Summary
Die ultraschallgesteuerte Zellabgabe um die Stelle des Myokardinfarkts bei Mäusen ist eine sichere, effektive und bequeme Art der Zelltransplantation.
Abstract
Das Hauptziel der Zelltherapie nach Myokardinfarkt (MI) ist es, die Zelltransplantationsrate effektiv zu erhöhen, und humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) sind eine vielversprechende Zellquelle für die Herzreparatur nach ischämischen Schäden. Eine niedrige Transplantatrate ist jedoch ein erhebliches Hindernis für eine effektive Regeneration des Herzgewebes nach der Transplantation. Dieses Protokoll zeigt, dass mehrere ultraschallgesteuerte perkutane Injektionen in einen MI-Bereich die Zelltransplantationsraten effektiv erhöhen. Die Studie beschreibt auch den gesamten hiPSC-CM-Kulturprozess, die Vorbehandlung und die ultraschallgesteuerten perkutanen Verabreichungsmethoden. Darüber hinaus hilft die Verwendung menschlicher mitochondrialer DNA, das Fehlen von hiPSC-CMs in anderen Mausorganen nachzuweisen. Schließlich beschreibt dieser Artikel die Veränderungen der Herzfunktion, der Angiogenese, der Zellgröße und der Apoptose an der infarktierten Grenzzone bei Mäusen 4 Wochen nach der Zellentbindung. Daraus kann geschlossen werden, dass die echokardiographiegesteuerte perkutane Injektion des linksventrikulären Myokards eine machbare, relativ invasive, zufriedenstellende, wiederholbare und wirksame Zelltherapie ist.
Introduction
Wenn akuter MI auftritt, sterben Myokardzellen im Infarktbereich aufgrund von Ischämie und Hypoxie schnell ab. Mehrere Entzündungsfaktoren werden nach Zelltod und Ruptur freigesetzt, während Entzündungszellen die Infarktstelle infiltrieren, um eine Entzündung zu verursachen1. Bezeichnenderweise ersetzen Fibroblasten und Kollagen, sowohl ohne Kontraktilität als auch ohne elektrische Leitfähigkeit, die Myokardzellen an der Infarktstelle, um Narbengewebe zu bilden. Aufgrund der begrenzten Regenerationsfähigkeit von Kardiomyozyten bei erwachsenen Säugetieren ist lebensfähiges Gewebe, das nach einem großen Infarktbereich gebildet wird, in der Regel nicht ausreichend, um ein ausreichendes Herzzeitvolumen aufrechtzuerhalten2. MI verursacht Herzinsuffizienz, und in schweren Fällen von Herzinsuffizienz können sich die Patienten nur auf Herztransplantationen oder Herzunterstützungssysteme verlassen, um eine normale Herzfunktion aufrechtzuerhalten 3,4.
Nach MI besteht die ideale Behandlungsstrategie darin, die toten Kardiomyozyten durch neu gebildete Kardiomyozyten zu ersetzen und eine elektromechanische Kopplung mit gesundem Gewebe zu bilden. Die Behandlungsoptionen haben jedoch in der Regel eher eine myokardiale Rettung als einen Ersatz übernommen. Derzeit gehören stammzell- und vorläuferzellbasierte Therapien zu den vielversprechendsten Strategien zur Förderung der Myokardreparatur nach MI5. Die Transplantation dieser Zellen hat jedoch mehrere Probleme, vor allem die Unfähigkeit adulter Stammzellen, sich in Kardiomyozyten zu differenzieren, und ihre kurze Lebensdauer6.
Die ethischen Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) können durch iPS-Zellen umgangen werden, die eine vielversprechende Quelle für Zellen darstellen. Darüber hinaus besitzen iPS-Zellen eine starke Selbsterneuerungsfähigkeit und können sich zu Kardiomyozytendifferenzieren 7. Studien haben gezeigt, dass hiPSC-CMs, die in die MI-Stelle transplantiert werden, überleben und Gap Junctions mit Wirtszellen bildenkönnen 8,9. Da sich diese transplantierten Zellen jedoch in der Mikroumgebung von Ischämie und Entzündung befinden, ist ihre Überlebensrate extrem niedrig10,11.
Es wurden mehrere Methoden etabliert, um die Überlebensrate transplantierter Zellen zu verbessern, wie z. B. Hypoxie und Hitzeschock-Vorbehandlung transplantierter Zellen12,13, genetische Modifikation 14,15 und die gleichzeitige Transplantation von Zellen und Kapillaren 16. Leider sind die meisten Methoden durch Komplexität und hohe Kosten begrenzt. Daher schlägt die vorliegende Studie eine reproduzierbare, bequeme, relativ invasive und effektive hiPSC-CM-Verabreichungsmethode vor.
Die ultraschallgesteuerte intramyokardiale Zellinjektion kann unabhängig von der Stelle nur mit einem hochauflösenden kleinen veterinärmedizinischen Ultraschallgerät und einem Mikroinjektor durchgeführt werden. Unter Ultraschallführung ist die direkte Abgabe von Zellen unter dem Xiphoid-Prozess vom Perikard in das Myokard bei Mäusen ein sicheres Protokoll, das Leber- und Lungenschäden vermeidet. Diese Methode kann gleichzeitig mit anderen Technologien kombiniert werden, um die Überlebensrate transplantierter Zellen deutlich zu verbessern.
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Protocol
Alle Tierversuche in dieser Studie wurden von der Ethikkommission des Zweiten Xiangya-Krankenhauses der Central South University überprüft und genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden. Die Zeitpläne für Zellinjektion, Bildgebung und Euthansie sind wie folgt: t0- Induktion des Infarkts, t1 Woche - Bild- und Implantatzellen, t2 Wochen - Bild- und Implantatzellen, t4 Wochen - endgültige Bildgebung, Euthanasie und Gewebeentnahme.
