Summary
Ce protocole décrit la préparation de tissu nerveux sciatique entier de rat pour la stimulation électrophysiologique ex vivo et l’enregistrement dans un bain salin perfusé à deux compartiments régulé par l’environnement.
Abstract
Les préparations ex vivo permettent d’étudier de nombreux processus neurophysiologiques isolément du reste du corps tout en préservant la structure tissulaire locale. Ce travail décrit la préparation des nerfs sciatiques de rat pour la neurophysiologie ex vivo, y compris la préparation du tampon, les procédures animales, la configuration de l’équipement et l’enregistrement neurophysiologique. Ce travail donne un aperçu des différents types d’expériences possibles avec cette méthode. La méthode décrite vise à fournir 6 h de stimulation et d’enregistrement sur le tissu nerveux périphérique extrait dans des conditions étroitement contrôlées pour une cohérence optimale des résultats. Les résultats obtenus à l’aide de cette méthode sont des potentiels d’action composés (CAP) de fibres A avec des amplitudes de crête à crête de l’ordre du millivolt sur toute la durée de l’expérience. Les amplitudes et les formes de CAP sont cohérentes et fiables, ce qui les rend utiles pour tester et comparer de nouvelles électrodes à des modèles existants, ou les effets d’interventions sur les tissus, tels que l’utilisation de produits chimiques, d’altérations chirurgicales ou de techniques de stimulation neuromodulatrice. Les électrodes de brassard conventionnelles disponibles dans le commerce avec des contacts platine-iridium et les électrodes en élastomère conducteur sur mesure ont été testées et ont donné des résultats similaires en termes de réponse force-durée du stimulus nerveux.
Introduction
La compréhension actuelle de la fonction nerveuse fondamentale telle que modélisée in silico manque à plusieurs égards, notamment en ce qui concerne les effets de la compartimentation du tissu nerveux en dehors du soma, de l’axone et des dendrites. Les interactions axon-myéline sont encore mal comprises, comme en témoigne le fait que même des modèles nerveux computationnels détaillés tels que MRG1 (pour les nerfs de mammifères) qui capturent correctement la réponse de stimulation électrique conventionnelle, ne capturent pas d’autres comportements observés expérimentalement tels que le transfert de bloc à haute fréquence2 ou la réponse d’apparition secondaire3.
Ce protocole fournit une méthode pour étudier efficacement les processus neurophysiologiques au niveau nerveux dans un modèle aigu de petit animal de laboratoire, en utilisant un protocole de préparation standardisé pour isoler le nerf, contrôler son environnement et le faire passer d’un contexte in vivo à un contexte ex vivo. Cela empêchera d’autres processus corporels ou anesthésiques utilisés par les protocoles de stimulation nerveuse in vivo de modifier le comportement nerveux et de confondre les résultats mesurés ou leur interprétation 4,5. Cela permet le développement de modèles plus réalistes se concentrant uniquement sur les effets spécifiques aux tissus nerveux mal compris. Ce protocole est également utile comme banc d’essai pour la nouvelle stimulation nerveuse et l’enregistrement des matériaux et des géométries des électrodes, ainsi que pour de nouveaux paradigmes de stimulation tels que le blochaute fréquence 2,3. Des variantes de cette technique ont déjà été utilisées pour étudier la physiologie nerveuse dans des conditions étroitement contrôlées6, par exemple, pour mesurer la dynamique et les propriétés des canaux ioniques ou les effets des anesthésiques locaux7.
Cette technique offre plusieurs avantages par rapport à des alternatives telles que l’expérimentation aiguë in vivo de petits animaux8. La technique évite d’avoir à maintenir la profondeur de l’anesthésie car le tissu a été extrait du corps, réduisant ainsi la quantité d’équipement requis tel qu’un diffuseur anesthésique, un concentrateur d’oxygène et un coussin chauffant. Cela simplifie le protocole expérimental, réduisant ainsi le risque d’erreurs. Comme les anesthésiques peuvent potentiellement altérer la fonction nerveuse4, cette technique garantit que les mesures ne seront pas confondues par les effets secondaires de ces composés anesthésiques. Enfin, cette technique est plus appropriée que les expériences in vivo aiguës lors de l’étude des effets de composés neurotoxiques tels que la tétrodotoxine, qui tueraient un animal anesthésié par paralysie.
Les sections nerveuses périphériques sont un système ex vivo unique car il y a de fortes chances que les fibres responsables des signaux neuronaux enregistrés ne contiennent pas de soma. Comme ceux-ci seraient normalement situés, pour les motoneurones, dans la colonne vertébrale, et pour les neurones sensoriels dans les ganglions de la racine dorsale à côté de la colonne vertébrale, la préparation d’une section du nerf mammifère peut être grossièrement modélisée comme une collection de membranes tubulaires avec des canaux ioniques, ouverts aux deux extrémités9. Le métabolisme est maintenu par les mitochondries situées dans l’axone au moment de la dissection tissulaire10. La suture des extrémités ouvertes de l’axolemme est encouragée après l’extraction pour les fermer et aider ainsi à maintenir les gradients ioniques existants à travers la membrane, qui sont essentiels pour le fonctionnement normal des nerfs.
