdifferentiering, hiPSC-CM-rening och hiPSC-CM-transplantation till mushjärtinfarktstället. Nyckeln är att använda hjärtultraljud för att transkutant styra behandlingen mot infarktstället vid kanten av infarktet där hiPSC-CMs injicerades i området.
Med förlängningen av odlingstiden förändras hiPSC-CM-fenotypen i morfologi (större cellstorlek), struktur (muskel, fibrilldensitet, arrangemang, mikroskopiska cellkluster) och fysiologi (kalciumbehandling och β-adrenerg respons) med differentiering över tiden. I denna studie utfördes fluorescensmärkning på den 10: e och 60: e dagen av hiPSC-differentiering i kardiomyocyter för att observera morfologiska och strukturella förändringar. Cellstorlek och sarkomerlängd ökade signifikant i hiPSC-CMs den 60: e dagen än den 10: e dagen. Studien använde hiPSC-CMs som var relativt stabila efter 60 dagars differentiering till kardiomyocyter för transplantation. Dessutom, under 60 dagars odling av hiPSC-CMs, utfördes flera ersättningar av mjölksyrainnehållande glukosfritt odlingsmedium för att rena kardiomyocyter och öka kardiomyocytinnehållet för att undvika biverkningar orsakade av icke-kardiomyocyter i de transplanterade cellerna.
En ultraljudssond placerades först på musens övre buk under ultraljudsstyrd cellinjektion för att visualisera dess lever. Mikroinjektornålen gick in snett under xiphoidprocessen, undviker levern och går in i perikardiet under ultraljudsvägledning. I denna studie bedömdes inte hjärtsäcken vertikalt från bröstväggens inre ben eftersom denna väg mot infarktområdet i myokardiet är signifikant kort, vilket innebär en hög risk för hjärtpunktering och celltransplantationsfel. Snett åtkomst till hjärtsäcken från xiphoidprocessen mot myokardiet utgör emellertid en betydligt längre väg med lägre risk för hjärtpunktering. Under den ultraljudsstyrda cellinjektionen intuberades mössen för att reglera andningsfrekvensen under punktering. Reglering av mössens andningsfrekvens och förlängning av inandnings- och utgångstiderna bidrar till punktering under utgången, vilket också undviker att skada lungorna. Under detta experiment dog inga möss av hjärtbrott och lungskada efter cellinjektion.
För stabiliteten hos transplanterade celler beaktade studien tidpunkten för hiPSC-CM-injektion och antalet injektioner. I det tidiga skedet av MI inträffade allvarlig inflammation i det infarkterade området23. Tidig undertryckning av det inflammatoriska svaret vid infarktstället kan förbättra myokardiell remodellering och begränsa dödliga möjligheter för försökspersonen24. Dessutom är ett allvarligt inflammatoriskt svar en orsak till transplanterad celldöd. Tidigare studier har visat att transplantation av ES-celldifferentierade kardiomyocyter till infarktstället kan hämma det inflammatoriska svaret vid hjärtinfarktstället25.
Efter att musens MI-modell etablerades injicerades hiPSC-CM i infarktstället och den infarkterade marginalzonen under direkt syn; endast en tiondel av hiPSC-CM överlevde. Studien tyder dock på att de initialt transplanterade hiPSC-CMs kan förbättra mikromiljön vid hjärtinfarktplatsen hos möss och förbättra överlevnaden av retransplanterade celler. Resultaten visade att antalet celler som överlevde efter tre hiPSC-CM-injektioner var 10x det för en enda hiPSC-CM-injektion (figur 3C). Ultraljud visade att den främre väggtjockleken på vänster kammare i MD- och SD-grupperna var mycket tunnare vid den tredje och fjärde veckan efter att MI-modellen etablerades än vid den första och andra veckan. Således injicerades mössen i MD-gruppen med celler omedelbart efter att MI-modellen etablerades, och sedan en och två veckor efter infarkt för att undvika död på grund av hjärtbrott.
Denna studie visar att antalet ympade celler är signifikant högre i MD-gruppen än i SD-gruppen. Musens ekokardiografi visade att EF- och SF-värdena för MD-gruppen var högre än för SD-gruppen. Den parakrina funktionen hos de transplanterade hiPSC-CMs bör också övervägas tillsammans med transplanterade kardiomyocyter för att förbättra hjärtfunktionen. En studie av Iwanaga et al.26 rapporterade att de parakrina faktorerna som utsöndras av hiPSC-CMs kan främja angiogenes genom att aktivera Akt1. Studien fann mycket få isolektin B4-positiva celler i det marginella infarktområdet i MI-gruppen. Däremot fanns det fler isolektin B4-positiva celler i SD- och MD-grupperna än i MI-gruppen; Noterbart var att MD-gruppen hade mest. Således visar dessa resultat att ju mer ympade hiPSC-CM, desto starkare blir de nya blodkärlen på platsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den stora forskningsplanen för National Natural Science Foundation of China (nr 91539111 till JY), Key Project of Science and Technology of Hunan Province (nr 2020SK53420 till JY) och The Science and Technology Innovation Program of Hunan Province (2021RC2106 till CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Cardiac troponin T | Abcam | ab8295 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150105 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150110 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150062 | |
| Human cardiac troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Isolectin B4 | Vector | FL-1201 | |
| Sarcomeric alpha actinin | Abcam | ab9465 | |
| Wheat germ agglutinin | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| Reagent | |||
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | |
| B27 Supplement(minus insulin) | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement(serum free) | Thermo Fisher Scientific | 17–504-044 | |
| Bouin's solution | Thermo Fisher Scientific | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| cyclosporin A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| DIRECT RED | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| FAST GREEN FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| lactic acid | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356234 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix kit | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| RPMI1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff | Stem Cell Technologies | 5030 | |
| STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium | Stem Cell Technologies | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| ultrasound coupling agent | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Applied Biosystems | Thermo Fisher Scientific | 7500 Real-Time PCR | |
| cryostat | Leica | CM1950 | |
| fluoresence microscope | Olympus | IX83 | |
| fine anatomical scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro syringe | Hamilton | 7633 | |
| Small animal anesthesia machine | MATRX | VMR | |
| Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Software | |||
| Statistical Product and Service Solutions | IBM | 21 | |
| Image J | NIH | 1.48 | |
| Human mitochondrial DNA primers | |||
| the forward primer sequence | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| the reverse primer sequence | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
References
- Leuschner, F., et al. Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis. The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).
- Lázár, E., et al. Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out. European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).
- Davis, M. K., et al. State of the art: cardiac transplantation. Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).
- Mancini, D., Colombo, P. C. Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant. Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).
- Zimmermann, W. H. Translating myocardial remuscularization. Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).
- Hu, X., et al. A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization. Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).
- Kempf, H., et al. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).
- Shiba, Y., et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts. Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).
- Nguyen, P. K., et al. Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review. JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).
- Zimmermann, W. H. Remuscularization of the failing heart. The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).
- Hu, X., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).
- Feng, Y., et al. Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway. Stem Cells. 32 (2), Dayton, Ohio. 462-472 (2014).
- Fan, C., et al. Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Sun, X., et al. Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats. Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).
- Wu, X., et al. Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873 (2021).
- Kannappan, R., et al. Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair. Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).
- Lou, X., et al. N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts. Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).
- Zhao, M., et al. Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice. Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).
- Zhao, M., et al. Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452 (2019).
- O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Rainer, P. P., et al. Cardiomyocyte-specific transforming growth factor β suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction. Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).
- Yu, Y., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 167 (2019).
- Iwanaga, K., et al. Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).