1. hiPSC-Kultur, Kardiomyozytendifferenzierung und Zellreinigung
- Mischen Sie DMEM/F12 und Basalmembran-Matrix-Stammlösung mit Eis bei 4 °C im Verhältnis 1,5:1, aliquot, und lagern Sie das resultierende Gemisch (Matrixverdünnungsmittel) bei -20 °C. Mischen Sie 25 ml DMEM/F12-Nährmedium bei 4 °C und 1 ml Matrixverdünnungsmittel gründlich mit Eis und verteilen Sie 1 ml/Well in einer 6-Well-Platte. Halten Sie die Platte 1 h lang aufrecht in einem Inkubator bei 37 °C und saugen Sie den DMEM/F12-Überstand aus den Vertiefungen ab. Berühren Sie nicht die Unterseite der 6-Well-Platte, wenn Sie den Vorgang durchführen.
- Entfernen Sie das Kryokonservierungsröhrchen mit den hiPS-Zellen aus flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie schnell in einem 37 °C heißen Wasserbad auf. Sterilisieren Sie die äußere Oberfläche des Kryokonservierungsröhrchens mit 75% Alkohol, wischen Sie den Alkohol ab und stellen Sie das Röhrchen auf einen sterilen, ultrasauberen Tisch.
- Verwenden Sie eine Pipette, um die Kryokonservierungslösung, die hiPS-Zellen enthält, vorsichtig in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu überführen, fügen Sie 5 ml feederfreies ES-Medium hinzu und zentrifugieren Sie die Suspension bei 300 × g für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 6 ml des feederfreien ES-Mediums. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Zellkonzentration mit dem Kulturmedium auf 5 × 105 Zellen/ml ein.
- ROCK-Inhibitor (Y27632) zu den hiPS-Zellen bis zu einer Endkonzentration von 5 μM geben. Übertragen Sie die hiPS-Zellen mit Y27632 auf die mit Basalmembranmatrix vorbehandelte 6-Well-Platte und schwenken Sie die 6-Well-Platte vorsichtig, wobei Sie die Form der Zahl "8" nachzeichnen, um die hiPS-Zellen gleichmäßig zu verteilen. Stellen Sie die hiPS-Zellen für 24 h in einen 37 °C heißen, feuchten Inkubator mit 5 % CO2 in aufrechter Position. Ersetzen Sie den Überstand durch das zuführfreie ES-Medium ohne Y27632.
- Wenn hiPS-Zellen einen Konfluenzgrad von 80 % erreichen, saugen Sie den Kulturüberstand ab, waschen Sie die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), fügen Sie insulinfreies RPMI1640 + B27 hinzu, das 10 μM CHIR99021 (GSK3-β-Inhibitor) enthält, und legen Sie die hiPS-Zellen 24 h lang in einen feuchten CO2 -Inkubator bei 37 °C.
- Ersetzen Sie die Hälfte des Überstands durch RPMI1640 + B27-Medium ohne Insulin und inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden.
- Ersetzen Sie das Nährmedium vollständig durch RPMI1640 + B27 (ohne Insulin). Stellen Sie die Platten für 24 h in einen feuchten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 in aufrechter Position.
- Ersetzen Sie das Nährmedium nach 3 Tagen vollständig durch insulinfreies RPMI1640 + B27 + 5 μM IWR1 (Wnt Signaling Pathway Inhibitor) und stellen Sie die Platten für 48 h in einen feuchten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 .
- Ersetzen Sie das Nährmedium nach 5 Tagen durch RPMI1640 + B27 ohne Insulin und inkubieren Sie 48 h in einem feuchten CO2 -Inkubator bei 37 °C weiter.
- Ersetzen Sie das Nährmedium nach 7 Tagen durch das Medium RPMI + B27 (einschließlich Insulin) und stellen Sie die Platten für 3 Tage bei 37 °C in einen befeuchteten CO2 -Inkubator. Ersetzen Sie das Medium alle 3 Tage durch das RPMI + B27-Medium. Achten Sie auf das spontane Schlagen von Zellen nach 9-12 Tagen der Differenzierung.
- Ersetzen Sie nach der Beobachtung der pulsierenden Zellen das RPMI + B27-Medium durch ein glukosefreies RPMI 1640-Medium, das Milchsäure enthält (1 ml Milchsäure wird zu 500 ml glukosefreiem RPMI 1640-Medium hinzugefügt). Die Zellen werden 72 h in einem feuchten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 inkubiert.
- Nach 72 h wird der Überstand durch RPMI + B27-Medium ersetzt und 48 h in einem feuchten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.
- Saugen Sie den Kulturüberstand unter Unterdruck ab und waschen Sie die Zellen 3x mit PBS, um Spuren des Nährmediums zu entfernen. Verwenden Sie die Zellablösungsenzymmischung, um die hiPSC-CMs bei 37 °C in einzelne Zellen zu dissoziieren. Die erhaltenen Zellen werden in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 3 ml Kardiomyozyten-Trägerlösung gesammelt, bei 300 × g 2 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand verworfen.
- Resuspendieren Sie die Zellen mit RPMI + B27-Medium, säen Sie sie auf mit Basalmembranmatrix beschichtete 6-Well-Platten und inkubieren Sie sie 48 h lang in einem feuchten Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2.
- Ersetzen Sie den Kulturüberstand zur Reinigung durch ein glukosefreies milchsäurehaltiges RPMI 1640-Medium und inkubieren Sie ihn 72 h in einem feuchten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2.
- Ersetzen Sie den Kulturüberstand durch RPMI + B27-Medium und wechseln Sie das Medium alle 3 Tage.