Pour maintenir l’homéostasie tissulaire à l’extérieur du corps, plusieurs variables environnementales doivent être étroitement contrôlées. Il s’agit de la température11, de l’oxygénation12, de l’osmolarité, du pH13,14 et de l’accès au glucose pour maintenir le métabolisme. Pour ce protocole, l’approche consiste à utiliser un tampon Krebs-Henseleitmodifié 15,16 (mKHB) aéré en continu avec un mélange d’oxygène et de dioxyde de carbone. Le mKHB fait partie de la famille des tampons cardioplégiques 6,17 utilisés pour préserver les tissus disséqués à l’extérieur du corps, par exemple dans des expériences ex vivo. Ces tampons ne contiennent pas d’hémoglobine, d’antibiotiques ou d’antifongiques et ne conviennent donc qu’aux préparations impliquant de petites quantités de tissu pendant un temps limité. Le contrôle du pH a été réalisé avec la paire redox carbonate et dioxyde de carbone, nécessitant une aération constante du tampon avec du dioxyde de carbone pour maintenir l’équilibre du pH. Il s’agit d’éviter d’utiliser d’autres agents tampons courants tels que HEPES, qui peuvent modifier la fonction des cellules nerveuses18. Pour oxygéner le tampon et contrôler le pH, un mélange de 5% de dioxyde de carbone dans l’oxygène appelé carbogène (95% O2, 5% CO2) a été utilisé. Un agitateur chauffant a été utilisé pour le contrôle de la température d’un récipient tampon, et le tampon a été perfusé à travers un bain nerveux, puis recirculé dans le récipient de départ. Une expérience typique durerait de 6 à 8 heures avant que le nerf ne perde sa viabilité et ne réponde plus suffisamment à la stimulation pour que les mesures soient représentatives des tissus sains.
Pour optimiser le rapport signal/bruit, des électrodes de chlorure d’argent ont été utilisées pour l’enregistrement, qui ont été préparées selon les méthodes décrites précédemment19. Pour la stimulation, une combinaison d’électrodes de brassard en platine prêtes à l’emploi et d’électrodes de brassard en polymère conducteur sur mesure peut être utilisée. Les électrodes conductrices à manchette en polymère ont des capacités de charge nettement plus élevées, ce qui est utile pour stimuler le nerf à l’aide de formes d’onde de haute amplitude20.
Le stimulateur utilisé dans ce protocole a déjà été décrit20. La documentation, les fichiers de conception et les scripts logiciels pour l’utiliser sont accessibles au public21. D’autres stimulateurs peuvent être utilisés pour exécuter ce protocole; cependant, le stimulateur personnalisé est également capable de bloc de courant alternatif à haute fréquence (HFAC) 2,20, ce qui permet un plus large éventail d’expériences de neurophysiologie. Pour utiliser le bloc HFAC, des poignets en élastomère conducteurs sont recommandés pour éviter d’endommager le nerf. Les poignets nerveux en élastomère conducteur sont des réseaux d’électrodes souples et entièrement polymères produits à partir d’élastomères conducteurs comme composant conducteur et de polydiméthylsiloxane comme isolant22. Les dispositifs ont été fabriqués dans une configuration bipolaire en utilisant des techniques conventionnelles de microfabrication laser.
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Protocol
Tous les soins et procédures pour animaux ont été effectués sous des licences appropriées délivrées par le ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni en vertu de la loi sur les animaux (procédures scientifiques) (1986) et ont été approuvés par le Conseil d’examen du bien-être animal et de l’éthique de l’Imperial College de Londres.
1. Préparation des tampons
REMARQUE: Cette partie du protocole peut être effectuée bien avant le reste du protocole, à l’exception des dernières étapes impliquant la préparation d’un tampon Krebs-Henseleit modifié (mKHB) à une concentration de 1x.
- Préparer 1 M de solution mère caCl2
- Ajouter 14,701 g de CaCl2 dihydraté dans un bécher propre de 100 ml. Ajouter ~75 mL d’eau désionisée et remuer jusqu’à dissolution complète du sel.
- Transférer la solution dans une fiole jaugée de 100 mL et ajouter de l’eau désionisée jusqu’à ce que le volume de 100 mL ait été atteint. Transférer la solution dans une bouteille et la conserver au réfrigérateur à 4 °C.
- Préparer 10x stock concentré de mKHB
- Ajouter 66,03 g de chlorure de sodium (NaCl), 3,57 g de chlorure de potassium (KCl), 1,63 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) et 1,44 g de sulfate de magnésium dans un bécher de 2 L.
- Ajouter environ 750 mL d’eau désionisée dans le bécher et remuer jusqu’à ce que les sels se soient dissous (il peut rester de petits cristaux de sel au fond). Ajouter 25 mL de 1 M de solution mère de CaCl2 (étape 1.1) et remuer; assurez-vous qu’il s’agit du dernier sel ajouté.
- Transférer la solution dans une fiole jaugée de 1 L et ajouter de l’eau désionisée pour atteindre un volume total de 1 L. Transférer la solution dans une bouteille de 1 L. Conserver concentré 10x mKHB à 4 °C au réfrigérateur.
REMARQUE: Le stock concentré de mKHB peut être stocké pendant environ 1 mois avant le remplacement.
- Préparer la boîte de Petri de dissection (revêtement)
- Préparez une boîte de Petri en verre propre (120 mm de diamètre) pour le revêtement en lavant et en séchant soigneusement le plat.
- En suivant les instructions du fabricant pour l’utilisation et le durcissement du revêtement alcoxy conforme, recouvrir le fond de la boîte de Petri d’environ 3 à 5 mm de revêtement en versant soigneusement le mélange de revêtement conforme dans le plat jusqu’à ce que l’épaisseur souhaitée ait été atteinte.
- Durcissez le revêtement dans un four à 60 °C jusqu’à ce qu’il soit ferme au toucher. La boîte de Petri de dissection est maintenant prête.
REMARQUE: Un nettoyage en douceur du plat après chaque utilisation garantira que le revêtement dure des années avant que le remplacement ne soit nécessaire. Lors du remplacement du revêtement, assurez-vous d’enlever tout le matériau de revêtement avant d’appliquer un nouveau revêtement. Notez que le revêtement alcoxy conforme (Table des matériaux) utilisé dans ce protocole a une durée de conservation inférieure à un an.
2. Préparations de pré-dissection
REMARQUE : cette étape démarre l’expérience. Les étapes ci-dessous doivent être effectuées le même jour, dans cet ordre.
- Préparer 1x mKHB
- Préparez un bécher propre de 2 L pour le tampon. Transférer 200 mL de stock 10x mKHB dans le bécher de 2 L. Ajouter 2,1 g de carbonate de sodium (NaHCO3) et 0,99 g de dextrose anhydre (D-glucose) dans le bécher de 2 L.
- Ajouter environ 1 L d’eau désionisée au bécher. Remuer jusqu’à ce que les sels aient été complètement dissous. Transférer la solution dans une fiole jaugée de 2 L et ajouter de l’eau désionisée pour atteindre un volume total de 2 L.
- Transférer la solution dans une bouteille en verre de 2 L placée sur un agitateur chauffant dont la température est réglée à 37 °C.
REMARQUE: Un agitateur chauffant plus petit sera souvent incapable d’atteindre la température cible de 37 ° C en raison de l’inertie thermique de grands récipients remplis d’eau. Réglez la température vers le haut pour que le contenu de la bouteille atteigne 37 °C en remuant. Surveillez la température pendant l’expérience et abaissez la température réglée en cas de dépassement. - Placez un thermomètre dans la bouteille de 2 L pour surveiller la température, en utilisant des pinces pour éviter que le thermomètre ne soit impacté par la puce remuante. Aérer le tampon avec du carbogène pendant au moins 30 min pour oxygéner la solution. Cela devrait régler le pH à 7,4. Mesurez le pH avec un pH-mètre pour vous assurer qu’il se situe dans les unités de pH de 0,1 de 7,4 (à 37 °C).
REMARQUE: Pour ajuster le pH à 7,4, utilisez de l’acide chlorhydrique ou de l’hydroxyde de sodium au besoin. - Remplissez deux tubes centrifuges de 15 mL et une bouteille de 100 mL avec du mKHB et placez-les sur de la glace pour refroidir.
REMARQUE: Les tubes de centrifugeuse et la bouteille peuvent être nettoyés et réutilisés après chaque expérience sans autoclavage. - Pour les parties ultérieures de l’expérience, continuer à aérer le tampon dans la bouteille de 2 L avec du carbogène à 37 °C sous agitation continue.
REMARQUE: L’utilisation non supervisée de carbogène peut être dangereuse si aucun système automatique n’est en place pour couper le flux de gaz en cas de fuite. Un capteur automatisé et une vanne d’arrêt électronique peuvent atténuer ce problème; sinon, une personne doit être laissée pour superviser l’équipement si la dissection a lieu dans une pièce différente. Dans tous les cas, un capteur d’oxygène doit être utilisé près de la configuration pour avertir les opérateurs lorsque la concentration ambiante d’oxygène dépasse 25%. Utilisez une pièce avec une ventilation active si possible.
- Allumez le dispositif d’acquisition de signal, le préamplificateur à faible bruit, le filtre de bruit de ligne et l’oscilloscope pour l’enregistrement et la stimulation, afin de laisser suffisamment de temps pour la stabilisation de la température.
- S’assurer que tout l’équipement de contrôle électrique est correctement configuré
- Réglez le préamplificateur à faible bruit sur une entrée couplée à courant alternatif avec le filtre passe-bande d’entrée réglé sur 6 dB roll-off par décennie et les fréquences de coupure réglées sur 30 Hz et 3 kHz pour les filtres passe-haut et passe-bas, respectivement.
- Réglez le gain du préamplificateur à faible bruit sur 100.
3. Anesthésie animale et euthanasie
NOTE : Des rats femelles entre 250 et 330 g (Tableau des matériaux) ont été utilisés pour les études.
- Préparer les outils chirurgicaux et les consommables: ciseaux droits de 12 cm (émoussés); Ciseaux à ressort inclinés de 2 mm; Ciseaux fins de 4 cm, tranchants ou semi-tranchants; #7 Pinces Dumont; Pinces fines inclinées à 45 ° et soie ou fil de suture 6-0.
- Placez le rat dans un récipient ou une chambre d’anesthésie. Connectez l’oxygène et le diffuseur anesthésique au récipient. Réglez la concentration d’anesthésique (isoflurane) à 3,5% et attendez environ 10 minutes ou jusqu’à ce que l’animal présente des signes d’anesthésie tels qu’une perte du réflexe de redressement.
- Une fois que le rat présente des signes d’anesthésie, confirmez la perte de conscience avec un test réflexe de sevrage par pincement des orteils. Ne procédez que lorsqu’il n’y a pas de retrait des orteils; sinon, vérifiez toutes les connexions et tous les niveaux d’anesthésie dans le diffuseur et répétez l’étape 3.2.
- Sortez l’animal du récipient et procédez à la luxation cervicale, suivie d’une incision d’une artère fémorale pour confirmer la mort.