- Setzen Sie den obigen Vorgang 30 Tage lang fort und ersetzen Sie den Kulturüberstand zur weiteren Reinigung durch ein glukosefreies Medium, das Milchsäure enthält. Inkubieren Sie die Zellen 3 Tage lang mit diesem Medium und ersetzen Sie den Überstand durch RPMI + B27. Kultivieren Sie die Zellen 30 Tage lang kontinuierlich, bis die hiPSC-CMs stabil schlagen, und verwenden Sie diese Zellen für die intramyokardiale Injektion bei Mäusen.
2. Herstellung von hiPSC-CMs und Etablierung eines akuten Myokardinfarktmodells der Maus
- Vakuumaspiration des Kulturüberstands von 60 Tagen kultivierten hiPSC-CMs, Waschen der Zellen 3x mit PBS und Dissoziieren der hiPSC-CMs bei 37 °C mit der Zellablösungsenzymmischung (~3-5 min) in einzelne Zellen. Sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 ml RPMI + B27-Medium und mischen Sie es gut, bevor Sie die Zellen zählen, um die Gesamtzahl der Zellen zu berechnen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 × g für 2 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie Kardiomyozyten-Trägermedium hinzu, um auf eine Konzentration von 0,6 × 105 Zellen/μl zu resuspendieren.
- Halten Sie das Zentrifugenröhrchen mit den resuspendierten hiPSC-CMs bei 37 °C für die Injektion bereit 14,17,18,19,20.
- Legen Sie die Mäuse in eine Anästhesiebox, die mit Isofluran verbunden ist, um eine Anästhesieinhalation zu induzieren, gefolgt von der Verwendung von Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
HINWEIS: Die Isoflurankonzentration betrug 5%. Achten Sie während des Experiments auf die Belüftung im Labor. - Achten Sie nach dem Kneifen auf den Verlust von Reflexen im Fuß- und Schwanzbereich, wenn die Maus flach auf den Operationstisch gelegt wird, was auf eine ausreichende Anästhesie hinweist. Buprenorphin (0,1 mg/kg) intraperitoneal verabreichen.
- Schmieren Sie die Haare in der Mitte des Halses und der linken Brust der Mäuse mit einer Enthaarungscreme ein und wischen Sie die aufgetragene Creme und das Haar nach 5 Minuten mit Gaze ab.
- Befestigen Sie die Gliedmaßen und den Mausschwanz mit Klebeband. Befestigen Sie die Schneidezähne der Maus mit einem 2-0-Seidenfaden und Klebeband. Sterilisieren Sie den Operationsbereich (mittlerer Hals und linke Brust) mit drei abwechselnden Runden Betadin, gefolgt von Alkohol.
- Legen Sie ein chirurgisches Tuch um den sterilisierten chirurgischen Bereich. Machen Sie dann einen mittleren Halsschnitt mit einer feinen anatomischen Schere und einer feinen Sezierzange, um die Luftröhre vollständig freizulegen. Schneiden Sie gegebenenfalls einige vordere Halsmuskeln zur Stabilisierung ab.
HINWEIS: Die Bediener waren blind für die Tiergruppen. - Führen Sie einen Trachealtubus (20 G Katheterpunktionsnadel) durch den Mund ein.
- Schließen Sie den Trachealtubus an das Beatmungsgerät an und überprüfen Sie die Bewegung des Brustkorbs, um sicherzustellen, dass beide Lungen gut belüftet sind.
- Passen Sie die Atemparameter an (Atemfrequenz: 100-150 Schläge pro Minute, Atemzug 250-300 μL). Danach fixieren Sie das linke Hinterbein wieder auf der unteren rechten Seite, lösen Sie das Klebeband um die linke obere Extremität und führen Sie eine Thorakotomie im 3-4 Interkostalraum des linken Thorax mit einer feinen Sezierschere und einer Pinzette durch, um eine maximale Herzexposition zu erzielen.
- Ziehen Sie das Perikard mit einer Pinzette unter einem Mikroskop ab, um die linke vordere absteigende Koronararterie (LAD) am unteren Rand des linken Vorhofohrs sichtbar zu machen.
- Verwenden Sie einen 6-0-Seidenfaden, um das proximale Ende des LAD zu ligieren. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass das akute MI-Modell ausreichend etabliert ist (wenn sich die distale LAD an der Ligaturstelle von rot nach weiß ändert), schließen Sie die Brust Schicht für Schicht und nähen Sie die Haut mit 4-0-Gewindestichen. Führen Sie alle oben genannten chirurgischen Eingriffe zur MI-Induktion für die Scheintiergruppe mit Ausnahme der Ligatur durch.
- Schalten Sie die Inhalationsanästhesie aus, entfernen Sie die Kanüle, nachdem die Maus die Spontanatmung wieder aufgenommen hat, und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück. Überwachen Sie das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrechtzuerhalten. Geben Sie es nicht an die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es sich vollständig erholt hat. Verabreichen Sie intraperitoneale Injektionen von Buprenorphin (0,1 mg/kg x 3 Tage) und Carprofen (5 mg/kg x 1 Tag) alle 12 Stunden postoperativ.
- Injizieren Sie Cyclosporin A (10 mg·kg-1·Tag-1) 3 Tage vor der Verabreichung von hiPSC-CMs in die intraperitoneale Höhle von Mäusen, um die Abstoßung der transplantierten Zellen zu verhindern. Injizieren Sie Cyclosporin A kontinuierlich für 1 Monat nach der Transplantation.
3. hiPSC-CM-Injektion unter Ultraschallkontrolle
- Ordnen Sie nach dem Einrichten des MI-Modells die Mäuse des MI-Modells (12 Wochen alte C57BL/6-Mäuse; 22 g bis 24 g Gewicht, 50 % männlich und 50 % weiblich) am ersten Tag nach dem MI einer Einzeldosis (SD, n = 8 in dieser Studie) und einer Mehrfachdosis (MD, n = 8 in dieser Studie) zu und legen Sie sie in der ersten und zweiten Woche nach MI in eine Anästhesiebox, die mit 5% Isofluran zur Einleitung einer Inhalationsanästhesie verbunden ist, gefolgt von Tracheale Intubation.