4. Protocole de dissection
REMARQUE: Placez l’animal avec son ventre vers le bas sur la table de dissection. Répétez les étapes suivantes pour les deux jambes. En règle générale, la jambe droite est disséquée en premier.
- En tenant fermement la cheville entre le pouce, l’index et le majeur, coupez le tendon calcanéen à l’aide de ciseaux contondants droits de 12 cm.
- Avec de fins ciseaux tranchants, faites une incision cutanée du tendon calcanéen le long de l’arrière de la jambe jusqu’à la base de la colonne vertébrale, en prenant soin de ne pas disséquer le tissu musculaire en dessous.
- À l’aide de pinces fines et de ciseaux fins, faites des incisions minutieuses à travers les couches musculaires près du milieu de l’arrière de la jambe jusqu’à ce que le nerf sciatique soit exposé. Dès que le nerf sciatique est visible, hydratez la cavité à l’aide de mKHB glacé pour empêcher le nerf de se dessécher.
- À l’aide d’hémostats, écartez les lambeaux de peau de chaque côté et maintenez l’incision ouverte pour un travail de dissection plus fin. En partant de l’emplacement de l’incision du tendon calcanéen, avec de fins ciseaux, interrompez le muscle du côté médian de la jambe pour libérer le nerf. Continuez à maintenir les niveaux d’humidité dans la région avec du mKHB glacé.
- Lorsque le nerf est exposé tout en remontant la jambe, disséquez le tissu musculaire sus-jacent. Libérez le nerf plus près de la colonne vertébrale des tissus conjonctifs jusqu’à atteindre la fente vertébrale, où il y a un pli dans le nerf. N’essayez pas encore de nettoyer le nerf car la vitesse est essentielle à ce stade.
- Coupez le nerf aussi près que possible de la colonne vertébrale avec de fins ciseaux. Pour faciliter la dissection, tirez très doucement l’extrémité du nerf près de la cheville à l’aide d’une pince. Ne pincez jamais le nerf au milieu, mais seulement les extrémités. Ne tirez jamais un nerf tendu.
FACULTATIF: À ce stade, si le temps le permet, la suture des deux extrémités du nerf peut être effectuée pour aider à maintenir la viabilité. Gardez la manipulation au minimum pour éviter les dommages. S’il n’y a pas suffisamment de temps (voir l’étape 4.5), ignorez cette étape et suivez l’étape 5.2 plus tard. - Placez le nerf disséqué dans le tube de centrifugeuse de 15 mL rempli de mKHB (étape 2.1.5), fermez le tube et replacez le tube sur la glace jusqu’au début de la procédure de nettoyage.
- Répétez les étapes 4.1 à 4.7 pour l’autre jambe. Idéalement, chaque nerf devrait prendre 5-10 min à extraire, afin de maximiser la viabilité des tissus.
5. Procédure de nettoyage des nerfs
- Remplissez la boîte de Petri enduite à peu près à mi-chemin avec du mKHB oxygéné réfrigéré. Placez l’un des nerfs sciatiques disséqués dans le plat et épinglez les deux extrémités du nerf au plat de sorte que le nerf soit droit sans plis, torsion ou torsions. Épinglez le nerf aussi près que possible des extrémités.
- À l’aide de sutures de soie 6-0 ou d’un fil fin, nouez un double nœud autour de chaque extrémité du nerf pour éviter les fuites de cytosol dans le tampon. Placez les nœuds juste à côté des épingles à insectes sur le côté plus près du centre du nerf, car cela empêchera les fuites du tissu nerveux dans le tampon. N’effectuez pas cette étape si le nerf a déjà été ligaturé.
- En utilisant le microscope pour la précision et les ciseaux à ressort inclinés de 2 mm, retirez la graisse, les vaisseaux sanguins et le tissu musculaire du nerf. Taillez toutes les branches nerveuses qui ne seront pas utilisées dans le protocole de stimulation et d’enregistrement.
- Toutes les 5 minutes de nettoyage, remplacez le tampon par du mKHB frais oxygéné réfrigéré. Utilisez des pinces fines pour tirer sur les tissus conjonctifs, la graisse et les vaisseaux sanguins afin de faciliter la dissection.
- Replacez les nerfs dans les tubes de transport remplis de mKHB frais oxygéné et réfrigéré et placez les tubes sur de la glace.
6. Configuration de l’équipement
REMARQUE : La configuration de l’équipement utilisé pour effectuer des expériences est illustrée à la figure 1. En bref, il se compose d’un bain nerveux à double compartiment, d’une bouteille de 2 L placée sur un agitateur chauffant, d’une source de carbogène pour l’aération tampon et d’un tube pour permettre au tampon de s’écouler de la bouteille au bain et de revenir à la bouteille à l’aide d’une pompe péristaltique. Le bain peut être usiné en plexiglas ou imprimé en 3D à partir de matériaux étanches. Il a une profondeur d’environ 2 cm et la cloison séparant les deux chambres du bain comporte un trou de 1,5 mm de diamètre pour permettre le filetage d’un nerf périphérique à travers les deux chambres. Une chambre est grande, doit mesurer au moins 4 ou 5 cm de long et sera remplie de tampon. L’autre chambre doit mesurer au moins 3 cm de long et sera remplie de silicone ou d’huile minérale. Le bain ne doit pas être trop grand car cela dégraderait le contrôle de la perfusion, de la température et du pH. Différentes tailles de bain peuvent être nécessaires en fonction de la taille du tissu nerveux étudié.
- Préparez un bain nerveux propre à double chambre (voir Le dossier supplémentaire pour les spécifications de conception). Placez le bain nerveux sous le niveau de la bouteille de 2 L placée sur l’agitateur chauffant, à l’aide de têtes et de pinces de laboratoire standard. Connectez le drain du bain à l’entrée de la pompe péristaltique.
- Connectez la sortie de la pompe péristaltique à un tube renvoyant au flacon tampon de 2 L. Connectez l’entrée de bain à un tube avec une soupape de débit réglable et placez le tube à l’intérieur de la bouteille de 2 L. Utilisez une valve à trois voies avec une seringue connectée à la sortie centrale pour aider à amorcer le tube en tant que siphon pour l’entrée de tampon assistée par gravité.
- Amorcer le siphon en tirant la seringue jusqu’à ce que le tampon s’y écoule. Configurez la vanne de telle sorte que le débit du tampon dans le bain soit d’environ 5-6 mL·min-1. Le débit peut être augmenté initialement pour remplir le bain. Une fois que le niveau de tampon du bain a atteint le drain, placez les nerfs dans le bain.
- À l’aide d’une épingle à insectes, fixez l’extrémité du nerf au coin de la chambre de bain remplie de tampons. À l’aide de pinces fines inclinées à 45 ° et en pinçant le nerf uniquement aux extrémités, enfilez soigneusement le nerf à stimuler à travers le trou dans la cloison entre les deux chambres de bain.
- Fixez l’autre extrémité du nerf dans la chambre à huile du bain avec une épingle à insectes, en veillant à ce que le nerf soit droit sans être étiré et exempt de plis et de torsions. À l’aide de graisse de silicone, faites un joint pour empêcher les fuites de tampon de la chambre tampon dans la chambre à huile. Remplissez la chambre à huile avec du silicone ou de l’huile minérale.
- Placez les crochets d’électrode d’enregistrement Ag/AgCl dans la chambre de bain d’huile et fixez-les à l’aide de têtes de bossage et de pinces. Drapez la partie du nerf dans le bain d’huile sur les crochets sans tirer le nerf tendu. Ne pincez pas le nerf; utilisez une pince inclinée pour soulever le nerf sans pincer.
- Ajustez ou réparez le joint de graisse en silicone si une fuite est observée après avoir déplacé le nerf.
- Connectez l’électrode Ag/AgCl de référence à la masse de l’amplificateur et placez l’électrode dans la chambre de bain remplie de tampons en la sécurisant à l’aide d’une pince de laboratoire.
7. Implantation d’électrodes sur le nerf dans le bain
- Préparez une électrode de brassard nerveux propre pour la stimulation conformément à la référence21. Placez l’électrode dans la chambre de bain remplie de tampons. À l’aide d’une pince ou d’une pince à épiler fine avec des pointes émoussées ou inclinées, ouvrez l’électrode dans le bain pour mouiller l’intérieur du brassard.
- S’il reste des bulles, utilisez une seringue fine pour extraire le tampon du bain et forcez les bulles à sortir du brassard. Avec une pince sous le nerf, ouvrez doucement le brassard et faites-le glisser sous le nerf. Fermez le brassard autour du nerf, en prenant soin d’éviter tout pli ou torsion du nerf.
- Connectez l’électrode de stimulation au stimulateur et fixez le fil de l’électrode de stimulation avec du ruban adhésif. Connectez l’électrode de retour de courant au stimulateur et fixez le fil avec du ruban adhésif. Si vous utilisez une feuille de platine carrée comme électrode de retour de courant, placez la feuille loin du nerf dans le bain.
8. Stimulation et enregistrement
- Connectez la sortie du signal TTL du stimulateur au canal 4 de l’oscilloscope, qui sera utilisé pour déclencher l’oscilloscope. Sur l’écran de l’oscilloscope, appuyez sur l’onglet Canal de déclenchement et spécifiez le canal 4 comme canal de déclenchement. Réglez le niveau de déclenchement sur 1 V à l’aide du bouton Niveau .
- Sur l’oscilloscope, réglez la résolution temporelle sur 1 ms/division et la résolution de tension sur 10 mV/division. Centrez la référence du déclencheur dans le temps et réglez le niveau du déclencheur sur 1 V.
REMARQUE : Suivez les étapes 8.3 à 8.6 si vous utilisez le stimulateur personnalisé (voir tableau des matériaux). On suppose que le logiciel MATLAB et les pilotes de périphériques ont été installés sur l’ordinateur de laboratoire en utilisant les instructions fournies gratuitement en ligne pour le stimulateur neuronal personnalisé21. Sinon, suivez les instructions du fabricant pour l’utilisation d’un stimulateur disponible dans le commerce comme alternative. - Connectez le stimulateur à l’ordinateur du laboratoire. Allumez le stimulateur en connectant l’alimentation de la batterie à l’entrée d’alimentation. Démarrez le logiciel MATLAB sur l’ordinateur du laboratoire.
- Exécutez le script MATLAB personnalisé : HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Table of Materials).
REMARQUE: Le câble de communication USB entre l’ordinateur et le stimulateur doit clignoter en vert. Si ce n’est pas le cas, il y a une erreur de configuration et l’alimentation et les connexions doivent être vérifiées. - Ouvrez le script MATLAB : HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Table of Materials). En éditant directement le script MATLAB, définissez les paramètres comme suit : amplitude de l’impulsion du stimulateur = -300 μA, largeur de l’impulsion du stimulateur = 300 μs, nombre d’impulsions du stimulateur = 10 et temps du stimulateur entre les impulsions = 1 s.