- Schmieren Sie die Haare auf Brust und Oberbauch der Mäuse mit Enthaarungscreme ein und wischen Sie die Creme 5 Minuten später mit Gaze ab. Überwachen Sie die Herzfrequenz der Maus auf dem Operationsbrett und verabreichen Sie Inhalationsisofluran, bis die Herzfrequenz bei 400-500 Schlägen pro Minute gehalten wird.
- Befestigen Sie die Gliedmaßen und den Schwanz der Maus mit Klebeband an der Detektionskonsole und stellen Sie die Plattformtemperatur auf 37 °C ein.
- Tragen Sie ein spezielles Ultraschallgelee auf den Oberbauch auf und verwenden Sie eine kleinere hochauflösende veterinärmedizinische Ultraschallsonde, um Leberbilder von Mäusen zu erhalten.
- Verringern Sie die Beatmungsrate auf 50 Schläge pro Minute. Verwenden Sie eine 5-μl-Mikrospritze, um ~3 × 105 Zellen zu ziehen (aus Schritt 2.1). Halten Sie die Spritze mit einem Mikromanipulator fest und führen Sie eine 3-mm-Nadel am linken para-xiphoiden Prozess ein (Abbildung 1A). Folgen Sie der Oberkante des Zwerchfells unter Ultraschallkontrolle (Abbildung 1B), beobachten Sie den Atemrhythmus und -bereich (Abbildung 1C, D) und treten Sie am Ende des Exspirationszyklus in das Perikard ein, um Schäden an Leber und Lunge zu vermeiden (Abbildung 1D).
- Nachdem die Mikroinjektornadel in die Perikardhöhle eingedrungen ist, stellen Sie die Atemfrequenz auf den ursprünglichen Parameter (150 Schläge pro Minute) ein. Erfassen Sie das parasternale Langachsenbild des Mausherzens durch M-Form-Echokardiographie gemäß den Anweisungen des Herstellers17 (Abbildung 1E). Injizieren Sie unter Ultraschallkontrolle 3 × 10 5 Zellen (Abbildung 1F) in drei Randbereiche (1 × 105 Zellen pro Injektionsstelle) der Infarktstelle.
- Entfernen Sie die spezielle Ultraschallsonde und spülen Sie das Gelee ab. Entwöhnen Sie die Maus von der Inhalationsanästhesie und bringen Sie sie nach vollem Bewusstsein in ihren Käfig zurück.
- Wiederholen Sie die oben genannten ultraschallgesteuerten Zellinjektionsverfahren 1 und 2 Wochen nach der Etablierung des MI für die Mäuse der MD-Gruppe.
4. Bewertung der Herzfunktion, der Fluoreszenzmarkierung, der Anzahl der transplantierten Zellen, des Myokardinfarktbereichs und des Nachweises menschlicher Mitochondrien bei Mäusen 30 Tage nach der Ligatur des linken vorderen absteigenden Astes
- Beurteilung der Herzfunktion
- Legen Sie die Maus in eine mit Isofluran verbundene Anästhesiebox für die Induktions-Inhalationsanästhesie, gefolgt von der Verwendung einer Tierarztsalbe auf den Augen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Entfernen Sie die Haare auf der linken Brust der Maus mit Enthaarungscreme. Legen Sie die Maus auf das Bedienfeld, um die Herzfrequenz zu überwachen und die Isofluran-Inhalation anzupassen. Halten Sie die Herzfrequenz der Maus bei 400-500 Schlägen pro Minute. Der experimentelle Endpunkt ist Tag 30 (nach der MI-Induktion).
- Befestigen Sie die Gliedmaßen und den Schwanz der Maus mit Klebeband an der Detektionskonsole und stellen Sie die Plattformtemperatur auf 37 °C ein.
- Verwenden Sie nach dem Auftragen eines speziellen Ultraschallgels auf den vorderen Herzbereich eine (veterinär-)hochauflösende Herzultraschallsonde, um parasternale langachsige und zweidimensionale kurzachsige Bilder unter Echokardiographie von M-Form und B-Form gemäß den Anweisungen des Herstellers17 aufzunehmen.
- Nachdem die Ultraschallerkennung abgeschlossen ist, spülen Sie das spezielle Ultraschallgel ab, schalten Sie die Inhalationsanästhesie aus und bringen Sie die Maus nach vollem Bewusstsein separat in ihren Käfig zurück.
- Analysieren Sie die erhaltenen Daten und berechnen Sie die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (EF) und die fraktionierte Verkürzung (FS) mit der Analysesoftware. Stellen Sie sicher, dass der Bediener für die Versuchsgruppen17 verblindet ist.
- Fluoreszenzmarkierung von Schnitten
- Waschen Sie das isolierte Herz mit PBS und tauchen Sie es 12 h lang bei 4 °C in 4% Paraformaldehyd. Nehmen Sie das Herz heraus und tauchen Sie es 24 Stunden lang in 30% Saccharose, um es zu dehydrieren.
- Betten Sie das dehydrierte Herz mit der optimalen Schnitttemperaturverbindung (OCT) auf Trockeneis ein. Schneiden Sie das Herz von unten bis zur Spitze mit einer Kryostatdicke von 10 μm in Scheiben und legen Sie die Abschnitte auf Objektträger und lagern Sie die Objektträger bei -20 °C.
- Waschen Sie die Objektträger mit dem Herzgewebe mit PBS für 3 min.
- Permeabilisieren Sie das Gewebe auf Objektträgern mit 0,5% Triton X-100 bei Raumtemperatur für 8 min und waschen Sie sie 3x mit PBS für 5 min pro Waschgang.
- Nachdem Sie das Gewebe mit 10% Eselserum und 90% PBS (Blockierlösung) bedeckt haben, blockieren Sie die Schnitte für 1 h bei Raumtemperatur.
- Nach dem Entfernen der Blockierlösung werden die Schnitte mit dem Primärantikörper (mit der Blockierlösung auf 1:100 verdünnt) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie sie 3x mit PBS für 5 Minuten pro Waschgang.
- Inkubieren Sie das Gewebe auf Objektträgern mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern (verdünnt auf 1:100 mit der Blockierlösung) für 1 h bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, das Gewebe mit dem Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper ab diesem Zeitpunkt dem Licht auszusetzen. - Waschen Sie die Objektträger 3x mit PBS für 5 min pro Waschgang.
- Die Objektträger werden mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-haltigem Einbettmedium montiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop17 fotografiert.
- Anzahl der transplantierten hiPSC-CMs17
- Führen Sie eine Gewebeimmunfluoreszenzfärbung an gefrorenen Herzschnitten für fußgängerspezifisches Troponin T (hcTnT), humanes nukleäres Antigen (HNA) und unspezifisches Sarkomer-Alpha-Actinin durch.
- Nachdem das ganze Herz seriell geschnitten wurde, nehmen Sie einen Abschnitt für jeweils 50 Abschnitte für die Fluoreszenzmarkierung.
- Nehmen Sie nach dem Zufallsprinzip fünf Bilder mit hoher Vergrößerung pro Schicht auf. Zählen Sie die Anzahl der gepfropften Sichtfelder, berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der gepfropften Zellen pro Flächeneinheit, und legen Sie sie als A1/μm2 fest. Berechnen Sie die gesamte gepfropfte Fläche der Scheibe mit ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) und legen Sie sie auf B1 μm2 fest, so dass die gepfropfte Anzahl in dieser Scheibe = A1 × B121,22 ist.
- Berechnen Sie die Gesamtzahl der transplantierten Zellen pro Mausherz mit Gl (1) und die prozentuale Transplantationsrate mit Gl (2), wobei ein Abschnitt aus 50 Abschnitten ausgewählt wurde21,22.
- Gesamtzahl der transplantierten Zellen pro Mausherz = (A1 × B1 + A2 × B2 +...+ An × Bn) × 50 (1)
Transplantationsrate =
(2)
ANMERKUNG: Die Anzahl der Lieferungen betrug 3 × 10 5 für die SD-Gruppe und 3 × 3 × 105 für die MD-Gruppe.
- Beurteilung des Myokardinfarktbereichs
- Schneiden Sie einen gefrorenen Querschnittsabschnitt (kurze Achse) des isolierten Herzens von der Spitze bis zur Basis des Herzens mit einer Dicke von 10 μm.
- Nachdem das ganze Herz seriell geschnitten wurde, nehmen Sie einen Schnittschieber für jeweils 30 Abschnitte und fixieren Sie ihn in vorgewärmter Bouin-Lösung bei 58 °C. Färben Sie den Abschnitt mit 0,04 % Direct Red und 0,1 % Fast Green Kollagenflecken (verdünnt in PBS) gemäß den Anweisungen des Herstellers17.
- Verwenden Sie eine Software (z. B. ImageJ), um die Bilder nach einer Querschnitts-Ganzkörperfotografie des Herzens unter dem Mikroskop mit Gl (3) zu analysieren:14,17
Infarktfläche % =
× 100% (3)
- Nachweis menschlicher mitochondrialer DNA in verschiedenen Organen
- Betäuben Sie die Mäuse mit 5% Isofluran und opfern Sie sie durch posteriore Zervixluxation. Sezieren Sie die Mäuse 4 Wochen nach der Zelltransplantation. Entnahme der Organe (Leber, Lunge, Gehirn, Niere, Milz) und eines Teils des Myokards (n = 3 in diesem Abschnitt).
- Mahlen Sie jedes Organgewebe in flüssigem Stickstoff und extrahieren Sie DNA aus dem Gewebe mit dem referenzierten Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um das referenzierte Kit und die Primer (siehe Materialtabelle) zu verwenden, um menschliche mitochondriale DNA in den oben genannten Geweben nachzuweisen (ab Schritt 4.5.1).
(2)
× 100% (3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Echokardiographie zur Beurteilung der linksventrikulären Funktion der Mäuse in jeder Gruppe zeigte, dass die MI-Verletzungen in der MD-Gruppe effektiv rückgängig gemacht wurden (Abbildung 2A). Im Vergleich zur MI-Gruppe zeigte die SD-Gruppe eine erhöhte Ejektionsfraktion (EF) (von 30% auf 35%; Abbildung 2B) und Fraktionsverkürzung (FS) (von 18 % auf 22 %; Abbildung 2C) nach MI. Es ist jedoch noch wichtiger zu beachten, dass mehrfache Injektionen der hiPSC-CMs in Mäusen der MD-Gruppe die EF perkutan erhöhten (von 30% auf 42%; Abbildung 2B) und FS (von 18 % auf 28 %; Abbildung 2C) des Mausherzens nach MI.
Die Fluoreszenzmarkierung von unspezifischem α-Aktin (αSA), DAPI, humanspezifischem Troponin T (hcTnT) und humanem nukleärem Antigen (HNA) von Gewebeschnitten zeigte, dass die transplantierte Zellzahl in der MD-Gruppe signifikant höher war als in der SD-Gruppe (Abbildung 3A). Obwohl die MD-Gruppe nur zwei Injektionen mehr hatte als die SD-Gruppe, war die transplantierte Zellzahl in der MD-Gruppe ~10x so hoch wie in der SD-Gruppe (Abbildung 3B). Darüber hinaus war der Anteil der transplantierten Kardiomyozyten in der MD-Gruppe auch signifikant höher als in der SD-Gruppe (Abbildung 3C). Diese Studie zeigte auch, dass die transplantierten Zellen in der MD-Gruppe im Infarktbereich und im Randinfarktbereich verteilt waren, während die transplantierten Zellen in der SD-Gruppe nur im Infarktbereich verteilt waren (Abbildung 3A).