- Démarrez le protocole de stimulation en cliquant sur Exécuter dans le logiciel MATLAB.
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Representative Results
Les résultats représentatifs qui peuvent être obtenus avec ce protocole sont les potentiels d’action composé cohérents des fibres nerveuses de type A dans le nerf sciatique. Ces potentiels d’action ont généralement une amplitude de crête à crête d’environ 1 mV à l’électrode et donc de 100 mV une fois amplifié (Figure 2). Des amplitudes de stimulation et des largeurs d’impulsion similaires devraient donner des amplitudes CAP similaires. Les électrodes de brassard en élastomère conductrice nécessitent généralement des amplitudes de stimulation légèrement plus élevées afin d’obtenir la même amplitude CAP par rapport aux électrodes de brassard en platine disponibles dans le commerce. Cette différence est généralement faible par rapport à la variation de l’amplitude de stimulation nécessaire pour stimuler les nerfs provenant de différents animaux. En effet, de petites différences dans la taille des nerfs et l’ajustement du brassard ont un effet important sur l’amplitude de stimulation requise pour obtenir une amplitude CAP spécifique, quel que soit le matériau du brassard. Cela peut être utilisé pour tester les effets de différentes compositions tampons, telles que différentes concentrations d’ions ou l’ajout de substances excitatrices ou inhibitrices nerveuses telles que la tétrodotoxine. Si le tuyau de déchets tampon est acheminé vers un récipient supplémentaire, l’ajout de substances altérant l’excitabilité nerveuse peut être rendu temporaire pour l’expérience, les taux de lavage dépendant du taux d’entrée du tampon.
La densité de courant minimale, calculée comme l’amplitude de stimulation divisée par la surface des électrodes de stimulation, nécessaire pour activer les fibres de type A et obtenir un potentiel d’action composé observable de l’oscilloscope a été tracée par rapport à la largeur d’impulsion de la figure 3. Les résultats présentés à la figure 3 représentent l’excitabilité nerveuse typique des poignets nerveux en platine standard disponibles dans le commerce et des poignets nerveux en élastomère conducteurs sur mesure.
Les nerfs extraits doivent rester viables pendant environ 6 heures après l’extraction et, par conséquent, les expériences doivent s’inscrire dans cette fenêtre de temps. La perte de viabilité nerveuse entraîne une baisse progressive de l’amplitude du CAP et de la vitesse de conduction. Après que l’amplitude potentielle de l’action diminue en dessous de 50% de l’amplitude initiale (au début de l’enregistrement), le nerf doit être considéré comme n’étant plus viable car les résultats seront considérablement faussés. Les résultats représentatifs en ce qui concerne la longévité nerveuse sont présentés à la figure 4. Les nerfs sciatiques droit et gauche ont été extraits d’un animal entre 10h00 et 11h00 un jour donné. Les PAC initiaux ont été obtenus à partir du nerf sciatique droit lors des tests initiaux avant les expériences, et les CAP standard ont été obtenus à partir des nerfs sciatiques gauche et droit, qui avaient été maintenus en vie à l’aide de ce protocole, à la fin des expériences. Une réduction minimale de l’amplitude de la CAP a été observée avec le nerf sciatique droit, tandis que l’amplitude de la CAP du nerf sciatique gauche à environ 3 mV était similaire à celle du nerf sciatique droit au début de l’expérience plus de 6 heures après l’extraction nerveuse.
Figure 1 : Représentation schématique de la configuration expérimentale utilisée dans le protocole. Ce chiffre a été modifié à partir de Rapeaux, A. et al. (2020)20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : CAP représentatifs obtenus ex vivo après stimulation par des réseaux de brassards nerveux en élastomère métallique et conducteur. Reproduit avec des modifications de Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Seuil d’activation de la fibre A des réseaux de brassards en élastomère métallique et conducteur. Les barres d’erreur représentent ±1 écart-type par rapport à la moyenne. Reproduit avec des modifications de Cuttaz, E. A. et al. (2021)22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Cap par cas représentatifs obtenus ex vivo au cours d’une journée d’expériences et en utilisant les deux nerfs sciatiques d’un animal. (A) CAP de fibre de type A obtenu vers midi à partir du nerf sciatique droit. (B) Cap de fibre de type A obtenue en milieu d’après-midi à partir du nerf sciatique gauche. (C) CAP de fibre de type A obtenu à la fin d’expériences avec le même nerf sciatique gauche dans (B). L’axe des x correspond à l’heure de la journée à laquelle les enregistrements ont été effectués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Dossier supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Dans ce travail, nous avons décrit un protocole pour préparer les nerfs sciatiques de rat à la neurophysiologie ex vivo. L’extraction tissulaire prend environ 30 minutes, y compris la manipulation des animaux, l’anesthésie, l’abattage et la dissection, tandis que le nettoyage des nerfs, la mise en bain et l’implantation d’électrodes devraient nécessiter 30 minutes supplémentaires avant que l’enregistrement puisse commencer. La préparation du tampon peut être effectuée en 30 minutes, bien que cela puisse être fait avant le reste de l’expérience. Ce type de préparation et d’expérience a été utilisé et décrit au cours des dernièresannées 7,12, en utilisant des tampons similaires et pour le même type de tissu. À la connaissance des auteurs, cependant, c’est la première fois qu’une description de la préparation du tampon, de la dissection, de l’équipement mis en place et de l’enregistrement ultérieur est donnée dans le même document.