Der MI-Bereich in der SD-Behandlungsgruppe war kleiner als der in der MI-Gruppe und der MI-Bereich in der SD-Gruppe war signifikant kleiner als der in der MD-Gruppe (Abbildung 2E). Darüber hinaus war die Dicke der linksventrikulären Vorderwand der MD-Gruppe 4-mal so hoch wie die der myokardialen MI-Gruppe, während die Dicke der linksventrikulären Vorderwand in der SD-Gruppe doppelt so hoch war wie die der MI-Gruppe (Abbildung 2F). Der Kollagenvolumenanteil in der MD-Gruppe war jedoch um 50 % niedriger als in der MI-Gruppe, während der Kollagenvolumenanteil in der SD-Gruppe nur um 30 % niedriger war als in der MI-Gruppe (Abbildung 2G).
Die Gesamtzahl der Zellen, die IB4 (ein Endothelzellmarker) und SM22α (ein Marker für glatte Muskelzellen) 28 Tage nach dem MI exprimierten, stieg in der MD-Gruppe (Abbildung 3D, E) im Vergleich zur SD- oder MI-Gruppe signifikant an. Diese Studie untersuchte auch den Grad der Hypertrophie von Kardiomyozyten in der Marginalzone jeder Gruppe. Die Fluoreszenzfärbung von Weizenkeim-Agglutinin (WGA) und Sarkomer-Alpha-Actinin zeigte, dass der minimale Faserdurchmesser (MFD) bei ligierten Mäusen in allen drei Gruppen signifikant höher war als bei den scheinligierten Mäusen. Das MFD der MD-Gruppe war jedoch signifikant kleiner als das der MI- und SD-Gruppen (Abbildung 3F,G). In dieser Studie wurde außerdem die TUNEL-Immunfärbung (die den Kern aller apoptotischen Zellen markieren kann) verwendet, um die Apoptose von Kardiomyozyten zu bewerten. Im Vergleich zur SD-Gruppe bzw. der MI-Gruppe war die Prävalenz von TUNEL-positiven Kardiomyozytenkernen in der MD-Gruppe signifikant reduziert (Abbildung 3H,I). In keinem Organ der Schein- und MI-Gruppen wurde menschliche mitochondriale DNA nachgewiesen (Abbildung 4A, B). Die MD- und SD-Gruppen zeigten nur menschliche mitochondriale DNA im Herzen, und es wurde keine menschliche mitochondriale DNA in einem anderen Organ nachgewiesen (Abbildung 4C, D).
Abbildung 1: Ultraschallgesteuerte intramyokardiale Zellinjektion bei Mäusen. Nachdem die Maus auf einem Operationstisch betäubt wurde, werden die Gliedmaßen und der Schwanz mit Klebeband bei einer konstanten Temperatur von 37 ° C fixiert, während die perkutane intramyokardiale Injektion in den linken Ventrikel verabreicht wird, die durch Echokardiographie geführt wird. Die Mäuse wurden betäubt und durch Inhalation von Isofluran (1,5%-2%) aufrechterhalten. Entfernen Sie die Haare am Oberbauch und an der Brust der Maus. Führen Sie unter Anleitung der transthorakalen Echokardiographie die Spitze der Mikrospritze unterhalb des Xiphoidfortsatzes (A) (Pfeil) ein und bewegen Sie sie (Pfeil) entlang der Oberkante des Zwerchfells (B), um die Atemfrequenz der Maus einzustellen. Drücken Sie die Nadelspitze in der inspiratorischen Phase gegen die Perikardwand (C). (D,E) Die Nadelspitze dringt in der exspiratorischen Phase in die Perikardhöhle ein und dringt schließlich in die linksventrikuläre Vorderwand (F) ein, um Zellen zu injizieren. Diese Zahl wurde von17 geändert. Abkürzungen: LV = linker Ventrikel; AO = aufsteigende Aorta; RL = rechte Lunge; LL = linke Lunge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Bewertung der Herzfunktion bei Mäusen in jeder Gruppe . (A) Verwenden Sie eine hochauflösende Echokardiographie, um die linksventrikuläre Funktion vor der Induktion eines Myokardinfarkts (Prä-S) und 4 Wochen nach der Behandlung (Post-S) zu beurteilen. Die Ejektionsfraktion (B) und die Fraktionsverkürzung (C) werden als absolute Werte ausgedrückt. Die Daten werden als Mittelwert ± SE ausgedrückt, 8 pro Gruppe. Beurteilen Sie die Infarktgröße, das Kollagenvolumen und die linksventrikuläre Morphologie. Durch die Sirius-Rot-/Schnellgrünfärbung (D) wurden die Infarktgröße (E), die linksventrikuläre Vorderwanddicke (F) und der Kollagenvolumenanteil (G) gemessen. Die Daten zeigen einen Mittelwert ± SE, 8 Mäuse pro Gruppe. Maßstabsleiste = 1 mm. Einweg-Varianzanalyse und Dunn-Mehrfachvergleichstest. * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Diese Zahl wurde von17 geändert. Abkürzungen: prä-S = präoperativ; post-S = nach der Operation; MI = Myokardinfarkt; SD = Einzeldosis; MD = Mehrfachdosis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Histologische Auswertung der Herzen von Mäusen in jeder Gruppe . (A) Serienschnitte der injizierten Herzmäuse mit hiPSC-CM wurden auf hcTnT, α-Sarkomeraktin (αSA) und DAPI gefärbt. Die Anzahl (B) und der Prozentsatz (C) der transplantierten Zellen wurden zur Quantifizierung verwendet. Serielle Schnitte von scheinoperierten, MI-, SD- und MD-behandelten Mausherzen, die 4 Wochen nach der MI-Induktion geopfert wurden, wurden histochemisch auf das Vorhandensein von IB4 gefärbt. (D,E) Kapillaren werden als Anzahl der IB4-positiven Gefäßstrukturen in jedem Hochleistungsfeldbereich um den Infarkt herum quantifiziert. Die Kardiomyozyten wurden mit WGA und αSA in der Marginalzone des Myokardinfarkts gefärbt und die Kerne mit DAPI markiert. (F,G) Die Querschnittsfläche von Kardiomyozyten wird gemessen und als absoluter Wert angezeigt. Die Randabschnitte des Myokardinfarkts wurden mit TUNEL gefärbt, um apoptotische Kardiomyozyten (rot, TUNEL) und normale Kardiomyozyten zu zeigen, die kardiales Troponin T exprimieren (grün, cTnT). (H,I) Das Verhältnis von TUNEL-positiven Zellen zu Gesamtzellen wurde berechnet. Maßstabsbalken = 500 μm (A), 20 μm (D, H) oder 10 μm (F). Einweg-Varianzanalyse und Dunn-Mehrfachvergleichstest. * S. < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * * p < 0,0001. Diese Zahl wurde von17 geändert. Abkürzungen: hcTnT = humanes kardiales Troponin T; αSA = α-sarkomerisches Aktin; WGA = Weizenkeim-Agglutinin; DAPI = 4', 6-Diamidino-2-phenylindol; TUNEL = terminale Desoxynukleotidyltransferase-dUTP-Nick-End-Markierung; MI = Myokardinfarkt; SD = Einzeldosis; MD = Mehrfachdosis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Nachweis menschlicher mitochondrialer DNA in Mausorganen in jeder Gruppe. Die Abbildung zeigt den Nachweis menschlicher mitochondrialer DNA in Mausherzen und anderen Organen in jeder Gruppe 1 Monat nach der Zelltransplantations-PCR. Die PCR der humanen mitochondrialen DNA fand keine transplantierten Zellen (A, B) in den Herzen und anderen Organen von Mäusen in der Schein- (n = 3) und MI-Gruppe (n = 3). Die PCR der menschlichen mitochondrialen DNA fand transplantierte Zellen in den Herzen von Mäusen der SD- (n = 3) und MD-Gruppe (n = 3), jedoch nicht in anderen Organen, einschließlich Lunge, Leber, Niere, Gehirn und Milz (C, D). Die quantitative qPCR-Analyse der humanen mitochondrialen DNA zeigte, dass die humane mitochondriale DNA der MD-Gruppe etwa achtmal so hoch war wie die der SD-Gruppe (E). (+) zeigt die Positivkontrolle des iPSC-CM an. (−) zeigt die DEPC-Wassernegativkontrolle an. Abkürzungen: n.s. = nicht signifikant; MI = Myokardinfarkt; SD = Einzeldosis; MD = Mehrfachdosis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Zu den kritischen Schritten dieser Studie gehören die hiPSC-Kultur, die Differenzierung der Kardiomyozyten, die hiPSC-CM-Aufreinigung und die hiPSC-CM-Transplantation in die Myokardinfarktstelle der Maus. Der Schlüssel liegt darin, Herzultraschall zu verwenden, um die Behandlung transkutan zur Infarktstelle am Rand des Infarkts zu führen, wo hiPSC-CMs in den Bereich injiziert wurden.
Mit der Verlängerung der Kulturzeit ändert sich der hiPSC-CM-Phänotyp in der Morphologie (größere Zellgröße), Struktur (Muskel, Fibrillendichte, Anordnung, mikroskopische Zellcluster) und Physiologie (Calciumbehandlung und β-adrenerge Reaktion) mit Differenzierung im Laufe der Zeit. In dieser Studie wurde die Fluoreszenzmarkierung am 10. und 60. Tag der hiPSC-Differenzierung in Kardiomyozyten durchgeführt, um morphologische und strukturelle Veränderungen zu beobachten. Zellgröße und Sarkomerlänge waren bei hiPSC-CMs am 60. Tag signifikant erhöht als am 10. Tag. In der Studie wurden hiPSC-CMs verwendet, die nach 60-tägiger Differenzierung in Kardiomyozyten für die Transplantation relativ stabil waren. Darüber hinaus wurden während der 60-tägigen Kultivierung von hiPSC-CMs mehrere Ersatzbehandlungen von milchsäurehaltigem glukosefreiem Kulturmedium durchgeführt, um Kardiomyozyten zu reinigen und den Kardiomyozytengehalt zu erhöhen, um Nebenwirkungen zu vermeiden, die durch Nicht-Kardiomyozyten in den transplantierten Zellen verursacht wurden.
Eine Ultraschallsonde wurde zunächst während der ultraschallgesteuerten Zellinjektion auf den Oberbauch der Maus gelegt, um ihre Leber sichtbar zu machen. Die Mikroinjektornadel trat schräg unter dem Xiphoid-Prozess ein, vermied die Leber und trat unter Ultraschallkontrolle in das Perikard ein. In dieser Studie wurde das Perikard nicht vertikal von den inneren Knochen der Brustwand aus beurteilt, da dieser Weg zum Infarktbereich im Myokard signifikant kurz ist, was ein hohes Risiko für Herzpunktion und Zelltransplantationsversagen darstellt. Der schräge Zugang zum Perikard vom Xiphoidfortsatz zum Myokard stellt jedoch einen wesentlich längeren Weg mit einem geringeren Risiko für eine Herzpunktion dar. Während der ultraschallgesteuerten Zellinjektion wurden die Mäuse intubiert, um die Atemfrequenz während der Punktion zu regulieren. Die Regulierung der Atemfrequenz der Mäuse und die Verlängerung der Einatmungs- und Verfallszeiten begünstigen die Punktion während der Exspiration, wodurch auch eine Schädigung der Lunge vermieden wird. Während dieses Experiments starb keine Maus an Herzruptur und Lungenverletzung nach Zellinjektion.