Ce protocole peut permettre une grande variété d’expériences en neurophysiologie qui ne seraient pas possibles dans des contextes in vitro ou in vivo . Par exemple, un avantage des préparations ex vivo est qu’elles préservent la macro et la micro-structure du tissu extrait tout en isolant ce tissu du reste du corps. Il en résulte une configuration plus simple car l’anesthésie n’a pas besoin d’être maintenue, ce qui est par ailleurs une exigence dans les expériences in vivo . En termes d’expériences habilitantes, les préparations ex vivo permettent l’utilisation de substances telles que la tétrodotoxine, qui sont difficiles à justifier dans un contexte in vivo 23 car elles présentent un risque élevé pour l’animal. Lorsque l’utilisation de telles substances est bénéfique pour l’investigation, elles sont plus faciles à utiliser dans les préparations ex vivo . L’utilisation du stimulateur personnalisé20 permet des expériences utilisant le bloc HFAC pour la neuromodulation en utilisant cette configuration expérimentale.
L’étape la plus critique du protocole est l’étape de dissection, car même une petite erreur en utilisant les ciseaux de dissection peut endommager le nerf si suffisamment de soin n’est pas pris. La vitesse à ce stade est également essentielle car le tissu doit être rapidement extrait du corps et placé dans un tampon réfrigéré pour maximiser la viabilité au début de l’enregistrement. Après l’extraction des tissus, bien qu’il faille faire preuve de prudence lors du nettoyage du nerf et de l’implantation d’électrodes, le protocole est plus flexible en ce qui concerne le temps et le risque d’erreur de l’opérateur est donc plus faible. Comme les diamètres nerveux et le placement des fascicules dans les nerfs varient d’un animal à l’autre, il faut s’attendre à une certaine variabilité des résultats, même en utilisant les mêmes électrodes et le même protocole de stimulation. L’effet de cette variabilité peut être vu dans les barres d’erreur pour les seuils de stimulation de la figure 3. Il est important de ne pas pincer le nerf à n’importe quel stade de la préparation, car cela peut causer des dommages irréversibles aux tissus. Manipulez le nerf uniquement par ses extrémités à l’aide d’une pince et avec le plus grand soin de ne pas tirer le nerf tendu.
Plusieurs aspects du protocole dans sa forme actuelle peuvent être améliorés en augmentant la quantité d’équipement et le temps de configuration. Pour aider au diagnostic des problèmes potentiels avec cette configuration expérimentale, des mesures automatisées du pH et de l’oxygène dissous dans le bain pourraient être utiles, mais n’ont pas été mises en œuvre ici. Les deux mesures peuvent être réalisées à l’aide de méthodes ampérométriques ou potentiométriques12,19. L’équipement qui nécessitera un entretien régulier est le tube et la verrerie, qui accumulent des dépôts de sel au fil du temps. Les crochets d’enregistrement AgCl nécessiteront également un re-revêtement ou un remplacement régulier, ainsi que la référence AgCl. Les électrodes de stimulation doivent être nettoyées après chaque utilisation, mais ne nécessiteront généralement pas de remplacement pour de nombreuses expériences.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
DÉCLARATION SUR LE LIBRE ACCÈS :
Aux fins du libre accès, l’auteur a appliqué une licence Creative Common Attribution (CC BY) (lorsque l’UKRI l’autorise, la « Licence Open Government » ou la licence Creative Commons Attribution Sans dérivés (CC BY-ND) peut être indiquée à la place) à toute version manuscrite acceptée par l’auteur.
PARTAGE DES DONNÉES :
Les données brutes utilisées dans les chiffres de cet article seront mises à disposition par les auteurs, sans réserve indue.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Gerald Hunsberger de GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, King of Prussia, PA, États-Unis, et Galvani Bioelectronics (Stevenage, Royaume-Uni) pour avoir partagé leur technique originale de préparation nerveuse avec nous. Les auteurs remercient Robert Toth pour la conception du bain nerveux à double chambre. Les auteurs reconnaissent le financement de la subvention Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) du Conseil de recherches en génie et en sciences physiques (EPSRC). Les auteurs remercient le High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) de l’Imperial College London pour le financement d’Adrien Rapeaux (EP/L016796/1). Adrien Rapeaux est actuellement financé par le UK Dementia Research Institute, Care Research and Technology Centre. Les auteurs remercient Zack Bailey de l’Imperial College, du Département de bioingénierie, pour son aide dans les expériences et l’accès aux tissus animaux pendant la production de l’article vidéo JoVE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1595 | Borosilicate glass |
| 1 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | 612-3626 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass bottle | VWR International Ltd | 215-1596 | Borosilicate glass |
| 2 L Glass graduated flask | VWR International Ltd | BRND937254 | Borosilicate glass |
| Adaptor, pneumatic, 8 mm to 1/4 NPT | RS UK | 536-2599 | push-to-fit straight adaptor between oxygen hose and gas dispersion tube |
| Alkoxy conformal coating | Farnell | 1971829 | ACC15 Alkoxy conformal coating for dissection petri dish preparation |