Für die Stabilität der transplantierten Zellen berücksichtigte die Studie den Zeitpunkt der hiPSC-CM-Injektion und die Anzahl der Injektionen. Im Frühstadium des MI trat eine schwere Entzündung im Infarktbereichauf 23. Eine frühzeitige Unterdrückung der Entzündungsreaktion an der Infarktstelle kann den myokardialen Umbau verbessern und die tödlichen Möglichkeiten für das Versuchssubjekt einschränken24. Darüber hinaus ist eine schwere Entzündungsreaktion ein Grund für den transplantierten Zelltod. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Transplantation von ES-Zell-differenzierten Kardiomyozyten in die Infarktstelle die Entzündungsreaktion an der Myokardinfarktstelle hemmen kann25.
Nach der Etablierung des Maus-MI-Modells wurden hiPSC-CMs unter direkter Sicht in die Infarktstelle und die infarktierte Randzone injiziert; nur ein Zehntel der hiPSC-CMs überlebte. Die Studie deutet jedoch darauf hin, dass die anfänglich transplantierten hiPSC-CMs die Mikroumgebung an der Myokardinfarktstelle bei Mäusen verbessern und die Überlebensrate der retransplantierten Zellen verbessern können. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl der Zellen, die nach drei hiPSC-CM-Injektionen überlebten, 10-mal so hoch war wie die einer einzelnen hiPSC-CM-Injektion (Abbildung 3C). Ultraschall zeigte, dass die vordere Wanddicke des linken Ventrikels in der MD- und SD-Gruppe in der dritten und vierten Woche nach der Etablierung des MI-Modells viel dünner war als in der ersten und zweiten Woche. So wurden den Mäusen in der MD-Gruppe unmittelbar nach der Etablierung des MI-Modells und dann ein und zwei Wochen nach dem Infarkt Zellen injiziert, um den Tod aufgrund einer Herzruptur zu vermeiden.
Diese Studie zeigt, dass die Anzahl der transplantierten Zellen in der MD-Gruppe signifikant höher ist als in der SD-Gruppe. Die Echokardiographie der Maus zeigte, dass die EF- und SF-Werte der MD-Gruppe höher waren als die der SD-Gruppe. Die parakrine Funktion der transplantierten hiPSC-CMs sollte auch zusammen mit transplantierten Kardiomyozyten in Betracht gezogen werden, um die Herzfunktion zu verbessern. Eine Studie von Iwanaga et al.26 berichtete, dass die parakrinen Faktoren, die von hiPSC-CMs sezerniert werden, die Angiogenese fördern können, indem sie Akt1 aktivieren. Die Studie fand nur sehr wenige Isolektin-B4-positive Zellen im Randinfarktbereich in der MI-Gruppe. Im Gegensatz dazu gab es in der SD- und MD-Gruppe mehr Isolektin-B4-positive Zellen als in der MI-Gruppe; Bemerkenswert ist, dass die MD-Gruppe am meisten hatte. Diese Ergebnisse zeigen also, dass die neuen Blutgefäße an der Stelle umso stärker sind, je mehr hiPSC-CMs transplantiert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch den großen Forschungsplan der National Natural Science Foundation of China (Nr. 91539111to JY), das Schlüsselprojekt für Wissenschaft und Technologie der Provinz Hunan (Nr. 2020SK53420 bis JY) und das Wissenschafts- und Technologieinnovationsprogramm der Provinz Hunan (2021RC2106 bis CF) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Cardiac troponin T | Abcam | ab8295 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150105 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150110 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150062 | |
| Human cardiac troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Isolectin B4 | Vector | FL-1201 | |
| Sarcomeric alpha actinin | Abcam | ab9465 | |
| Wheat germ agglutinin | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| Reagent | |||
| Accutase | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | |
| B27 Supplement(minus insulin) | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement(serum free) | Thermo Fisher Scientific | 17–504-044 | |
| Bouin's solution | Thermo Fisher Scientific | SDHT10132 | |
| CHIR99021 | Selleck | CT99021 | |
| cyclosporin A | Medchemexpress | HY-B0579 | |
| DIRECT RED | Sigma-Aldrich | 365548-25G | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| FAST GREEN FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Selleck | S7086 | |
| lactic acid | Sigma-Aldrich | L6661 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356234 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PowerUP SYBR Green MasterMix kit | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| RPMI1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff | Stem Cell Technologies | 5030 | |
| STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium | Stem Cell Technologies | 5027 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| ultrasound coupling agent | CARENT | 22396269389 | |
| Y-27632 | Selleck | S6390 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Applied Biosystems | Thermo Fisher Scientific | 7500 Real-Time PCR | |
| cryostat | Leica | CM1950 | |
| fluoresence microscope | Olympus | IX83 | |
| fine anatomical scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| fine dissecting forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Micro syringe | Hamilton | 7633 | |
| Small animal anesthesia machine | MATRX | VMR | |
| Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Software | |||
| Statistical Product and Service Solutions | IBM | 21 | |
| Image J | NIH | 1.48 | |
| Human mitochondrial DNA primers | |||
| the forward primer sequence | CCGCTACCATAATCATCGCTAT | ||
| the reverse primer sequence | TGCTAATACAATGCCAGTCAGG |
References
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