| Anesthetic | Chanelle | N/A | Isoflurane inhalation anesthetic, 250 mL bottle |
| Beaker, 2 L | VWR International Ltd | 213-0469 | Borosilicate glass |
| Bipolar nerve cuff | Cortec GMBH | N/A | 800 micron inner diameter, perpendicular lead out, no connector termination |
| Bossheads | N/A | N/A | Standard wet laboratory bossheads for attaching grippers to rods |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902-500g | 500 g in plastic bottle |
| Carbogen canister | BOC | N/A | F-size canister |
| Centrifuge Tubes, 15 mL volume | VWR International Ltd | 734-0451 | Falcon tubes |
| Conductive elastomer nerve cuff | N/A | N/A | high charge capacity nerve cuff for stimulation, see protocol for fabrication reference |
| Connector, Termimate | Mouser UK | 538-505073-1100-LP | These should be soldered to wire terminated with crocodile clips (see entry 11) |
| Crocodile clip connectors | RS UK | 212-1203 | These should be soldered to wire terminated with TermiMate connectors (see entry 10) |
| Deionized Water | N/A | N/A | Obtained from deionized water dispenser |
| Forceps angled 45 degrees | InterFocus Ltd | 91110-10 | Fine forceps, student range |
| Forceps standard Dumont #7 | InterFocus Ltd | 91197-00 | Student range forceps |
| Gas Disperson Tube, Porosity 3 | Merck | 12547866 | N/A |
| Glucose anhydrous, powder | VWR International Ltd | 101174Y | 500 g in plastic bottle |
| Grippers | N/A | N/A | Standard wet laboratory rod-mounted grippers |
| Heating Stirrer | RS UK | 768-9672 | Stuart US152 |
| Hemostats | N/A | N/A | Any hemostat >12 cm in length is suitable |
| Insect Pins, stainless steel, size 2 | InterFocus Ltd | 26001-45 | N/A |
| Laptop computer | N/A | N/A | Any laboratory-safe portable computer with at least 2 unused USB ports is suitable |
| Line Noise Filter | Digitimer | N/A | Humbug noise eliminator (50 Hz line noise filter) |
| Low-Noise Preamplifier, SR560 | Stanford Research Systems | SR560 | Low-noise voltage preamplifier |
| Magnesium Sulphate salt | VWR International Ltd | 291184P | 500g in plastic bottle |
| MATLAB scripts | Github | https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch | Initialization, calibration and stimulation scripts for the custom stimulator |
| MATLAB software | Mathworks | N/A | Standard package |
| Microscope Light, PL-2000 | Photonic | N/A | Light source with swan necks. Product may be obtained from third party supplier |
| Microscope, SMZ 745 | Nikon | SM745 | Stereoscopic Microscope |
| Mineral oil, non-toxic | VWR International Ltd | 31911.A1 | Oil for nerve bath |
| Nerve Bath | N/A | N/A | Plexiglas machined nerve bath, see protocol for details. |
| Oscilloscope | LeCroy | N/A | 434 Wavesurfer. Product may be obtained from 3rd party suppliers |
| Oxygen Hose, 1 meter | BOC | N/A | 1/4" NPT terminations |
| Oxygen Regulator | BOC | C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar | N/A |
| Peristaltic Pump P-1 | Pharmacia Biotech | N/A | Product may be obtained from third party supplier |
| Petri Dish, Glass | VWR International Ltd | 391-0580 | N/A |
| Potassium Chloride salt | Sigma Aldrich | P5405-250g | 250 g in plastic bottle |
| Potassium Dihydrogen Sulphate salt | Merck | 1.04873.0250 | 250 g in plastic bottle |
| Rat | Charles River Laboratories | N/A | Sprague Dawley, 250-330 grams, female |
| Reference electrode, ET072 | eDaQ (Australia) | ET072-1 | Silver silver-chloride reference electrode |
| Rod | N/A | N/A | Standard wet laboratory rods with fittings for stands |
| Scale | Sartorius | N/A | M-Power scale, for weighing powders. Product may be obtained from third-party suppliers |
| Scissors straight 12 cm edge | InterFocus Ltd | 91400-12 | blunt-blunt termination, student range |
| Signal Acquisition Device | Cambridge Electronic Design | Micro3-1401 | Micro3-1401 Multichannel ADC |
| Silicone grease, non-toxic | Farnell | 3821559 | for sealing of bath partition |
| Silicone tubing, 2 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silicone tubing, 5 mm inner diameter | N/A | N/A | N/A |
| Silver wire | Alfa Aesar | 41390 | 0.5 mm, annealed |
| Sodium Bicarbonate salt | Sigma Aldrich | S5761-500g | 500 g in plastic bottle |
| Sodium Chloride salt | VWR International Ltd | 27810.295 | 1 kg in plastic bottle |
| Spring scissors angled 2 mm edge | InterFocus Ltd | 15010-09 | N/A |
| Stand | N/A | N/A | Standard wet laboratory stands with sockets for rods |
| Stimulator | Digitimer | DS3 | DS3 or Custom Stimulator (see references) |
| Stirring flea | VWR International Ltd | 442-0270 | For use with the heating stirrer |
| Syringe tip, blunt, 1 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe tip, blunt, 2 mm diameter | N/A | N/A | N/A |
| Syringe, plastic, 10 mL volume | N/A | N/A | syringe should have luer lock fitting |
| Tape, water-resistant | N/A | N/A | For securing tubing and wiring to workbench |
| Thermometer | VWR International Ltd | 620-0806 | glass thermometer |
| USB Power Bank | RS UK | 135-1000 | Custom Stimulator power supply, fully charge before experiment. Not needed if using DS3 |
| Valve, Leuer Lock, 3-Way | VWR International Ltd | 229-7440 | For attaching syringe to bath feed tube and priming siphon |
References
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